專利名稱：：包括接骨木屬物種的提取物和方法包括接骨木屬物種的提取物和方法相關(guān)申請本申請要求2006年3月17日提交的美國臨時(shí)專利申請第60/783,453號(hào)，2006年9月22日提交的60/846,412號(hào)，和2006年12月7日提交的美國臨時(shí)專利申請第60/873,473號(hào)的優(yōu)先權(quán)，本申請將其全文以引用的方式并入本文。發(fā)'效銀乂4本發(fā)明涉及衍生自接骨木屬物種(eldersambucusspecies)的提取物和其方法，以及由這類方法提取的提取物和這類提取物的使用方法，所述提取物具有大幅提高的精油化學(xué)成分、酚酸化學(xué)成分、花色素(anthocyanidin)或原花色素化學(xué)成分，或者植物血凝素-多糖化學(xué)成分。接骨木屬，西洋接骨木(SambucanigraL.),原生于歐洲、北美和西亞，是一種野生灌木。接骨木屬進(jìn)一步由超過20種接骨木物種(Sambucaspecies)組成，其大部分具有類似的化學(xué)成分。大多數(shù)的科學(xué)研究圍繞西洋接骨木進(jìn)行。其為落葉樹，能長到10米，開乳白色花并結(jié)藍(lán)黑色果(接骨木果)。其花、葉和果均包含有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值的化學(xué)成分，包括精油復(fù)合物、酚酸特別是類黃酮和花色素、植物血凝素蛋白復(fù)合物，和多糖復(fù)合物。接骨木屬物種的藥用歷史可以追溯到15世紀(jì)BCE,包括在Hippocrates、Dioscorides和Pliny的著作中。在美洲原住民和歐洲草藥醫(yī)生當(dāng)中，接骨木的傳統(tǒng)應(yīng)用有悠久歷史。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用和現(xiàn)代研究活動(dòng)都集中在花提取物上。在春天采摘花朵，并在低于40。C的陽光下千燥，以使香味損失最小。在秋天完全成熟的時(shí)候采摘果實(shí)。市場上大部分的花和果是從俄羅斯聯(lián)邦、波蘭、匈牙利、保加利亞和葡萄牙進(jìn)口的。果實(shí)也用來給酒、冬季提神飲料、果醬、食物、和調(diào)味品調(diào)味和上色?；ê凸鳛樗幱迷噭┮呀?jīng)有很長的歷史。西洋接骨木花和果的化學(xué)成分包括生物活性酚酸(類黃酮和花色素)、蛋白質(zhì)、多糖和維生素(C、P、Bl、B2和B6)。雖然有關(guān)接骨木屬物種花和果的化學(xué)成分的信息是不完全的，但是表1列舉了已知的化學(xué)成分。站在商業(yè)和生物學(xué)的角度，傳統(tǒng)上認(rèn)為類黃酮和花色素比其他成分更重要。表l:西洋接骨木花和果的化學(xué)成分化學(xué)成分％質(zhì)量重量精油揮發(fā)油亞油酸亞麻酸棕櫚酸三薛彿a-香樹素卩-香樹素三辟烯酸烏索酸石竹酸酚酸類黃酮苷紫云英苷金絲桃苷異櫟素蕓香苷糖苷配基櫟精莰非醇咖啡酸衍生物綠原酸花色素花0.04-0.31果0.010.850.92-32-31-3花青素(cyanidin)3-接骨木二糖苷(sambubioside)-5-糖普花青素3,5-二葡糖苷花青素3-接骨木二糖苷花青素3-糖苷丹寧酸烷類黏液果膠蛋白質(zhì)(plastocynin)碳水化合物類單糖多糖.礦物質(zhì)8-93-9接骨木屬物種的藥用性質(zhì)導(dǎo)致其具有藥理學(xué)活性的化學(xué)成分的存在。作為化學(xué)含量的一般規(guī)則，色彩艷麗的果實(shí)含有高水平的花色素(作為色素)，以及黃酮醇苷和糖苷配基(EspinJC等等，JAgricFoodChem48:1588-1592,2000;KahkonenMP等等，JAgricFoodChem49:4076-4082,2001)。花色素是2-苯基苯并吡喃f翁(pyrylium)鹽的糖基化-多羥基和-多甲氧基書亍生物(BrouillardKaHSH，ChemicalStructureofAnthocyanins.AcademicPress,紐約，1982)。接骨木果是這些色素的最豐富的資源之一，具有0.2-1%的含量，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葡萄中的含量(Bronnum-HansenK等等，JFoodTechnology20:703-711，1985)。接骨木果包含幾種不同的花色素苷，其中花青素-3-接骨木二糖苷(化合物1)和花青素-3-糖苷(化合物2)在數(shù)量上是最重要的，占花色素含量的超過85%，而花青素-3-接骨木二糖苷-5-糖苷(化合物3)和花青素-3，5二葡糖苷(化合物4)僅為微量(Bronnum-HansenK等等，JChromatography262:393-396，1983;DrdakM&DaucikP.，ActaAliment19:3-7，1990)?；ㄉ仫@示了很廣的生物活性。最著名的屬性之一是抗氧劑活性，尤其是花青素衍生物的抗氧劑活性(DrdakM&DaucikP.,ActaAliment19:3-7，1990;TsudaT等等，JAgricFoodChem42:2407-2410，1994)?；衔?:Rl-接骨木二糖普，R2=H化合物2:Rl=糖苷，R2=H化合物3:Rl-接骨木二糖普，R2=糖普化合物4:Rl=糖苷，R2=糖苷通過測試不同種類的越桔酚酸化合物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)生長的能力，發(fā)現(xiàn)花色素是強(qiáng)力酚類(KameiH等等，CancerInvest13:590-594，1995)。特別是，在低至2pg/ml的濃度時(shí)花青素在抑制細(xì)胞生長方面仍非常有效，該濃度僅為所需強(qiáng)力抗癌劑染料木素濃度的1/10。已發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓中的花色素苷具有抗癌活性(SmithMAL等JFoodSci65:352-356,2000)。蕓香苷和異櫟素是接骨木屬物種植物體中主要的黃酮醇苷(PiettaP&BrunoA.，JChromatography593:165-170，1992)。這些化合物能充當(dāng)強(qiáng)力的自由基清除劑(ShahidiF&WannasundraPK.，CritRevFoodSciNutr32:67-103，1992;Rice-EvansCA等等，F(xiàn)reeRadicalBiol&Med20:933-956，1996)，抑制多種酶(FormicaJV&RegelsonW.，F(xiàn)oodandChemToxic33:1061-1080,1995),并且通過收緊血管而具有抗出血活性(DawidowiczAJ等等，JLiquidChromotog&RelatedTechnologies26:2381-2397，2003)。在使用西洋接骨木的花、果和葉的加速溶劑提取物的研究中，發(fā)現(xiàn)蕓香苷是主要的類黃酮。花具有濃度為2-3%和0.1%的最高含量的類黃酮和異櫟素。接骨木果和葉具有類似含量的蕓香苷，濃度約0.2%。結(jié)果如表2所示。蕓香苷R-蕓香糖苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>異櫟素R-糖苷表2.用80%曱醇從西洋接骨木的不同部位得到的蕓香苷和異櫟素提取率。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由于其揮發(fā)性成分，接骨木種植物體具有令人愉快的強(qiáng)烈氣味。在接骨木葉中已經(jīng)識(shí)別出多種烷烴，其中二十七烷、二十九烷和三十一烷的含量是最重要的。接骨木花精油具有高含量的脂肪酸(66%)和正烷烴(7.2%)。已經(jīng)從接骨木花精油的蒸汽蒸餾物中識(shí)別出79種化合物(ToulemondeB等等，JAgricFoodChem31:365-370,1983)。精油的主要成分是反-3,7-二曱基-l,3,7-辛三烯(octatrien)-3-醇(13%)、棕櫚酸(11.3%)、芳樟醇(3.7%)、順-己烯醇(2.5%)和順-和反-玫瑰醚類(分別為3.4%和1.7%)。市場上主要的接骨木果提取物包含濃度為0,5。/。的花色素(EspinJC等等，JAgricFoodChem48:1588-1592,2000)。主要的花色素是花青素-3-單糖苷(97%)和花青素-3,5-二糖苷(3%)。濃縮物的特征還在于存在咖啡酸衍生物(0.011%)和蕓香苷(0.055)。三碎烯和類黃酮長期被認(rèn)為是對(duì)接骨木屬物種的生物活性作出貢獻(xiàn)的主要化學(xué)成分(BlumenthalM等等，HerbalMedicine:ExpandedCommissionEMonographs,IntegrativeMedicineCommunications,Newton，MA，2000,pp，103-105)。然而，四種主要的花色素似乎在接骨木屬物種的抗流感活性中起著重要作用。將這些花色素引入到暴露于接骨木屬物種提取物4小時(shí)后的內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和細(xì)胞液中(YoudinKA等等，F(xiàn)reeRadicBiolMed29:51-60，2000)。富含接骨木的保護(hù)作用。'此外，接骨木屬物種果的提取物已經(jīng)顯示出:有吸收氧自由基的能力(RoyS等等，F(xiàn)reeRadicalRes36:1023-1031,2002)。接骨木屬物種的血凝素和核糖體-滅活蛋白質(zhì)也展示了抗病毒活性(VanderbusscheF等等，EurJBiochem27:1508-1515，2004;deBenitoFM等等，F(xiàn)EBSLett428:75-79,1998;FujimuraY等等，VirchowsArch444:36-42，2003)。西洋接骨木果的標(biāo)準(zhǔn)化提取物(Sambuco1⑧.RazeiBar，Jerusalem)(成人劑量4克)，包含38%的與紫錐花屬angustifolica(根莖)提取物、紫錐花屬紫癜(莖、葉和花)提取物、維生素C(100mg)和鋅(10毫克)結(jié)合的具有花色素的黑色接骨木果提取物，該標(biāo)準(zhǔn)提取物顯示以下性質(zhì)抑制由人流感病毒產(chǎn)生的紅血球凝聚(Zakay-RonesZ等等，JAlternative&ComplementaryMedicine1:361-369,1995);抑制人體內(nèi)和體外的病毒復(fù)制(Zakay-RonesZ等等，JAlternative&ComplementaryMedicine1:361-369，1995);提高人體內(nèi)炎性和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(BarakV等等，IsrMedAssocJ4(s叩pl11):919-922，2002);減少紅血球凝聚和抑制A型和B型人流感病毒在體外的復(fù)制(Zakay-RonesZ等等，JAlternative&ComplementaryMedicine1:361-369，1995);減少HIV的體外傳染(Zakay-RonesZ等等，JInternationalMedRes32:132-140，2004);抑制HSV-1菌抹的體外復(fù)制(Zakay-RonesZ等等，JInternationalMedRes32:132-140,2004);減少大鼠模型中的結(jié)腸炎(BobekP等等，BiologiaBratislavia56:643-648，2002);減輕黑猩猩的流感癥狀(GmyAM等等，JNutr30:15-20，2000);以及隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)證明減輕了人類的A型和B型流感癥狀(Zakay-RonesZ等等，JInternationalMedRes32:132-140，2004)。源于西洋接骨木的其他提取組合物的其他發(fā)現(xiàn)包括增加溶酶體酶類，減少脂肪氧合酶作用(lipoxygenation)產(chǎn)物的產(chǎn)生，和降低髓過氧物酶的體外活性(BobekP等等，BiologiaBratislavia56:643-648,2002);防止體外氣化應(yīng)激反應(yīng)(stress)(BrouillardKaHSH，，ChemicalStructureofAnthocyanins.，AcademicPress,紐約，1982);增進(jìn)體外的氧自由基吸收能力(Bronnum-HansenK等等，JChromatography262:393-396，1983)和體內(nèi)的類胰島素及胰島素釋放活動(dòng)(GrayAM等等，JNutr30:15-20,2000)。為了簡要概括西洋接骨木化學(xué)成分的治療價(jià)值，科學(xué)探索和臨床研究證明了接骨木屬物種的各種化合物、化學(xué)基團(tuán)或提取組合物的下列治療作用，包括抗病毒、抗感冒、抗流行性感冒、抗-HIV、抗HSV(三辟烯、花色素、植物血凝素蛋白、多糖、粗提取物)；抗氧劑和清除氧自由基(類黃酮、花色素、粗提取物)；消炎活性(粗提取物)；抗糖尿病活性(多糖、水溶性提取物)；調(diào)節(jié)腸活動(dòng)和緩和腹渴(提取物)；和減少興奮和失眠(提取物)。此外，通常認(rèn)為西洋接骨木接骨木花或接骨木果提取組合物是安全的，且沒有公知的禁忌癥。發(fā)效力容一方面，本發(fā)明涉及包含具有圖36-70中任一圖所示實(shí)時(shí)直接分析(DART)質(zhì)譜色鐠的級(jí)分的接骨木屬物種提取物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該級(jí)分具有圖46-50中任一圖所示的DART質(zhì)語色語。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該級(jí)分具有圖48的DART質(zhì)語色語。一方面，本發(fā)明涉及包含對(duì)H1N1流感病毒測得的IC50為150-1500ng/mL的級(jí)分的接骨木屬物種提取物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該級(jí)分具有150-750pg/mL的IC50。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該級(jí)分具有150-300|iig/mL的IC5o。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該級(jí)分具有至少195pg/mL的IC50。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分包含花色素苷；類黃酮；C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯；和/或多糖。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所迷花色素苷選自花青素_3-糖苷和花青素-3-接骨木二糖苷。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述花色素苷的含量超過10、20、30、40或50重量％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述類黃酮為蕓香苷。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯選自十六醇、十六酸、十六酸曱酯、十六酸乙酯、十六酸丁酯、十八酸、十八酸乙酯、十八酸丁酯、9-十八碳烯-l-醇、9，12-十八碳二烯酸，以及它們的組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯為2、4、6、8或10重量％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多糖選自右旋糖酐、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，以及它們的組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多糖的含量為10、15、20、25、30、35或40重量％。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的接骨木提取物，其中所迷級(jí)分包含花色素苷；C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯；和多糖。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述花色素苷選自花青素-3-糖苷和花青素-3-接骨木二糖苷。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述花色素苷的含量超過10、20、30、40或50重量％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯選自十六醇、十六酸、十六酸甲酯、十六酸乙酯、十六酸丁酯、十八酸、十八酸乙酯、十八酸丁酯、9'-十八碳烯-l-醇、9,12-十八碳二烯酸酸，以及它們的組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯為2、4、6、8或10重量％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多糖選自右旋糖酐、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，以及它們的組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多糖的含量為10、15、20、25、30、35或40重量％。另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明接骨木屬物種提取物的食物或藥劑。另一方面，本發(fā)明涉及治療患者的病毒感染的方法，包括對(duì)需要上述治療的患者給藥有效量的本發(fā)明接骨木屬物種提取物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該病毒感染由包膜病毒(envelopevirus)引起。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該包膜病毒為黃病毒(flavievirus)。在另一實(shí)施方案中，所述病毒感染由無包膜病毒引起。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述病毒感染由流感病毒、A型和B型人流感病毒、禽流感病毒、H1N1、H5N1、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、SARs、單純皰疹病毒(HSV)、黃熱病病毒、登革熱、黃熱病、西尼羅河病毒(WestNile)和腦炎病毒引起。在另一實(shí)施方案中，所述病毒感染由諾瓦克(Norwalk)病毒、曱型肝炎、骨髓灰質(zhì)炎、andoviruses或鼻病毒引起。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述患者為靈長類、?？啤ⅧB類、綿羊科、馬科、豬科、嚙齒類、貓科、或犬科動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述患者為人類。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞的病毒感染的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與本發(fā)明的接骨木屬物種提取物接觸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該病毒感染為包膜病毒感染。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該包膜病毒感染為黃病毒感染。在另一實(shí)施方案中，該病毒感染為無包膜病毒感染。在另一實(shí)施方案中，該病毒感染為流感病毒、A型和B型人流感病毒、禽流感病毒、H1N1、H5N1、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、SARs、單純皰滲病毒(HSV)、黃熱病病毒、登革熱、黃熱病、西尼羅河病毒和腦炎病毒感染。在又一實(shí)施方案中，該病毒感染為諾瓦克病毒、甲型肝炎、骨髓灰質(zhì)炎、andoviruses或鼻病毒感染。在另一方面，本發(fā)明涉及制備具有至少一種預(yù)定特征的接骨木屬物種提取物的方法，該方法包括通過以下步驟循序提取接骨木屬物種植物體，以產(chǎn)生精油級(jí)分、多酚級(jí)分和多糖級(jí)分a)通過超臨界二氧化碳萃取來提取接骨木屬物種植物體，以產(chǎn)生精油級(jí)分和第一殘余物；b)通過用約40。C到約70。C的水、或水-醇(hydro-alcoholic)提取來提取接骨木屬物種植物體或步驟a)中得到的第一殘余物，以產(chǎn)生多酚級(jí)分和第二殘余物；和c)通過用水在約70。C到約90。C提取來提取步驟b)得到的第二殘余物，以產(chǎn)生多糖級(jí)分。在另一實(shí)施方案中，所述提取方法可以應(yīng)用于任何富含花色素和/或原花色素的物種，例如黑醋栗果、紅醋栗果、醋栗、歐洲越桔(bilberry)、黑莓、藍(lán)莓、櫻桃、酸果蔓(cranberry)、山楂果、羅甘莓、懸鉤子、花楸果(chokeberry)、蘋果、石榴、溫柏和李子。在另一實(shí)施方案中，獲得精油級(jí)分包括l)將研磨的接骨木屬物種植物體裝入浸提器；2)在超臨界條件下加入二氧化碳；3)將接骨木屬物種植物體與二氧化碳結(jié)合一段時(shí)間；以及4)在采集器中收集精油級(jí)分。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括通過用超臨界二氧化碳分級(jí)分離(fractionals印aration)系統(tǒng)分餾所述精油提取物來改變精油化學(xué)成分的復(fù)比(compoundratios)。在又一實(shí)施方案中，通過以下步驟獲得多酚級(jí)分l)將研磨的接骨木屬物種植物體或步驟a)得到的殘余物與約40°C到約70°C的水、或水-醇溶液接觸一段足夠提取多酚化學(xué)成分的時(shí)間；2)使步驟a)獲得的所提取多酚化學(xué)成分的水-醇溶液通過親和吸附劑樹脂柱，其中包括花色素在內(nèi)的多酚酸被吸附；和3)從親和吸附劑樹脂上將純化的一個(gè)或多個(gè)多酚化學(xué)成分級(jí)分洗脫。