專利名稱：：由具有無義突變的dna生產(chǎn)功能蛋白的方法以及相關(guān)疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由包含無義突變的核酸序列編碼的功能蛋白。本發(fā)明還涉及包含無義突變的核酸序列編碼的功能蛋白的生產(chǎn)方法，以及該蛋白在預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病中的用途。2.
背景技術(shù)：
：基因在細胞中的表達依賴于相繼的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。這些過程一起從蛋白相應(yīng)基因的核苷酸序列生成該蛋白。轉(zhuǎn)錄涉及通過RNA聚合酶從DNA合成RNA。轉(zhuǎn)錄起始于基因的啟動子區(qū)域，并繼續(xù)直至誘發(fā)終止，例如在新生RNA中形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或結(jié)合r/o基因產(chǎn)物。然后在核糖體上在tRNA、tRNA合成酶和各種其它蛋白和RNA類型的輔助下通過翻譯過程從mRNA生成蛋白。翻譯包含起始、延伸和終止三個階段。翻譯可通過形成起始復(fù)合物而啟動，該起始復(fù)合物由蛋白因子、mRNA、tRNA、輔助因子和識別在mRNA上指導(dǎo)翻譯機制開始翻譯該mRNA的信號的核糖體亞基組成。一旦形成了所述起始復(fù)合物，多肽鏈通過核糖體以及tRNA和tRNA合成酶的肽基轉(zhuǎn)移酶活性反復(fù)添加氨基酸而得以生長。在核糖體的A位點中存在的三個終止密碼子(UAA、UAG、UGA)中的一個向多肽鏈釋放因子(RF)發(fā)出結(jié)合和識別該終止信號的信號。從而，位于核糖體P位點的tRNA的3'核普酸和新生多肽鏈之間的酯鍵被水解。該完成的多肽鏈被釋放，而所述核糖體亞基循環(huán)進入另一輪翻譯。其中堿基數(shù)量有變化的DNA序列突變被分類為插入或刪除突變(移碼突變)，其可導(dǎo)致基因組的嚴(yán)重破壞。將一種堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N堿基的DNA突變被稱為錯義突變，其被細分為轉(zhuǎn)換型(一種噤呤轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N噤呤，或一種嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘧咬)和顛換型(。票p令轉(zhuǎn)變?yōu)猷祝?，或?定轉(zhuǎn)變?yōu)榭谄边?。插入、刪除、轉(zhuǎn)換和顛換突變均可導(dǎo)致無義突變或鏈終止突變，其中堿基突變?nèi)缫拼a突變或框內(nèi)突變將氨基酸密碼子轉(zhuǎn)為稱為三個終止密碼子中的一個。因為4是前的翻譯終止，這些才是前終止密碼子可以在細胞中生成異常蛋白?；虻臒o義突變可導(dǎo)致一系列疾病，例如癌癥、溶酶體沉積性疾病、肌肉萎縮癥、嚢性纖維化和血友病等。在具有無義突變的細菌和真核菌抹中，由于tRNA分子之一發(fā)生突變而使該突變的tRNA能識別無義密碼子，由于翻譯過程中涉及蛋白的突變，由于核糖體中(核糖〗本RNA或核糖體蛋白)突變，或通過加入可改變翻譯過程的化合物，可導(dǎo)致無義突變的抑制。其結(jié)果是氨基酸在無義突變的位點處被整合進所述多肽鏈，且翻譯在所述無義密碼子處并不提前終止。該插入的氨基酸并不必需地與野生型蛋白中的原始氨基酸一致；然而，許多氨基酸替換并不對蛋白結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生明顯的影響。因此，通過無義突變抑制生成的蛋白可能具有與野生型蛋白類似的活性。這一情況提供了通過抑制無義突變，避免翻譯的提前終止來治療與無義突變相關(guān)的疾病的機會。制和/或預(yù)防與人個體中基因的無義突變相關(guān)的疾病的非野生型蛋白以在人個體中治療、控制和/或預(yù)防與基因的無義突變相關(guān)的疾病的方法的需求，該化合物介導(dǎo)無義密碼子的錯讀以在人體中抑制提前翻譯終止。3.發(fā)明概述本發(fā)明部分地是基于發(fā)現(xiàn)了無義密碼子抑制劑，其可被全身性地施用至個體(包括人)以抑制從包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子，從而允許通讀該無義密碼子并在該無義密碼子的位置插入氨基酸。在某些實施方式中，該插入的氨基酸不同于在野生型蛋白的相應(yīng)位置處存在的氨基酸以生成功能通讀蛋白。通過抑制從包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子生成的功能通讀蛋白可用于治療、預(yù)防和/或控制與該基因無義突變有關(guān)的疾病。通過用無義密碼子抑制劑抑制從包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子在個體(包括人)中生成功能通讀蛋白比用于預(yù)防、治療和/或控制與基因無義突變相關(guān)的疾病的其它療法中具有許多益處。例如，與基因治療不同，使用無義密碼子抑制劑生成功能通讀蛋白不涉及向個體中導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)。因此，可以消除在染色體DNA中的錯誤位置插入外源遺傳性物質(zhì)的風(fēng)險，消除被導(dǎo)入個體的外源遺傳物質(zhì)編碼的蛋白過量表達的風(fēng)19險，和消除將用于向個體中導(dǎo)入外源遺傳性材料的載體(例如病毒)傳遞至其它個4本的風(fēng)險。本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向個體施用有效量的無義密碼子抑制劑。具體地，本發(fā)明^是供了用于預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中有效量的該試劑足以生產(chǎn)有效量的由所述包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白?？杀槐景l(fā)明所述的方法治療、控制和/或預(yù)防的與基因無義突變相關(guān)的疾病的非限制性范例包括淀粉樣變性、LINCL、血友病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、巨大癥、侏儒癥、甲狀腺功能減退癥、甲狀腺功能亢進癥、嚢性纖維化、老化、肥胖、帕金森病、尼曼-匹克病、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、肌肉萎縮癥(如杜興肌營養(yǎng)不良)、脊髓性肌萎縮和馬凡綜合癥。一方面，本發(fā)明提供了可被口服施用至個體(優(yōu)選人)以預(yù)防、治療和/或控制與基因無義突變相關(guān)的疾病的無義密碼子抑制劑。該口服施用的無義密碼子抑制劑在生成有效量的功能通讀蛋白的劑量下不具有或具有極少的(如有)的不良副作用。在一個特定的實施方式中，該無義密碼子抑制劑在生成有效量的功能通讀蛋白的劑量下向個體(優(yōu)選人)口服施用時不導(dǎo)致腎衰竭和/或聽力損失。因此，該無義密碼子抑制劑可被長期全身性地(例如，口服)施用而無毒性，例如腎衰竭和聽力損失?？诜┯脽o義密碼子抑制劑可使個體攝取他/她的處方劑量的無義密碼子抑制劑，而無需醫(yī)療人員來施用該試劑。由于減少了通過醫(yī)療人員施用該試劑的成本，因而就減少了與預(yù)防、治療和/或控制與基因無義突變相關(guān)疾病有關(guān)的醫(yī)療成本。口服施用無義密碼子抑制劑還改善了個體的生活質(zhì)量，因為該個體無需受限于和/或不方便地約見醫(yī)療人員來接受他的/她的無義密碼子抑制劑劑量。此外，口服施用無義密碼子抑制劑允許向所有疾病影響的器官位點傳遞全身性治療。另一方面，本發(fā)明提供了對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性的無義密碼子抑制劑。與具有抗菌活性的無義密碼子抑制劑不同，使用對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性的無義密碼子抑制劑不會導(dǎo)致對具有抗生素活性的藥物形成細菌耐受性。此外，使用對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性的無義密碼子抑制劑不太可能像許多長期施用抗生素那樣誘發(fā)與正常微生物菌叢的病理性過度生長相關(guān)的并發(fā)癥。因此，本發(fā)明提供了由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白，該蛋白通過包括施用在個體中耐受良好且對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不具有明顯抗菌活性的無義密碼子抑制劑等方法生成。4.圖1.來自熒光素酶報告構(gòu)建體的mRNA的示意圖。圖2A-2E.來自mRNA構(gòu)建體中熒光素酶-CD40報告基因的m脂A。圖3.小鼠(3-微管蛋白mRNA的示意圖。5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分地是基于發(fā)現(xiàn)無義密碼子抑制劑，其可被全身性地施用至個體(包括人)以抑制從包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義突變，從而允許通讀該無義突變并在該無義密碼子的位置處插入氨基酸。在某些實施方式中，該插入的氨基酸不同于在野生型蛋白的相應(yīng)位置處存在的氨基酸殘基以生成功能非野生型蛋白。通過抑制從包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子生成的功能通讀蛋白可用于治療、預(yù)防和/或控制與該基因無義突變有關(guān)的疾病。本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向個體施用有效量的無義密碼子抑制劑。依據(jù)本發(fā)明，該功能通讀蛋白具有全長野生型蛋白的一個或多個功能。在特定的實施方式中，由本發(fā)明的方法生成的功能通讀蛋白為功能非野生型蛋白。在另一實施方式中，該功能非野生型蛋白為全長蛋白。在其它實施方式中，該功能非野生型蛋白不是全長蛋白。該功能通讀蛋白的生成可通過體外測定和/或在動物模型中進行評價。例如，可采用報告測定來檢測功能通讀蛋白是否被生成。可替代地，可采用動物模型(例如W血鼠)檢測功能通讀蛋白是否被生成。在某些實施方式中，如本發(fā)明所述施用至個的無義密碼子抑制劑的有效量等于在包含如下步驟的報告基因測定中抑制無義密碼子的量(a)將所述試劑與具有包含報告基因的核酸序列的細胞相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的表達和/或活性。在其它實施方式中，無義密碼子抑制劑的有效量等于在包含如下步驟的報告基因測定中抑制無義密碼子的量(a)將所述試劑與細胞裂解產(chǎn)物和帶有報告基因的核酸序列相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的表達和/或活性。有關(guān)該類測定的詳細描述參見5.4節(jié)。在一方面，本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向該個體口服施用有效量的無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該口服施用的無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg。在一些實施方式中，該口服施用的無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg，并作為單個劑量、兩個劑量、三個劑量、四個劑量或更多個劑量施用。在具體的實施方式中，該口服施用的無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg，其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，第三劑量為總施用量的50%。在其它實施方式中，該向人口服施用的無義密碼子抑制劑的有效量小于每天35mg/kg。在具體的實施方式中，該向人口服施用的無義密碼子抑制劑的有效量介于每天0.1mg/kg和30mg/kg。在另一方面，本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向個體施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該試劑的有效量足以生成0.5(ig/ml至500pg/ml的該試劑的血漿濃度2小時、2.5小時、3小時或更多時間。在某些實施方式中，該試劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg。在具體的實施方式中，該試劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%,第三劑量為總施用量的50%。在某些實施方式中，該無義密碼子抑制劑被口服施用至該個體。在另一方面，本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向該個體施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該無義密碼子抑制劑的有效量對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。在一些實施方式中，該無義密碼子抑制劑被口服施用。在某些實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg。在具體的實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，第三劑量為總施用量的50%。在某些其它實施方式中，該試劑的有效量足以生成0.1嗎/ml至500嗎/ml的該試劑的血漿濃度2小時、2.5小時、3小時或更多時間。通過向個體施用無義密碼子抑制劑生成由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白可用于治療、控制和/或預(yù)防與基因無義突變相關(guān)的疾病?？赏ㄟ^生成由包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白治療、控制和/或預(yù)防的疾病的非限制性范例包括淀粉樣變性、LINCL、血友病、阿爾茨海默病、動^c粥樣石更化、巨大癥、〃f朱儒癥、甲狀腺功能減退癥、甲狀腺功能亢進癥、嚢性纖維化、老化、肥胖、帕金森病、尼曼-匹克病、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、肌肉萎縮癥(如杜興肌營養(yǎng)不良)、脊髓性肌萎縮和馬凡綜合癥。在某些實施方式中，通過生成由包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白治療、控制和/或預(yù)防的所述疾病不是腸胃疾病。在其它實施方式中，通過生成由包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白治療、控制和/或預(yù)防的該疾病不是皮膚性疾病。在一些實施方式中，通過生成由包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白治療、控制和/或預(yù)防的該疾病不是如下一種或多種或所有疾病基底細胞痣綜合癥(例如，PTCH基因)、偶發(fā)性基底細胞癌(例如，PTCH基因)、黑色素瘤(例如，CDKN2a基因)、交界型大皰性表皮松解癥(例如，LAMB3、LAMC2、LAMA3基因)、泛發(fā)性萎縮性良性大皰性表皮松解癥(例如，C0L17A1基因)、營養(yǎng)不良性表皮松解(例如，COL7A1基因)、良性天皰癡疾病(如ATP2C1基因)、Darier氏癥(例如，ATP2A2基因)、板層狀魚鱗病(例如，TGM1基因)、X-連鎖魚鱗病(例如，STS基因)、著色性干皮病(例如，XPA、XPC、XPG基因)、布盧姆綜合征(例如，BLM基因)、紋狀掌跖角化病(例如，DSP、DSG1基因)、Cockayne綜合癥(例如，ERCC6基因)、眼皮膚白化病(例如，TYR、TYRP1基因)、Hermansky-Pudlack綜合癥(例如，HPS1、HPS4基因)、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(例如，ATM基因)、Griscelli綜合癥(例如，RAB27A、MY05A基因)、和外胚層發(fā)育不良/皮膚脆性(例如，PKP1基因)。在一些實施方式中，該種通過生成由包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白治療、控制和/或預(yù)防的疾病不是如下一種或多種或所有疾病偶發(fā)性食道癌(p53基因)和偶發(fā)性結(jié)腸癌(APC、p53基因)、Barrett食道(p53基因)、遺傳性癌綜合癥如腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC基因)、遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(MLH1、MSH2基因)、Peutz-Jeghers綜合癥(STK11基因)、以及Cowden綜合癥(PTEN基因)。本發(fā)明提供了用于預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該試劑的有效量足以生成有效量的由該包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白。