在又一實(shí)施方案中，獲得多糖級(jí)分的方法包括l)將步驟b)獲得的第二殘余物與約70。C到約90。C的水接觸一段足夠提取多糖的時(shí)間；和2)用乙醇沉淀法將多糖從水溶液中沉淀出來。另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的任意方法制得的接骨木屬物種提取物。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含連苯三酚(pyrogallol)、重量為連笨三酚的15-25%的曱基肉桂酸、重量為連苯三酚的1-4%的肉桂酰胺、重量為連苯三酚的5-10%的2-甲氧基苯酚、重量為連苯三酚的1-2%的苯曱醛、重量為連苯三酚的5-10°/。的肉桂醛、和重量為連苯三酚的5-15%的乙酸肉桂酯。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含蕓香苷、重量為蕓香苷的20-30%的阿魏酸、重量為蕓香苷的25-35%的肉桂酸、重量為蕓香苷的15-25%的莽草酸、和重量為蕓香苷的55-65%的苯乳酸。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含蕓香苷、重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素(taxifolin)、重量為蕓香苷的1-5%的阿魏酸、重量為蕓香苷的1-5%的肉桂酸、重量為蕓香苷的0.5-5%的莽草酸、重量為蕓香苷的1-5%的苯乳酸、重量為蕓香苷的5-15%的花青素、和重量為蕓香苷的15-25%的矮牽牛配基(petunidin)。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的30-40%的花青素、重量為蕓香苷的75-85%的矮牽牛配基、重量為蕓香苷的5-10%的香草酸、重量為蕓香苷的1-5%的阿魏酸、和重量為蕓香苷的1-10%的肉桂酸。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸、重量為對(duì)羥笨基丙烯酸/苯丙酮酸的65-75%的蕓香苷、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/笨丙酮酸的65-75%的香草酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的35-45%的阿魏酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的65-75%的肉桂酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的45-55%的莽草酸。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含蕓香苷、重量為蕓香苷的20-30%的橙皮苷、重量為蕓香苷的70-80%的香草酸、和重量為蕓香苷的40-50%的肉桂酸。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含矮牽牛配基、重量為矮牽牛配基的85-95%的蕓香苷、重量為矮牽牛配基的55-65%的香草酸、和重量為矮牽牛配基的30-40%的肉桂酸。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，其包含蕓香苷、重量為蕓香普的5-15%的花青素、重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素、重量為蕓香苷的5-15%的咖啡酸、重量為蕓香苷的1-10%的阿魏酸、重量為蕓香苷的1-10%的莽草酸、重量為蕓香苷的25-35%的矮牽牛配基、和重量為蕓香苷的1-5%的圣草酚或黃顏木素。另一方面，本發(fā)明涉及接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的10-20%的花青素、重量為蕓香苷的1-5%的圣草酚或黃顏木素、重量為蕓香苷的10-20%的柚皮素、和重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素。通過以下的描述、附圖和權(quán)利要求，本發(fā)明的這些實(shí)施方案、其他實(shí)施方案、及其特征和特點(diǎn)是顯而易見的。餘^的謬異說銀圖l顯示了本發(fā)明的接骨木屬物種提取方法的示例性的示意圖。圖2顯示了本發(fā)明的接骨木屬物種提取方法的示例性的示意圖。圖3顯示了本發(fā)明的接骨木屬物種提取方法的示例性的示意圖。圖4顯示了本發(fā)明的接骨木屬物種提取方法的示例性示意圖。圖5顯示了使用人A型H1N1病毒的病毒進(jìn)入分析系統(tǒng)(viralentryassaysystem)。在僅使用病毒(左上；10-4流感A)、不使用病毒(左下；PBS)、使用與濃度1:1，000(右上；1:1000Ab)和l:500(右下；1:500Ab)的抗流感病毒抗體混合的病毒的條件下孵育MDCK細(xì)胞。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三次。每個(gè)棕紅斑點(diǎn)表示一個(gè)病毒感染事件。在抗體對(duì)照中檢測到病毒抑制或彩色斑點(diǎn)數(shù)量的減少。圖6顯示了使用接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4和人流感A型H1N1病毒的抑制分析的實(shí)施例。在與MDCK細(xì)胞孵育之前，將接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的系列稀釋液(未稀釋到1:32稀釋液)與病毒預(yù)孵育。每個(gè)試驗(yàn)做三次。斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于一個(gè)病毒感染事件。斑點(diǎn)數(shù)量的減少表示病毒抑制。圖7顯示了使用接骨木果B花色素苦級(jí)分ADS5解吸F4和人流感A型H1N1病毒的抑制分析。在與MDCK細(xì)胞孵育之前，將接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的系列稀釋液(未稀釋到1:32稀釋液)與病毒預(yù)孵育。每個(gè)試驗(yàn)做三次。棕紅色斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于一次病毒感染事件。彩色斑點(diǎn)數(shù)量的減少表示病毒抑制。圖8顯示了使用接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4和人流感A型H5N1病毒的抑制分析。在與MDCK細(xì)胞孵育之前，將接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的系列稀釋液(未稀釋到1:32稀釋液)與病毒預(yù)孵育。每個(gè)試驗(yàn)做三次。棕紅色斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于一個(gè)病毒感染事件。彩色斑點(diǎn)數(shù)量的減少表示病毒抑制。圖9顯示了嵌合HIV-1SG3(基因組)C亞型(包膜)的抑制分析。+，為陽性感染對(duì)照；F4，為接骨木果提取物級(jí)分F4;以及T為分析中所用病毒的滴定。圖10顯示了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2級(jí)分在293T細(xì)胞中的MTT存活性(viability)分析。圖11顯示了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2級(jí)分在MDCK細(xì)胞中的MTT存活性分析。圖12顯示了24小時(shí)后接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分在293T細(xì)胞中的MTT存活性分析。圖13顯示了44小時(shí)后接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分在293T細(xì)胞中的MTT存活性分析。圖14顯示了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖15顯示了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F3級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖16顯示了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖17顯示了接骨木花XAD7HP解吸F2級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖18顯示了接骨木花XAD7HP解吸F3級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖19顯示了使用H1N1病毒得到的無緩沖接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F3級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖20顯示了使用H1N1病毒得到的無緩沖接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F3級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖21顯示了使用H1N1病毒得到的無緩沖接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖22顯示了使用H1N1病毒得到的無緩沖接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖23顯示了使用H1N1病毒得到的緩沖的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖24顯示了使用H1N1病毒得到的無緩沖接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖25顯示了使用H5N1病毒得到的緩沖的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖26顯示了使用H5N1病毒得到的緩沖的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖27顯示了所測試提取物的組合的(combined)傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線。圖28顯示了使用H1N1病毒得到的緩沖接骨木花ADS5解吸F2級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖29顯示了對(duì)接骨木花F2級(jí)分計(jì)算的ICsoHlNl。圖30顯示了接骨木果F4級(jí)分和接骨木花F2級(jí)分的IC5oH1N1的對(duì)照。圖31顯示了接骨木果F4級(jí)分和接骨木花F2級(jí)分的IC9oH1N1的對(duì)照。圖32顯示了使用2型登革熱病毒得到的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖33顯示了使用HIV病毒得到的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線。該曲線在所示濃度下顯示出100%的抑制。圖34顯示了使用HIV病毒得到的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線。該曲線在所示濃度下顯示出100%的抑制。圖35顯示了使用HIV病毒得到的接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4級(jí)分的傳染性抑制劑量響應(yīng)曲線和50%抑制濃度。圖36顯示了接骨木果多糖的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。圖37顯示了接骨木果多糖的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。圖38顯示了接骨木花多糖的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。圖39顯示了接骨木花多糖的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。圖40顯示了具有所描述的可能結(jié)構(gòu)的全接骨木果進(jìn)料的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。檢測到曱基肉桂酸(163.0688)(豐度(abund.)-19.47)、肉桂酰胺(148.0826)(豐度=2.63)、2-曱氧基苯酚(125.0599)(豐度=7.34)、3-甲氧基-1-酪氨酸(212,0985)(豐度=17.42)、苯曱醛(107,0422)(豐度=1.10)、肉桂醛(133.0568)(豐度-6.56)、乙酸肉桂酯(177.0956)(豐度=8.51)，和連苯三酚(127.0344)(豐度=93.67)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H804+H+(在145.0469)和C6H603+H+(在127.0344)。圖41顯示了具有所描述的可能結(jié)構(gòu)的全接骨木果進(jìn)料的AccuTOF-DART質(zhì)語(負(fù)離子模式)。檢測到肉桂酸(147.0385)(豐度=5.57)、肉桂醛(131.04)(豐度=5.57)、連苯三酚(125.024)(豐度=3.54)、櫟精(301.0253)(豐度=0.73)、熊果酸(455.3518)(豐度=10.99)，和莽草酸(173.0454)(豐度=7.18)。圖42顯示了使用80%EtOH溶液得到的全接骨木果進(jìn)料提取物的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C6H,。O5+H+(163.0601)(豐度-17.19)和CMH15NO+H+(214.1266)(豐度=24.06)。圖43顯示了使用ADS5解吸填料得到的F2柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)鐠(正離子模式)。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0541)(豐度=59.28)、阿魏酸(195,0755)(豐度=13.54)、肉桂酸(149.0572)(豐度-19.55)、莽草酸(175.0699)(豐度-11.72)和苯乳酸(167.0793)(豐度=36.17)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H6O3+H+(127.0348)(豐度=100)和C7H6O4+H+(155.0335)(豐度=59.18)。圖44顯示了使用ADS5解吸填料得到的F3柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0521)(豐度=100)、花旗松素(305.0693)(豐度=4.25)、阿魏酸(195.075)(豐度=1.34)、肉桂酸(149.0552)(豐度-3.32)、莽草酸(175.0696)(豐度=0.96)、苯乳酸(167.0701)(豐度=3.97)、花青素(287.0622)(豐度=8.36)和矮牽牛配基(317.0707)(豐度=21.71)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C10H12O3+H+(181.0854)(豐度=9.71)和C13H14N202+H+(231.1163)(豐度=5.85)。圖45顯示了使用ADS5解吸填料得到的F4柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0534)(豐度=100)、阿魏酸(195.0744)(豐度=3.32)、肉桂酸(149.057)(豐度=6.36)、花青素(287.0608)(豐度=36.44)、矮牽牛配基(317.0691)(豐度=78.75)和香草酸(169.0524)(豐度=7.75)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C29H!807+H+(479.1218)(豐度=22.62)和C12H14O4+H+(223.0994)(豐度=21.56)。圖46顯示了使用ADS5解吸填料得到的接骨木果B花色素苷的F2柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。該級(jí)分用于使用H1N1的抗病毒分析得到IC5o=333pg/mL。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0566)(豐度=18.33)、阿魏酸(195.0724)(豐度-10.32)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(165.0639)(豐度=25.54)、肉桂酸(149.0573)(17.86)、莽草酸(175.0633)(豐度-12.62)和香草酸(169.0575)(豐度=18.01)。也檢測到未確認(rèn)的化合物d3HuO+H+(183.0818)(豐度=43.33)和C14H17N03+H+(248.1271)(豐度=60.28)。圖47顯示了使用ADS5解吸填料得到的接骨木果B花色素苷的F3柱色語級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)i普(正離子模式)。該級(jí)分用于使用H1N1的抗病毒分析得到IC50=294ng/mL。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0553)(豐度=41.74)、橙皮苷(hesperin)(287.0936)(豐度-10.41)、肉桂酸(149.0584)(豐度=17,85)和香草酸(169,0571)(豐度=31.09)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C8H80+H+(121.0586)(豐度=29.36)和CwH2oN203+H+或C!5H2。04+H+(265.1469)(豐度-26.23)。圖48顯示了使用ADS5解吸填料得到的接骨木果B花色素苷的F4柱色語級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。該級(jí)分用于使用H1N1的抗病毒分析得到IC5o=195ng/mL。檢測到蕓香苷或花翠苷(303.0557)(豐度=20.27)、肉桂酸(149.0593)(豐度=7.94)、矮牽牛配基(317.071)(豐度-22.09)和香草酸(169.0538)(豐度=12.82)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H10O5+H+(163.076)(豐度=63.28)和C17H180+H+(239.1531)(豐度=26.32)。圖49顯示了使用XAD7HP解吸填料得到的接骨木花F2柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。該級(jí)分用于使用H1N1的抗病毒分析得到IC5Q=1592ng/mL。檢測到花青素(287.0588)(豐度=10.92)、蕓香苷或花翠苷(303.0531)(豐度=100)、花旗松素(305,0651)(豐度=4.69)、咖啡酸/4-羥基苯乳酸(181.0589)(豐度=9.45)、阿魏酸(195.0741)(豐度=3.33)、莽草酸(175.0645)(豐度=3.11)、矮牽牛配基(317.0689)(豐度=29.48)和圣草酚或黃顏木素(288.0709)(豐度=2.36)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C函3NO2+H+(180.1024)(豐度=15.98)和C8H6N20+H、1C9H602+H+(147.0545)(豐度=73.50)。圖50顯示了使用XAD7HP解吸填料得到的接骨木花的F3柱色譜級(jí)分的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。該級(jí)分用于使用H1N1的抗病毒分析得到IC5()=582^ig/mL。檢測到花青素(287.0574)(豐度=17.16)、蕓香苷或花翠苷(303.0518)(豐度-lOO)、花旗松素(305.0658)(豐度=5.54)、柚皮素/紫鉚因/根皮素(273.0797)(豐度=16.06)，和圣草酚或黃顏木素(289.0795)(豐度=3.14)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C10H16O+H+(153.1268)(豐度=30.96)和C23HMO4+H+(355.1048)(豐度-30.03)。圖51顯示了#185的AccuTOF-DART質(zhì)鐠(正離子模式)。檢測到肉桂酸(149.0616)(豐度=3.82)、莽草酸(175.0613)(豐度=14.71)，和苯乳酸(167.074)(豐度=5，3"。也檢測到未確認(rèn)的化合物C30H46O2+H+(439.3625)(豐度=16.49)和(:39&805+『(617.5151)(豐度=4,09)。圖52顯示了#319的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(165.0604)(豐度=3.96)、肉桂酸(149.0579)(豐度=0.48)、3，5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(225.0816)(豐度=10.59)、莽草酸(175.0699)(豐度-5.37)，和苯乳酸(167.0773)(豐度-2.71)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H8O4+H+(145.0507)(豐度-100)和C12H12O6+H+(253.0708)(豐度=35.27)。圖53顯示了#322的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。檢測到花翠苷(304,0576)(豐度=8.75)、蕓香苷(303.057)(豐度=49.28)、圣草酚/黃顏木素(289.0752)(豐度=13.50)、花旗松素(305.0638)(豐度=3.41)、阿魏酸(195.0745)(豐度=7.15)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(165.0613)(豐度=16.91)、肉桂酸(149.0695)(豐度=3.20)、莽草酸(175.067)(豐度=8.34)和苯乳酸(167.0722)(豐度=8.84)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H603+H+(127,0413)(豐度=100)和CnHi5O5+H+(227,0876)(豐度-29.26)。圖54顯示了#324的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C37H6604+H+(575.51)(豐度=5.42)和C59H8805+H+(877.67)(豐度-15.46)。圖55顯示了#325的AccuTOF-DART質(zhì)諳(正離子模式)。檢測到莽草酸(175.0658)(豐度=6.05)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C16H1404+H+(271.0941)(豐度=22.24)和(16&605+11+(289.0983)(豐度=15.76)。圖56顯示了#326的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到肉桂酸(149.0681)(豐度=2.67)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C22H4204+H+(371.3196)(豐度=46.60)和(18^13002+11+(279.2346)(豐度=20.28)。圖57顯示了#327的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C8H8O+H+(121.0663)(豐度=66.34)和C8H8O2+H+(137.065)(豐度=20.16)。圖58顯示了#328的AccuTOF-DART質(zhì)語(正離子模式)。檢測到阿魏酸(195.0737)(豐度-4.04)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(165.0604)(豐度=3.67)、肉桂酸(149.0691)(豐度=3.49)、3，5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(225.0817)(豐度=5.18)、莽草酸(175.0616)(豐度=4.88)，和苯乳酸(167.0786)(豐度=2.63)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C6H1C)05+H+(163.0602)(豐度-10.84)和(:12^407+^(271.0829)(豐度=21.7)。圖59顯示了#329的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到肉桂酸(149.0621)(豐度=1.43)和莽草酸(175.0633)(豐度=3,23)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C21H3603+H+(337.2763)(豐度=13.38)和C39H6604+H+(599.507)(豐度=5.53)。圖60顯示了#330的AccuTOF-DART質(zhì)譜(正離子模式)。檢測到阿魏酸(195.0747)(豐度-2.76)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(165.0608)(豐度=2.42)、肉桂酸(149.0616)(豐度=0.79)、3，5-二曱氣基-4-羥基肉桂酸(225.0824)(豐度=2.98)、莽草酸(175.0604)(豐度=2.55),和苯乳酸(167.078)(豐度-1.95)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C14H14O4+H+(247.0895)(豐度=4.28)和(:30114602+1^(439.3619)(豐度=5.98)。圖61顯示了#185的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到橙皮苷(285.0841)(豐度=0.44)和根皮苷(255.0711)(豐度=0.71)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C4H6Os-H+(133.0134)(豐度-100)和C10H8O4-H+(191.0325)(豐度=25.34)。圖62顯示了#319的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到肉桂酸(147.0358)(豐度=0,67)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C4H605-H+(133.0135)(豐度=86.11)和d。H8O4-H+(191,0195)(豐度-100)。圖63顯示了#322的AccuTOF-DART質(zhì)語(負(fù)離子模式)。檢測到花青素(286.0502)(豐度=5.30)、花翠苷(302.0388)(豐度=18.51)、花葵素(270.0512)(豐度=0.34)、楊梅黃酮(317.0315)(豐度=13.27)、蕓香苷(301.0324)(豐度=100)、水飛薊素(silybin)/染料木素(269.0399)(豐度=0.42)、3-OH黃酮(237.0587)(豐度=0.89)、圣草酚/黃顏木素(287.0592)(豐度=7,09)、兒茶素/表兒茶素(epitcatechin)(289.0784)(豐度=5.29)、花旗松素(303,0468)(豐度=5.31)、根皮苷(255.0614)(豐度=0.81)、香草酸(167.0416)(豐度=4.07)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(163.0307)(豐度=12.95)、3,5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(223.054)(豐度=0.80)、沒食子酸(169.0166)(豐度=1.73)和莽草酸(173.0475)(豐度=1.11)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C,。H8O4-H+(191.0532)(豐度-31.51)和C22H22O13-H+(493.0955)(豐度=4.42)。圖64顯示了#324的AccuTOF-DART質(zhì)鐠(負(fù)離子模式)。檢測到圣草酚/黃顏木素(287.0655)(豐度=0.99)、兒茶素/表兒茶素(289.0726)(豐度=0.92)、熊果酸(455.3465)(豐度=0.87)、香草酸(167.0388)(豐度-1.89)、阿魏酸(193.0478)(豐度=7.35)、對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(163.0404)(豐度=5.66)、肉桂酸(147.0373)(豐度-5.97)、和莽草酸(173.0373)(豐度=10.00)。也4企測到未確認(rèn)的化合物(:16^404-1+(269.0878)(豐度=21,98)和C23H803-H+(341.1193)(豐度=12.27)。圖65顯示了#325的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C4H6O5-H+(133.0118)(豐度=100)和C10H8O4-H+(191.0183)(豐度=81.19)。圖66顯示了#326的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到蕓香苦(301.0441)(豐度=31.62)、3-OH黃酮(237.062)(豐度=0.74)、兒茶素/表兒茶素(289.079)(豐度=2.70)、根皮苷(255.0687)豐度=2.24)、熊果酸(455,3556)(豐度=7.43)、咖啡酸/4-羥基苯乳酸酸(179.0398)(豐度=12,26)、阿魏酸(193.051)(豐度=7.63)、對(duì)羥苯基丙彿酸/苯丙酮酸(163.0405)(豐度=8.75)、肉桂酸(147.0414)(豐度=3.24)和莽草酸(173.0452)(豐度=23.59)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C5H6O4-H+(129.0178)(豐度=100)和C16H1608-H+(335.0807)(豐度-25.82)。圖67顯示了#327的AccuTOF-DART質(zhì)谞(負(fù)離子模式)。檢測到3-OH黃酮(237，0524)(豐度=0.26)、橙皮苷(285.0822)(豐度=0.63)、兒茶素/表兒茶素(289.0732)(豐度-0.U)、根皮苷(255.0706)(豐度=0.82)、3,5-二甲氣基-4-羥基肉桂酸(223.0543)(豐度=0.09)，和分支酸(chorismic3(^)(225.0489)(豐度=0.10)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C4H605-H+(133.0117)(豐度=100)和C20H20O7-H+(371.1175)(豐度=2.39)。圖68顯示了#328的AccuTOF-DART質(zhì)語(負(fù)離子模式)。檢測到蕓香苷(301.0446)(豐度=0.62)、根皮苷(255.0744)(豐度-0.05)，和對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸(163.0386)(豐度=0.36)。也檢測到未確認(rèn)的化合物C5H805-H+(147.0293)(豐度=7.50)和C6H606-H+(173'0099)(豐度=7.84)。圖69顯示了#329的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C6H10O5-H+(161.04)(豐度=2.97)和C8H,2O7-H+(219,05)(豐度-3.64)。圖70顯示了#330的AccuTOF-DART質(zhì)譜(負(fù)離子模式)。檢測到未確認(rèn)的化合物C5H403-H+(lll.Ol)(豐度=12.32)和C6H,206-H+(179,05)(豐度=1.20)。發(fā)效的詳勿說效定乂本文使用冠詞"a"和"an"指一種或超過一種(即至少一種)該冠詞的文法對(duì)象。例如"an元素(anelement)"意思是一種元素或超過一種元素。術(shù)語"花色素"是本領(lǐng)域公知的，指包含黃詳鹽(flavylium)正離子衍生物的化合物。術(shù)語"花色素苷"是本領(lǐng)域公知的，指具有糖基團(tuán)的花色素。其主要為花色素中的3-糖苷。所迷花青素細(xì)分為無糖花色素糖苷配基和花色素苷糖苷。術(shù)語"病毒殼體(capsid)"是本領(lǐng)域公知的，指圍繞和保護(hù)病毒核酸(DNA或RNA)的蛋白質(zhì)殼。術(shù)語"包含"和"包括"用其包括在內(nèi)的、開放式的含義，即還可包括其他要素。術(shù)語"由…組成"用于將要素限定到除了與之相聯(lián)系的常見雜質(zhì)外明確指定的那些要素。術(shù)語"基本由…組成"用來將要素限定到明確指定的那些要素，和術(shù)語"花青素"或"黃酮-3-醇"是本領(lǐng)域公知的，指劃分為類黃酮和花色素苷的天然有機(jī)化合物。其是在許多紅果(redberries)中均可找到的一種色素，這些紅果包括但不限于越桔、黑莓、藍(lán)莓、櫻桃、酸果蔓果、接骨木果、山楂、羅甘莓、巴西莓(acaiberry),和懸鉤子。其在其他水果如蘋果和李子中也可找到。本文使用的術(shù)語"有效量"指引起所需生物響應(yīng)必需的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，組合物或生物活性藥劑的有效量會(huì)隨著諸如所需生物學(xué)終點(diǎn)、待輸送的生物活性藥劑、形成膠囊的基質(zhì)的組成、目標(biāo)組織等等的因素變化。本文所用"接骨木"指源于接骨木屬物種植物的接骨木屬物種植物體。術(shù)語"接骨木"也可與接骨木屬物種、接骨木物種和接骨木果互換使用，并且意思指這些植物、復(fù)制體、變種和突變體等。本文使用的術(shù)語"接骨木成分"意思是在接骨木屬物種中發(fā)現(xiàn)的化合物，并且包括上述識(shí)別的所有這類化合物以及在接骨木屬物種中發(fā)現(xiàn)的其他化合物，包括但不限于精油化學(xué)成分、多酚酸和多糖。本文使用的術(shù)語"包膜病毒"指包含脂質(zhì)雙分子膜的病毒，該雙分子膜包含來源于宿主細(xì)胞膜的病毒糖蛋白類。在包膜病毒中，在包膜中發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和穿透的病毒蛋白。包膜病毒的實(shí)例包括人和禽流感病毒、HIV、SARs、HPV、單純皰疹病毒(HSV)、登革熱病毒，和諸如黃熱病、西尼羅河病毒，和腦炎病毒的黃病毒。本文使用的術(shù)語"精油級(jí)分"包括得自或源于接骨木和相關(guān)物種的脂溶性、水不溶性的化合物，包括但不限于劃分為反亞油酸(Linoelaidicacid)的化合物。本文使用的術(shù)語"精油細(xì)分級(jí)分(sub-fraction)"包括得自或源于接骨木和相關(guān)物種的脂溶性、水不溶性化合物，包括但不限于劃分為反亞油酸的化合物，其具有提高或降低濃度的在接骨木屬物種精油中發(fā)現(xiàn)的具體化合物。本文使用的術(shù)語"進(jìn)料(feedstock)"通常指未加工的植物體，包括單獨(dú)的整個(gè)植林，或植林的一個(gè)或多個(gè)組成部分的結(jié)合包括葉、根(包括但不限于主根、尾根和不定須根(fiberroots))、莖、皮、葉、果、種子和花，其中所述植抹或組成部分可包括未加工的、千燥的、蒸制的、加熱的或經(jīng)過物理加工的材料，以有利于加工，其還可包括完好的、剁碎的、切塊的、碾碎的、研磨的或經(jīng)過加工以影響植物體的尺寸和物理完整性的材料。有時(shí)，術(shù)語"進(jìn)料"可用來表示提取產(chǎn)物，該產(chǎn)物將用作其他提取過程的進(jìn)料源。"黃病毒"是包膜病毒的亞型(subset)。它們是通常發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物中，并通過獲得脂質(zhì)雙分子膜包膜來感染人類的病毒。黃病毒的實(shí)例包括黃熱病、登革熱、西尼羅河病毒和腦炎病毒。本文使用的術(shù)語"級(jí)分"指包含一組特定化合物的提取組合物，所述化合物以某種物理的、化學(xué)的性質(zhì)或物理或化學(xué)性質(zhì)為特征。本文使用的術(shù)語"包括"意思是"包括但不限于"。"包括"和"包括但不限于"可互換使用。本文使用的術(shù)語"無包膜病毒"指無脂質(zhì)雙分子膜的病毒。在無包膜病毒中，病毒殼體介導(dǎo)了對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和穿透。無包膜病毒的例子包括諾瓦克病毒、甲型肝炎、骨髄灰質(zhì)炎和鼻病毒。本文使用的術(shù)語"一種或多種化合物"指至少一種化合物，例如但不限于，反亞油酸(接骨木屬物種的脂溶性精油化學(xué)成分)、或花青素-3-糖芬(接骨木屬物種的水溶性多酚)或接骨木屬物種的多糖分子，或超過一種化合物，例如反亞油酸和花青素-3-糖苷。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，術(shù)語"化合物"并不是指單種分子，而是指多種或大量的一種或多種化合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，術(shù)語"化合物"指具有獨(dú)特化學(xué)和物理性質(zhì)的特定化學(xué)成分，其中"化合物"指一種或多種化學(xué)成分。用目標(biāo)方法治療的"病人"、"患者"或"宿主"可為靈長類動(dòng)物(如人)、?？?、綿羊科、馬科、豬科、嚙齒類、貓科或犬科動(dòng)物。術(shù)語"藥學(xué)可接受的鹽"是本領(lǐng)域公知的，指化合物的相對(duì)無毒的、無機(jī)和有機(jī)酸加合鹽，包括例如包含在本發(fā)明組合物中的那些。本文使用的術(shù)語"多酚級(jí)分"包含得自或源于接骨木和相關(guān)物種的水溶性和乙醇可溶性的多酚化合物，包括但不限于諸如蕓香苷和花青素-3-糖苷的化合物。本文使用的術(shù)語"多糖級(jí)分"包含得自或源于接骨木和相關(guān)物種的水溶性-乙醇不溶性植物血凝素蛋白質(zhì)和多糖化合物。接骨木的其他化學(xué)成分也可出現(xiàn)在這些提取物級(jí)分中。本文使用的術(shù)語"花青素苷(proanthocyanins)"指花色素苷的二聚物、三聚物和四聚物。本文使用的術(shù)語"配比(profile)"指提取物級(jí)分或細(xì)分級(jí)分中化合物的質(zhì)量重量百分比的比例，或最終接骨木提取組合物中的三種接骨木級(jí)分化學(xué)成分中每種的質(zhì)量重量百分比的比例。本文使用的術(shù)語"純化的"級(jí)分或提取物指包含濃縮至高于所述級(jí)分或提取物化學(xué)成分的10%質(zhì)量重量的一組特定化合物的級(jí)分或提取物，所迷化合物以某些物理-化學(xué)性質(zhì)或物理的或化學(xué)的性質(zhì)為特征。換句話說，純化的級(jí)分或提取物包含低于80%的不以限定所述級(jí)分或提取物的某些所需物理-化學(xué)性質(zhì)或物理的或化學(xué)的性質(zhì)為特征的化學(xué)成分化合物。術(shù)語"協(xié)同"是本領(lǐng)域所公知的，指兩種或更多種成分一起作用，從而總效果大于各成分效果之和。術(shù)語"治療"是本領(lǐng)域所公知的，指治療和改善任何疾病狀態(tài)或病癥的至少一種癥狀。術(shù)語"病毒，，是本領(lǐng)域所公知的，指自身缺乏代謝機(jī)制并且通過使用宿主細(xì)胞的代謝機(jī)制來繁殖的無細(xì)胞生物體。病毒包含核酸(DNA或RNA)分子，并且可為包膜病毒或無包膜病毒。本發(fā)明包括來源于一種或多種接骨木屬物種的、分離的和純化的精油(或精油細(xì)分級(jí)分)、多酚酸和多糖級(jí)分的組合物。這些獨(dú)立的級(jí)分組合物可以特定的比例(配比)組合，以提供有益的復(fù)合組合物，以及提供在當(dāng)前已知的提取產(chǎn)物中尚未發(fā)現(xiàn)的、可靠的或可再生的提取產(chǎn)物。例如，來自一個(gè)物種的精油級(jí)分或細(xì)分級(jí)分可與來自同一物種或不同物種的精油級(jí)分或細(xì)分級(jí)分組合，或與來自同一物種或不同物種的多酚酸級(jí)分組合，并且該組合可以與或者不與來自同一接骨木屬物種或不同接骨木屬物種的多糖級(jí)分結(jié)合。根據(jù)給定產(chǎn)物所需的有益的一種或多種生物學(xué)作用，提取的接骨木屬物種組合物可包含濃縮的提取物級(jí)分中的任何一種、兩種或所有三種。通常，一般優(yōu)選包含所有三種接骨木屬物種提取級(jí)分的組合物作為這類代表包含在天然植物體中發(fā)現(xiàn)的所有三種主要生物學(xué)有益的化學(xué)成分的第一高純接骨木屬物種提取產(chǎn)物的新型組合物。本發(fā)明的實(shí)施方案包括方法，其中預(yù)定的特征包括在各提取級(jí)分中預(yù)定的選擇性提高的接骨木屬物種精油化學(xué)成分、多酚-花色素和多糖的濃度。特別是，相對(duì)于包括在自然界中發(fā)現(xiàn)的組合物在內(nèi)的公知組合物，本發(fā)明組合物具有提高的花色素苷含量?；ㄉ剀諡榕c眾多健康益處的聯(lián)系日益密切的強(qiáng)力抗氧劑、高活性化學(xué)品，包括保護(hù)身體免于心臟疾病和癌癥。除了其抗氧劑性質(zhì)，椐報(bào)導(dǎo)，花色素苷還可用于治療糖尿病，將胰島素產(chǎn)生量提高至50%。本發(fā)明組合物可包含提高含量的作為唯一活性成分的花色素苷，或者該組合物可包含與接骨木相關(guān)的其他活性成分。其他活性成分的實(shí)例包括在精油級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的C16或C18脂肪酸、醇或酯，或在多糖級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的多糖。在這類應(yīng)用中可使用的聚合物吸附劑的范圍非常廣泛，例如AmberliteXAD4、XAD7HP(Rohm-Hass)、DialonHP20、HP21、SP825(Mitsubishi)、ADS5、ADS17(Naikai大學(xué))。PA處理的操作原理是基于"相似相吸"(被吸附物是保持粘附到吸附劑上還是溶解到洗脫液中取決于相對(duì)強(qiáng)度)。本文提供了使用XAD7HP和ADS5的實(shí)施例。結(jié)果如下表所示表3提取后花色素苷成分的重量％XAD7HP聚合物吸附刑ADS5聚合物吸附劑進(jìn)料F2F3F4F5F6F2F3F4總花色素苷0.062.432.992.921.290.802.20.030扁CY-3,5-GLU0.021.040.830.560.060.070.80CY-3-SAM0.010.370.480.450.220.140.330CY-3-GLU0.041.011.671.911.010,591.060.030細(xì)蕓香苷0.270.232.605.7416.2817.010.4129.1211.2總多盼酸1.5527.8131.0240.4931.8736.8741.834,320.7總花色素苷CY-3，5-GLUCY-3-SAMCY-3-GLU表4花色素苷配比XAD7HP聚合物吸附劑進(jìn)料F2F3F4F5F688.1100.0100.0100.0100.0100.025.843.027.919.24.89.19.015.316.115.516.816.953.241.856.065.378.373.9ADS5聚合物吸附刑F2F3F410010010036.611.51511.148.477.4100蕓香苷對(duì)總花色素苷的比例表5蕓香苷對(duì)總花色素苷的比例XAD7HP聚合物吸附劑ADS5進(jìn)料F2F3F4F5F6F23.80.100.871.9612.521.30.2081聚合物吸附刑F3F48853267表6配比％XAD7HP聚合物吸附劑ADS5聚合物吸附劑FeedF2F3F4F5F6F2F3F4總花色素苷4.68.79,67.24.12,25.30.10.02CY-3，5-G1AJ1.23.82.71.40.20.21.90CY-3-SAM0.41.31.51.10.70.40.80CY-3-GIAJ2.53.65.44.73.21.62.50.10.02蕓香苷17.60.88.414.251.146.2184.954.1化合物的重量百分比告訴我們在處理過程中，化合物被純化(濃縮)的程度花青素-3，5-糖苷被純化到進(jìn)料中的56.2倍(F2XAD7HPPA);花青素-3-接骨木二糖苷被純化到進(jìn)料中的74倍(F3，XAD7HPPA);花青素-3-糖苷被純化到進(jìn)料中的50倍(F4，XAD7HPPA);總花色素苷被純化到進(jìn)料中的46-47倍(F2和F3XAD7HPPA);蕓香苷被純化到進(jìn)料中的107倍(F3，ADS5PA)和總酚酸被純化到進(jìn)料中的13-17倍。