在某些的實施方式中，該功能通讀蛋白的有效量為預(yù)防疾病或其癥狀發(fā)作、發(fā)展和/或進展所必需的蛋白的量。在其它實施方式中，該功能通讀蛋白的有效量為減少疾病或其癥狀的延續(xù)時間和/或嚴(yán)重性所必需的蛋白的量。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白的有效量等于在目標(biāo)25疾病的動物模型中所生成的量。在其它實施方式中，該功能通讀蛋白的有效量為在所述疾病的動物模型中生成的具有治療和/或預(yù)防效益的蛋白的量。在某些實施方式中，所述功能通讀蛋白的有效量等于在包含如下步驟的報告基因測定中生成的量(a)將無義密碼子抑制劑與具有包含報告基因的核酸序列的細胞相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的生成量。在其它實施方式中，該功能通讀蛋白的有效量等于在包含如下步驟的報告基因測定中生成的量(a)將無義密碼子抑制劑與細胞裂解產(chǎn)物和包含該報告基因的核酸序列相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的生成量。功能通讀蛋白的量可采用，例如，免疫測定檢測功能通讀蛋白的表達水平，或通過檢測功能通讀蛋白的活性得到檢測。在某些實施方式中，所述功能通讀蛋白的有效量為具有與所述疾病相關(guān)基因(即，包含與該疾病相關(guān)的無義突變的基因)的細胞所生成的量。在一些實施方式中，由該細胞生成的量為由包含編碼相應(yīng)野生型蛋白的正?；?即，不包含該無義突變的基因)的相同物種和類型的細胞所生成量的約0.1%、約1°/。、約2%、約5%、約7%、或約10%(在其它實施方式中，約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45。/0、約50%、約75%或約90%,且在其它實施方式中，0.1-25%、0.1-50%、10-50%、10-90%、0.1-98%、5-98%或10-98%)。該功能通讀蛋白的量以及野生型蛋白的量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法進行測定，只要測量該兩種蛋白的方法一致。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白的量和野生型蛋白的量通過免疫測定(例如，ELISA)進行測量。在具體的實施方式中，該細胞經(jīng)工程改造后含有所述基因。在替代性的實施方式中，該細胞天然地包含該基因。在某些實施方式中，所述功能通讀蛋白的有效量為來自與包含無義突變的基因相關(guān)的疾病的患者的細胞生成的量。在一些實施方式中，由該患者細胞生成的量為來自不患有該疾病的相同物種和類型的個體的細胞(該細胞包含編碼相應(yīng)野生型蛋白的基因)所生成量的約1%、約2%、約5%、約7%或約10%(在其它實施方式中，約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約75%、約90%，且在其它實施方式中，0.1-25%、0.1-50%、0.1-90%、10-90%、5-25%、5-90%、10-98%、0.1-98%或5-98%)。該功能通讀蛋白的量以及野生型蛋白的量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法進行測定，只要測量該兩種蛋白的方法一致。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白的量和野生型蛋白的量通過免疫測定(例如，ELISA)進行測量。在具體的實施方式中，該患者細胞來自于正接受或?qū)⒁邮軣o義密碼子抑制劑的患者。本發(fā)明揭^共了預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)口服施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該無義密碼子抑制劑的有效量足以生成有效量的由該包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白。在某些實施方式中，該試劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。在具體的實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg，分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，第三劑量為總施用量的50%。在其它實施方式中，該試劑的有效量為可生成0.1pg/ml、2|ig/ml或更多(在一些實施方式中，5|ig/ml、10jig/ml、15(ig/ml、20(ig/ml、25嗎/ml、30(ig/ml、35[ig/ml、40嗎/ml、45|ig/ml、50嗎/ml、75嗎/ml、100嗎/ml、125嗎/ml、150嗎/ml、175嗎/ml、200pg/ml、225jig/ml、250(ig/ml、275(ig/ml、300|ig/ml、325|ig/ml、375fig/ml、400嗎/ml、425jig/ml、450嗎/ml、475(ig/ml或500嗎/ml)的該試劑的血漿濃度至少2小時、至少2.5小時、至少3小時或更多時間。在某些實施方式中，該無義密碼子抑制劑對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。本發(fā)明提供了用于預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該試劑的有效量足以生成0.1pg/ml至500pg/ml的該試劑的血漿濃度2小時、2.5小時、3小時或更長時間。在某些實施方式中，該試劑的有效量介于每天O.lmg/kg至500mg/kg。在具體的實施方式中，該試劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg，分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，第三劑量為總施用量的50%。在某些其它實施方式中，該試劑對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不具有明顯的抗菌活性。本發(fā)明提供了用于治療、控制和/或預(yù)防與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性的無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該試劑的有效量介于每天O.lmg/kg至500mg/kg。在具體的實施方式中，該試劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%,第三劑量為總施用量的50%。由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的生成可用于(i)不能表達足量的相應(yīng)野生型蛋白的個體，和/或(ii)不能從特定功能通讀蛋白的表達受益的個體。在一方面，本發(fā)明提供了在有此需要的個體(優(yōu)選人)中生成由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向該個體施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該個體已構(gòu)建成包含所述核酸序列。在具體的實施方式中，該功能通讀蛋白對應(yīng)于在個體中具有有益效果的野生型蛋白。在某些實施方式中，施用該試劑的該個體生成不足量的對應(yīng)該功能通讀蛋白的野生型蛋白。在具體的實施方式中，施用該試劑的該個體患有與對應(yīng)該功能通讀蛋白的野生型蛋白生成不足相關(guān)的疾病。在本發(fā)明的某些實施方式中，待接受無義密碼子抑制劑的該個體在接受該試劑前經(jīng)過篩選。在具體的實施方式中，該個^f本經(jīng)篩選以確定該試劑是否能生成功能通讀蛋白。在另一實施方式中，該個體經(jīng)篩選以確定該有效量的該試劑是否施用至該個體。下文5.6節(jié)提供了篩選個體的方法。本發(fā)明包括使用無義密碼子抑制劑以從包含突變的核酸序列生成功能通讀蛋白，其中該突變導(dǎo)致從該核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA中的終止密碼子不同于編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子。具體地，本發(fā)明提供了與包含突變(其導(dǎo)致從該核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA中的終止密碼子不同于編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子)的基因相關(guān)的疾病的預(yù)防、控制和/或治療的方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量是足以生成有效量的由該基因編碼的功能通讀蛋白的量。在一些實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg至500mg/kg。在一些其它實施方式中，該無義密碼子抑制劑的有效量為導(dǎo)致介于0.1pg/ml至500pg/ml的血漿濃度的試劑量。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用所述無義密碼子抑制劑不是氨基糖普。氨基糖苷的非限制性范例包括慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B、負霉素(negamycen)、巴龍霉素(paromycen)、西索米星、G-418及其杏f生物和類似物。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是以下一種、兩種、三種或多種慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B、負霉素(negamycen)、巴龍霉素(paromycen)、西索米星、G-418和/或其衍生物和類似物。在其它實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是保留了促進提前終止密碼子通讀活性的氯霉素及其衍生物或類似物。在其它實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是惡唑烷酮。惡唑烷酮的非限制性范例為利奈唑酮、依哌唑胺及其類似物或衍生物。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑在基于細胞的測定、動物模型測定或是此處描述的或本領(lǐng)域已知的針對無義密碼子抑制的其它測定中比同等劑量的氨基糖苷、惡唑烷酮和/或氯霉素生成更多的(在一些實施方式中，5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75。/。、80%或更多，在其它實施方式中，5-95%、10%-95%、25%-95%或10%-65%以上)功能通讀蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是具式I、式n、式m或式iv的化合物。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是表1、表2、表3或表4的化合物。在其它實施方式30中，該無義密碼子抑制劑不是具式v、式vi、式vn、式vm或式IX的化合物。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不是表5、表6、表7、表8或表9的化合物。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的所述無義密碼子抑制劑對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑為5.2節(jié)中描述的化合物。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑是具式i、式n、式m或式iv的化合物。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑是表l、表2、表3或表4的化合物。在其它實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑是具式v、式vi、式vii、式vni或式xi的化合物。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑是表5、表6、表7、表8或表9的化合物。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑與28SrRNA相互作用。在具體的實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑結(jié)合28SrRNA的特定區(qū)域。在其它實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不與18SrRNA相互作用。本發(fā)明提供了由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白，該蛋白由本發(fā)明所述的方法生成。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白發(fā)現(xiàn)位于細胞中相應(yīng)野生型蛋白的相同位置。在一些實施方式中，該功能通讀蛋白為功能非野生型蛋白。在具體實施方式中，該功能非野生型蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別僅在于在非野生型蛋白中由該提前終止密碼子編碼的位置處插入的氨基酸殘基。在其它實施方式中，該功能非野生型蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別在于(i)在非野生型蛋白中由提前終止密碼子編碼的位置處插入的氨基酸殘基；和(ii)在非野生型蛋白中提前終止密碼子編碼的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基。在其它實施方式中，該非野生型蛋白為全長蛋白(即，與相應(yīng)的野生型蛋白具有相同的長度)。由本發(fā)明的方法生成的功能通讀蛋白的氨基酸序列可通過對包含目標(biāo)核酸序列(即，包含該目標(biāo)無義突變的核酸序列)的細胞生成的蛋白進行測序來測定。在某些實施方式中，該細胞天然地包含該核酸序列。在具體的實施方式中，該細胞為來自于正接受或?qū)⒁邮軣o義密碼子抑制劑的患者的細胞。在其它實施方式中，該細胞纟皮工程改造以包含該核酸序列。因此，本發(fā)明所公開了示例性的、結(jié)構(gòu)多樣的無義密碼子抑制劑；制備該試劑的參考方法；測定該試劑的無義密碼子抑制劑活性的方法；施用無義密碼子抑制劑的施用途徑和劑型，包括優(yōu)選的給藥方案和藥物代謝動力學(xué)模式；與無義突變相關(guān)的疾病，包括對無義突變和此處所引的疾病之間的關(guān)系的公開；適于所公開的治療、控制和預(yù)防方法的患者群體，包括患者篩選的方法；以及用于確定無義密碼子抑制劑的效力的治療終點。5.1定義此處所用的術(shù)語"提前翻譯終止"指將對應(yīng)氨基酸的密碼子改變?yōu)榻K止密碼子的突變所產(chǎn)生的結(jié)果。此處所用的術(shù)語"無義介導(dǎo)的mRNA降解"指介導(dǎo)包含提前翻譯終止密碼子的mRNA降解的任意機制。此處所用的術(shù)語"提前終止密碼子"和"無義密碼子"指在氨基酸相對應(yīng)的密碼子應(yīng)該出現(xiàn)時出現(xiàn)終止密碼子。此處所用的術(shù)語"無義突變"指將編碼氨基酸的密碼子改變?yōu)榻K止密碼子的突變。此處所用的術(shù)語"無義密碼子抑制"指對提前翻譯和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的抑制或阻抑。在一個實施方式中，對提前翻譯和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的抑制或阻抑存在于體內(nèi)。在另一實施方式中，對提前翻譯和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的抑制或阻抑存在于體外。此處所用的短語"對提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的調(diào)節(jié)"指通過改變無義密碼子抑制的水平調(diào)節(jié)基因表達。例如，如果需要提高由具有提前終止密碼子的基因編碼的功能通讀蛋白的生成，即允許通讀該疾病基因的提前終止密碼子從而可以翻譯該RNA,則提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的調(diào)節(jié)需要上調(diào)無義密碼子抑制。相反地，如果需要促進具有提前終止密碼子的mRNA的降解，則提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的調(diào)節(jié)需要下調(diào)無義密碼子抑制。此處所用的術(shù)語"個體"和"患者"可相互替換地指動物(例如，牛、馬、羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)，優(yōu)選哺乳動物例如非靈長動物和靈長動物(例如，猴和人)，最優(yōu)選人。在某些實施方式中，該患者為胚胎、胎兒、嬰兒、兒童、青少年或成人。在一個實施方式中，通過預(yù)篩選確定該患者具有無義突變。在另一實施方式中，通過預(yù)篩選確定該患者具有哪一個無義突變(即，UAA、UGA或UAG)。