花色素苷配比數(shù)據(jù)顯示，在處理過程中可調(diào)整花色素苷的配比花青素-3-糖苷的配比調(diào)整至42%-100%;花青素-3-接骨木二糖苷的配比可調(diào)整至9%-17%;花青素-3，5-糖苷的配比可調(diào)整至4.8%-43%。蕓香苷和花色素苷為接骨木屬物種中重要的藥物化合物。在處理過程中，蕓香苷對(duì)總花色素苷的比例可調(diào)整為0.10-3267。在處理過程中，也可調(diào)整總多酚酸中的花色素苷和蕓香苷濃度的配比花青素-3-糖苷的配比可調(diào)整至0.02-5.4%;花青素-3-接骨木二糖普的配比可調(diào)整至0-1.5%;花青素-3，5-糖苷的配比可調(diào)整至0-3.8%;總花色素苷的配比可調(diào)整至0.02-9.6%;蕓香苷的配比可調(diào)整至0.8-84.9%。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物包含提高含量的花色素苷和如下所述的藥物栽體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物包括另一種接骨木成分，如來自精油級(jí)分的C16和C18飽和及不飽和脂肪酸、醇和酯。干燥接骨木花揮發(fā)成分的文獻(xiàn)數(shù)椐(Toulemonde1983)和目前研究之間的比較如下表所示表7文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較文獻(xiàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)脂肪酸精油異戊烷乙醇T4P1T4P3T4P5T6P3T6P5T8P3T8P5提取物濃縮物十一烷酸30.060.190.352.7800.871.6十二烷酸20.070.310.31.020.870.740.92肉豆蔻酸2.10.410.170.15000.120.290.5十五烷酸0.80.21.20.130.2900.920.4200棕櫚酸37.816.619.420,5715.0411.9111.7922.3622.6421.39十八坑酸0.40.70.76.365.954.633.535.587.514.56油酸5.77.9185.918.826.088.549.1412.718.01亞油酸917.51931.995.2411.335.652.8711.934.89亞麻酸9.124162.732.12001.882.31.31反亞油酸22.118.51.331.522.381.19總脂肪酸69.967.375.371.4117.8117.549.778,822.6210.08本發(fā)明組合物可以包含提高含量的花色素苷和多糖。在水粗提物中，接骨木花中的蛋白質(zhì)收率為0.09%,接骨木果中的蛋白質(zhì)收率為0.59%。通過80%的乙醇可使粗提物中的95%蛋白質(zhì)沉淀。因此，80%的沉淀物為多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這些復(fù)合物的平均分子量為2000KDa。在一實(shí)施方案中，所述組合物包含植物血凝素-多糖級(jí)分組合物，該組合物的基于色度(colormetric)分析法的純度為100-170mg/g右旋糖酐當(dāng)量，基于本發(fā)明教導(dǎo)的Bradford蛋白分析的植物血凝素蛋白純度高于4-50%質(zhì)量重量。本發(fā)明組合物可包含提高含量的花色素苷、C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇和多糖?！?duì)f天,辨^樹^的炎承樹本發(fā)明組合物也可通過與在天然接骨木屬物種中發(fā)現(xiàn)的組合物的相對(duì)濃度來定義。例如，精油的濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.001到IOOOO倍，和/或所需多酚酸的濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.001到40倍的組合物，和/或水溶性-乙醇不溶性多糖的濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.001到40倍的組合物，和/或植物血凝素蛋白濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.001到IOO倍的組合物。本發(fā)明組合物包括精油濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.01到IOOOO倍的組合物，和/或所需多酚酸濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.01到40倍的組合物，和/或多糖濃度為天然接骨木屬物種濃度的0.01到40倍的組合物，和/或植物血凝素蛋白濃度為天然接骨木屬物種植物體濃度的0.01到100倍的組合物。此外，本發(fā)明組合物包括^晴油化學(xué)成分的細(xì)分級(jí)分，該精油化學(xué)成分具有存在于天然植物體精油中的至少一種或多種化合物中，這些化合物的含量高于或低于在天然接骨木植物體精油化學(xué)成分中的含量。例如，所述化合物、反亞油酸在精油細(xì)分級(jí)分中的濃度可從占天然接骨木植物體中總精油化學(xué)成分的2%質(zhì)量重量提高至細(xì)分級(jí)分的22%質(zhì)量重量，濃度增加了10倍。與之相對(duì)地，反亞油酸在精油細(xì)分級(jí)分中的濃度可從占天然接骨木植物體中總精油化學(xué)成分的約2%質(zhì)量重量，降低到低于細(xì)分級(jí)分的0.01%質(zhì)量重量，濃度降低了100倍。本發(fā)明組合物包括以下組合物，在該組合物中這類新型精油細(xì)分級(jí)分中的特定化合物的濃度比天然接骨木精油化學(xué)成分中的濃度提高約l，l到約10倍，或降低約0.1到約100倍。炎歡樹趟^在執(zhí)行前述提取方法的過程中，發(fā)現(xiàn)在精油SCC02提取物級(jí)分中可提取出超過80%質(zhì)量重量收率的原始接骨木屬物種的千燥果或花進(jìn)料中的精油化學(xué)成分，其具有超過95%純度的精油化學(xué)成分(步驟1A)。使用步驟1A和1B中教導(dǎo)的方法，由于精油化學(xué)成分的細(xì)分級(jí)分變?yōu)榫哂行禄瘜W(xué)成分配比的高純精油細(xì)分級(jí)分，因而所述精油的產(chǎn)量可能會(huì)降低。此外，本發(fā)明教導(dǎo)的SCC02提取和分餾方法使得可以改變構(gòu)成精油化學(xué)成分級(jí)分的各化合物的比例(配比)，從而為具體的醫(yī)學(xué)目的構(gòu)造獨(dú)特的精油細(xì)分級(jí)分配比。例如，可以提高醇精油化學(xué)成分的濃度同時(shí)降低脂肪酸化合物的濃度，反之亦然。使用本發(fā)明步驟2所教導(dǎo)的方法，以35.6%的質(zhì)量重量收率從具有4.3%濃度的總酚酸的原始接骨木屬物種進(jìn)料得到的水醇浸取級(jí)分，天然接骨木果進(jìn)料中的酚酸化學(xué)成分的收率為約60%質(zhì)量重量。此外，該水醇溶劑提取物也包含有價(jià)值的花色素化學(xué)成分。法)，可得到純度超過提取物級(jí)分的4oy。干p燥質(zhì)量，曰其中:卞色)超過2.5%質(zhì)量重量的多酚級(jí)分。可能從水醇浸取提取物進(jìn)料中提取多酚酸的約60%。這相當(dāng)于40%收率的天然接骨木屬物種植物體中的多酚酸化學(xué)成分。也可能產(chǎn)生含有高濃度酚酸(>30°/。質(zhì)量重量)，和相對(duì)高濃度的花色素(>2.9%質(zhì)量重量)或相對(duì)低濃度的花色素(<0.05%質(zhì)量重量)的純化的酚酸細(xì)分級(jí)分。使用本發(fā)明步驟4所教導(dǎo)的方法(水浸取和乙醇沉淀法)，可在植物血凝素-多糖級(jí)分中提取和純化超過90%質(zhì)量重量收率的原始千燥接骨木屬物種進(jìn)料材料中的水溶性-乙醇不溶性植物血凝素蛋白質(zhì)和多糖化學(xué)成分。使用80%乙醇來沉淀植物血凝素和多糖，可從水浸取提取物中收集純化的植物血凝素-多糖級(jí)分。植物血凝素-多糖級(jí)分的收率為基于天然接骨木植物體進(jìn)料的約3.45%質(zhì)量重量?；谑褂糜倚轻C作為參考標(biāo)準(zhǔn)的色度分析法，可得到多糖純度為100-170mg/gm右旋糖酐當(dāng)量?；贐radford蛋白質(zhì)分析法，可得到植物血凝素純度為級(jí)分的16%質(zhì)量重量?？奢兜玫淖C據(jù)表明級(jí)分中殘余的化合物為多糖(約83%質(zhì)量重量)。使用60%乙醇沉淀，可使植物血凝素蛋白降至約5%，或者通過在60%乙醇沉淀和多糖提取后，對(duì)殘余溶液進(jìn)行分階賴的80%乙醇沉淀，可使植物血凝素蛋白進(jìn)一步提高到占細(xì)分級(jí)分的約50%質(zhì)量重量。最后，本發(fā)明教導(dǎo)的方法使得所述接骨木屬物種精油化學(xué)成分級(jí)分、新型多酚級(jí)分或細(xì)分級(jí)分，和新型植物血凝素-多糖級(jí)分的純度(濃度)能夠達(dá)到精油級(jí)分中高至99%質(zhì)量重量的所需化學(xué)成分，酚酸級(jí)分中高至41%質(zhì)量重量的酚酸，多酚級(jí)分中高至3%的花色素，植物血凝素-多糖級(jí)分中高至50%質(zhì)量重量的植物血凝素，和植物血凝素-多糖級(jí)分中高至90%質(zhì)量重量的多糖。所使用的具體提取環(huán)境、提取速率、需的純度水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員只需采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可很容易地確定本發(fā)明所教導(dǎo)的具體方法，這類實(shí)驗(yàn)通常用于調(diào)整方法，以適應(yīng)待加工成具有特定屬性的輸出材料的原材料屬性的樣品偏差。例如，在大量具體的接骨木屬物種植物體中，使用本發(fā)明教導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員今知的方法，可以確定精油化學(xué)成分、多酚酸、花色素、植物血凝素和多糖的初始濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定，為到達(dá)最終接骨木屬物種組合物產(chǎn)物中所需的濃度和/或化學(xué)配比，從精油化學(xué)成分的初始濃度到例如采用本文所述提取方法的最終提取產(chǎn)物的精油化學(xué)成分預(yù)定量或分布(配比)的變化量。勿為、彭、本發(fā)明的又一實(shí)施方案為包含所述精油化學(xué)成分的新型細(xì)分級(jí)分的組合物，其中諸如但不限于醇、醛、酯或脂肪酸的特定化學(xué)基團(tuán)各自在該新型提取組合物產(chǎn)物中的濃度升高或者降低。本發(fā)明的又一實(shí)施方案為包含所述純化多酚化學(xué)成分的新型細(xì)分級(jí)分的組合物，其中諸如但不限于花色素的特定化學(xué)基團(tuán)各自在新型提取組合物中濃度升高或降低。本發(fā)明的另一實(shí)施方案為包含所述純化植物血凝素-多糖化學(xué)成分的新型細(xì)分級(jí)分的組合物，其中諸如但不限于植物血凝素的特定化學(xué)基團(tuán)各自在新型提取組合物中的濃度升高或降低。炎承才法本發(fā)明方法提供了治療和預(yù)防人類疾病的新型接骨木組合物。例如，與在接骨木屬天然植物體或通常公知的提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的相比，治療流感的新型接骨木屬物種組合物可具有提高的多酚級(jí)分組合物濃度(重量％)、提高的多糖組合物濃度(重量％),和降低的精油級(jí)分組合物濃度(重量％)。與在天然接骨木屬物種植物體或通常公知的提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的相比，用于抗氧劑、抗血管損傷，和缺血性腦血管疾病的新型接骨木屬物種組合物可具有提高的精油和多朌級(jí)分組合物(重量％)和降低的多糖級(jí)分組合物(重量％)。與在天然接骨木屬物種植物體或通常公知的提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的相比，用于治療糖尿病的新型接骨木屬物種組合物的另一實(shí)例包含提高的多酚級(jí)分組合物濃度、降低的多糖組合物，和降低的精油級(jí)分組合物。其它實(shí)施方案包括接骨木屬物種化學(xué)成分的配比(比例分布)相對(duì)于在天然植物體或現(xiàn)有接骨木屬物種提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的配比發(fā)生變化的組合物。例如，相對(duì)于多酚酸和/或多糖濃度，所述精油級(jí)分增多或減少。類似地，相對(duì)于其他提取物成分級(jí)分，所述多酚酸或多糖可增多或減少，使得存在用于特定生物作用的新型成分化學(xué)配比組合物。通過結(jié)合精油、多酚和/或多糖中的一種或多種的分離和純化的級(jí)分，可以制造新型組合物。所教導(dǎo)的下列方法可單獨(dú)使用，或與公開的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法結(jié)合使用。用于提取的原料是來自一種或多種接骨木屬物種的植物體。該植物體可為所述植物的任何部位，然而果和花為最優(yōu)選的原料。本發(fā)明預(yù)期，所述接骨木屬物種植物體可經(jīng)過提取前步驟，使所述材料成為任何特定形式，和任何有利于提取的形式。這類提取前步驟包括但不限于，剁碎、切碎、撕碎、碾磨、研磨、切割，或扯裂所述材料的步驟，并且在提取前步驟之前，所述原料為干燥的或新鮮的植物體。優(yōu)選的提取前步驟包括將所迷接骨木屬物種植物體碾磨和/或研磨成細(xì)粉。在提取前步驟后，將所述原料或材料干燥或向其中加入水分。一旦所述接骨木屬物種植物體成為用于提取的形式，提取方法為本發(fā)明所預(yù)期的。接骨木的超臨界流體萃取本發(fā)明的提取方法包括本文公開的方法。通常，本發(fā)明的方法包括如下方法作為一部分，該方法中用二氧化碳作為溶劑(SCC02)使用超臨界液體萃取(SFE)對(duì)接骨木屬物種植物體進(jìn)行提取，隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)溶劑提取步驟，例如但不限于水、水醇、和親合聚合物吸收劑提取過程。本發(fā)明預(yù)期的其他方法包括使用其他有機(jī)溶劑、制冷化學(xué)品、可壓縮氣體、超聲、加壓液體萃取、高速逆流色譜、分子印記聚合物，及其他公知的提取法對(duì)接骨木植物體進(jìn)行提取。這類技術(shù)被本領(lǐng)域技術(shù)人所公知。一方面，通過包括圖1-4所示步驟的方法可制備本發(fā)明的組合物。本發(fā)明包括使用SCC02技術(shù)，濃縮(純化)和配比來自接骨木植物體的精油和其他脂溶性化合物的方法。本發(fā)明包括將接骨木的脂溶性化學(xué)成分分級(jí)成，例如，高純度的精油級(jí)分(高精油化學(xué)成分濃度)。此外，本發(fā)明包括SCC02方法，其中提取物級(jí)分中的各化學(xué)成分可具有不同的化學(xué)成分比例或配比。例如，SCC02分級(jí)分離精油級(jí)分中的而可產(chǎn)生某些化合物濃度高于其他化合物濃度的精油物提取細(xì)分級(jí)分。如本發(fā)明所教導(dǎo)的，用SCC02對(duì)所述接骨木屬物種的精油化學(xué)成分進(jìn)行提取不使用有毒有機(jī)溶劑，并且同時(shí)提供了提取物的分餾。二氧化碳是天然的和安全的生物產(chǎn)物和許多食物和飲料中的成分。圖l-4顯示了接骨木生物活性化學(xué)成分的提取方法的示意圖。該提取方法通常是，但不限于5個(gè)步驟。在實(shí)施例部分描述了提取方法中使用的分析方法。歩驟l:接骨木精油的超臨界流體二氧化碳萃取由于精油的疏水性，該提取方法可使用非極性溶液，包括但不限于SCC02、己烷、石油醚和乙酸乙酯。由于精油的一些成分具揮發(fā)性，蒸汽蒸餾也可用作提取方法。圖l描述了使用scco2提取接骨木屬物種根莖的精油化學(xué)成分。進(jìn)料IO為干燥的碾磨的接骨木果或花(約140目)。提取溶劑210為純二氧化碳。乙醇可用作共溶劑。所述進(jìn)料裝入SFE提取容器20中。在吹掃(purge)和滲漏測試之后，所述方法包括〗吏液化的C02從貯存容器通過冷卻器流向C02泵。將該C02壓縮至所需的壓力，并流過提取容器中的進(jìn)料，其中壓力和溫度維持在所需水平。提取的壓力范圍從約60巴到800巴，溫度范圍從約35'C到約90。C。本文所教導(dǎo)的SCC02提取優(yōu)選在至少100巴的壓力和至少35。C的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選在約60巴到500巴的壓力和約40°C到約80。C的溫度下進(jìn)行。單階段提取的提取時(shí)間從約30分鐘到約2.5小時(shí)，到約1小時(shí)。溶劑對(duì)進(jìn)料的比例通常對(duì)每一SCC02提取為約60比1。循環(huán)使用所述C02。然后用采集器或分離器收集所提取的、純化的和配比的精油化學(xué)成分30,在避光玻璃瓶中保持，并貯存在4'C無光的冰箱內(nèi)。接骨木進(jìn)料10材料可用一步法(圖l)提取，其中所得提取和純化的接骨木精油級(jí)分30收集在單個(gè)采集器SFE或SCC02系統(tǒng)20中，或者用多步法提取(圖1，步驟1B)，其中所提取的純化和配比的接骨木精油細(xì)分級(jí)分50、60、70、80分別依次收集在單個(gè)采集器SFE系統(tǒng)20中?？蛇x擇地，在分級(jí)SFE系統(tǒng)中，所述SCC02提取的接骨木進(jìn)料材料被隔離到多個(gè)采集容器(分離器)中，從而在每個(gè)采集器內(nèi)，每種收集的純化精油細(xì)分級(jí)分具有不同相對(duì)百分比的精油化學(xué)成分組成(配比)。收集、保存所述殘余物(剩余物)40，并用來進(jìn)一步處理以得到接骨木屬物種多酚酸和多糖的純化級(jí)分。本發(fā)明的一實(shí)施方案包括在60巴到500巴的壓力和35。C到9(TC的溫度下使用多步SCC02提取法來提取接骨木屬物種進(jìn)料材料，并在每步之后收集所提取的接骨木材料。本發(fā)明的第二實(shí)施方案包括在60巴到500巴的壓力和35。C到90。C的溫度下使用分級(jí)SCC02提取法提取所述接骨木屬物種進(jìn)料材料，并以預(yù)定條件(壓力、溫度和密度)和預(yù)定間隔(時(shí)間)下，在不同的采集容器中收集所提取的接骨木材料。來自每一多步提取器或收集在不同采集容器(分餾系統(tǒng))中的所得提取的接骨木純化精油細(xì)分級(jí)分組合物可單獨(dú)回收和使用，或者組合以形成一種或多種接骨木精油組合物，該組合物包含高于或低于在天然植物體或常規(guī)接骨木提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的濃度的預(yù)定精油化學(xué)成分濃度。通常，使用單步最大SCC02提取法從接骨木屬物種果得到的精油級(jí)分總收率為約9重量％(>95%的精油化學(xué)成分)，精油化學(xué)成分純度高于所述提取物的95%質(zhì)量重量。與此相對(duì)照，使用單步最大SCC02提取法從接骨木屬物種花得到的精油級(jí)分總收率為約1.5重量％(>95%的精油化學(xué)成分)，精油化學(xué)成分純度高于所述提取物的95%質(zhì)量重量。這些數(shù)椐證明了所述接骨木果與接骨木花相比包含約6倍濃度的精油化合物。作為本發(fā)明的實(shí)施例，使用接骨木果作為天然接骨木屬物種進(jìn)料材料。在實(shí)施例1中可發(fā)現(xiàn)這種提取方法的實(shí)例。在該實(shí)驗(yàn)實(shí)例中，使用接骨木果作為進(jìn)料，設(shè)定所述提取條件，其中溫度范圍為40-8(TC，壓力范圍為80-500巴。所述C02流率為10gm/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8和9所示。表8.溫度、壓力和時(shí)間對(duì)使用接骨木果作為進(jìn)料的SCC02精油提取率的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表9.在不同SFE條件下(溫度-T和以巴表示的壓力)提取的接骨木果SCC02精油提取級(jí)分的GC-MS化學(xué)組成保留時(shí)間T=40°C_T=60°C_T=80°C峰(Ret.Time)編號(hào)10030050010030050010030050017.10.020.171.0327.20.070.543.052.442.321.060.6838.40.080.452.221.810.810.64412.10.030.10.0717.50.090,190.20.914.173.060.241.590.3617.70.060.120.131.711.31.410.523.47180.310.230.360.240.320.16819.00.070.130.331.891.481.160.620.41919.70.020.080.10.80.50.340.631020.10,20.590.271.075.234.462.942.012.021120.60.030.130.120.880.60.30.71231.70.060.190.352.780.871.61334.40.020.210.421435.80.020.240.130.881.070.61.121536.20.020.110.291638.80.040.080.110.020.390.270.31742.20.020.060.181.020.870.520.921844.10.050.250.30.420.221944.80.20.190.450.5310.317.462.512.192045.10.020.080.310.030.910.670.530.370.642147.40.160.090.120.532248.40.030.050.160.350.420.360.350.432349.20.010.060.160.290.52449.70.020.090.390.231.20.060.641.062549,80.060.070.451.010.490.312649.90.130.290.20.920.420.012750.10.110.120.660.30.250.270.290.,222850.60.032950.70.070.150.220.420.3418.63051.23.578.215.14.644.157.9799.556.,513151.80.260.096.850.280.420.170.270,,383252.50.120.151.380.210.50.23353.00,263.220.0816.13454.175.56.1312.530.263.5210.57.423.■383554.80.70.640.080.180.340.771.690.890.,6236550.130.10.730.50.170.083756.30.040.110.070.241.31.150.140.681.,1316.33857.25.658.826.089.955.329.14812.718.,013957.50.881.220.830.80.521.082.241.30.,864057.80.050.3710.14158.33.395.673.356.673.535.5827.214.■564258.80.250.221.060.240.230.260,,334359.11.980.4912.970.50.540.580,,554459.70.330.470.160.820.580.540.91.080,.754560.71.442.612.81.460.921.734.982.,3529.14661.632.9411.3328.454.622.873.1811.934.,8922.1476218.51.81.331.522.342.381,,194862.32,862.30.911.030.364962.72.732.121.81.882.582.31.,315062.92.850.145163.40.150.440.2410.85263.80.130.690.62.677.0410.10.754.7885364.30.090.141.280,360.35464.70.2223.85567.168.831.380.770.20.91.115668.70.10.40.30.390.385769.40.110.375869.80.090.245970.10.090.020.610.910.180.750.916070.92.470.2711.311.490.320.290.276171.93.986273.10.10.220.50.166374.70.361.961.77.9315.3822.312.259.9623.164750.170.371.60.460.440.280.60.276575.20.320.6710.56676.424.250.451.141.680.230.81.36776.80.360.480.311.040.640.570.770.8671.417.818.310.0脂肪酸170.5117.017.5455.769.778.8222.628C16+C185817.4655.589.437.9116.121.739.4636.05.1416.418.326.612.2113.6925.1133.397.1550.617.76625.7醇6316.4224.2719.1327.43736.074碳?xì)?6.1化合物5.66646,140.485.834.212.043.855.32醛0.671.480.693.517.8412.159.135.148.2總計(jì)99.398.992.3197.777.6885.9887.385.4485.4<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表10.通過GC-MS識(shí)別的接骨木果精油化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>這些結(jié)果驗(yàn)證了壓力對(duì)提取動(dòng)力學(xué)的作用。較高的提取壓力導(dǎo)致系統(tǒng)以較短的時(shí)間到達(dá)平衡，消耗較少量的co2。由于密度隨著壓力升高而增加，總提取率隨著提取壓力的升高而增加。有趣的是，在較低的壓力下如100-300巴，溫度越低，由于密度更高收率同樣越高。在較高的壓力下，如300-500巴，溫度對(duì)提取收率的作用小得多。雖然在超過300巴的壓力下，可達(dá)到較高的提取收率和較大的提取效率，但是在低于300巴的壓力和約40-60。C的溫度下，精油化學(xué)成分的純度可達(dá)到95%。在研究的試驗(yàn)范圍中，清楚地顯示了在溫度和密度之間存在竟?fàn)幮?yīng)。這方面在文獻(xiàn)中有充分的定義和記栽，其中由于超臨界和近臨界流體的溶解能力提高，在恒定的溫度下，壓力增加導(dǎo)致收率增加。溫度的增加促使有助于提取的化合物蒸汽壓的增加。此外，隨著溫度提高到較高值，擴(kuò)散系數(shù)的增加和溶劑粘度的降低也有助從草本多孔基質(zhì)中提取化合物。另一方面，在恒定的系統(tǒng)壓力下，溫度的增加導(dǎo)致溶劑密度的降低。根椐每種化合物的質(zhì)譜，使用GC-MS分析法可從接骨木果精油中分離和識(shí)別出67種化合物(表9和10)。所述化合物在7碳化合物(C7)到23碳化合物(C23)范圍中變化，包括保留時(shí)間為7-50分鐘的9種醛類(C7-C15)，主要為不飽和C7和C10醛(表5中的化合物弁1、2、6和8);111種醇類(C13-C20);12種酯類(C13-C22);7種脂肪酸(C14-C22);和其他芳香族和脂族化合物。基于已知的生物活性，最重要的化合物為C16和C18的飽和和不飽和脂肪酸、醇及其酯。例如，十六醇(#30)、十六酸(#34)、十六酸曱酯(#32)、十六酸乙酯(#35)，和十六酸丁酯(#52)都屬于C16化合物。飽和的十八烷酸及其酯(十八烷酸乙酯(#53)和十八烷酸丁酯)、單不飽和脂肪酸9-十八碳烯-1-醇異構(gòu)體(#38，39)、多不飽和脂肪酸9，12-十八碳二烯酸異構(gòu)體(#46,48)屬于C18化合物。C16和C18脂肪酸的常用名是棕櫚酸和硬脂酸在表9中，突出顯示的化合物為在精油級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的較高濃度的化合物。應(yīng)當(dāng)說明的是所述化合物的比例隨不同的scco2提取條件而變化。例如，在諸如100巴的低壓下，C16和C18脂肪酸處于較高濃度，然而總提取率較低。與此相對(duì)照，在高提取溫度下發(fā)現(xiàn)C16和C18脂肪酸酯的濃度更高。有趣地是，所述提取的角鯊烯在40。C和300巴的精油級(jí)分中具有約23%的高濃度，而在40。C和500巴的級(jí)分中具有約8%的低濃度。已經(jīng)對(duì)角鯊烯作為某些人類癌癥的輔助治療進(jìn)行研究。在動(dòng)物模型中，已證明其可有效地抑制肺癌。在動(dòng)物模型中，還顯示了其對(duì)結(jié)腸癌具有化學(xué)預(yù)防作用。在動(dòng)物模型中，顯示補(bǔ)充角鯊烯可提高免疫功能和降低膽固醇水平?？傊承┙庸悄緦傥锓N精油化學(xué)成分的濃度可隨著所用SFE條件的不同而變化。通過使用如步驟1B、圖1所示的循序多步SCC02分餾方法或多采集器分餾系統(tǒng)，這類不同的SFE提取特性可用來進(jìn)一步提高或降低純化精油細(xì)分級(jí)分中某些化合物的濃度。歩驟2提取粗酚酸級(jí)分的水醇浸取法一方面，本發(fā)明包含生物活性酚酸化學(xué)成分的提取物和濃縮物，同時(shí)保留了用于單獨(dú)提取和純化(步驟4)的殘余物中的植物血凝素和多糖。圖2圖解了本步驟的概括性描述。步驟2的提取方法為溶劑浸取法。本提取的進(jìn)料為接骨木屬物種的碾磨干植物體IO或步驟1的精油化學(xué)成分SCC02提取的殘余物40。提取溶劑220為含水乙醇。提取溶劑可為10-95%的含水乙醇，80%的含水乙醇是優(yōu)選的。在此方法中，將所述接骨木進(jìn)料材料和所述提取溶劑裝入加熱和攪拌的提取容器100,150中?？蓪⑵浼訜嶂?00。C、約90。C、約8(TC約70。C、或約60-90°C該提取進(jìn)行約1-10小時(shí)、約1-5小時(shí)、約2小時(shí)。將所得的流體-提取物過濾110和離心120。收集濾液(上清)310、320、330作為產(chǎn)物，在蒸發(fā)所述溶劑后，測量體積和干重固體含量。保留和儲(chǔ)存所迷提取殘余材料160用于進(jìn)一步的處理(參看步驟4)。如果必要或需要，重復(fù)該提取數(shù)次?？芍貜?fù)l次或多次，2次或更多次，3次或更多次，等等。例如，圖2顯示了三步法，其中第二步和第三步使用相同的方法和條件。實(shí)施例2中展示了該提取步驟的實(shí)例。結(jié)果如圖11所示。表u接骨木果浸提粗酚酸收率和純度<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>總粗酚酸提取收率約為原始天然接骨木果進(jìn)料的35%質(zhì)量重量，總酚酸提取收率為1.6%且酚酸純度為所述級(jí)分的4.3%質(zhì)量重量。所述粗酚酸級(jí)分中的花色素提取收率為原始接骨木果進(jìn)料的0.06%質(zhì)量重量，純度(濃度)為所迷級(jí)分的0.18質(zhì)量重量。主要的酚酸為蕓香苷，且主要的花色素為花青素-3、糖苷。這些數(shù)據(jù)都與文獻(xiàn)中的一致。該粗酚酸組合物可用作最終產(chǎn)物，或作為進(jìn)一步處理的進(jìn)料以純化所需的酚酸化學(xué)成分(步驟3)。歩驟3.親和吸附劑提取法如本文所教導(dǎo)的，可通過將接骨木進(jìn)料的水醇提取物與固體親和聚合物吸附劑樹脂接觸，以將所述水醇提取物中所含的活性酚酸吸附到親和吸附劑上，來獲得純化的接骨木和相關(guān)物種的酚酸級(jí)分提取物。隨后通過本文所教導(dǎo)的方法洗脫所述結(jié)合的化學(xué)成分。在洗脫所述酚酸級(jí)分化學(xué)成分之前，可用任何便利的方式，將帶有吸附的所需化學(xué)成分的親和吸附劑與提取物殘余物分離，優(yōu)選通過使水性提取物流過提取柱或吸附劑材料床層，來實(shí)現(xiàn)與吸附劑接觸的過程和所述分離。各種親和吸附劑均可用來純化接骨木屬物種的酚酸化學(xué)成分，例如但不限于"AmberliteXAD-2"(Rohm&Hass)、"DuoliteS曙30"(DiamondAlkaiCo.)、"SP207"(MitsubishiChemical)、ADS-5(南開大學(xué)，中國天津)、ADS-17(南開大學(xué)，中國天津)、DialonHP20(Mitsubishi,日本)，和AmberliteXAD7HP(Rohm&Hass)。由于對(duì)接骨木和相關(guān)物種的酚酸化學(xué)成分的高親和性，優(yōu)選使用AmaberliteXAD7HP。雖然可使用各種洗脫液從所述吸附劑中回收所述酚酸化學(xué)成分，一方面，該洗脫液包含低分子量醇，包括但不限于曱醇、乙醇或丙醇。第二方面，所述洗脫液包含在含水混合物中的低分子醇。另一方面，所述洗脫液包含低分子量醇、第二有機(jī)溶劑，和水。優(yōu)選地，所述接骨木屬物種進(jìn)料經(jīng)歷了一個(gè)或多個(gè)預(yù)純化過程，例如但不限于，步驟1和2中描述的、在將包含提取物的含水酚酸化學(xué)成分與所述親和吸附劑材料接觸之前的過程。使用如本發(fā)明所教導(dǎo)的親和吸附劑，得到高純的接骨木屬物種酚酸化學(xué)成分，其明顯不含通常存在于天然植物體或市售提取產(chǎn)物中的其他化學(xué)成分。例如，本發(fā)明所教導(dǎo)的方法可得到純化的酚酸提取物，其包含超過40%干質(zhì)量重量的總酚酸化學(xué)成分和超過2%干質(zhì)量重量的總花色素。圖3圖解顯示了使用聚合物親和吸附劑樹脂珠從接骨木屬物種葉中提取和純化酚酸的概括性描述。本提取方法的進(jìn)料可為包含來自步驟2的水浸提310+/-320+/-330的酚酸的乙醇水溶液。在裝入柱410、420之前和之后，用4-5BV乙醇230和4-5BV蒸餾水240洗滌適當(dāng)重量的吸附劑樹脂珠(每mg吸附樹脂5mg酚酸)。隨后將包含酚酸的水溶液310+320以3-5床體積(BV)/小時(shí)的流率加載到柱430上。一旦該柱裝滿，用蒸餾水250以2-3BV/小時(shí)的流率洗滌450該柱，以除去所吸附酚酸中的任何雜質(zhì)。收集流出的物殘余物440和洗滌殘余物460，測量其質(zhì)量含量、酚酸含量，并丟棄。用40或80%乙醇/水作為洗脫溶液260，以3-4BV/小時(shí)的流率，以等度(isocratic)方式，實(shí)現(xiàn)吸附酚酸470的洗脫，并記錄洗脫提取物(多種提取物)480的洗脫曲線?？梢约s每25分鐘收集洗脫體積480,并且使用HPLC分析這些樣品，并測量其固體含量和純度。在實(shí)施例3中可發(fā)現(xiàn)本提取方法的實(shí)例。結(jié)果如表12和13所示。表12.從XAD7HP柱中洗脫的不同級(jí)分的質(zhì)量平衡和HPLC分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表13.從ADS5柱中洗脫的不同級(jí)分的質(zhì)量平衡和HPLC分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>如本文所教導(dǎo)的，所述親和吸附劑XAD7HP和ADS5可進(jìn)一步純化(濃縮)接骨木屬物種植物體的黃酮類(flavanoid)和花色素酚酸?？偡铀?、總花色素和蕓香苷的純度超過各自洗脫細(xì)分級(jí)分的40%、2.8%、29%質(zhì)量重量。這說明與在接骨木屬天然植物體中發(fā)現(xiàn)的或公知的相比濃度提高了超過10倍，或與在現(xiàn)有接骨木提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的相比濃度提高了超過5倍。在洗脫液中，回收了所裝載溶液中超過60%質(zhì)量重量收率的酚酸化學(xué)成分?；谠冀庸悄具M(jìn)料，總酚酸收率為原始進(jìn)料材料的約4.2%質(zhì)量重量。事實(shí)上，在流出物或洗滌溶液中幾乎檢測不到蕓香苷或花色素。有趣的是，ADS5具有非常獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，即通過使用不同濃度的乙醇溶液可在不同細(xì)分級(jí)分中將蕓香苷與花色素分離。例如，所述ADS540。/。乙醇洗脫級(jí)分(F2)將花色素濃縮了超過10倍，而組合的細(xì)分級(jí)分(F3+F4)將蕓香苷濃縮了超過25倍，而花色素濃度極少或沒有。因此，步驟3的親和吸附劑法可產(chǎn)生具有新化學(xué)成分配比的新型的純化酚酸細(xì)分級(jí)分。歩驟4.植物血凝素-多糖級(jí)分提取法科技文獻(xiàn)中將接物骨木屬物種化學(xué)成分的植物血凝素-多糖提取物級(jí)分定義為"水溶性、乙醇不溶性的提取物級(jí)分"。圖4圖解了使用水溶劑浸取和乙醇沉淀法從接骨木屬物種提取物中提取多糖級(jí)分的概括性描述。進(jìn)料160為來自步驟2的水醇浸提法的固體殘余物。用兩步浸提該進(jìn)料。所述溶劑為蒸餾水270。用此方法，將所述接骨木屬物種殘余物160和提取溶劑270裝入提取容器500、520中，并加熱和攪拌?？蓪⑵浼訜嶂?00。C、到約80。C、或到約70-90。C。該提取進(jìn)行約1-5小時(shí)、約2-4小時(shí)、或約2小時(shí)。將所述兩步提取溶液600+610結(jié)合，將漿液過濾540、離心550、并蒸發(fā)560以除去水分，直到溶液620中的化學(xué)成分濃度提高約8倍。然后使用無水乙醇280來重組原始體積的溶液，使乙醇的最終濃度到達(dá)60-80%。觀察到大量的沉淀物570。將溶液離心580、倒出590，并丟棄上清殘余物730。沉淀產(chǎn)物640為純化的植物血凝素-多糖級(jí)分，可使用以分子量5,000-410,000的右旋糖酐作為參考標(biāo)準(zhǔn)物的色度法來分析其多糖，并使用Bradford蛋白分析法來分析其蛋白質(zhì)。所提取的多糖級(jí)分的純度為約100-170mg/g右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量，總收率為原始的天然接骨木植物體進(jìn)料的2.4-3.5%質(zhì)量重量。所提取的植物血凝素蛋白質(zhì)的純度為植物血凝素-多糖級(jí)分的約16%質(zhì)量重量，總收率為原始的天然接骨木植物體進(jìn)料的0.56%質(zhì)量重量。實(shí)施例4給出了本方法的實(shí)例。結(jié)果如表14和15所示。此外，使用AccuTOF-DART質(zhì)譜(參看實(shí)施例部分)來進(jìn)一步配比構(gòu)成所述純化多糖級(jí)分的化合物的分子量。表14.接骨木果植物血凝素-多糖級(jí)分的多糖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>60%乙醇沉淀和80%乙醇沉淀的總接骨木植物血凝素-多糖收率分別為原始的天然接骨木果進(jìn)料材料的2,43%和3.45%質(zhì)量重量。基于接骨木屬物種植物體和其他植物性藥材的多次試驗(yàn)及科技文獻(xiàn)，植物血凝素-多糖級(jí)分的3.5。/。收率與原料接骨木屬物種植物體中的水溶性-乙醇不溶性多糖和植物血凝素蛋白質(zhì)的濃度非常相近。所述多糖的純度為100-170mg/gm右旋糖肝當(dāng)量。雖然多糖級(jí)分的右旋糖酐當(dāng)量似乎與在源于其他植物性藥材的純化多糖級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的相比稍微低些，但是還不知道接骨木屬物種植物體中多糖的分子量。因此，接骨木屬物種純化多糖級(jí)分中的多糖化學(xué)成分的純度可能比使用右旋糖酐當(dāng)量色度分析所估計(jì)的高得多。60%乙醇沉淀和80%乙醇沉淀的接骨木植物血凝素-多糖級(jí)分的植物血凝素蛋白質(zhì)的純度分別為該級(jí)分的4,8%和16.2%質(zhì)量重量。80%乙醇沉淀的總植物血凝素蛋白質(zhì)收率為原始天然接骨木進(jìn)料的0.56%質(zhì)量重量，和粗水浸提提取物的約95%質(zhì)量重量。60%乙醇沉淀的總植物血凝素收率僅為粗水浸提提取物的約20%質(zhì)量重量。60%乙醇沉淀得到較高的多糖化學(xué)成分純度和較低的植物血凝素蛋白質(zhì)純度。因此，使用所述兩步乙醇沉淀，可實(shí)現(xiàn)以下結(jié)果使用60%乙醇得到具有高多糖濃度、低植物血凝素蛋白質(zhì)濃度配比(~0/1)的細(xì)分級(jí)分，隨后使用使用80%乙醇進(jìn)行第二步沉淀，以產(chǎn)生低多糖/高植物血凝素蛋白質(zhì)濃度配比(2/l)的細(xì)分級(jí)分。從溶液中除去醇的許多方法是本領(lǐng)域所公知的。如果需要保持該醇來循環(huán)使用，提取后可通過常壓或減壓蒸餾來從所述溶液中去除該醇。該醇可再利用。此外，還有許多本領(lǐng)域公知的從溶液(或者水溶液或者除醇的溶液)中除去水的方法。這類方法包括，但不限于將水溶液噴霧干燥到適合的栽體上，例如但不限于碳酸鎂或麥芽糖糊精，或者可選擇地可通過凍干或反射窗(refractivewindow)千燥將所迷液體干燥。作為本發(fā)明的食物形式，可將其配制成任何可選形式，例如，微粒態(tài)、顆粒態(tài)、漿糊態(tài)、凝膠態(tài)、固態(tài)，或液態(tài)。在這些形式中，可任意包含允許加入食物中的本領(lǐng)域技術(shù)人員通常公知的各種類型的物質(zhì)，例如粘合劑、崩解劑、增稠劑、分散劑、再吸收促進(jìn)劑、調(diào)味劑、緩沖劑、表面活性劑、溶解助劑、防腐劑、乳化劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或pH控制劑等等。加入到食物中的接骨木果提取物的量沒有特別限制，例如，作為體重約60kg的成人攝入量，其可為每天約10mg到5g，優(yōu)選50mg到2g。特別當(dāng)其作為保健食物、功能性食物等使用時(shí)，其優(yōu)選包含能充分顯示本發(fā)明預(yù)定作用的量的本發(fā)明有效成分。本發(fā)明的藥劑可任意地根據(jù)通常公知的方法制備成固體藥劑，例如諸如藥片、微粒、粉末、膠囊等等，或諸如注射劑等的液體藥劑。在這些藥劑中可配制任何通常使用的材料，例如粘合劑、崩解劑、增稠劑、分散劑、再吸收促進(jìn)劑、調(diào)味劑、緩沖劑、表面活性劑、溶解助劑、防腐劑、乳化劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或pH控制劑。所述藥劑中有效成分(接骨木果提取物)的給藥量可根據(jù)種類、藥劑形式、患者的年齡、體重或待應(yīng)用的癥狀等等而變化，例如，當(dāng)口服給藥，體重約60kg的成人每天給藥一次或幾次，給藥劑量約為每天10mg到5g，優(yōu)選約50mg到2g。所述有效成分可為所述接骨木提取物的一種或幾種成分。餘這,系鍵有利于輸送本發(fā)明組合物的向患者給藥的方式包括本領(lǐng)域技術(shù)人員通常公知的給藥方式，例如粉末、噴霧、軟骨、漿糊、乳青、洗液、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。在一實(shí)施方案中，該給藥方式為吸入劑，其可包括諸如微脂體(liposomal)制劑的延時(shí)釋放或控釋吸入劑形式。這類輸送系統(tǒng)可用于治療患者的SARS、禽流感等等。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑可用于適合鼻內(nèi)給藥的任何劑量分配裝置。對(duì)于鼻制劑，該裝置構(gòu)建時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到確保最優(yōu)的計(jì)量準(zhǔn)確性和與其構(gòu)成元件的兼容性，所述元件例如容器、閥和致動(dòng)器，并且可以基于機(jī)械泵系統(tǒng)，例如計(jì)量劑量噴霧器、干粉吸入器、軟霧吸入器，或噴霧器的機(jī)械泵系統(tǒng)。