在另一實施方式中，該患者^皮細菌細胞(例如，銅綠作￡單孢菌)感染。在另一實施方式中，該患者的細胞^t病毒感染。此處所用的短語"對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性"指無義密碼子抑制劑在添加至革蘭氏陰性微生物的培養(yǎng)基和/或革蘭氏陽性微生物的培養(yǎng)基時具有250pg/ml或更大(在特定實施方式中，300^g/ml、350ng/ml、400|ig/ml、450|ig/ml或500pg/ml，以及在其它實施方式中，約250}ig/ml至約1000)ig/ml、或250)ig/ml至約500昭/ml)的最小抑制濃度。在具體實施方式中，該短語指在添加至大腸桿菌BAS849的培養(yǎng)基(可滲透)、銅綠假單孢菌27853的培養(yǎng)基、金黃葡萄球菌29213的培養(yǎng)基、上皮葡萄球菌12228(CNSA)的培養(yǎng)基、屎腸球菌49624的培養(yǎng)基和/或糞腸球菌29212的培養(yǎng)基中時MIC為250pg/ml或更多(在特定實施方式中，300嗎/ml、350嗎/ml、400嗎/ml、450嗎/ml或500(ig/ml，以及在其它實施方式中，約250|ig/ml至約1000)ig/ml、或250嗎/ml至約500pg/ml)的無義密碼子抑制劑。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"牛奶"包括標(biāo)準(zhǔn)化的、完全的、減脂的(2%)、低脂的(1%)、脫脂的、無脂的以及無乳糖的牛奶。術(shù)語"牛奶"還包括來自人或馴養(yǎng)動物(例如，牛、水牛、山羊、綿羊或-恪駝)的牛奶和豆奶以及任意基于牛奶或含奶產(chǎn)品。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"取代的"指被一個至四個或更多個取代基取代的基團，該取代基如卣素、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)氧基、氧代、烷酰基、烷基羰基、環(huán)烷基、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氰基、疊氮基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、環(huán)烷氨基、雜環(huán)氨基、單和雙取代的氨基，其中在氨基基團上的兩個取代基選自烷基、芳基、芳烷基、烷酰氨基、芳酰氨基、芳烷酰氨基、取代的烷酰氨基、取代的芳烷氨基、取代的芳烷醜氨基、疏代、烷硫基、芳疏基、芳烷硫基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)疏基、烷硫羰基、芳硫羰基、芳烷-克羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺?；?、亞磺酰氨基(例如，SQ2NH2)、取代的亞磺酰氨基、硝基、羧基、氨基甲酰(例如，CONH2),取代的氨基甲酰(例如，CONH烷基、CONH芳基、CONH芳烷基或是氮上具有兩個選自烷基、芳基或芳烷基的取代基的情況)、烷氧基羰基、芳基、取代的芳基、胍基和雜環(huán)，例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基等。其中，如上文所述，該取代基本身可被進一步取代，該種進一步的取代基選自i素、烷基、烷氧基、芳基和芳烷基。在某些實施方式中，術(shù)語取代的不是指氰基。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"烷基"指具有1至20個碳原子、優(yōu)選1-10個碳原子、最優(yōu)選1-4個碳原子的飽和直鏈或支鏈非環(huán)狀烴。代表性的飽和直鏈烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而飽和支鏈烷基包括-異丙基、-仲丁基、-異丁基、-叔丁基、-異戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2,2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3,3-二甲基戊基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2,2-二乙基戊基、3，3-二乙基己基、2,2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。烷基基團可被取代或未被取代。不飽和烷基基團包括烯基基團和炔基基團，其將在下文討論。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"烯基基團"指具有2至20個碳原子、優(yōu)選2-10個碳原子、最優(yōu)選2-6個碳原子，并包括至少一個碳碳雙鍵的直鏈或支鏈非環(huán)狀烴。代表性的直鏈和支鏈(C2-Qo)烯基包括-乙烯基、-丙烯基、-l-丁烯基、2-丁烯基、-異丁烯基、-l-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-l-己烯基、-2-己烯基、-3-己烯基、-l-庚烯基、-2-庚烯基、-3-庚烯基、-l-辛烯基、-2-辛烯基、-3-辛烯基、-l-壬烯基、-2-壬烯基、-3-壬烯基、-l-癸雄基、-2-癸烯基、-3-癸烯基等。烯基基團的雙鍵未結(jié)合或結(jié)合至另一不飽和基團。烯基基團可被取代或未纟皮耳又代。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"炔基基團"指具有2至20個碳原子、優(yōu)選2-10個碳原子、最優(yōu)選2-6個碳原子，并包括至少一個碳碳三鍵的直鏈或支鏈非環(huán)狀烴。代表性的直鏈和支鏈(C2-do)炔基包括包括-乙炔基、-丙炔基、-l-丁炔基、-2-丁炔基、-l-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-l-丁炔基、-4-戊炔基、-l-己炔基、-2-己炔基、-5-己炔基、-l-庚炔基、-2-庚炔基、-6-庚炔基、畫1誦辛炔基、-2隱辛炔基、隱7-辛炔基、-l-壬炔、隱2-壬炔、-8隱壬炔、-1-癸炔、-2-癸炔、-9-癸炔等。烯基基團的三鍵未結(jié)合或結(jié)合至另一不飽和基團。炔基基團可被取代或未被取代。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"鹵素"指氟、氯、溴或碘原子。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"卣烷基"指被一個或多個卣素原子取代的烷基基團。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"卣烷氧基"指被一個或多個卣素原子取代的烷氧基基團。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"烷基磺?；?指-烷基-S03H或-SO;r烷基(其中烷基如上文定義)，包括-S02-CH3、-S02-CH2CH3、-S02-(CH2)2CH3、-S02-(CH2)3CH3、-S02-(CH2)4CH3、-S02-(CH2)5CH3等。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"羧基"指-COOH。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"烷氧基"指-O-(烷基)(其中烷基如上文定義)，包括-OCH3、-OCH2CH3、-0(CH2)2CH3、-0(CH2)3CH3、-0(CH2)4CH3、陽0(CH2)5CH3等。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"烷氧基羰基"指-c(二o)o-(烷基)(其中烷基如上文定義)，包括-C(=0)0-CH3、-C(=0)0-CH2CH3、-C(=0)0-(CH2)2CH3、-C(=0)0-(CH2)3CH3、-C(=0)0-(CH2)4CH3、-C(=0)0-(CH2)5CH3等。在優(yōu)選的實施方式中，該酯可生物水解(即，該酯可在4本外或體內(nèi)水解為羧酸)。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"烷氧基烷基"指-(亞烷基)-O-(烷基)(其中各"烷基"獨立為上文定義的烷基基團)，包括-CH20CH3、-CH2OCH2CH3、-(CH2)2OCH2CH3、-(CH2)20(CH2)2CH3等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"芳基"指含有5至14個環(huán)原子的石友環(huán)型芳香環(huán)。該碳環(huán)芳基基團中的環(huán)原子均為碳原子。芳基環(huán)結(jié)構(gòu)包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物(例如單、雙或三環(huán)化合物以及苯稠合的石炭環(huán)部分，如5，6,7,8-四氫萘基等)。優(yōu)選地，該芳基基團為單環(huán)狀環(huán)或雙環(huán)狀環(huán)。代表性的芳基基團包括苯基、甲苯基、蒽基、苐基、茚基、奧基、菲基和萘基。碳環(huán)芳基基團可被取代或未被取代。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"雜芳基"指含5至14個環(huán)原子的碳環(huán)芳香環(huán)，且該環(huán)原子包含至少一個、優(yōu)選1至3個獨立地選自氮、氧或疏的雜原子。雜芳基環(huán)結(jié)構(gòu)包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，例如，單-、雙-、或三環(huán)化合物以及稠合雜環(huán)部分。代表性的雜芳基為三唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯疏基、苯并疏苯基、苯并異噁唑基、苯并異噻唑基、喹啉基、吡咯基、丐1咮基、"惡唑基、苯并唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑、異噁唑基、吡唑基、異瘞唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞溱基、喹唑啉基、苯并喹唑啉基、吖啶基、嘧啶基和噁唑基?；鶊F可被取代或未被取代。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"芳氧基"指-O-芳基基團，其中芳基如上文定義。芳氧基團可被取代或未被取代。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"芳烷基"指-(烷基)-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定義)，包括但不限于-(CH2)苯基、-(012)2苯基、-((:112)3苯基、-CH(苯基:b、-CH(苯基)3、-(CH2)苯甲基、-(CH2)蒽基、-(CH2)苐基、-(CH2)茚基、-(0112)奧基、-(012)萘基等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"雜芳烷基"指-(烷基)-(雜芳基)(其中烷基和雜芳基如上文定義)，包括但不限于-(CH2)吡啶基、-(CH2)2吡啶基、-(CH2)3吡啶基、-CH(吡啶基)2、-CH(吡啶基)3、-(012)三唑基、-(CH2)四唑基、-(CH2)噁二唑基、-(CH2)呋喃基、-(CH2)苯并呋喃基、-(CH2)疏苯基、-(CH2)苯并疏苯基等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"芳烷氧基"指-O-(烷基H芳基)(其中烷基和芳基如上文定義)，包括但不限于-0-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、-0-01(苯基)2、-0-0^1(苯基)3、-0-(012)苯甲基、-0-(012)蒽基、-0-(CH2)苐基、-0-(CH2)茚基、-0-(CH2)奧基、-0-(012)萘基等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"環(huán)烷基"指包含碳和氫原子且不具有碳碳多鍵的單環(huán)狀或多環(huán)狀飽和的環(huán)。環(huán)烷基基團可被取代或未被取代。環(huán)烷基基團的范例包括但不限于(C3-C7)環(huán)烷基基團、包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基以及飽和的環(huán)狀和雙環(huán)薛烯。環(huán)烷基基團可被取代或未4皮取代。優(yōu)選地，該環(huán)烷基基團為單環(huán)狀環(huán)或雙環(huán)狀環(huán)。除非另行指明，此處所用的術(shù)i吾"雜環(huán)基"指包含^5友和氳原子，任選地具有1至4個多重鍵的單環(huán)狀或多環(huán)狀環(huán)，且環(huán)原子至少包含1個、優(yōu)選1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子。雜環(huán)基環(huán)結(jié)構(gòu)包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，例如單-、雙-、或三環(huán)化合物。優(yōu)選地，該雜環(huán)基基團為單環(huán)狀環(huán)或雙環(huán)狀環(huán)。代表性的雜環(huán)包括但不限于嗎啉基、吡咯烷酮基、吡略烷基、哌啶基、乙內(nèi)酖月尿基、戊內(nèi)酰胺基、環(huán)氧基(oxiranyl)、叔環(huán)丁基、四氫咬喃基、四氫吡喃基、四氫吡p定基、四氫嘧咬基、四氫苯石克基、四氫硫吡喃基等。雜環(huán)基環(huán)可被取代或未被取代。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"環(huán)烷氧基，，指-O-(環(huán)烷基)，其中環(huán)烷基如上文定義。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"環(huán)烷基烷氧基"指o-(烷基)-(環(huán)烷基)(其中環(huán)烷基和烷基如上文定義)，包括但不限于-O-環(huán)丙基、-O-環(huán)丁基、-O-環(huán)戊基、-O-環(huán)己基、-O-環(huán)庚基等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"氨烷氧基"指-0-(烷基)-NH2(其中烷基如上文定義)，包括但不限于-0-CHrNH2、-0-(CH2)2-NH2、-0-(CH2)rNH2、-0-(CH2)4-NH2、-0-(CH2)5-NH^。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"烷氨基"指-NH(烷基)或-N(烷基)(烷基)(其中烷基如上文定義)，包括但不限于NHCH3、-NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、-NH(CH2)5CH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N((CH2)2CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3:^。除非另行說明，此處所用的術(shù)語"芳氨基"指-NH(芳基)(其中芳基如上文定義)，包括但不限于-NH(苯基)、-NH(苯甲基)、-NH(蒽基)、-NH(第基)、-NH(節(jié)基)、-NH(奧基)、-NH(吡啶基)、-NH(萘基)等。除非另行說明，此處所用的術(shù)語"芳烷氨基"指-NH-(烷基)-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定義)，包括-NH-CH2-(苯基)、-^[11-(3112-(苯甲基)、-腿-(:112-(蒽基)、->1-0€2-(苐基)、->^-012-(茚基)、-NH-CH2-(奧基)、-順-(3112-("比咬基)、-NH-CH2-(萘基)、-麗-(012)2-(苯基)等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"環(huán)烷氨基"指-NH-(環(huán)烷基)(其中環(huán)烷基如上文定義)，包括-NH-環(huán)丙基、-NH-環(huán)丁基、-NH-環(huán)戊基、-NH-環(huán)己基、-NH-環(huán)庚基等。除非另行指明，此處所述的術(shù)語"氨烷基"指-(烷基)-NH2(其中烷基如上文定義)，包括-CH2-NH2、-(CH2)2-NH2、-(CH2)3-NH2、-(CH2)4-NH2、-(CH2)S-NH2等。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"烷氨烷基"指-(烷基)-NH(烷基)或-(烷基)-N(烷基)(烷基)(其中各"烷基"獨立為上文定義的烷基基團)，包括-CH2-NH-CH3、-CH2-NHCH2CH3、-CH2-NH(CH2)2CH3、-CH2-NH(CH2)3CH3、-CH2-NH(CH2)4CH3、-CH2-NH(CH2)5CH3、-(CH2)2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、-CH2-N(CH2CH3)2、-CH2-N((CH2)2CH3)2、-CH2-N(CH3)(CH2CH3)、隱(CH2)2-N(CH3)2等。