由于大的給藥劑量，優(yōu)選裝置包括噴射噴霧器(例如，PARILCStar,AKITA)、軟霧吸入器(例如，PARIe-Flow)和基于膠嚢的干粉吸入器(例如，PH&TTurbospin)。適合的推進(jìn)劑可從諸如碳氟化合物、碳?xì)寤衔?、氮?dú)夂脱趸瘉喌蚱浠旌衔锏臍怏w中逸出。所述吸入輸送裝置可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的噴霧器或定量吸入器(MDI),或任何其它適當(dāng)?shù)奈胼斔脱b置。該裝置可包括和用于輸送單劑量的制刑，或該裝置可包括和用于輸送多劑量的本發(fā)明組合物。噴霧器型的吸入輸送裝置可包含溶液(通常為水溶液)或懸浮液形式的本發(fā)明組合物。在產(chǎn)生吸入組合物的霧狀噴霧時(shí)，可通過超聲、壓縮空氣、其他氣體，電動(dòng)或機(jī)械方式來驅(qū)動(dòng)該噴霧型輸送裝置。超聲噴霧裝置通常借助電氣化學(xué)振蕩表面向制劑液膜上施加迅速振蕩的波形。在給定振幅，該波形變得不穩(wěn)定，從而其分解該液膜并且產(chǎn)生小滴制劑?？諝饣蚱渌麣怏w驅(qū)動(dòng)的噴霧裝置以如下方式為基礎(chǔ)進(jìn)行工作，高壓氣流產(chǎn)生局部壓降，該壓降經(jīng)由毛細(xì)管作用將液態(tài)制劑汲取入氣流中。然后通過剪切力分解該細(xì)液流。所述噴霧器可設(shè)計(jì)為便攜式和手提式，并且可配備配套的電子零件。該噴霧裝置可包含具有兩個(gè)預(yù)定孔尺寸的并存(coincident)出口通道的噴嘴，液體制劑通過這些通道時(shí)可被加速。這導(dǎo)致兩股物流的撞擊和制劑的霧化。所述噴霧:;于吸人的制劑;霧劑:在單劑量噴霧器的設(shè)計(jì)中，可采用包含單劑量制劑的泡罩包裝(blisterpacks)。在本發(fā)明中，采用噴霧器可確保顆粒的尺寸對(duì)于所述顆粒在例如肺膜內(nèi)的定位是最佳的。定量吸入器(MDI)可用作本發(fā)明組合物的吸入輸送裝置。對(duì)該裝置進(jìn)行加壓(pMDI)，并且它的基本結(jié)構(gòu)包含計(jì)量閥、致動(dòng)器和容器。使用推進(jìn)劑來從該裝置中釋放制刑。所述組合物可由懸浮在加壓的一種或多種推進(jìn)劑液體中的預(yù)定尺寸的顆粒構(gòu)成，或所述組合物可在加壓的一種或多種液體推進(jìn)劑的溶液或懸浮液中。所用的推進(jìn)劑主要是大氣友好的氬氟碳類(HFC),例如134a和227。僅當(dāng)必要時(shí)，才使用常規(guī)的氯氟碳，如CFC-ll、12和U4。吸入系統(tǒng)的裝置可經(jīng)由例如泡罩包裝來輸送單劑量，或其可設(shè)計(jì)成多劑量。吸入系統(tǒng)的加壓定量吸入器可通過呼吸驅(qū)動(dòng)來輸送精確劑量的含脂制劑。為確保劑量的精確性，該制劑的輸送可通過微處理器編程，以在吸入周期中的某一點(diǎn)實(shí)現(xiàn)。該MDI可為便攜式或手提式。在另一實(shí)施方案中，所述輸送系統(tǒng)可為透皮輸送系統(tǒng)，例如水凝膠、乳骨、洗液、軟骨，或貼劑。特別當(dāng)需要幾周甚至幾月的延時(shí)輸送時(shí)，可使用貼劑。在另一實(shí)施方案中，可使用胃腸外給藥途徑。胃腸外途徑包括向身體各個(gè)部分的注射。胃腸外路線包括靜脈內(nèi)(iv),即通過靜脈直接向血管系統(tǒng)內(nèi)給藥；動(dòng)脈內(nèi)(ia)，即通過動(dòng)脈直接向血管系統(tǒng)內(nèi)給藥；腹膜內(nèi)(ip)，即向腹腔內(nèi)給藥；皮下(sc)，即在皮下給藥；肌肉內(nèi)(im)，即向肌肉內(nèi)給藥；和皮內(nèi)(id)，即在皮層之間給藥。當(dāng)所給藥制劑的一部分會(huì)在胃腸道中部分或完全降解時(shí)，胃腸外路線有時(shí)比口服途徑更為優(yōu)選。類似地，當(dāng)在急診中需要快速響應(yīng)時(shí)，胃腸外給藥通常也比口服更優(yōu)選。治療流行感冒的方法量化了接骨木果級(jí)分對(duì)A型H1N1流感病毒的抑制活性。將各級(jí)分的系列稀釋液與已知量的病毒一起孵育，并輸送到細(xì)胞培養(yǎng)單層(參看圖5)。繪制劑量響應(yīng)曲線，并且測定了每一級(jí)分抗A型人H1N1病毒的50%抑制濃度(1(:5。)。ICs。值參看圖6-ll和下表16。還確定了接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2抑制了登革熱病毒和A型H1N1人類流感病毒(參看圖12)。實(shí)驗(yàn)方案參見實(shí)施例9。表16.使用A型H1N1人流感病毒的抑制分析結(jié)果概述接骨木果級(jí)分ICso^ig/mL)接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F2333接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F3521接骨木果B花色素苷級(jí)分ADS5解吸F4195接骨木花XAD7HP解吸F21,592接骨木花XAD7HP解吸F3582治^/Z/K的才法定量了接骨木果級(jí)分對(duì)HIV-1病毒的抑制活性。將已知的提取物稀釋液與已知量的嵌合HIV-1SG3(基因組)C亞型(包膜)病毒一起孵育。參看圖9。繪制了劑量響應(yīng)曲線，并且確定了外推的50%抑制濃度(ICso)。參看圖32-34和下表17。實(shí)驗(yàn)方案參看實(shí)施例IO。表17.使用HIV-1病毒的抑制分析結(jié)果概述實(shí)驗(yàn)觀察到細(xì)胞毒性的劑量IC5o(pg/mL)18,182pg/mL50026,550ng/mL153《滋辨材料植物性藥材:從BlessedHerbs,Inc.Elder(Cincinnati)購買的野生西洋接骨木(接骨木)果(Product#:724，Lot弁:L10379w，Hungary)和西洋接骨木(接骨木)花(Product#:725，Lot#:L01258W，Poland)。有機(jī)溶劑:丙酮(67-64-l)，299.5%,ACS試劑(179124);HPLC用乙腈(75-05-8)，梯度級(jí)^99.9o/o(GC)(000687);己烷(l10-54-3)，95+%，分光光度級(jí)(248878);乙酸乙酯(141-78-6)，99.5+%，ACS級(jí)(319902);乙醇，用4.8%的異丙醇(02853)變性；乙醇(64-17-5)，無水(02883);甲醇(67-56-l)，99.93%,ACSHPLC級(jí)，(4391993);和水(7732-18-5)，HPLC級(jí),(95304)。所有溶劑都從Sigma-Aldrich購買。酸和堿:從Fisher公司購買曱酸(64-18-6),50%溶液(09676);乙酸(64-19-7)，99.7+%，ACS試劑(320099);鹽酸(7647-01-0)，容量標(biāo)準(zhǔn)(volumetricstandard".ON水溶液(318949);Folin-Ciocalteu酚試劑(2N)(47641);苯酚(108-95-2)(p3653);石危酸(7664-93-9)、ACS試劑，95-97%(44719);和碳酸鈉(s263-l，Lot#:037406)?；瘜W(xué)參照標(biāo)準(zhǔn)物:從Chromadex購買血清白蛋白(9048-46-8),牛血清白蛋白級(jí)分V粉末細(xì)胞培養(yǎng)測試(A9418);蕓香苷(CAS弁153-18-4);和花青素-3-糖苷氯化物(CAS弁7084-24-4)。從Fluka公司購買根據(jù)DIN鑒定的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)物[5000(00269)，50,000(00891)和410,000(00895)]。HPLC化學(xué)參照標(biāo)準(zhǔn)物的結(jié)構(gòu)如下所示。聚合物親和吸附劑:AmberliteXAD7HP(Rohm&Haas,法國)，以白色半透明小珠形式使用的大網(wǎng)格脂肪族丙烯酸交聯(lián)聚合物，粒度為560-710nm、表面積為380m2/g的。ADS-5(南開大學(xué)，中國)，酯基團(tuán)蕓香苷花青素-3-糖苷氯化物修飾的聚苯乙烯，粒度為300-1200nm、表面積為500-600m2/g。方法高效液相色譜(HPLC)法色語系統(tǒng)配備有帶SPD-M10AVP光電二極管陣列;險(xiǎn)測器的LC10ADVP泵的Shimadzu高效液相色i普LC-10AVP系統(tǒng)。在反相JupiterCI8柱(250x4.6mmI.D.,5，300A)(Phenomenex，Part#:00G-4053-E0,系列號(hào)2217520-3，批號(hào)5243-17)上測量了本發(fā)明的乙醇提取產(chǎn)物。注射體積為10^1，流動(dòng)相的流率為lml/分鐘。柱溫為25。C。該流動(dòng)相由八(5%曱酸乙酸，v/v)和B(甲醇)構(gòu)成。按如下方式設(shè)置梯度最初的2分鐘，B維持在5%，2-10分鐘，溶劑B從5%線性增加到24%，10-15分鐘，B維持在24%,15-30分鐘，B從24%線性增加到35%，30-35分鐘，B維持在35%，35-50分鐘，B從35%線性增加到45%，在該組成保持5分鐘，然后55-56分鐘，B從45%線性降低到5%，65-68分鐘，B維持在5%。類黃酮的檢測波長為350nm，而花色素的檢測波長為520nm。通過將稱重的標(biāo)準(zhǔn)化合物以5mg/ml溶解到乙醇中，來制備兩個(gè)參照標(biāo)準(zhǔn)物的甲醇儲(chǔ)備溶液。然后將混合的參考標(biāo)準(zhǔn)物溶液一步一步稀釋，來產(chǎn)生一系列最終濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.1和0.05mg/ml的溶液。所有的儲(chǔ)備溶液和工作溶液均在7天內(nèi)使用，在+(C儲(chǔ)存，并且在使用前升溫到室溫。該溶液用來識(shí)別和量化所述接骨木果和接骨木花中的化合物。520nm的花青素-3-糖苷(CY3glu)和350nm的蕓香苷的保留時(shí)間分別約13.27和20.20分鐘。發(fā)現(xiàn)線性擬合(linearfit)范圍為0.01-20ng?；貧w方程和相關(guān)系lt如下花色素-3-糖苷面積簡-20888*xC(ng)+502.21,R2=0.9994(N=5);和蕓香苷面積/100=11573xC(pg)+584.57，R2=0.9996(N=5)。HPLC結(jié)果如表18所示?；诜迕娣e，通過內(nèi)插法由相應(yīng)的4交準(zhǔn)曲線(calibrationcurves)計(jì)算每個(gè)樣品中的參照標(biāo)準(zhǔn)物的含量。表18.在甲醇中濃度為0.1mg/ml的接骨木參照標(biāo)準(zhǔn)物的HPLC分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>豐通過N-16x(tR/w計(jì)算理論板數(shù)。tR為保留時(shí)間，w為峰的寬度，https:〃www.mn-net.com/web%5CMN-WEBHPLCKatalog.nsf/WebE/GRUNDLAGEN氣相色譜-質(zhì)諮(GC-MS)法使用ShimadzuGCMS-QP2010系統(tǒng)進(jìn)行GC-MS分析。該系統(tǒng)包括高效氣相色謙儀、直接耦合(coupled)的GC/MS界面、具有獨(dú)立溫度控制的電子碰撞(EI)離子源，和四極濾質(zhì)器。該系統(tǒng)受GCMSsolutionVer.2軟件控制，進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和運(yùn)轉(zhuǎn)后分析。在AgilentJ&WDB-5熔凝硅石毛細(xì)管柱(30mx0.25mmi.d.，0,25膜(5%苯基，95%聚二曱基硅氧烷)厚度)(編目1225032，系列號(hào)US5285774H)上，使用下列溫度程序進(jìn)行分離。初始溫度為60。C,保持2分鐘，然后以4。C/分鐘的速度升高到120°C，保持15分鐘，然后以4。C/分鐘的速度升高到200。C，保持15分鐘，然后以4t7分鐘的速度升高到24(TC，再保持15分鐘。總運(yùn)行時(shí)間大約為92分鐘。樣品注入溫度為250°C。通過自動(dòng)注射器以不分流(splitless)方式在1分鐘內(nèi)注入lpl樣品。栽體氣體為氦，通過60KPa的壓力控制流率。在這種壓力下，所述流率為1.03ml/分鐘，線速度為37.1cm/分鐘，且總流率為35ml/分鐘。MS離子源溫度為230。C，GC/MS界面溫度為250°C。MS探測器在50-500m/z之間掃描，掃描速度為1000AMU/秒，電離電壓為70eV。溶劑截留(cutoff)溫度為3.5分鐘。通過Folin國Ciocalteu法(Markar,H.P.S.,Bluemmel,M.,Borowv,N.K.和Becker,K.,1993,J.Sci.FoodAgric.61:161-165)的總酚酸濃度儀器ShimadzuUV-Vis分光光度計(jì)(帶有UV探針的UV1700:S/N:All02421982LP)參照標(biāo)準(zhǔn)物制備濃度lmg/ml的儲(chǔ)備沒食子酸/水溶液。向試管內(nèi)裝入適量的沒食子酸溶液，用蒸餾水將體積補(bǔ)足至0.5ml,加入0.25ml的FolinCiocalteu試劑，然后加入1,25ml的20wt。/o碳酸鈉溶液。在超聲浴中充分振蕩該試管40分鐘，并且記錄725nm處的吸光度。所述參照標(biāo)準(zhǔn)物數(shù)據(jù)如表19所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*:依據(jù)吸光度信息的沒食子酸溶液量未知樣品將包含丹寧酸的提取物的適當(dāng)?shù)确衷嚇?aliquots)放入試管，用蒸悔水補(bǔ)足體積到0.5ml，力口入0.25mlFolinCiocalteu試劑，然后加入.25ml碳酸鈉溶液。40分鐘后，旋轉(zhuǎn)該試管并記錄725nm的吸光度。從上述校準(zhǔn)曲線計(jì)算以沒食子酸當(dāng)量表示的總酚類含量。通過Bradford試劑方法測定的蛋白質(zhì)含量儀器ShimadzuUV-Vis分光光度計(jì)(帶有UV探測器的UV1700:S/N:All02421982LP)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線制備溶于相同援沖劑中的適當(dāng)濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物作為未知樣品。在本發(fā)明中，去離子水可替換為緩沖劑。通過系列稀釋2mg/ml的BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物溶液，使BSA標(biāo)準(zhǔn)物為0.1-1.4mg/ml。然后，將O.lml的BSA標(biāo)準(zhǔn)物與3ml的Bradford試劑混合。將混合物渦流混合(vortex)，并在室溫下孵育樣品5-45分鐘。記錄595nm處的吸光度。樣品的吸光度必須在60分鐘的時(shí)間限制之前，并且彼此在IO分鐘內(nèi)記錄。結(jié)果如表20所示。表20.Bradford蛋白質(zhì)分析的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>未知樣品的分析將含蛋白質(zhì)試樣的適當(dāng)?shù)确衷嚇臃湃朐嚬苤校挥谜麴s水補(bǔ)足體積到O.lml。然后加入3ml的Bradford試劑。在5-45分鐘內(nèi)，振蕩該試管，并記錄595nm的吸光度。從上述校準(zhǔn)曲線，計(jì)算表示為BSA標(biāo)準(zhǔn)物當(dāng)量的蛋白質(zhì)含量。使用色度法的多糖分析(Dubois，M.,Gilles，K.A.，Hamilton,J.K.，Rebers，P.A.和Smith,F.，1956,AnalyticalChemistry28(3):350-356)。分光光度計(jì)系統(tǒng)在本研究中使用了ShimadzuUV-1700紫外線-可見光分光光度計(jì)(190-1100nm，1mm分辨率)。比色(colorimetric)法已經(jīng)用于多糖分析。制造0.1mg/ml的儲(chǔ)備右旋糖酐(Mw-5000、50，000和410,000)溶液。取0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml的儲(chǔ)備溶液，并用蒸餾水補(bǔ)足體積到0.4ml。然后加入0.2ml5%的酚溶液和lml濃硫酸。在執(zhí)行UV掃描前，將該混合物靜置10分鐘。在488nm發(fā)現(xiàn)最大吸光度。然后將波長設(shè)定在488nm，并測量每個(gè)樣品的吸光度。結(jié)果如表21所示。對(duì)如下的每種右旋糖酐溶液荻得標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線右旋糖酐5000，吸光度-0.01919+0.027782C(ng),R2=0.97(N=5);右旋糖酐50,000,吸光度-0.0075714+0.032196C(pg)，R2=0.%(N=5);和右旋糖酐410,000,吸光度-0,03481+0,036293C(嗎)，R2=0.98(N=5)。表21.右旋糖酐參照標(biāo)準(zhǔn)物的比色分析<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>多糖分析的實(shí)時(shí)直接分析(DART)質(zhì)譜所有DART色譜，特別是來自XAD7HP填料的級(jí)分F1-F6和來自ADS5填料的級(jí)分Fl-F4的DART色i普均使用如下所述的儀器和方法來運(yùn)行。儀器JOELAccuTOFDARTLC飛行時(shí)間(timeofflight)質(zhì)譜儀(JoelUSA,Inc.,Peabody,Massachusetts,USA)。該飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜儀技術(shù)不要求任何樣品制備，并且產(chǎn)生準(zhǔn)確度達(dá)到0,00001質(zhì)量單位的質(zhì)量。方法用來收集和分析多糖級(jí)分的儀器設(shè)置如下對(duì)于正離子模式，DART針的電壓是3000V,加熱元件在250。C,電極1在100V,電極2在250V，且氦氣流率為7.45升/分鐘(L/min)。對(duì)于質(zhì)譜儀，孔1是10V，透鏡圈(ringlens)是5V，且孔2為3V。為了獲得大約60m/z的初始分辨能力，同時(shí)在更高質(zhì)量范圍仍有足夠的分辨率，峰值電壓設(shè)置成600V。微通道板檢波器(MCP)電壓設(shè)置成2450V。每天早上進(jìn)樣前，使用0.5M的咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma-AldrichCo.,St.Louis,USA)進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)公差保持在55mmu。用消毒的鑷子將樣品引入DART氦等離子體內(nèi)，以確保樣品暴露于氦等離子體射線的表面積最大。為了將樣品引入射線，采用擺動(dòng)運(yùn)動(dòng)。該運(yùn)動(dòng)允許樣品在前后擺動(dòng)時(shí)以大約0.5秒/輪(swipe)反復(fù)暴露，并且防止樣品的高溫分解。重復(fù)該運(yùn)動(dòng)直到在檢波器中觀察到可感知的總離子流(TIC)信號(hào)，然后除去樣品，以進(jìn)行基線/背景的標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于負(fù)離子模式，所述DART和AccuTOFMS轉(zhuǎn)變成負(fù)離子模式。所述針電壓為3000V、加熱元件250。C、電極1為100V、電極2為250V，且氦氣流率為7.45L/min。對(duì)于質(zhì)鐠儀，孑L1為-20V、透鏡圏為-13V，且孔2為-5V。峰值電壓為200V。MCP電壓設(shè)置為2450V。用與正離子模式完全相同的方式引入樣品。所有的數(shù)椐分析用與儀器同時(shí)提供的MassCenterMainSuite軟件進(jìn)行。實(shí)施例l歩驟1A的實(shí)施例接骨木果的單歩SFE最大提取和純化在設(shè)計(jì)壓力和溫度分別為至多690巴和200。C的SFT250(SupercriticalFluidTechnologies,Inc.,Newark,Delaware,USA)上進(jìn)行所有的SFE提取。該裝置允許在超臨界條件下靈活地以動(dòng)態(tài)或靜態(tài)模式操作簡單和有效地提取。該裝置主要由三個(gè)模塊構(gòu)成；烘箱、泵和控制器、以及收集模塊，該烘箱具有一根預(yù)熱柱和一個(gè)100ml的提取容器。該泵模塊具有恒定流量為300ml/min的壓縮空氣驅(qū)動(dòng)泵。該收集模塊為用蓋和隔片密封的40ml玻璃瓶，用于提取產(chǎn)物的回收。該設(shè)備裝備有微計(jì)量閥和流量計(jì)。提取容器壓力和溫度監(jiān)測和控制在士3巴和土1。C內(nèi)。在典型的實(shí)施例中，每次實(shí)驗(yàn)將5克碾磨的西洋接骨木果(接骨木果)或花(接骨木花)的粉末裝入100ml提取容器中，所述粉末用篩網(wǎng)(140目)篩測的尺寸超過105nm。將玻璃棉放置在柱的兩端，以避免任何可能的固體物料的夾帶。在裝栽填料容器之前，將所述烘箱預(yù)熱到要求的溫度。在將該容器聯(lián)接到烘箱之后，通過用C02(850psig)對(duì)系統(tǒng)加壓來測試所述提取系統(tǒng)的滲漏，并吹掃。使用氣動(dòng)液泵將該系統(tǒng)封閉并加壓至所需的提取壓力。然后讓該系統(tǒng)平衡3分鐘。將取樣瓶(40ml)稱重并連接到取樣口。通過以5SLPM(10g/分鐘)的速度流過C02(由計(jì)量閥控制)，開始提取。收率定義為總提取物對(duì)原材料進(jìn)料的重量比例。收率定義為所提取的油相對(duì)于在提取器內(nèi)最初裝入的原料的重量百分比。采取完全分級(jí)(fullfactorial)提取方案，在40-80。C的溫度和100-500巴變化。對(duì)于氣相色鐠質(zhì)鐠(GC-MS)分析，每種條件下獲得的提取物溶解在的二氯曱烷中，濃度為400ppm。實(shí)施例2步驟2的實(shí)施例:水醇浸提接骨木屬物種酚酸化學(xué)成分的兩步溶劑提取的典型實(shí)例如下所述原料為來自步驟l的精油SCCO2提取(60。C，300巴，90分鐘)的17,6gm碾磨的接骨木果SFE殘余物。