此處所用的術(shù)語"具有無義密碼子抑制活性的化合物"和"無義密碼子抑制劑"指在體外或體內(nèi)可引起無義密碼子通讀的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、溶劑化物、水合物、多晶型或?qū)τ丑w。此處所用的"治療方案"指一個或多個治療的時機和劑量方案。此處所用的"預(yù)防性方案"指一個或多個治療的時機和用藥方案。此處所用的"方案"包括用藥安排和用藥方案。此處所用的"聯(lián)合"指使用一種以上療法。術(shù)語"聯(lián)合"的使用不限制各療法被施用至患病個體的順序。第一療法可在第二療法被施用至已患或易患疾病的個體之前(例如，1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、l小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、l周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同時或之后(例如，1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、l周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)進行施用。該療法可以一定的順序在一定的時間間隔內(nèi)施用至個體，從而使本發(fā)明的試劑可以與其它療法共同作用，以提供較以其它方式施用更好的效果?？膳c其它密碼子抑制劑聯(lián)合施用的療法的非限制性范例包括鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)痙劑、支持性療法以及其它列舉于美國藥典和/或醫(yī)生桌上參考手冊(Physician'sDeskReference)的療法。此處所用的術(shù)語"控制"在向個體施用療法的上下文中指個體從療法中獲得的不導(dǎo)致該疾病的治愈的有益效果。在某些實施方式中，向個體施用了一種或多種療法以"控制"疾病，從而防止該疾病或其癥狀的進展或惡化。此處所用的術(shù)語"療法"指任何可用于預(yù)防、控制和/或治療疾病或其癥狀的方案、方法和/或試劑。在某些實施方式中，該術(shù)語"療法"指可用于預(yù)防、控制和/或治療疾病或其癥狀的生物療法、手術(shù)和/或支持性療法。在具J本實施方式中，無義密碼子抑制劑為一種療法。此處所用的術(shù)語"預(yù)防"在向個體施用療法的上下文中指通過施用療法預(yù)防個體中疾病或其癥狀的發(fā)作、形成、復(fù)發(fā)、擴散和/或惡化。此處所用的術(shù)語"治療"在向個體施用療法的上下文中指消除或緩解疾病或與該疾病相關(guān)的癥狀。在某些實施方式中，該術(shù)語指通過向患有該疾病的個體施用一種或多種療法而使疾病的擴散或惡化的最小化。在其它實施方式中，該術(shù)語指降低疾病或與該疾病相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性和/或延續(xù)時間。此處所用的術(shù)語"全長"在功能通讀蛋白的上下文中指與相應(yīng)野生型蛋白相同數(shù)量的氨基酸殘基組成的功能通讀蛋白。此處所用的術(shù)語"非野生型蛋白"指氨基酸序列與相應(yīng)野生型蛋白不同的蛋白。在某些實施方式中，該非野生型蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別僅在于在非野生型蛋白中提前終止密碼子編碼位置處插入的氨基酸殘基。在其它實施方式中，該非野生型蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別在于(i)在非野生型蛋白中提前終止密碼子編碼位置處插入的氨基酸殘基；和(ii)在非野生型蛋白中提前終止密碼子編碼的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基。此處所用的術(shù)語"野生型"在涉及蛋白時指天然發(fā)現(xiàn)的蛋白(通常(但非絕對)為主要蛋白)且被稱為標(biāo)準(zhǔn)或參考蛋白。此處所用的短語"功能通讀蛋白"指由基因轉(zhuǎn)錄的RNA(例如，mRNA)中的無義密碼子的通讀所生成的功能蛋白。在具體的實施方式中，短語"功能通讀蛋白"指由包含無義突變的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子的通讀所生成的功能蛋白。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白與不具有無義突變的基因編碼的相應(yīng)野生型蛋白由相同的氨基酸序列組成。在其它實施方式中，該功能通讀蛋白為功能非野生型蛋白。此處所用的術(shù)語"皮膚疾病"指皮膚的疾病，特別指皮膚的表皮或真皮成分的疾病，更特別地指皮膚的表皮成分的疾病。"表皮"包括角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和生發(fā)層(基底層、基底細胞層)。在具體的實施方式中，本發(fā)明治療、預(yù)防和/或控制的疾病不是皮膚疾病。此處所用的術(shù)語"腸胃疾病"指胃腸(GI)道，包括口腔、咽、食道、胃和十二指腸(例如小腸、大腸(例如結(jié)腸))的疾病。在具體的實施方式中，本發(fā)明治療、預(yù)防和/或控制的疾病不是腸胃疾病。此處所用的術(shù)語"疾病"和"失調(diào)"可以互換使用。此處所用的短語"與基因無義突變相關(guān)的疾病"和"與基因無義突變相關(guān)的失調(diào)"可互換使用，指由基因無義突變直接或間接導(dǎo)致的疾病，其中該無義突變阻止在感染細胞中生成野生型蛋白。與無義突變相關(guān)的疾病包括單個基因中包含一個、兩個、三個或更多無義突變的疾病，以及兩個、三個或更多(多個)基因中包含一個、兩個、三個或更多無義突變的疾病。此處所用的術(shù)語"功能"在功能通讀蛋白的上下文中指具有足夠的相應(yīng)野生型蛋白的功能，以在由于編碼該蛋白的核酸序列(例如，基因)的突變(例如，無義突變)而導(dǎo)致不生成或不足量生成野生型蛋白的細胞或個體中產(chǎn)生有益效果的蛋白。此處所用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"指由藥學(xué)上可接受的無毒的酸或;威(包括無機酸和i威以及有機酸和石威)制備的鹽。本發(fā)明化合物適用的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括但不限于由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備的金屬鹽，或由賴氨酸、N,N'-二芐乙烯二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲葡糖胺)和普魯卡因制備的有機鹽。適用的無毒酸包括但不限于無機和有機酸，例如醋酸、褐藻酸、鄰氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、擰檬酸、乙烯磺酸、甲酸、富馬酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲基磺酸、粘酸、硝酸、樸酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水楊酸、石更脂酸、琥珀酸、磺胺酸、石克酸、酒石酸和對曱苯磺酸。具體的無毒酸包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、石克酸和甲磺酸。具體鹽的范例包括鹽酸鹽和甲磺酸鹽。鹽的其它范例已為本領(lǐng)域公知。例^!口，參見，iew/"gto"戶/z^7w"ceM/ica/5We"ces，第18;/反，MackPublishing,EastonPA(1990)。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"前藥"指在生物學(xué)條件下(體外或體內(nèi))能水解、氧化或以其它方式反應(yīng)而提供活性化合物(特別是本發(fā)明的化合物)的化合物的衍生物。前藥的范例包括但不限于包含如可生物水解酰胺基、可生物水解酯、可生物水解氨基甲酸酯、可生物水解碳酸酯、可生物水解酰脲、以及可生物水解磷酸酯類似物的可生物水解部分的本發(fā)明化合物的衍生物和代謝產(chǎn)物。優(yōu)選地，具有羧基功能基團的化合物的前藥為該羧酸的低級烷基酯。該羧酸酯可通過將該分子上的任意羧酸部分酯化得以方便地形成。前藥通?？刹捎?>知方法進行制備，例如在SwgerkMeWc/wa/C/zem/s^yZ>wgD&cov"，第6版(DonaldJ.Abraham編，2001,Wiley)以及Des/g"朋t/v4/7///(^/ow尸rat/n/g^(H.Bundgaard編，1985,HarwoodAcademicPublishersGmfh)中描述的方法。44除非另行指明，此處所用的術(shù)語"可生物水解酰胺"、"可生物水解酯"、"可生物水解氨基甲酸酯"、"可生物水解碳酸酯"、"可生物水解酰脲"、以及"可生物水解磷酸酯"分別指l)不干擾該化合物的生物活性但在體內(nèi)可賦予該化合物攝取、作用期限或作用發(fā)生等有利特性；或者2)無生物活性但在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為生物活性化合物的化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、以及磷酸酯?？缮锼怩サ姆独ǖ幌抻诘图壨榛?、烷氧基酰氧基酯、烷基酰胺烷基酯、以及膽堿酯?？缮锝到獾孽０返姆独ǖ幌抻诘图壨榛０?、a-氨基酸酰胺、烷氧?；０芬约巴榘蓖轸驶０贰？缮锼獍被姿狨グǖ幌抻诘图壨榘?、取代乙撐二胺、氨基酸、鞋烷胺、雜環(huán)和雜芳環(huán)胺以及聚醚胺。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"光學(xué)純的"或"立體異構(gòu)純的"指基本沒有該化合物的另一立體異構(gòu)體的化合物的立體異構(gòu)體。例如，具有一個手性中心的立體異構(gòu)純的化合物就基本上不含有該化合物的相對對映體。具有兩個手性中心的立體異構(gòu)純的化合物就基本不含有該化合物的其它非對映異構(gòu)體。典型的立體異構(gòu)純化合物包含大于約80%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約20%重量的該化合物的其它立體異構(gòu)體，更優(yōu)選大于約卯％重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約10%重量的該化合物的其它立體異構(gòu)體，更優(yōu)選大于約95%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約5%重量的該化合物的其它立體異構(gòu)體，最優(yōu)選大于約97%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約3%重量的該化合物的其它立體異構(gòu)體。除非另行指明，此處所用的術(shù)語"立體異構(gòu)純的"指具有一個手性中心的化合物的立體異構(gòu)純的組合物。此處所用的術(shù)語"單位劑型"包括片劑；咀嚼片；囊片；膠囊，如軟彈性凝膠膠嚢；藥囊劑；扁嚢劑；錠劑；糖錠；分散劑；粉末；溶液；凝膠；適于向患者進行口服或黏膜施用的液體劑型，包括懸浮劑(例如，水或非水液體懸浮劑)、乳劑(例如，水包油型乳劑、或油包水型乳劑)、溶液和酏劑；以及可以重新配制為可通過口服或腸胃外施用至患者的液體劑型的無菌固體(例如，結(jié)晶或非晶質(zhì)固體)。該單位劑型不一定必須作為單個劑量施用。此處所用的術(shù)語"庫"在涉及化合物時指多個化合物。庫可以是組合庫，例如采用組合化學(xué)技術(shù)合成的化合物的集合，或是各自占據(jù)獨特的三維空間的低分子量(小于1000道爾頓)的獨特化合物的集合。此處所用的術(shù)語"報告基因"指通過其確定提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的調(diào)節(jié)的基因。在具體的實施方式中，報告基因的表達可簡單地測定，并具有在獲取細胞或翻譯提取物的生物體中通常不能發(fā)現(xiàn)的活性。此處所用的"無義介導(dǎo)的mRNA降解"指介導(dǎo)包含提前翻譯終止密碼子的mRNA降解的任意機制。此處所用的術(shù)語"預(yù)先確定的參考范圍"指特定測定的讀數(shù)的參考范圍。在具體的實施方式中，該術(shù)語指特定細胞或特定的無細胞萃取物中報告基因的表達和/或報告基因產(chǎn)物的活性的參考范圍。在一些實施方式中，各個實驗室針對各個特定的測定、各個細胞類型和各個無細胞萃取物建立了其自己的參考范圍。在優(yōu)選的實施方式中，在進行分析的各批化合物中包括至少一個陽性對照和至少一個陰性對照。應(yīng)當(dāng)指出如果在所示結(jié)構(gòu)和對該結(jié)構(gòu)所給的名稱之間存在差異，則應(yīng)當(dāng)側(cè)重所示的結(jié)構(gòu)。此外，如果一種結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)部分的立體化學(xué)未通過如粗線或虛線等線條指出，則該結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)部分應(yīng)解釋為包含了其所有的立體異構(gòu)體。5.2具有無義突變抑制活性的示例化合物在一個實施方式中，所述無義密碼子抑制劑為具式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋體或立體異構(gòu)體，其中Z為取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基羰基；X為CH2、O、S或NH;W為氬，取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基；R2為取代或未取代的烷基、羧基、酰胺基、酰基、烷基羰基、卣素、可生物水解的基團、OP(0)32-、0[P(0)3]23-、0[P(0)3]34-、N3、CH2-NR6R7或CH2-OR6;R3、R3'、W和W在各情況下獨立為OR7、OR8、氫、卣素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基羰基、取代或未取代的烷基羰基、可生物水解的基團，或R3和R4—起形成鍵，或R3和R4與它們結(jié)合的原子一起形成取代或未取代的雜環(huán)，或R3和R'和/或R4和R4'與它們結(jié)合的碳一起形成C(=0);且R6、R7和RS在各情況下獨立為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基羰基、取代或未取代的烷基羰基、可生物水解的基團，或113和114與它們結(jié)合的原子一起形成取代或未取代的雜環(huán)。優(yōu)選的式I的化合物列舉于下表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>具式I的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例"i;口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms矛口Structure,第4版，1992。因此，可用于制備式I的化合物的起始材料和中間體可從商業(yè)途徑獲得，或可用商業(yè)途徑購得的材料通過已知的合成方法和試劑制備得到。制備具式I的化合物的具體方法在2004年4月8日公開的US2004-0067900中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，所述無義密碼子抑制劑為式II的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、多晶型、前藥或立體異構(gòu)體，其中X為C(喝、C(=S)、S、S(二0)或S(0)2;Y為取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)；R為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基；n為介于0-4的整數(shù)；&和R2各自獨立為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、_(CH2)m-W、羧烷基、烷基羰基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、芳烷基、磺?；Ⅴ０?，或Rj和R2與它們連接的原子一起形成任選地被取代的5-7元雜環(huán)、任選地被取代的5-7元雜芳基環(huán)，或R！和R2—起形成—CH26—.—CH2-CH2~.—CH2-CH2—,—(CH2〉3-,—CH=CH—;W各情況下獨立地選自氫、卣素、羥基、烷氧基、羧基、醛、NH2、NR14R'4'、硝基、環(huán)烷基、雜芳基、雜芳烷基；其中(i)各情況下R"和RW獨立地選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基或CF3;或(ii)R"和RW與它們連接的氮原子一起形成含有5至8個環(huán)原子(其中1至3個為雜原子)的任選地被取代的雜環(huán)狀環(huán)；m為介于1-4的整數(shù)；R3-R6各自獨立地選自氬、卣素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜芳烷基、取代或未取代的環(huán)烷基烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、烷氨基、氨烷基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、酰胺、鹵烷基(例如CF3)、鹵烷氧基(例如OCF3或OCHF2)、OH、CN、COOH、COOR15、S02R15、N02、NH2,或者NR"R"'和R15選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基或CF3。優(yōu)選的式II的化合物列于下表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>式II的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例如，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms和Structure,第4版，1992。因此，可用于制備式II的化合物的起始材料和中間體可從商業(yè)途徑購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備具式II的化合物的具體方法在2004年1月29日公開的WO2004/009558A2中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為具式m的化合物2，1%或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中X為氧、硫、CO、SO或S(0)2;Y為氧或碌—Z為取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基；n為介于0至4的整數(shù)；R1為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、S02R7、CF3、CN、COOH、COR7或COOR7;RQ為氫、或與R1及它們結(jié)合的原子一起形成任選地被取代的5-7元雜環(huán)、或雜芳基環(huán)；R2、R3、114和115獨立地為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取^代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、囟素、CF3、OCF3、OCHF2、CN、COOH、COOR/、S02R7、N02、麗2或順7)2;W為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或任何可生物水解的基團；以及各情況下R"獨立為氳、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、卣素或CF3;前提是，當(dāng)X為O，Y為O,n為0且W為氫時，Z不是4-氯苯基、4-甲基苯基、3-氯苯基或2,4-二氯苯基；且前提是，當(dāng)X為O，Y為O，n為0，W為氫，且Z為未取代的苯基時，R2-R5中至少一個不是氫；且前提是，當(dāng)R3為COOH,R2、R4和R5不全為卣素。優(yōu)選的式III的化合物列于下表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>式III的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例^口,March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms和Structure,第4版，1992。因此，可用于制備具式III的化合物的起始材料和中間體可從商業(yè)途徑購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備式III的化合物的具體方法在2004年1月29日公開的WO2004/009533A1中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為式IV的化合物IV或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中Z為取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的雜環(huán)、取代或未取代的芳烷基；W為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、-(CH2CH20)nR6或任何可生物水解的基團；R2、R3、R4、RS和R"蟲立為氬、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、卣素、CF3、OCF3、OCHF2、CN、COOH、COOR7、S02R7、N02、順2或順7)2;各情況下R"獨立為氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基；烷氧基；芳氧基；雜芳氧基、卣素或CF3;且n為介于l至7的整數(shù)；優(yōu)選的式IV的化合物列于下表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中X、Y和Z獨立地選自N、S、O和C，其中X、Y或Z中至少一個為雜原子；&為氫、Q-C6烷基、或Na+、或Mg2、R2獨立地為缺失；氫；-CH二N-OH基團；氰基基團；C廣C6烷基，其任選地被幾基基團取代；羰基基團，其任選地被氫、幾基或C廣C4烷氧基取代；R3獨立地為缺失、卣素、羥基、C廣C6烷基、d-C4烷氧基或硝基基團；R4獨立地為缺失、氫、C廣C6烷基，或與W—起時，R4可以是鍵，且W與R4和W所連接的雜環(huán)形成一個十一至十三元雜三環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；W選自(a)C2-C6炔基，其任選地被苯基取代；(b)C!-C8直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代C廣C6烷基；卣素；-CtO)-NH-苯基，其中苯基任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或Q-C4烷基的基團取代；五至六元雜環(huán)；Q-C8芳基，其任選地被一個或多個獨立地選自鞋基、卣素、C廣C4烷基、C廣C4卣烷基、Q-C4烷氧基或任選地被一個或多個C!-C4烷基取代的氨基的基團取代；芳氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代羥基、卣素、C廣Ct烷基基團、Q-C4卣烷基基團、C,-C4烷氧基基團或任選地被一個或多個CVC4烷基基團取代的氨基基團；(c)C2至Q蹄基；(d)C3-Q環(huán)烷基，任選地被C!-C6烷基取代；(e)CVC8芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代鞋基；卣素；Q-C4直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或羥基的基團取代；Q-C4烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或苯基的基團取代；C3-Q環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣Q烷基的基團取代；CVC8芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的d-C4烷基的基團取代；芳氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代羥基、卣素、Q-Q烷基基團、C廣C4閨烷基基團、C廣C4烷氧基基團、或被一個或多個C廣C4烷基基團任選地取代的氨基基團；五至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代CVC4烷基、氧代、或任選地被獨立地選自如下的基團取代的CVQ芳基鞋基、卣素、C,-C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、C廣Q烷氧基基團、或被一個或多個獨立選擇的CVC4烷基基團任選地取代的氨基基團；萘基基團，其任選地被氨基或氨烷基或烷氧基基團取代；-C(O)-NRxRy基團；-C(O)-Rx基團；異吲哚-l,3-二酮基團；硝基基團；氰基基團；-S03H基團；烷疏基基團；烷基磺?；鶊F；-NRx-C(O)-Rz基團；-NRxRy基團；-NRx-S02-Rz基團；-NRx-C(0)-NRxRy基團；-NRx-C(O)O-Rz基團；(f)C,o-Cw芳基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇卣素、氨基基團或氨烷基基團、或烷氧基基團取代；(g)-C(O)-NRxRy基團；(h)五或六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代氧代基團；卣素；C廣Cr烷基基團；C廣C4烷氧基基團；d-C4卣烷基基團；C廣Q卣烷氧基基團；芳氧基基團；-NRxRy基團；烷疏基基團；-C(0)-Rx基團；或C6至Cs芳基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素、Q-Q烷基基團、Q-Gt烷氧基基團取代；(i)具有二至三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雜環(huán)基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素、氧代基團、C廣C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、或C廣Q烷氧基基團取代；(D或W與R4包括當(dāng)R4是一個鍵時)，和R4和W所連接的雜環(huán)一起形成一個十一至十三元雜-三環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其中Rx為氫、C廣C6烷基基團，或Rx和Ry以及它們所連接的原子一起形成四至七元石炭環(huán)或雜環(huán)；Ry為氳、Q-C6烷基基團；任選地被一個或多個獨立地選擇的C廣C4烷基基團取代的芳基基團，或Rx和Ry與它們所連接的原子一起形成四至七元》友環(huán)或雜環(huán)；和Rz為Q-C6烷基，其任選地被芳基或卣素取代；或芳基，其任選地被鹵素、Q-C6烷基或C,-C6烷氧基取代。優(yōu)選的式V的化合物列于下表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage103</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>式V的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例A口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms禾口Structure,第4版，1992。因此，可用于制備具式V的化合物的起始材料和中間體可從市場購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備式V的化合物的具體方法在2005年10月13日提交的國際申請PCT/US05/036673中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為式VI的化合物A人'N上'H.O八O,(》"P衛(wèi)、N,、^^./。^廣o、—"N、a上，N丄、,H133<formula>formulaseeoriginaldocumentpage134</formula>或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氬或C廣Q烷基基團，其中W、X、Y和Z中至少一個為N;n為0、1、2或3;R！為氰基基團；氨基甲酰，其任選地被一個或兩個C,-C4烷基基團取代；或羰基基團，其被羥基、Q-Q烷基、或Q-C4烷氧基基團取代；R為羥基基團；卣素；Q-C4烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或羥基基團取代；C廣C4烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或苯基基團取代；CrC8環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團取代；-Rb基團；-O-Rb基團；五至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基、氧代、或-Rb基團取代；具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；羰基基團，其^皮羥基、Q-Q烷基、或Q-C4烷氧基基團取代；氨基甲?；淙芜x地被一個或兩個C!-C4烷基基團取代；硝基基團；氰基基團；任選地被羥基、C!-C4烷基、或-Rb基團取代的疏代；磺酰基，其任選地被幾基、Q-Q烷基、或-Rb基團取代；氨基，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣d烷基、磺?；螋驶鶊F取代，其中的所述氨基磺?；芜x地被羥基、d-C4烷基、或-Rb基團取代，且其中的所述氨基羰基基團任選地被d-C4烷基、d-C4卣烷基、苯甲酰氧基或被-Rb基團任選地取代的氨基基團取代；或者兩個R基團與它們所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]二氧雜或2,3-二氳-苯并[l,4]二噁唑基(dioxinyl)基團，其中-Rb為C6-C8芳基，任選地被一個或多個如下基團取代幾基、卣素、Q-C4烷基基團、CVQ卣烷基基團、C,-Q烷氧基基團、或任選第一個或多個d-C4烷基基團取代的氨基基團。優(yōu)選的式VI的化合物列于下表6:表6<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>制備式VI的化合物的具體方法在2005年10月13日提交的國際申請PCT/US05/036764中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為式VII的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage142</formula>或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中Aj為C、CH或N;V和X獨立地選自N或C;W選自N、C或CH;其中V、W或X中至少一個為N，且其中當(dāng)W為N時，V或X中至少一個也是N;Y和Z獨立地選自N、C、C-Rc、C=0、C=S，其中Rc為H、CH3或NH2;前提是，當(dāng)Y或Z之一為CO或C二S時，另一個可選自NH、S或O;R,為羧基、氰基或羰基基團，任選地被CrQ烷氧基基團取代；R2缺失或為硝基；Ar,為d至C4烷基，任選地被R基團取代；C6至Cw芳基，其任選地被一個、兩個或三個獨立選擇的R基團取代；五至十元雜環(huán)，其任選地被一個、兩個、三個獨立選擇的R基團取代；或與Ar2和A"和Ar2所連接的雜環(huán)一起形成選自Aru的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；或與Ar3和和Ar3所連接的雜環(huán)一起形成選自ArL3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar2缺失或與Ar和Ar!和Ar2所連接的雜環(huán)一起形成選自Ar!_2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar3缺失或與An和Ar!和Ar3所連接的雜環(huán)一起形成選自Ar^的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar4缺失，或為C]-C4烷基、C廣C4烷氧基、或d-C4硫烷基，其中的任爿阿一個與a,—起形成四至七元石炭環(huán)或雜環(huán)；R為氫；-Ra基團；或兩個R基團，其中R還可包括氧基團，與它們所連接的苯基或雜環(huán)一起形成選自RR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其中A巧-2和Ar!.3選自十一至十四元雜-三環(huán)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其任選地被一個或多個卣素、d-C4烷基基團、C廣C(卣烷基基團、任選地被卣素或C,-Q烷氧基基團取代的CrQ烷氧基基團、Q-C4卣烷氧基基團、或任選地被羰基基團(被CVC4烷基基團取代)取代的氨基基團取代；RR為九至十元雙環(huán)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其任選地被一個或多個卣素、Q-Q烷基基團、CrC4囟烷基基團、C,-C4烷氧基基團、氧代基團或C,-C4卣烷氧基基團取代；Ra選自羥基基團；卣素；C廣C4烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或羥基基團取代；C,-Ct烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或苯基基團取代；C4-Q環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團取代；-Rb基團；-O-Rb基團；四至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團、氧代或-Rb基團取代；具有兩個環(huán)狀143結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；羰基，其任選地被鞋基、CrQ烷基或d-C4烷氧基基團取代；氨基甲酰，其任選地被一個或兩個C廣C4烷基基團取代；硝基基團；氰基基團；任選地被羥基、CrC4烷基基團或-Rb基團取代的硫代；磺?