溶劑為300ml的25Q/。乙醇水溶液。在本方法中，進(jìn)料材料和80%的乙醇水溶液分別裝入500ml的提取容器中，并在60。C的熱水浴中混合4小時(shí)。使用顆粒保留尺寸為4-8jiim的FisherbrandP4濾紙過濾提取溶液，在2000rpm離心20分鐘，并且顆粒狀殘余物用于進(jìn)一步提取。收集和合并濾液(上清)進(jìn)行收率計(jì)算、HPLC分析和產(chǎn)生F1-F4及F1-F6級(jí)分(參看下面的實(shí)施例3)。使用上述方法提取階段l的殘余物2小時(shí)(階段2)。實(shí)施例3歩驟3的實(shí)施例酚酸級(jí)分的親和吸附劑提取(F1-F4和Fl-F6級(jí)分的制備)在典型的實(shí)驗(yàn)中，工作溶液為步驟2的接骨木屬物種乙醇水溶液浸取提取物的透明水醇溶液。親和吸附劑聚合樹脂為XAD7HP或ADS5。在填裝入ID為25mm、長500mm的柱之前及之后，用95%的乙的XAD7HP親和吸附劑。加栽的溶液為粗80%乙醇浸取酚酸溶液，其中化學(xué)成分通過旋轉(zhuǎn)真空蒸餾和乙醇回收進(jìn)行了濃縮。對(duì)于XAD7HP加栽，最后的加栽溶液濃度為29.03mg/ml，對(duì)于ADS5加栽，其濃度為34.90mg/ml。在0，3BV/hr流率下，將50ml加栽溶液加栽在XAD7HP柱上，并且60ml加栽溶液加栽在ADS5柱上。加栽時(shí)間大約50-60分鐘。用2BV的蒸餾水以0.2BV/hr的流率清洗加栽的柱，清洗時(shí)間為13分鐘。依次用40ml的40%和80%乙醇水溶液洗脫該加栽柱，對(duì)于XAD7HP以2ml/分鐘的流率洗脫，對(duì)于ADS5以1.5ml/分鐘的流率洗脫。在洗脫過程中，分別從XAD7HP柱中收集到6種洗脫液級(jí)分(F1-F6:Fl20mL，F(xiàn)220mL,F318mL，F(xiàn)410mL，F(xiàn)517mL和F6~27mL),從ADS5柱中收集到4種洗脫液級(jí)分(F1-F4:Fl20mL，F(xiàn)220mL，F(xiàn)3~17mL和F417mL)。對(duì)于XAD7HP柱，使用40W乙醇洗脫出F1-F3，使用80。/o乙醇收集到F4-F6。對(duì)于ADS5柱，使用40%乙醇洗脫出Fl-F2，使用80。/o乙醇洗脫出F3-F4。然后用4-5BV的95。/。乙醇以3.6BV/hr流率清除該柱上剩余的化學(xué)品，隨后用4-5BV蒸餾水以3.8BV/hr流率沖洗?？偺幚頃r(shí)間小于2小時(shí)。在整個(gè)處理期間，使用FPU2520megaflexa⑧變速(3-50ml/分鐘)蠕動(dòng)泵控制流率。通過DART質(zhì)量平衡和HPLC收集和分析每一洗脫級(jí)分。實(shí)施例4歩驟5的實(shí)施例多糖級(jí)分提取接骨木屬物種的水溶性、乙醇不溶性純化植物血凝素-多糖級(jí)分化學(xué)成分的溶劑萃取和沉淀的典型實(shí)施例如下所迷分兩段，將來自階段2的水醇浸提(步驟2)的15gm固體殘余物用300ml的蒸餾水在80。C提取2小時(shí)。合并兩次的提取溶液，并用FisherbrandP4濾紙(孔徑4-8pm)過濾該漿液，并以2，000rpm離心20分鐘。溶液中化合物的濃度為3.8mg/ml。取300ml該溶液，隨后加入456ml或者1200ml無水乙醇，以將最終的乙醇濃度補(bǔ)足至60%或者80%。當(dāng)發(fā)生沉淀時(shí)，將該溶液靜置1小時(shí)。用該提取溶液以3，000rpm離心20分鐘，并且倒出和丟棄上清液。收集該沉淀物，并用烘箱在50。C干燥12小時(shí)。稱重干燥的多糖級(jí)分并溶解在水中，使用以右旋糖酐作為參照標(biāo)準(zhǔn)物的色度法分析多糖純度，以及使用Bradford蛋白質(zhì)分析法分析植物血凝素蛋白純度。使用AccuTOF-DART質(zhì)譜來進(jìn)一步配比構(gòu)成純化多糖級(jí)分的化合物的分子量。接骨木果的結(jié)果如圖36、37和表22所示。接骨木花的結(jié)果如圖38、39和表22所示。表20.接骨木果和接骨木花的多糖DART分析接骨木果正離子負(fù)離子(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度59.1309.989.0622.573.1332.1121.0556.674.1204.9143.198.489.1157.2165.0711.5101.1556.5179.1105.211U356.6637.146.5113.1127.2825,268.5114.1207.3115.1107.7119.1136.2121.1153.4124.1404.1125.193.7135.1187.0136.184.4138.1143.6141.189.1143.1241.9144.167.8145.1737,2151.1162.5152.1196.1153.1649.2155.1174.0157.1178.8163.1413.8167.190.3169.1120.417U123.5接骨木花正離子負(fù)離子(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度61.0490.089.0368.565.196.194.0142.770.1116.6111.052.074.1148.3112.0104.278.1116.5113.0概984.1107.2133.0122.290.1401.5171.0128.298.1262.319U112.2110.170.1146.1142.9228.268.9269.2278.1271.3517.4272.3121,2273.3676.9283.2850.1284.2164.7285.2269.3286,2167.0287.3356.4288.341楊289.32578.7290.3521.0291.3112.9295.290.8300.3112.7301.2472.6302.2200.1303.2719.0接骨木果正離子負(fù)離子(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度173.1159.9174.1102.4179.1191.2l肌2912.9181.1195.4185.1102.0186.1123.7195.1528.5198.185.0199.2143.6211.1130.5217.2428.7219.2131.2223.1264.7279.2229.8287.2365.1288.3848.4289.393.5304.2703.1305.277.7316.3200.2371.1534.9372.1130.1373.1107.3388.1164.0391.3405.3409.4451.1正離子負(fù)離子(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度305.31332.0306.3361.8307.36262.5308.31781.9309.395.0316.311R4317.3189.6319.2627.1320,3247.6321.21612.0322.3521,6323.31510.2324.3358.6335.2140.7337.3805.3338.3429.6339.31079.5340.3546.7344.3192.4347.3ll畫348.3235.6349.34638.4350.3廳.4351.3113.1353.3306.8354.3238.3355,3417.2356.3584.2357.3134.8接骨木果接骨^^ft正離子負(fù)離子正離子負(fù)離子(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m+H)/z相對(duì)強(qiáng)度(m-H)/z相對(duì)強(qiáng)度363.3628.0364.3127.8365,3725.6366.3243.5367.3108.1368.3141.9370.3378.9372.3686.7379.3278.8380.370.5381.3252.7382.3330.0386.3141.3388.3198.4391.3167.3396,3188.3397.3138.7398.3501.2412.3133.1414.3235.2425.485.7430.389.8438.370.7實(shí)施例5按配方混合下列成々西洋接骨木果提取物150.0mg精油級(jí)分(10mg，6.6。/。干重)多酚級(jí)分(120mg,80%干重)多糖(40mg，26.60/0干重)甜菊苷(甜葉菊提取物)羧甲基纖維素乳糖12.5mg35.5mg77.0mg總量275.0mg接骨木屬物種的新型提取物包括％質(zhì)量重量大于在天然根莖材料或常規(guī)提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的數(shù)值的精油級(jí)分、酚酸-精油級(jí)分和多糖級(jí)分。該制劑可制成任何口服劑量形式，并且為了所需的生理學(xué)和心理學(xué)作用(降低興奮和失眠)和醫(yī)療作用(病毒性疾病，例如普通感冒、流行性感冒、單純性皰疹、帶狀皰疹和HIV,糖尿病、心血管和腦血管疾病的預(yù)防和治療，抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧劑和自由基清除、消炎、抗關(guān)節(jié)炎、抗風(fēng)濕病、和胃腸疾病)可根椐需要每天給藥或達(dá)每天15次給藥。實(shí)施例6按配方混合下列成分:西洋接骨木果提取物150.0mg精油級(jí)分(6mg，4%千重)多酚級(jí)分(30mg，20%干重)多糖(114.0mg，76%干重)維生素C三氯蔗糖35.0mg綠豆粉末10:1摩卡香料(MochaFlavor)50.0mg40.0mg15.0mg巧克力香并十(ChocolateFlavor)10.0mg總量300.0mg接骨木川芎(chuangxiong)的新型提取組合物包括％質(zhì)量重量大于在天然植物體或常規(guī)提取產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的數(shù)值的精油、酚酸-精油和多糖化學(xué)成分級(jí)分。該制劑可制成任何口服劑量形式，并且根據(jù)對(duì)所需生理、心理和醫(yī)療作用的需求每天安全地給藥高達(dá)15次(參看上述實(shí)施例5)。實(shí)施例7確定待使用的細(xì)胞數(shù)量的MTT分析目的這是用來確定以后的MTT/細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞數(shù)量的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每個(gè)所用的細(xì)胞系只需要做一次。生體活性物質(zhì)的抗病毒活性的JD評(píng)價(jià)第一天從一融合(confluent)T-75燒瓶的細(xì)胞(使用MDCKs寫成這個(gè)方案)1.吸除培養(yǎng)基，并向燒瓶中加入2mL胰蛋白酶，在37°C孵育5分鐘。2.用力擊打燒瓶的側(cè)壁，并將胰蛋白酶轉(zhuǎn)移到50cc錐形管中。還向該管中加入0.5mL的生長培養(yǎng)基(DMEM+P/S+Glutamax+FBS)。3.向燒瓶中再加入2ml胰蛋白酶，在37。C孵育3-5分鐘，。4.用力擊打燒瓶側(cè)壁，并將胰蛋白酶轉(zhuǎn)移到步驟2的50cc管中。向燒瓶中加入10mL生長培養(yǎng)基，漂洗燒瓶底部2次。將這10mL培養(yǎng)基放入相同的50cc管中。使用顯微鏡檢查燒瓶，看看是否除去了細(xì)胞。5.在4。C、1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸除上清。6.移出顆粒物，并將該顆粒重懸在5mL的生長培養(yǎng)基中。7.在4。C、1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸除上清。8.移出顆粒物，并將該顆粒重懸在lmL的生長培養(yǎng)基中。9.在微量離心管中，通過把500nl細(xì)胞加入到500W生長培養(yǎng)基中來以1:2稀釋細(xì)胞。如果從細(xì)胞密度非常高的板開始，可能需要在生長培養(yǎng)基中以l:4稀釋細(xì)胞。10.在血球計(jì)上核查的稀釋細(xì)胞。用記錄了3大格的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取這三組數(shù)字的平均數(shù)。這樣得到細(xì)胞計(jì)數(shù)平均數(shù)x104細(xì)胞/mL。需要從大約5x106細(xì)胞/mL開始。如果有太多的細(xì)胞，在又一次稀釋后重新進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。11.使用總共U個(gè)微量離心管達(dá)到2倍稀釋。下面為一例子管#細(xì)胞/mL力口入培養(yǎng)基力口入細(xì)月包11.34x10626.7x105400|nl400pi從管133.35x105400pi400pi從管241.68x105400pi400nl從管358.4x104400jlU400pi從管464.2x104400^400pi從管572.1x104400pi400pi從管681.05x104400pipi從管795.25x103400pi400pi從管8102.63x103400^400pi從管911僅培養(yǎng)基的對(duì)照400...........12.該分析進(jìn)行三次，所以從每一管中加100^1到96-孔板的孔A-C中，板上每一列的編號(hào)對(duì)應(yīng)于其當(dāng)前所含樣品的管。13.將板在37。C孵育過夜w/C02，或者孵育細(xì)胞恢復(fù)或再附著所需的時(shí)間(通常12-18小時(shí))。第二天1.大約上午9:00，在顯微鏡下核查板上的細(xì)胞以確認(rèn)它們是附著的，他們至少在列1是融合的(confluent),并且當(dāng)你掃視整塊板時(shí)，你看到每孔的細(xì)胞較少。在最開始的2-3列內(nèi)的培養(yǎng)基應(yīng)該為橙色的；其他應(yīng)該為粉紅色。2.每孔加入10^1MTT試劑(其儲(chǔ)存在4。C)，在每孔間更換尖端(tips),并且當(dāng)心不要污染MTT試劑的儲(chǔ)備液。將板在37。C孵育2小時(shí)。3.在顯微鏡下核查板上出現(xiàn)的紫色點(diǎn)狀、細(xì)胞內(nèi)沉淀。如果沒有看到這個(gè)，繼續(xù)孵育至多24小時(shí)。4.一旦看到沉淀物，向每孔加入清潔劑(儲(chǔ)存在室溫)。此后不要搖動(dòng)該板。用鋁箔覆蓋所述板，將板在室溫放置過夜。第三天1.使用Tecan讀板器，測量各孔在560nm的吸光度，參考波長為620nm。如果使用XFluor4中任何稱為"MTT"的程序，需要這樣做。需要確保濾光器滑片(filterslide)C在該Tecan中。2.由三次讀數(shù)確定平均值，并減去由僅含培養(yǎng)基的空白(列11)平均得到的平均值。在Y軸上標(biāo)出吸光度和在X軸上標(biāo)出每毫升的細(xì)胞數(shù)。選擇產(chǎn)生0.75-l,25吸光度的細(xì)胞數(shù)，以在后續(xù)分析中使用。所選擇的細(xì)胞數(shù)應(yīng)當(dāng)落在曲線的直線部分。實(shí)施例8MTT分析目的確定提取物對(duì)細(xì)胞是否有細(xì)胞毒性作用生物活性物質(zhì)的抗病毒活性JD評(píng)估第一天1.通過WH265中的窗口使用超敏平衡，量出O.Olg的提取物，并溶解在IO(HU無菌PBS中。要使其精確可能會(huì)讓人瘋狂，因此盡量使其接近，并在筆記本上記錄質(zhì)量(mass)，以及提取物管的標(biāo)簽細(xì)節(jié)。這是"未稀釋的提取物"，且濃度為約0.1g/mL。如果提取物不是完全溶解可溶的，則在微量離心機(jī)中以13krpm旋轉(zhuǎn)沉淀30秒，將上清轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中作為當(dāng)日使用，而顆粒物在-20。C保存用于可能的后續(xù)使用。從一融合T-75燒瓶的細(xì)胞(使用MDCK寫成這個(gè)方案)1.吸除培養(yǎng)基，并向燒瓶中加入2mL胰蛋白酶，在37。C孵育5分鐘。2.用力擊打燒瓶的側(cè)壁，并將胰蛋白酶轉(zhuǎn)移到50cc錐形管中。還向該管中加入0.5mL的生長培養(yǎng)基(DMEM+P/S+Glutamax+FBS)。3.向燒瓶中再加入2ml胰蛋白酶，在37°C孵育3-5分鐘。4.用力擊打燒瓶側(cè)壁，并將胰蛋白酶轉(zhuǎn)移到步驟2的50cc管中。向燒瓶中加入1OmL生長培養(yǎng)基，漂洗燒瓶底部2次。將這1OmL培養(yǎng)基放入相同的50cc管中。使用顯微鏡檢查燒瓶，看看是否除去了細(xì)胞。5.在4。C、1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸除上清。6.移出顆粒物，并將該顆粒重懸在5mL的生長培養(yǎng)基中。7.在4。C、1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸除上清。8.移出顆粒物，并將該顆粒重懸在lmL的生長培養(yǎng)基中。9.在微量離心管中，通過把500W細(xì)胞加入到50(Htl生長培養(yǎng)基中來以1:2稀釋細(xì)胞。如果從細(xì)胞密度非常高的板開始，可能需要在生長培養(yǎng)基中以l:4稀釋細(xì)胞。10.在血球計(jì)上核查10^1的稀釋細(xì)胞。用記錄了3大格的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取這三組數(shù)字的平均數(shù)。這樣得到細(xì)胞計(jì)數(shù)平均數(shù)x104細(xì)胞/mL。開始時(shí)，需要大約1-1.6x105MDCK細(xì)胞/mL,或1.3-2.1x105293T細(xì)胞/mL;這可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)對(duì)MDCK:a.l:4稀釋b.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通常得到約360細(xì)胞/大格。c.將1:4以1:3稀釋。隨后以1:10稀釋(40(HU細(xì)胞在3.6mL培養(yǎng)基中)。d.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。需要10-16細(xì)胞/大格。對(duì)于293T:a.1:8稀釋。b.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通常得到約300細(xì)胞/大格。c.將1:8以1:2稀釋。隨后以1:10稀釋(40(Hil細(xì)胞在3.6mL培養(yǎng)基中)。d.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。需要13-21細(xì)胞/大格。11.如下所示使用總共9個(gè)微量離心管達(dá)到提取物的2倍稀釋管提取物稀釋率加入PBS加入提取物1未稀釋21250nl50nl從管131450pl50pl從管241850pl50pl從管3511650卞150pi從管4613250|lU50pl從管5716450pl50nl從管68112850^150pl從管79125650^150pl從管810151250pi50pl從管9在96-孔板中，列11=僅PBS/溶劑的對(duì)照(有細(xì)胞但無提取物)12=僅培養(yǎng)基的對(duì)照(空白-無細(xì)胞，無提取物)12.該分析進(jìn)行三次，因此向無菌96-孔板的列1-11的A-C行加入100nl剛渦流(vortexed)處理的適當(dāng)稀釋的細(xì)胞，填充了3列后對(duì)管內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行渦流處理。13.向列12的A-C行加入100pl的培養(yǎng)基。14.然后向板上1-10列的A-C行加入6pl的提取物稀釋液。(注意板上每一列的序號(hào)應(yīng)當(dāng)對(duì)應(yīng)上述的管#)15.向列11的A-C行加入6^1溶劑。16.觀察板，并輕輕擊打以確保提取物位于每孔中的液體內(nèi)，而不是在孔的側(cè)壁上。17.將板在37。C孵育過夜w/C0224小時(shí)。18.從最初的微量離心管中取500^1細(xì)胞(剛渦流處理);故入T-75燒瓶內(nèi)的10mL生長培養(yǎng)基中，以進(jìn)行1:2分割(split)，放置在37°C直到可以再次分割。19.利用這段時(shí)間，根據(jù)測出的以及向每列中加入的體積來計(jì)算每列中確切的ng/mL提取物。第二天1.吸除每孔內(nèi)的液體。使用多通道移液管，用200^1無菌PBS洗滌每孔一次。向每孔加入lOOpl無菌培養(yǎng)基。2.在顯微鏡下檢查細(xì)胞，以確保它們?nèi)栽谀抢铮⑶宜鼈兾匆驗(yàn)閮?nèi)在化的提取物而顯紫色。3.從瓶中移出40(HilMTT試劑(其保存在4。C的BSL3室內(nèi))到微量離心管內(nèi)。使用常規(guī)移液管向每孔加入lOplMTT試劑，每孔間更換尖端，并小心不要污染MTT試劑儲(chǔ)備液。將板在37。C孵育2小時(shí)。4.使用多通道移液管，每孔加入100|il清潔劑(在室溫貯存)。此后不要搖動(dòng)所述板。用鋁箔覆蓋所述板，并將板在37。C放置直到下午3:00，此時(shí)應(yīng)當(dāng)在Tecan上讀板。讀板1.使用Tecan讀板器，測量各孔在560nm的吸光度。使用XFluor4中稱為"MTT，，的程序。確保濾光器滑片(filterslide)C在該Tecan中。由三次讀數(shù)確定平均值，并減去由僅含培養(yǎng)基的空白(列12)平均得到的平均值。在Y軸上標(biāo)出吸光度和在X軸上標(biāo)出ng/mL提取物。實(shí)施例9接骨木果提取物對(duì)流感病毒A感染的抑制分析第l天1.通過WH265內(nèi)的窗口以超敏平衡量出提取物。從至少40mg/ml開始。這應(yīng)當(dāng)為5mg(或0.005g)每125pl無菌PBS。2.渦流處理以溶解。如果不進(jìn)入溶液中，加入相同量的PBS。如果需要再重復(fù)。如果這樣嘗試三次后，其不能完全進(jìn)入溶液中，則在微量離心機(jī)中以10-13,000rpm旋轉(zhuǎn)30秒。取出上清并作為替代使用。但是，將不溶部分標(biāo)注并貯存在-20。C。3.重復(fù)步驟1&2，并合并量出的溶解的提取物，以制備250nl的提取物溶液。4.