；?，其任選地被羥基、CrC4烷基基團或-Rb基團取代；或氨基，其任選地被一個或兩個獨立選擇的d-Q烷基、磺酰基或羰基基團取代，其中的所述氨基磺?；鶊F任選地被羥基、CVC4烷基或-Rb基團取代，且其中的所述氨基羰基被C廣C4烷基、Q-C4卣烷基、苯甲酰氧基或任選地被-Rb基團取代的氨基基團取代；和其中-Rb為CVC8芳基，其任選地被一個或多個如下基團取代羥基、卣素、C廣C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、C,-C4烷氧基基團、或任選地被一個或多個C廣C4烷基基團取代的氨基基團。優(yōu)選的式VII的化合物列于下表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage154</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage165</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage172</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage179</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage184</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table>式VII的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例4口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms禾口Structure，第4版，1992。因此，可用于制備具式VII的化合物的起始材料和中間體可從市場購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備式VII的化合物的具體方法在2005年10月13日提交的國際申請PCT/US05/036761中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為式VIII的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage188</formula>或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中Y和Z獨立地選自N或C;W為N或CH;n為0、1、2或3;&為氫，被羧基基團任選地取代的"至C8芳基，或當(dāng)Z為N時R！缺失；R2為氳；C6至Q芳基，其任選地被一個、兩個或三個獨立選擇的Ra基團取代；四至七元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣Q烷基基團耳又代，或三至七元雜環(huán)；或當(dāng)Y為N時R2缺失；R獨立地選自卣素；羧基基團；Q-C6烷基基團，其任選地被四至七元雜環(huán)、C6-C8芳氧基基團或氨基基團取代，其中該四至七元雜環(huán)、C6-C8芳氧基基團或氨基基團任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣C6烷基或C6-C8芳基基團取代，其中該C6-Cs芳基基團任選地和獨立地被一個或多個C廣C6烷基烷基基團取代；C-C6烷氧基；CVCs芳氧基；0>-(:8芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素、C廣C4烷基、d-C4卣烷基、氧代、C廣Q烷氧基或C廣Q卣烷氧基基團取代；氨基基團，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C6-Q芳基或Q-C6烷基基團(其任選地被羥基、C6-C8芳基或具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元環(huán)取代)取代；羰基基團，其被五至六元雜環(huán)基團取代；四至七元雜環(huán)基團，其任選地被一個或多個C廣C4烷基或氧代基團取代；具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；或雙R基團，其中R還可包括氧代基團，與它們所連4妄的雜-雙環(huán)一起形成具有三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的十二至十三元雜環(huán)；和其中Ra為卣素；C廣C6烷基；C廣C6烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素基團取代；CVC8芳基；四至七元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的氧代基團取代；羰基，其任選地被羥基或C廣C6烷氧基基團取代；氨基甲?；话被?，其任選地被獨立選擇的C廣C6烷基基團取代，其中該d-C6烷基基團任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或羥基基團取代；或兩個Ra基團，其中Ra還可包括氧代基團，與它們所連接的Qs至Q芳基基團一起形成具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)，其中該具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素取代。優(yōu)選的式VIII的化合物列于下表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage197</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage198</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table>式VIII的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例嘖口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms矛口Structure,第4版，1992。因此，可用于制備具式VIII的化合物的起始材料和中間體可從市場購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備式VIII的化合物的具體方法在2005年10月13日提交的國際申請PCT/US05/036762中有公開，其全文在此引用作為參考。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑為式IX的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、包合物、前藥、多晶型、立體異構(gòu)體，立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、外消旋體或立體異構(gòu)體的混合物，其中X為卣素；R為Q-C8烷基基團；C廣C4鹵烷基基團；-OR!基團；或氨基基團，其任選地被一個或兩個獨立選擇的R2基團取代；R,為Q-C8烷基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的Ra基團取代；-Rb基團；吡咯烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的Q-Ct烷基或氧代基團取代；哌啶基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C,-C4烷基基團、苯甲基基團或羧基基團(其任選地被一個或多個Q-C4烷基或C廣C4烷氧基基團取代)取代；四氫呋喃基團；四氫吡喃基團；四氳萘基基團；或薛滿基基團；R2為氫、Q-C6烷基基團；C廣C4卣烷基基團；C廣C4烷氧基基團；-Rb基團；嘧啶基基團；吡啶基基團；任選地被-Rb基團取代的磺酰基基團；或201兩個R2與它們結(jié)合的氨基一起形成任選地被苯基取代的嗎啉基基團、吡咯烷基基團、異吲哚基基團、或哌。秦基基團；其中Ra為卣素；C廣Q烷氧基基團；氨基甲?；?，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣C4烷基或C廣C4烷氧基基團取代；膦?；鶊F，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣Q烷基或CVC4烷氧基基團取代；嗎啉基基團；吡啶基基團；或-Rb基團；和其中Rb為CVC8芳基，其任選地被一個或多個獨立地選自如下的基團耳又代羥基；卣素；C廣Q烷基基團；d-C4卣烷基基團；Q-C4烷氧基基團；或氨基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的C-Q烷基基團取代。優(yōu)選的式IX的化合物列于下表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table>式IX的化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例4口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms禾口Structure,第4版，1992。因此，可用于制備具式X的化合物的起始材料和中間體可從市場購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。制備式IX的化合物的具體方法在2005年10月13日提交的國際申請PCT/US05/037052中有公開，其全文在此引用作為參考。此處所述的化合物的無義密碼子抑制活性可通過5.4節(jié)所述的報告測定法進行檢測。在具體的實施方式中，此處所述的化合物的無義密碼子抑制活性可采用基于細胞的焚光素酶報告測定法進行檢測，該測定中包含了被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至293T人胚胎腎細胞的含有UGA提前終止密碼子的熒光素酶報告構(gòu)建體。已知一種允許提前終止密碼子通讀的小分子3-[3-(4-異丙基-苯基)-2,5-二氧代-咪唑烷-l-基]-苯甲酸可被用作內(nèi)標(biāo)?；钚缘臏y量基于在細胞中生成給定蛋白所需的化合物的最小濃度(潛能)和該細胞生成蛋白的最大數(shù)量(效力)之間的定量關(guān)系。相信在基于細胞的熒光素酶測定中具有較低顯著性蛋白合成潛能或效力或兩者的化合物仍可用于在本發(fā)明的體內(nèi)方法中。5.3示例化合物的合成和制備此處所述的示例化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)的、公知的合成方法獲得，該類方法可參見，例4口，March,J.AdvancedOrganicChemistry;ReactionsMechanisms和Structure，第4版，1992。因此，可用于制備該示例化合物的起始材料和中間體可從商業(yè)途徑購得，或可由商業(yè)途徑購得的材料采用已知的合成方法和試劑制備得到。可獲得此處所述的示例化合物的具體方法至少在2004年4月8日公開的US2004/0067900、2004年1月29日公開的WO2004/009558A2，2004年1月29日公開的WO2004/009533Al、2004年10月14日公開的US2004-0204461Al、2005年10月13日提交的囯際申請PCT/US2005/036673、2005年10月13日提交的國際申請PCT/US2005/037052、2005年10月13日提交的國際申請PCT/US2005/036764、2005年10月13日提交的國際申請PCT/US2005/036762、2005年10月13日提交的國際申請PCT/US2005/036761中有描述，其全文在此引用作為參考。5.4鑒定無義密碼子抑制劑的方法抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進行鑒定。例如，參見，2005年10月20日公開的題為"MethodsforIdentifyingSmallMoleculesthatModulatePrematureTranslationTerminationandNonsenseMediatedmRNADecay(調(diào)節(jié)提前翻譯終止和無義介導(dǎo)的mRNA降解的小分子的鑒定方法)"的美國公開2005/0233327;題為"MethodsofAssayingforCompoundsthatInhibitPrematureTranslationTerminationandNonsenseMediatedRNADecay(抑制提前翻譯終止和無義介導(dǎo)的RNA降解的化合物的測定方法)"的美國專利6,458,538;2003年1月9曰公開的題為"MethodsofAssayingforCompoundsthatInhibitPrematureTranslationTerminationandNonsenseMediatedRNADecay(抑制提前翻譯終止和無義介導(dǎo)的RNA降解的化合物的測定方法)"的美國公開2003/0008317;以及題為"MethodsofAssayingforCompoundsthatInhibitPrematureTranslationTerminationandNonsenseMediatedRNADecay(抑制提前翻譯終止和無義介導(dǎo)的RNA降解的化合物的測定方法)"的國際申請公開WO2004/010106，其全文分別在此引用作為參考。具體地，可采用基于細胞的和無細胞的測定法來鑒定抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物的鑒定方法，所述方法包括(a)將化合物或者化合物庫的成員與帶有包含報告基因的核酸序列的細胞相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測所述報告基因的表達，其中相對于預(yù)先測定的參考范圍或所述報告基因在不存在所述化合物或存在合適對照(例如，陰性對照)時的表達和/或活性，如果在存在化合物時所述報告基因的表達和/或活性有所提高，則鑒定得到抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物的鑒定方法，所述方法包括(a)將化合物或者化合物庫的成員與包含報告基因的無細胞萃取物和核酸序列相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測所述報告基因的表達，其中相對于預(yù)先測定的參考范圍或所述報告基因在不存在所述化合物或存在合適對照(例如，陰性對照)時的表達和/或活性，如果在存在化合物時所述報告基因的表達和/或活性有所提高，則鑒定得到抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物。根據(jù)該實施方式，該細胞萃取物可從在約(TC至約l(TC下聘育過的細胞中分離得到，并且/或者是S10至S30無細胞萃取物。210根據(jù)本發(fā)明，此處所述的基于報告基因的測定中化合物與細胞或無細胞萃取物和核酸序列的接觸步驟優(yōu)選在包含緩沖液和鹽的組合(例如KC1、NaCl和/或MgCl2)的水溶液中進行。在水溶液中使用的各種鹽的最佳濃度取決于例如由該核酸序列編碼的蛋白、多肽或肽(例如，調(diào)節(jié)蛋白)以及所用的化合物，并可通過常規(guī)實驗進行檢測。在具體的實施方式中，該水溶液接近或模仿生理條件。在另一具體的實施方式中，該水溶液進一步包含去污劑或表面活性劑。本發(fā)明的測定可采用不同的孵育時間。在基于細胞的系統(tǒng)中，該細胞和化合物或化合物庫的成員在檢測報告基因的表達和/或活性前共同孵育至少0.2小時、0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、18小時、至少1天、至少2天或至少3天。在無細胞系統(tǒng)中，該無細胞萃取物和該核酸序列(例如，報告基因)可在添加化合物或化合物庫成員前共同孵育。在某些實施方式中，該無細胞萃取物與核酸序列(例如，報告基因)在化合物或化合物庫成員添加前至少孵育0.2小時、0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、18小時或至少1天。在其它實施方式中，該無細胞萃取物或該核酸序列(例如，報告基因)在添加該核酸序列(例如，報告基因)或該無細胞萃取物前分別與化合物或化合物庫成員共同孵育。在某些實施方式中，化合物或化合物庫的成員與核酸序列(例如，報告基因)或無細胞萃取物在添加剩余成分(即，分別為無細胞萃取物或核酸序列(例如，報告基因))前至少孵育0.2小時、0.25小時、0.5小時、l小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、18小時或至少1天。一旦反應(yīng)容器包含該成分(即，化合物或化合物庫的成員，該無細胞萃取物和該核酸序列(例如，報告基因))，該反應(yīng)可進一步孵育至少0.2小時、0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、18小時或至少1天。在基于報告基因的測定中可連續(xù)檢測反應(yīng)的進展。可替代地，可在反應(yīng)的不同時間的時間點監(jiān)測基于報告基因的測定中的反應(yīng)進展。此處所述的基于報告基因的測定可在經(jīng)遺傳工程改造后表達該報告基因的細胞中進行?？商娲?，此處所迷的基于報告基因的測定可在天然表達在基因編碼區(qū)包含無義突變的報告基因的細胞中進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意物種的任意細胞或細胞系均可用于本發(fā)明所述的方法。此外，無細胞萃取物可來自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意物種的任意細胞或細胞系。細胞和細胞類型的范例包括但不限于人細胞、培養(yǎng)的小鼠細胞、培養(yǎng)的大鼠細胞或中國倉鼠卵巢("CHO")細胞。在此處所述的基于報告基因的測定中采用的該報告基因構(gòu)建體包含報告基因的編碼區(qū)以及導(dǎo)致提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的提前終止密碼子。優(yōu)選地，該提前終止密碼子為該報告基因的野生型終止密碼子的N末端，且其位置使得對提前終止密碼子的抑制方便檢測。在具體建體包含報告基因編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含來自報告基因開發(fā)閱讀框架中離起始密碼子至少15個核苷酸、優(yōu)選25至50個核普酸、50至75個核普酸、75至100個核普酸、100至300個核香酸、100至500個核香酸、100至750個核苷酸或100至1000個核脊酸的提前終止密碼子。在另一實施方式中，在此處所述的基于報告基因的測定中采用的報告基因構(gòu)建體包含報告基因編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含來自報告基因開發(fā)閱讀框架中離野生型終止密碼子至少15個核苷酸、優(yōu)選25至50個核香酸、50至75個核苷酸、75至100個核苷酸、100至150個核苷酸、150至300個核苷酸、300至500個核苷酸、500至750個核香酸或500至1000個核苷酸的提前終止密碼子。在另一實施方式中，在此處所述的基于報告基因的測定中采用的報告基因構(gòu)建體包含報告基因編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含UAG和/或UGA提前終止密碼子。在另一實施方式中，在此處所述的基于報告基因的測定中采用的報告基因構(gòu)建體包含報告基因編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含在UGAA、UGAC、UGAG、UGAU、UAGA、UAGC、UAGG、UAGU、UAAA、UAAC、UAAG或UAAU中的才是前終止密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意報告基因均可用于此處所述的報告基因構(gòu)建體。報告基因的獲得以及該元件的核苷酸序列的測定均可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行。才艮告基因的核苷酸序列可從，例如，文獻或GenBank等數(shù)據(jù)庫獲得?？商娲兀幋a報告基因的多聚核苷酸可由適當(dāng)來源的核酸生成。當(dāng)對報告基因的核苷酸序列進行測定后，可采用本領(lǐng)域公知的操作核香酸序列的方法(如重組DNA技術(shù)、定點突變、PCR等(例如，參見Sambrook等人，1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY以及Ausubel等人編,1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY聲斤述的技術(shù)，其全文在此引用作為參考))對報告基因的核苷酸序列進行操作，以生成具有不同氨基酸序列(例如形成氨基酸替換、刪除、和/或插入)的報告基因。在具體的實施方式中，報告基因是具有提前終止密碼子的任意天然存在的基因。可用于本發(fā)明的具有提前終止密碼子的基因包括但不限于此處所述的基因。在替代性的實施方式中，報告基因為在自然界中未知的包含提前終止密碼子的任意基因。報告基因的范例包括但不限于編碼螢火蟲熒光素酶的基因、編碼海腎熒光素酶的基因、編碼叩頭蟲熒光素酶的基因、編碼綠色熒光蛋白的基因、編碼黃色熒光蛋白的基因、編碼紅色熒光蛋白的基因、編碼青色熒光蛋白的基因、編碼藍色熒光蛋白的基因、編碼(3-半乳糖苷酶的基因、編碼(3-葡萄糖醛酸苷酶的基因、編碼(3-內(nèi)酰胺酶的基因、編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因、以及編碼堿性磷酸酶的基因。此處所述的測定中采用的化合物可以是化合物庫的成員。在一個實施方式中，該化合物選自包含類肽；隨機的生物低聚物；diversomers，如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮和二肽類等；插烯(vinylogous)多肽；非肽類肽類似物；低聚氨基甲酸酯；肽基磷酸酯；肽核酸庫；抗體庫；糖庫；以及小有機分子庫的化合物組合庫。在具體的實施方式中，該小有機分子庫為苯并二氮類、異戊烯類、噻唑啉酮類、間噻噪酮類、吡咯烷類、嗎啉化合物或二氮雜二酮類的庫。在某些實施方式中，該化合物在池中篩選。鑒定得到陽性池后，對該池的單個化合物進行單獨測試。在某些實施方式中，該池的大小為至少2個、至少5個、至少10個、至少25個、至少50個、至少75個、至少IOO個、至少150個、至少200個、至少250個或至少500個化合物。本領(lǐng)域已知的用于檢測蛋白表達的任意方法均可用于檢測根據(jù)本發(fā)明生成的功能通讀蛋白的表達。該種方法的非限制性范例包括免疫測定例如Western印跡，免疫沉淀4妄連十二烷基石克酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，免疫細胞化學(xué)，放射性免疫測定，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)，"夾心"免疫測定，免疫沉淀測定，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴散沉淀素反應(yīng)，免疫214擴散測定，凝集測定，補體-固定測定，免疫放射分析，熒光免疫測定，蛋白A免疫測定以及使用特異性針對目標(biāo)基因編碼的多肽的抗體的表位標(biāo)記。在具體的實施方式中，在免疫測定中采用的抗體對免疫測定中所用的多肽的C末端部分具有特異性。這些均為常規(guī)測定并在本領(lǐng)域公知(例如，參見Ausubel等人編，1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,其全文在此引用作為參考)。下文簡述了示范性的免疫測定(但并非進行限制)。免疫沉淀方案通常包括在添加了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)的裂解緩沖液如RIPA緩沖液(l%NP-40或TritonX-100、1%脫氧膽酸鹽、0.1%SDS、0.15MNaCl、pH7.2的0.01M磷酸鈉、lQ/。特血爾(Trasylol))中裂解一定量的細胞，向細胞裂解產(chǎn)物添加識別該抗原的抗體，在40。C下培養(yǎng)一定時間(例如，1-4小時)，向細胞裂解產(chǎn)物添加蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠，在4(TC下培養(yǎng)一小時或更多時間，以裂解緩沖液洗滌珠子并將珠子重新懸浮于SDS/樣本緩沖液中?？贵w免疫沉淀特定抗原的能力可通過，例如，western印跡分析進行評價。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解可對該參數(shù)進行調(diào)整以提高抗體與抗原的結(jié)合，并降低背景干擾(例如，以瓊脂糖珠預(yù)先去除細胞裂解產(chǎn)物)。有關(guān)免疫沉淀方案的進一步討論可參見，例如Ausubel等人編，2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,第10章。Western印跡分析通常包括制備蛋白樣本，將蛋白樣本在聚丙烯酰胺凝膠(例如，根據(jù)抗原的分子量選擇8G/。-20Q/。SDS-PAGE)中進行電泳，將蛋白樣本從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜如硝化纖維、PVDF或尼龍上，在封閉液(例如，含有3%BSA或脫脂牛奶的PBS)中封閉膜，以洗滌緩沖液(例如，PBS-Tween20)清洗膜，以稀釋于封閉緩沖液的一抗(識別該抗原的抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中清洗膜，以稀釋于封閉緩沖液的結(jié)合至酶底物(例如，辣根過氧化酶、堿性磷酸酶)或放射性底物(例如，32p或1251)的二抗(可識別該一抗，例如抗人抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中清洗膜，并檢測抗原的存在。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解可對該參數(shù)進行調(diào)整以提高檢測到的信號并降低背景噪音。有關(guān)western印跡方案的進一步討論可參見，例如Ausubel等人編，2003，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork，第10章。ELISA包括制備抗原，以抗原涂布96孔微量滴定板的孔，向孔中添加與可測化合物如酶底物(例如，辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)結(jié)合的一抗(其識別該抗原)并孵育一段時間，檢測抗原的存在。在ELISA中該目標(biāo)抗體并非必須連接至可測化合物；事實上可向孔中添加一種結(jié)合了可測化合物的二抗(可識別一抗)。此外，除了用抗原涂布微孔外，也可以使用抗體涂布微孔。在這一情況下，在添加目標(biāo)抗原后可能要向涂布的微孔中添加結(jié)合了可測化合物的二抗。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解可對該參數(shù)進行調(diào)整以提高檢測到的信號以及其它本領(lǐng)域已知的ELISA變量。有關(guān)ELISA的進一步討論可參見，例如Ausubel等人編，2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。檢測由包含無義突變的報告基因編碼的功能通讀蛋白活性的方法將隨所用的報告基因而變化。各種報告基因的測定已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，熒光素酶、P-半乳糖苷酶("(3-gal")、P-葡萄糖醛酸苷酶("GUS")、(3-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶("CAT")以及堿性磷酸酶("AP")為可在底物存在下進行分析并可適用于高通量篩選的酶。例如，熒光素酶、P-半乳糖苷酶("(3-gar)和》咸性磷酸酶("AP")的反應(yīng)產(chǎn)物可通過光成像(例如，熒光素酶)、分光光度吸收(例如，"P-gal")或熒光(例如，AP)的變化進行測定。光輸出、吸收和/或熒光的變化的測定可在高通量篩選中簡單地采用。例如，(3-gal活性可通過酶標(biāo)儀進行檢測。綠色熒光蛋白("GFP")活性可通過熒光的變化進行檢測。例如，對于在488nm下發(fā)熒光的突變GFP，可采用標(biāo)準(zhǔn)的熒光激活細胞分類("FACS")設(shè)備根據(jù)GFP活性分離細胞。以下描述了基于細胞的報告基因測定的具體實例制備報告構(gòu)建體，該報告構(gòu)建體能夠基于熒光素酶介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光對翻譯通讀的水平進行定量評價。以在氨基酸位置l卯處包含提前終止密碼子的北美螢火蟲熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染生長于培養(yǎng)基(例如，含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基)中的細胞(例如，HEK293細胞)。代替通常存在于所述位點的蘇氨酸密碼子(腺苷-胞咬-腺苷(ACA))，通過定點突變導(dǎo)入3個可能的無義密碼子(UAA、UAG或UGA)中的一個以及在無義密碼子后的環(huán)境(contextually)重要的下游+1位置處的4個可能的核苷酸(C、U、A、G)中的一個。圖1才是4共了整合進入這些構(gòu)建體的多類熒光素酶mRNA的示意圖。將不同濃度的目標(biāo)化合物、陽性對照(例如，慶大霉素)或陰性對照(例如，僅溶劑(例如，PBS、DMSO或水))添加到該細胞，大約四小時后檢測生成的發(fā)光量。發(fā)光可采用ViewLuxCCD成像儀(Perkin-Elmer，Turku，芬蘭)進行檢測。發(fā)光數(shù)據(jù)被歸一化為由溶劑單獨產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，相對背景的抑制倍數(shù)計算為化合物發(fā)光單位/溶劑發(fā)光單位。在對照細胞(僅用溶劑處理)中，焚光素酶基因的翻譯被熒光素酶mRNA中存在的提前終止密碼子中斷，并生成不能有效催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的截短的、非功能的熒光素酶蛋白。然而，當(dāng)能夠誘導(dǎo)提前終止密碼子的核糖體通讀的化合物存在時，可生成全長熒光素酶蛋白，并能夠?qū)ο鄬τ趯φ盏南鄳?yīng)發(fā)光進行量化。以下描述了無細胞報告基因測定的具體實例采用MegaScript體外T7-啟動子轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，Austin,TX)制備在位置190處具有提前終止密碼子(具有+lA)的熒光素酶mRNA。將該mRNA與從細胞(例如，HeLa細胞)制備的包含核糖體和其它翻譯必需細胞因子的細胞質(zhì)萃取物進行孵育。將不同濃度的目標(biāo)化合物、陽性對照(例如，具有無義抑制活性的化合物)或陰性對照(例如，單獨的溶劑(例如，PBS、DMSO或水))添加入該體外反應(yīng)，大約4小時后檢測生成的發(fā)光量。發(fā)光可采用ViewLuxCCD成像儀(Perkin-Elmer，Turku，芬蘭)進行檢測。發(fā)光數(shù)據(jù)被歸一化為由溶劑單獨產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，相對背景的抑制倍數(shù)計算為化合物發(fā)光單位/溶劑發(fā)光單位。在對照萃取物(僅用溶劑處理)中，熒光素酶mRNA的翻譯被熒光素酶mRNA中存在的提前終止密碼子中斷，并生成不能有效催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的截短的、非功能的熒光素酶蛋白。然而，當(dāng)能夠誘導(dǎo)提前終止密碼子的核糖體通讀的化合物存在時，可生成全長熒光素酶蛋白，并能夠?qū)ο鄬τ趯φ盏南鄳?yīng)發(fā)光進行量化。如果化合物能夠在不含核的細胞質(zhì)萃取物中誘導(dǎo)全長熒光素酶蛋白的生成，則表明該化合物的無義通讀活性發(fā)生在翻譯水平而非轉(zhuǎn)錄水平。鼠的細胞中進行評價，該細胞包含含有與人類疾病相關(guān)的無義突變的基因。該w血小鼠在肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子23中具有無義突變，其可在肌營養(yǎng)不良mRNA中生成提前UAA(+lA)終止密碼子(Sicinski等人，Science244:1578-1580(1989))，并導(dǎo)致幾乎完全不生成全長蛋白。以下描述了用來自動物模型的細胞進行的報告基因測定的具體實例，該細胞含有與人類疾病相關(guān)的無義突變的基因原代成肌細胞通過已建立的方法耳又自1天大新生w血小鼠(Neville等人(編)，MethodsinCellBiology,第52巻，第85-116頁，SanDiego,AcademicPress(1998);以及Barton-Davis等人，J.Clin,Invest.104(4):375-381(1999))。吸附至塑料碟后，在添加了目標(biāo)化合物或陽性對照(即，具有無義密碼子抑制活性的化合物)的含血清培養(yǎng)基中使細胞分化成為肌管。每隔一天補充培養(yǎng)基和化合物，并在12日通過免疫熒光檢測肌營養(yǎng)不良蛋白和肌球蛋白。各自的陰性和陽性對照包含未處理的附血和野生型C57/B16小鼠原代肌培養(yǎng)物。染色的程度采用a-、+1、+2、+3和+4半定量等級進行評價。具有無義抑制活性的目標(biāo)化合物將導(dǎo)致生成全長肌營養(yǎng)不良蛋白。包含了具有與人類疾病相關(guān)的無義突變的基因的動物模型系統(tǒng)可用于確認在報告測定中鑒定的化合物的無義密碼子抑制劑活性。例如，化合物的無義密碼子抑制劑活性可在w血或CFTR小鼠模型中進行評價。針對人類疾病的其它動物模型系統(tǒng)的范例參見，例如，國際公布WO2004/001010，其全文在此引用作為參考。在具體的實例中m血小鼠在2至12或更多星期的期間內(nèi)被施用目標(biāo)化合物、陽性對照(即，具有無義密碼子抑制活性的化合物)或陰性對照(例如，單獨的運載體)。所有的小鼠以Peptamen⑧等張液體要素飲食(NestW，血清CK活性通過市售的NADH-連接的動力學(xué)測定進行評價(DiagnosticChemicalsLimited,Oxford,CT))進行喂養(yǎng)。用于血清肌酸酐激酶(CK)檢測的血液以不同的時間間隔采集。在治療的末期，將小鼠處死。采集血液以評價血清CK水平。去除脛前(TA)肌和趾長伸(EDL)肌以進行后續(xù)分析。將TA219快速冷凍以進行肌營養(yǎng)不良蛋白整合進入橫紋肌的免疫熒光分析。將EDL用于功能(包括離心收縮損傷的強度和易感性)測試。