將兩個(gè)無菌微量離心管標(biāo)注為"Abl:1000"和"Ab500"。向"Ab1:1OOO，，管中加入999^1的無菌PBS和1^的抗流感A—抗(primaryantibody)。渦流處理。向"Abl:500"管中加入998plPBS和2^1的抗流感A—抗。渦流處理。5.稀釋病毒a.將4個(gè)微量離心管標(biāo)注為"UV"，"-l"，"-2",和"-3"。向"UV"管中加入990^1PBS，并向其他管加入卯(HilPBS。b.在冰上向"UV"管中加入10^1的病毒。渦流處理。更換尖端。從該管中取出100|il并加入"-l"管中。渦流處理。繼續(xù)，從每管中取出100^1并加入下一管中，渦流處理，并在每次稀釋之間更換尖端。6.稀釋提取物a.將5個(gè)微量離心管標(biāo)為"1:2"，"1:4"，"1:8"，"1:16"，和"1:32"。向每管內(nèi)加125pl的PBS。b.渦流處理提取物溶液。向"1:2"管中加入125|xl的提取物溶液。渦流處理并更換尖端。從"1:2"中加125^U到"1:4"中。渦流處理并更換尖端。從"1:4"中加125pl到"1:8"中。對(duì)剩余的管重復(fù)進(jìn)行，各稀釋之間渦流處理并更換尖端。7.建立分析a.將7個(gè)微量離心管標(biāo)為"未稀釋"，"1:2","1:4","1:8","1:16"，"1:32"和"PBS"。b.向除"PBS"管外的所有管內(nèi)加入600pl的PBS，"PBS"管加入1000^1的PBS。c.向非"PBS，，管的所有6個(gè)管內(nèi)加入100^1的"-3"病毒稀釋液(剛渴流處理的！)。d.對(duì)"1:2"提取物溶液進(jìn)行渦流處理。向新的"1:2"管內(nèi)加入100pl"l:2"的提取物溶液。渦流處理。e對(duì)"1:4"到"1:10"的管重復(fù)步驟d，向它們各自標(biāo)注的含PBS和病毒的新管內(nèi)加入提取物稀釋液。f.向含PBS和病毒的"未稀釋"管中加入100^1未稀釋的提取物溶液(剛渦流處理的！)。渦流處理。g.建立含100^1的-3病毒和700|iil的PBS的另一管，并標(biāo)注為"-4病毒"。渦流處理。h.立即從"Abl:1000"和"Abl:500"管中棄去300一，并向"Abl:1000"和"Abl:500"中的每一管內(nèi)加入100…的"-3"病毒稀釋液(剛渦流處理的！)。渦流混合。i.設(shè)定計(jì)時(shí)器為1小時(shí)。j.在該孵育前階段，關(guān)閉通風(fēng)櫥(hood)內(nèi)的燈。k.標(biāo)記所述板，其中"未稀釋提取物"，"1:2"，"1:4"，"1:8","1:16"，"1:32"，"1:1000"和"1:500"各標(biāo)記三列，對(duì)應(yīng)于抗體對(duì)照、"僅-4病毒+PBS"和"僅PBS"。進(jìn)入孵育前階段約50分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞三次，將孔排空用于后續(xù)步驟。在孵育前階段的時(shí)間過完后，對(duì)每管進(jìn)行渦流處理，隨即從各管向每一分別標(biāo)記的孔加入200^1。在BellyDancer上在室溫孵育30分鐘，15分鐘后旋轉(zhuǎn)90°,且此時(shí)還制備瓊脂覆層(overlay)。當(dāng)感染約I5分鐘時(shí)，設(shè)置瓊脂覆層a.向水浴中加入DMEM瓶，使其升溫。b.將5%SeaPlaque儲(chǔ)備溶液微波處理1.5-2分鐘。c.將如下成分在保存至少100mL的無菌玻璃瓶中混合。瓊脂覆層對(duì)16-孔板1.mDMEM,升溫至50°C抗生素-抗真菌7.5%BSA1Glutamax胰蛋白酶(1mg/ml)*5%SeaPlaque瓊脂糖tU.56mL0.576pi150|il14.4pi2.55mL對(duì)56-孔板57.8mL750nl2.88mL750pi72pi12.75mL15mL總體積75mL總體積t為制備BSA,將0.75gBSA加入10mLCaMg-PBS中，并在通風(fēng)櫥內(nèi)過濾-殺菌。等分為1.5-mL的試樣并在-20。C貯存。*胰蛋白酶制成8.5g/LNaCl-H20溶液，在通風(fēng)櫥中過濾殺菌，等分為lmL的試樣，并在-20。C貯存。t向100mLH2O和高壓滅菌器中加入5g瓊脂糖。室溫貯存。d.除去接種體，并且每孔用2ml瓊脂覆層替代。將板正面朝上在4。C放置約20分鐘。e.感染后(在步驟m中向細(xì)胞內(nèi)加入病毒后)，從冰箱中取出板，并正面朝上在37。C的孵育器中放置27小時(shí)第2天感染27小時(shí)后，每孔加入0.5-1mL的Formafresh。將板在4。C放置過夜。第3天1.吸除Formafresh。2.用抹刀除去瓊脂塞。3.加入0.5mL70。/。EtOH，并在室溫孵育至少20分鐘。同時(shí)，在上層(upstairs)50cc錐形管內(nèi)將Blotto中的一抗補(bǔ)足為1:1000，渦流處理以混合各成分。15.5mLPBS0.775g干奶15.5^1Tween2015.5^1抗流感A抗體(保持在4°C)4.吸除EtOH。用PBS清洗一次。5.向每孔加入500|xl剛渦流處理的位于Blotto中的一抗。在BellyDancer上在4°C搖動(dòng)上層過夜。第4天1.上層，將二抗在Blotto中混合至1:500。(因而如前所述補(bǔ)足Blotto,僅加入62|_il二抗(其在甘油中冷凍，等分并貯存在-20。C)替代一抗。)2.將板放到下層，并吸除一抗。3.用PBS洗滌一次。4.每孔加入500W位于Blotto中的二抗，并在BellyDancers上于室溫孵育5小時(shí)。5.吸除二抗。用PBS洗滌一次。6.每孔加入6滴Dakko底物(substrate)(保存在室內(nèi)P3內(nèi)的4°C下層)7.立即放在BellyDancer上，并室溫孵育10-15分鐘，或直到看見病灶。8.吸除底物，并用PBS洗滌一次。貯存在PBS中。9.在淺色盒子上拍照并計(jì)數(shù)病灶。實(shí)施例10分析接骨木果提取物活性的HIV抑制方案通過將293T細(xì)胞在含6pg的pSG3&"v(包含HIV-l菌林SG3基因組的缺包膜副本的質(zhì)粒)、2jig包膜克隆ZM53M.PB12(編碼來自Zambia的HIV-l菌株C亞型的包膜)的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生假模標(biāo)本HIV-l病毒。使用Effectene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen,Valencia,CA)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。18小時(shí)后，替代含Effectene轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集上清，通過低速離心來澄清，等分，并在-18。C冷凍。通過感染GHOST細(xì)胞，接種在96-孔板上，37。C保持2小時(shí)并系列稀釋10倍來測定病毒儲(chǔ)備液的滴定度。孵育2小時(shí)后，用含10%胎牛血清的新鮮Dulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基替代含病毒的培養(yǎng)基，并在370C孵育48小時(shí)。用Typhoon磷造影儀(phosphorimager)借助ImageQuant軟件(AmershamBioscience,Piscataway，NJ)對(duì)板進(jìn)行掃描，并進(jìn)行病灶計(jì)數(shù)。凝矛木^炎承樹^務(wù)fF4焱為》和^染^賴為、奸通過將40mg的凍干接骨木果提取物重懸在lmL的PBS(pH7.2)中，并通過用40^L0.625M的NaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.0來使其完全進(jìn)入溶液中，從而制得接骨木果提取物(F4)。為了分析F4對(duì)HIV-l的抗病毒活性，將5x104GHOST細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上的每個(gè)孔中。第二天，在存在或不存在6.55，3.28，1.64,0.82,0,41和0.20(ig的F4/mL的條件下，向每孔中加入1,000p.f.u.的假模標(biāo)本病毒。在37。C孵育2小時(shí)后，除去含病毒的培養(yǎng)基，并向每孔加入20(HU含10%胎牛血清的Dulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基，并在37。C繼續(xù)孵育48小時(shí)。隨后，用Typhoon磷造影儀借助ImageQuant軟件(AmershamBioscience)對(duì)板進(jìn)行掃描，并進(jìn)行病灶計(jì)數(shù)。亞fc卑^/力、浙嵌合HIV-1SG3(基因組)亞型C(包膜)的抑制分析。這種特定的包膜蛋白來自包膜克隆ZM135M.PB12，GeneBank登記號(hào)AY423984，來自于Zambia,傳播方式雌性到雄性，E.Hunter和C.Derdeyn博士提供。在微乳白色背景上的明亮白色點(diǎn)(參見圖9)是病灶。背景由宿主細(xì)胞的輕微焚光造成，并且不能進(jìn)一步減弱。+,陽性感染對(duì)照；F4，接骨木過提取物級(jí)分F4;T，分析中所用病毒的滴定。-/入伊力^,裙本文引用的所有美國專利和美國專利申請公開均在此引入作為參照本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或使用不超過常規(guī)試驗(yàn)的手段即可發(fā)現(xiàn)，本文描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同物。這類等同物應(yīng)當(dāng)涵蓋在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.包含具有圖36-70中任一附圖所示的實(shí)時(shí)直接分析(DART)質(zhì)譜色譜的級(jí)分的接骨木屬物種提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分具有圖46-50中任一附圖所示的DART質(zhì)諳色語。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分具有圖48所示的DART質(zhì)語色語。4.包含ICso為150-1500^ig/mL的級(jí)分的接骨木屬物種提取物，其中所述ICso在H1N1流行感冒抑制分析中測得。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分在H1N1流行感冒抑制分析中測得的ICso為150-750ng/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分具有150-300pg/mL的IC50。7.根椐權(quán)利要求4所述的接骨木屬物種提取物，其中所述級(jí)分具有至少約195pg/mL的IC50。8.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的接骨木屬物種提取物，其中所迷級(jí)分包含花色素苷；類黃酮；C16或C18的飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯；和/或多糖。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述花色素苷選自花青素-3糖苷和花青素-3-接骨木二糖苷。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述花色素苷的含量高于10重量％。11.根椐權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述類黃酮為蕓香苷。12.根椐權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述C16或C18的飽和或不飽和脂肪酸、醇、或酯選自十六醇、十六酸、十六酸甲酯、十六酸乙酯、十六酸丁酯、十八酸、十八酸乙酯、十八酸丁酯、9-十八碳彿-l-醇、9，12-十八碳二烯酸，及其組合。13.根椐權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯的含量為至少約2重量％。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其中所述多糖選自右旋糖酐、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，及其組合。15.根據(jù)權(quán)利要求8所迷的接骨木屬物種提取物，其中多糖含量為至少約10重量％。16.權(quán)利要求8所述的接骨木屬物種提取物，其包含花色素苦；C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯；和多糖。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中所述花色素苷選自花青素-3-糖苷和花青素-3-接骨木二糖苷。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中所述花色素苷的含量高于10重量％。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯選自十六醇、十六酸、十六酸甲酯、十六酸乙酯、十六酸丁酯、十八酸、十八酸乙酯、十八酸丁酯、9-十八碳烯-l-醇、9，12-十八碳二烯酸，及其組合。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中C16或C18飽和或不飽和脂肪酸、醇或酯的含量為至少約2重量％。21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中所迷多糖選自右旋糖酑、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，及其組合。22.根椐權(quán)利要求16所述的接骨木屬物種提取物，其中多糖的含量為至少約10重量％。23.包含權(quán)利要求l或4所述的接骨木屬物種提取物的食物或藥劑。24.治療受病毒感染的患者的方法，包括對(duì)需要所迷治療的患者給藥有效量的權(quán)利要求1或4所述的接骨木屬物種提取物。25.根椐權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒為包膜病毒。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述包膜病毒為黃病毒。27.根椐權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒為無包膜病毒。28.根椐權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒選自流感病毒、A型和B型人流感病毒、禽流感病毒、H1N1、H5N1、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、SARs、單純皰疹病毒(HSV)、黃熱病病毒、登革熱、黃熱病、西尼羅河病毒和腦炎病毒。29.根據(jù)權(quán)利要求24所迷的方法，其中所迷病毒選自諾瓦克病毒、甲型肝炎、骨髄灰質(zhì)炎、andoviruses和鼻病毒。30.根椐權(quán)利要求24所述的方法，其中所述患者是靈長類、鳥類、牛科、綿羊科、馬科、豬科、嚙齒類、貓科或犬科動(dòng)物。31，根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述患者為人類。32.抑制細(xì)胞的病毒感染的方法，包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1或4所述的接骨木屬物種提取物接觸。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述病毒為包膜病毒。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述包膜病毒為黃病毒。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述病毒為無包膜病毒。36.根椐權(quán)利要求32所述的方法，其中所述病毒選自流感病毒、A型和B型人流感病毒、禽流感病毒、H1N1、H5N1、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、SARs、單純皰療病毒(HSV)、黃熱病病毒、登革熱、黃熱病、西尼羅河病毒和腦炎病毒。37.根椐權(quán)利要求32所述的方法，其中所述病毒選自諾瓦克病毒、曱型肝炎、骨髓灰質(zhì)炎、andoviruses和鼻病毒。38.制備具有至少一種預(yù)定特征的接骨木屬物種提取物的方法，包括通過以下步驟循序地提取接骨木屬物種植物體，以產(chǎn)生精油級(jí)分、多酚級(jí)分和多糖級(jí)分a)通過超臨界二氧化碳萃取來提取接骨木屬物種植物體，以產(chǎn)生所述精油級(jí)分和第一殘余物；b)通過用約40。C到約70。C的水，或用水醇提取來提取接骨木屬物種植物體或得自步驟a)的第一殘余物，以產(chǎn)生所述多酚級(jí)分和第二殘余物；以及c)通過用約70。C到約90°C的水提取來提取得自步驟b)的第二殘余物，以產(chǎn)生所述多糖級(jí)分。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中步驟a)包括1)將碾磨的接骨木屬物種植物體裝入提取容器中；2)在超臨界條件下加入二氧化碳；3)使所述接骨木屬物種植物體與二氧化碳接觸一段時(shí)間；以及4)在收集容器中收集精油級(jí)分。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，還包括通過用超臨界二氧化碳分級(jí)分離系統(tǒng)使所述精油提取物分級(jí)，來改變所述精油化學(xué)成分的復(fù)比。41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中步驟b)包括1)使碾磨的接骨木屬物種植物體或得自步驟a)的殘余物與約40。C到約70°C的水，或與水醇溶液接觸足夠長的時(shí)間，以提取多酚化學(xué)成分；2)使得自步驟a)的所提取多酚化學(xué)成分的水或水醇溶液通過親和吸附劑樹脂柱，其中包括花色素在內(nèi)的酚酸被吸附；以及3)從所述親和吸附劑樹脂中洗脫一個(gè)或多個(gè)純化的多酚化學(xué)成分級(jí)分。42.根椐權(quán)利要求38所述的方法，其中多糖級(jí)分的提取方法包括1)使得自步驟b)的第二殘余物與約70°C到約90。C的水接觸足夠長的時(shí)間，以提取多糖；以及2)用乙醇沉淀法將多糖從水溶液中沉淀出來。43.通過權(quán)利要求38-42中任一權(quán)利要求所述的方法制備的接骨木屬物種提取物。44.接骨木屬物種提取物，包含連苯三酚、重量為連苯三酚的15-25%的曱基肉桂酸、重量為連苯三酚的1-4%的肉桂酰胺、重量為連苯三酚的5-10%的2-甲氧基苯酚、重量為連苯三酚的卜2%的苯甲醛、重量為連苯三酚的5-10%的肉桂搭、和重量為連苯三酚的5-15%的乙酸肉桂酯。45.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的20-30%的阿魏酸、重量為蕓香苷的25-35%的肉桂酸、重量為蕓香苷的15-25%的莽草酸、重量為蕓香普的55-65%的苯乳酸。46.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素、重量為蕓香苷的1-5%的阿魏酸、重量為蕓香苷的1-5%的肉桂酸、重量為蕓香苷的0.5-5%的莽草酸、重量為蕓香苷的1-5%的苯乳酸、重量為蕓香苷的5-15%的花青素、和重量為蕓香苷的15-25%的矮牽牛配基。47.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的30-40%的花青素、重量為蕓香苷的75-85%的矮牽牛配基、重量為蕓香苷的5-10%的香草酸、重量為蕓香苷的1-5%的阿魏酸、和重量為蕓香苷的1-10%的肉桂酸。48.接骨木屬物種提取物，包含對(duì)幾苯基丙烯酸/苯丙酮酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的65-75%的蕓香苷、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的65-75%的香草酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的35-45%的阿魏酸、重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的65-75%的肉桂酸和重量為對(duì)羥苯基丙烯酸/苯丙酮酸的45-55%的莽草酸。49.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的20-30%的橙皮苷、重量為蕓香普的70-80%的香草酸、和重量為蕓香苷的40-50%的肉桂酸。50.接骨木屬物種提取物，包含矮牽牛配基、重量為矮牽牛配基的85-95%的蕓香苷、重量為矮牽牛配基的55-65%的香草酸、和重量為矮牽牛配基的30-40%的肉桂酸。51.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的5-15%的花青素、重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素、重量為蕓香苷的5-15%的咖啡酸、重量為蕓香苷的1-10%的阿魏酸、重量為蕓香苷的1-10%的莽草酸、重量為蕓香苷的25-35%的矮牽牛配基、和重量為蕓香苷的1-5%的圣草酚或黃顏木素。52.接骨木屬物種提取物，包含蕓香苷、重量為蕓香苷的10-20%的花青素、重量為蕓香苷的1-5%的圣草酚或黃顏木素、重量為蕓香苷的10-20%的柚皮素、和重量為蕓香苷的1-10%的花旗松素。全文摘要本發(fā)明涉及通過超臨界CO<sub>2</sub>萃取方法制備的接骨木屬物種植物體提取物，處理患者內(nèi)的病毒的方法，以及抑制細(xì)胞的病毒感染的方法。文檔編號(hào)A61K36/00GK101415332SQ200780009471公開日2009年4月22日申請日期2007年3月19日優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日發(fā)明者D·李,G·W·塞佩爾特,R·S·阿爾伯特,R·T·高申請人:草藥科學(xué)新加坡私人有限公司