肌營養(yǎng)不良蛋白的一抗為市售的針對對應(yīng)人肌營養(yǎng)不良蛋白的羧基末端附近序列的合成肽的兔多克隆抗體(Abcam15277)。該抗體與小鼠肌營養(yǎng)不良蛋白交叉反應(yīng)。該表位位于m血小鼠的肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子23編碼的提前終止位點的更下游(更朝向肌營養(yǎng)不良蛋白的羧基末端)。以連接在入射熒光顯微鏡的數(shù)碼攝像機捕捉圖像，并以圖像分析軟件進行處理。采用專門設(shè)計的裝置在EDL肌肉(包括可制備雙側(cè)制備物的動物中的各EDL肌肉)上進行分離的全肌肉力學(xué)研究(Barton-Davis等人，PNASUSA95(26):15603-15607(1998))。對EDL的比力(每單位橫截面積上的力)進行分析。對針對一系列5個離心收縮(其牽張為10%的最佳長度)誘導(dǎo)的機械損傷所提供的保護進行評價；損傷測定為第一和最后離心收縮之間的力的百分比損失。血清CK活性采用市售的NADH連接的動力學(xué)測定(DiagnosticChemicalsLtd.,Oxford,CT)進行評價。相對于未處理m血小鼠的肌肉，以具有無義密碼子抑制活性的化合物處理的附血小鼠會顯示出肌營養(yǎng)不良蛋白的可見著色。相對于未處理附血小鼠或運載體對照處理的w血小鼠的平均EDL力，以具有無義密碼子抑制活性的化合物處理的m血小鼠還提高了平均EDL比力。以具有無義密碼子抑制活性的化合物處理的附血小鼠還會保護以免受離心收縮損傷。此外，以具有無義密碼子抑制活性的化合物處理的附血小鼠相對于未處理附A小鼠或運載體對照處理的m血小鼠會降低血清CK。在另一具體的實例中為了評價目標(biāo)化合物對無義密碼子抑制的作用，以該化合物、陰性對照或陽性對照處理c/^-/-i^aP-/7CF77-0542^小鼠一周或更長時間。陰性對照組包含未處理的c/化-/-i^S尸-;2CF77-G54Z^d、鼠。陽性對照組包含接受了已知具有無義密碼子抑制活性的化合物的q/^-/-Fv^P-ZzCFTTe-OS^Z小鼠。在十二指腸切片上進行CFTR特異性免疫熒光染色以證實CFTR的生成。也可評價目標(biāo)化合物對CFTR-介導(dǎo)的經(jīng)上皮氯電導(dǎo)的功能影響。具有無義密碼子抑制活性的化合物將導(dǎo)致定位于十二指腸分粘膜腺體的上皮頂端區(qū)的CFTR免疫熒光染色的陽性結(jié)果。此外，在添加毛喉素而導(dǎo)致環(huán)腺脊酸(cAMP)升高后，具有無義突變抑制活性的化合物還會導(dǎo)致經(jīng)上皮氯電導(dǎo)的強烈上升。一旦抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物被鑒定，則該化合物的結(jié)構(gòu)可采用公知的技術(shù)或者通過參考預(yù)定的規(guī)范進行測定。例如，該化合物的結(jié)構(gòu)可通過質(zhì)譜、NMR、振動光譜或X射線晶體學(xué)進行測定。為了評價化合物對此處所述的報告測定的部分作用是否是通過報告基因mRNA水平的變化來介導(dǎo)的，采用實時反轉(zhuǎn)錄PCR測定法(Bustin，J.Mol.Endocrinol.25(2):169-193(2000))。以高濃度的目標(biāo)化合物處理生長于培養(yǎng)基(例如，含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基)中的細胞(例如，HEK293細胞)48小時。該實驗還包括陰性對照細胞(以單獨的溶劑處理)和陽性對照細胞(以已顯示能使含有無義突變的mRNA穩(wěn)定的化合物處理)。從細胞裂解產(chǎn)物萃取總RNA。采用針對報告基因mRNA和18S核糖體RNA(rRNA)的引物進行定量實時PCR。以18SrRNA的測量作為起始原料數(shù)量的歸一化因子，計算處理細胞相對對照細J包的4艮告基因mRNA的水平?；瘜W(xué)足跡法可用于對目標(biāo)化合物和rRNA相互作用的位點進行定位。在這些實驗中，將由細胞(例如，HeLa細胞)制備的核糖體與運載體對照或目標(biāo)化合物共同孵育，然后與用能改變rRNA結(jié)構(gòu)的2種化學(xué)修飾劑(疏酸二甲酯或凱托沙(kethoxal))進行處理?；瘜W(xué)修飾反應(yīng)后，分離rRNA，并采用末端標(biāo)記的，被雜交至人28S、18S和5.8SrRNA的不同區(qū)域的寡核香酸進行引物延伸分析。在6%聚丙烯酰胺凝膠上分辨引物延伸的產(chǎn)物。rRNA對硫酸二甲酯或凱托沙的化學(xué)修飾的可及性可顯示為凝膠上條帶強度的出現(xiàn)、消失或變化；任意該類事件可認為是該化合物對rRNA上特定區(qū)域的潛在作用的指示。該凝膠上條帶的出現(xiàn)與對化學(xué)修飾劑的新導(dǎo)入的可及性一致(例如，作為引起rRNA中構(gòu)象變化的化合物相互作用的結(jié)果)。相反地，條帶的消失與對化學(xué)修飾劑的新導(dǎo)入的不可及性相一致(例如，由于化合物結(jié)合或rRNA中堿基配對的改變而對位點產(chǎn)生保護)。根據(jù)其誘導(dǎo)提前終止密碼子的特異性核糖體通讀的能力和不誘導(dǎo)普通終止密碼子的非特異性核糖體通讀的能力，在體外評價目標(biāo)化合物的特異性。例如，將熒光素酶報告體連接至其它蛋白(例如，CD40蛋白)。CD40是由B-淋巴細胞和其它免疫細胞表達的細胞表面受體；它的mRNA^是供合適的3'-UTR序列且該蛋白具有通過Western印跡檢測潛在蛋白延伸的適當(dāng)大小。在該測定中，以編碼熒光素酶-CD40融合蛋白的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染生長于培養(yǎng)基(例如，含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基)的細胞(例如，HEK293細胞)。代替通常存在于熒光霉素的位置190處的蘇氨酸密碼子(ACA)，通過定點突變導(dǎo)入UGA無義密碼子。此外，將CD40蛋白的3'-UTR導(dǎo)入到熒光素酶UAA終止密碼子的下游。對于各個構(gòu)建體，在熒光素酶基因的5'端包含了6個222組氨酸(6X-His),以方便該目標(biāo)蛋白從細胞裂解產(chǎn)物中純化。此外，還包含XpressTM表^f立標(biāo)記，以允i午在Western印跡分析時分離該目標(biāo)蛋白。圖2顯示了由這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的mRNA的特征以及在各種條件和假定下的預(yù)期結(jié)果。在未處理的細胞中，應(yīng)當(dāng)僅觀察到截短的熒光素酶蛋白(圖2A)。在用具有無義抑制活性、誘導(dǎo)普通終止密碼子特異性通讀的化合物處理的細胞中，應(yīng)當(dāng)同時生成截短和全長熒光素酶蛋白(圖2B)。然而，如果化合物具有誘導(dǎo)普通終止密碼子的非特異性核糖體通讀的能力，則可預(yù)期在位置190處插入的提前終止密碼子和熒光素酶ORF末端的普通終止密碼子會發(fā)生通讀。這將導(dǎo)致熒光素酶蛋白產(chǎn)生CD303'-UTR編碼的84個氨基酸的延伸，且通過Western印跡會檢測到9kD的分子量增加(從66kD至75kD)。如果這種情況發(fā)生，則該構(gòu)建體的分子量就會增加，且會生成所有的3種蛋白(截短的、熒光素酶以及熒光素酶-CD40)(圖2C)。進一步制備構(gòu)建體作為標(biāo)記。陰性對照構(gòu)建體僅編碼該全長熒光素酶mRNA(圖2D)。該陰性對照構(gòu)建體僅編碼該全長熒光素酶mRNA(圖2D)。陽性對照構(gòu)建體編碼所述延長的熒光素酶-CD40mRNA，并通過在熒光素酶ORF的末端構(gòu)建有義(非終止)突變(CAA)產(chǎn)生(圖2E)。用目標(biāo)化合物處理細胞一段時間(例如，72小時)，然后制備細胞裂解產(chǎn)物。將細胞裂解產(chǎn)物與設(shè)計來捕獲所述6X-His標(biāo)記蛋白的磁性鎳-帶電瓊脂糖珠相混合。在蛋白捕獲步驟之后，在12.5%聚丙烯酰胺凝膠上分離該蛋白，并采用抗Xpress抗體進行Western印跡分析?？梢允褂?維凝膠電泳進行有關(guān)非特異性終止密碼子通讀理論問題的更通用但靈敏性和特異性較低的方法(OTarrell,J.Biol.Chem.250(10):4007-421(1975))。可誘導(dǎo)普通終止密碼子的核糖體通讀的化合物可能會產(chǎn)生異常延長的蛋白，并由于分子量的增加和/或電荷的改變可能會導(dǎo)致電泳遷移模式隨之改變。在該種測定的一個實例中，以目標(biāo)化合物或運載體處理雙份細胞(例如，HDEK293細胞)樣本一段時間(例如，48小時)，該細胞在熒光素酶報告體的190氨基酸位置處具有UGA(+1A)終止密碼子。在標(biāo)準(zhǔn)的基于細胞的報告測定中檢測等分的細胞以確定化合物誘導(dǎo)的熒光素酶核糖體通讀的證據(jù)。進行2維電泳并用Phoretix軟件進行計算分析。通過評價化合物在體內(nèi)對單個富集mRNA翻譯的作用，可在動物疾病模型中對非特異性終止密碼子通讀的潛力進行更具體的實驗。例如，每天以目標(biāo)化合物、陽性對照或運載體處理w瓜小鼠一段時間(例如，28天)，然后從動物個體中采集肌肉組織。同樣對來自未處理的野生型C57/B10小鼠的肌肉進行分析。另外，已知(3-微管蛋白(小鼠肌肉中的富含蛋白)的mRNA在ORF的末端具有UAA(+lA)終止密碼子，且在其3'-UTR下游具有第二框內(nèi)UAA(+lA)終止密碼子。在這2個終止密碼子之間是126個核脊酸的間隔序列，其理論上可編碼小鼠P-微管蛋白的42個氨基酸延伸。圖3提供了P-微管蛋白mRNA的示意圖。如果目標(biāo)化合物能夠誘導(dǎo)終止密碼子的非特異性核糖體通讀，可以預(yù)期該(3-微管蛋白的大小將增加$42個氨基酸(~5kD),且該變化可通過Western印跡檢測到。根據(jù)其誘導(dǎo)提前終止密碼子的特異性核糖體通讀的能力和不誘導(dǎo)普通終止密碼子的非特異性核糖體通讀的能力，可在施用了所述無義密碼子抑制劑的個體(具體地是人)的生物樣本中評價該無義密碼子抑制劑的特異性。例如，可在給藥前和給藥后的不同時間點(例如，2、4、6、8、12、24、48和72小時)從無義密碼子抑制劑處理的個體(例如，人)獲耳又血液樣本。從該個體獲取的血液樣本或來自血液樣本的樣本(例如，PBMC和血漿)可在分析前匯集。例如，來自相同時間點的相同性別的個體的血液樣本或血液樣本的樣本可在分析前匯集。可替代地，來自各個個體的血液樣本或該血液樣本的樣本可單獨地分析。分離外周血單核細胞(PBMC)和血漿，并任選地在使用前進行冷凍和貯存。將PBMC和血漿加載至聚丙蹄酰胺凝膠，該聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)優(yōu)化以獲得延長的通讀蛋白產(chǎn)物之間的最大分離，進行電泳，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜(或其它適當(dāng)?shù)哪ぃ缒猃埬?進行免疫印跡。蛋白，例如C-反應(yīng)蛋白(CRP)、B2微球蛋白和胱抑素C可用于評價普通終止密碼子的非特異性通讀。野生型和相應(yīng)的延長的蛋白可用作對照?？刹捎迷摫辉u價蛋白的特異性一抗和包含辣根過氧化酶結(jié)合物的該一抗的特異性二抗進行免疫印跡。施用該無義密碼子抑制劑的個體可包括已知具有包含無義突變的基因的個體，在這種情況下，由該基因編碼的功能通讀蛋白的生成可用作無義密碼子的特異性通讀的陽性對照。施用該無義密碼子抑制劑的個體還可包括未知是否具有包含無義突變的基因的個體。在這種情況下，來自用無義密碼子抑制劑處理的個體的血漿可被添加至以包含提前終止密碼子的報告基因(例如，在氨基酸殘基190處包含UGA提前終止密碼子的螢火蟲熒光素酶報告基因)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞(例如，HEK293細胞)的培養(yǎng)基，或與細胞萃取物和含有提前終止密碼子的報告基因共同醉育。測定處理的細胞或處理的細胞萃取物中的提前終止密碼子的通讀，作為陽性對照。根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物的毒性和/或效力可在細胞培養(yǎng)物或試驗動物中通過標(biāo)準(zhǔn)的藥物程序進行測定，例如測定LD5o(50X群體的致死劑量)和ED5o(50X群體的治療有效劑量)。用于評價本發(fā)明鑒定的化合物的細胞毒性的細胞和細胞系包括但不限于外周血單核細胞(PBMC)、Caco-2細胞和Huh7細胞。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，可以LD50/ED50來表示。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的本發(fā)明的化合物。盡管也可使用顯示具有毒副作用的本發(fā)明的化合物，但在設(shè)計傳遞系統(tǒng)的時候應(yīng)當(dāng)注意將該試劑耙向作用組織的位點以最小化對未感染細胞的潛在損傷，從而減少副作用。從細胞培養(yǎng)測定和動物試驗獲得的數(shù)據(jù)可用于制定本發(fā)明的化合物在人體中使用的劑量范圍。該試劑的劑量優(yōu)選處于包含ED50且毒性很小或沒有毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。該劑量可根據(jù)采用的劑型和給藥途徑在該范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明的方法中所使用的任何試劑，其治療有效劑量可通過細胞培養(yǎng)分析進行初始估計。劑量可以在動物模型中制定，以得到包含細胞培養(yǎng)中測得的IC50(即達到癥狀最大抑制一半時該化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可用于更準(zhǔn)確地制定有用的人體劑量。血漿中的水平可通過，例如，高效液相色譜進行測定。毒性測定的具體實例包括如下將運載體或各劑量的所述化合物每日施用至雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠一段時間(例如，28天)。多個大鼠/性別/組在一段時間后(例如，28天)終止，一些其它大鼠/性別/組則在給藥期后進行一額外的恢復(fù)期(例如，4周的恢復(fù)期)，剩余的大鼠/性別/組用于在給藥后的數(shù)小時和數(shù)天中(例如，在第1和28天給藥后0.5、1.5、4、8、12和24小時)進行毒理動力學(xué)評i"介。將運載體或各劑量的所述化合物施用至雄性和雌性beagle犬一段時間(例如，28天)。多個犬/性別/組在給藥期后終止。其它犬/性另'j/組繼續(xù)進行一恢復(fù)期(例如，4周的恢復(fù)期)并進行毒理動力學(xué)評價，在給藥后的數(shù)小時226和數(shù)天(例如，在第1和28天給藥后1、2、4、8、12、16和24小時)中采集樣本。通過HPLC進行劑量分析以確認動物接受了所述預(yù)期劑量。每天進行兩次籠側(cè)觀察，每周記錄具體的臨床觀察和體重。對治療期的食物消耗進行記錄。在治療前和治療期最后一天進行檢眼鏡檢查和心電圖(僅針對犬)。在基線處(僅針對犬)和在治療期的最后一天(所有動物)以及在恢復(fù)動物的恢復(fù)期評價血液學(xué)、凝血、臨床化學(xué)和尿分析參數(shù)。在治療或恢復(fù)期的最后的步驟包括進行總體的尸體解剖檢查，取出器官并稱重，對保藏的組織進行福爾馬林固定以供顯微鏡分析。采用對各個動物種類有效的HPLC和串聯(lián)質(zhì)譜法進行血漿的化合物濃度分析。采用非房室方法評價藥代動力學(xué)參數(shù)。采用單因素方差分析(ANOVA)分析體重、食物消耗、臨床病理學(xué)和器官重量，并以Dunnett檢驗對各劑量與對照進行兩兩比較。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所采用的所述無義密碼子抑制劑誘導(dǎo)提前終止密碼子的特異性核糖體通讀，但不誘導(dǎo)普通終止密碼子的非特異性通讀。可通過本領(lǐng)域已知或是此處所述的任意測定來評價目標(biāo)化合物對提前終止密碼子的特異性核糖體通讀。本發(fā)明所用的無義密碼子抑制劑可與28SrRNA、18SrRNA和/或5.8SrRNA相互作用。在某些實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑結(jié)合28SrRNA。在其它實施方式中，本發(fā)明所采用的該無義密碼子抑制劑不結(jié)合18SrRNA。在一些實施方式中，該無義密碼子抑制劑通過與另一蛋白的相互作用間接結(jié)合至rRNA。在某些其它實施方式中，本發(fā)明所采用的明顯的抗菌活性。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明所用的該無義密碼子抑制劑在全身(例如，口服)施用至個體(優(yōu)選人)時具有極少(如有)的不良或不需要的副作用。在具體的實施方式中，該無義密碼子抑制劑在口服施用至個體(優(yōu)選人)時不引起腎衰竭和/或聽力問題(例如，聽力損失)。5.5功能通讀蛋白本發(fā)明提供了由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白，該蛋白由此處所述的方法生成。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白為功能非野生型蛋白。在具體的實施方式中，該功能通讀蛋白為全長非野生型蛋白。在其它的實施方式中，該功能通讀蛋白與相應(yīng)的野生型蛋白由相同的氨基酸序列組成。本發(fā)明提供了由包含突變(例如，刪除、插入和/或替換)的核酸序列編碼的功能通讀蛋白，該突變導(dǎo)致由該核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA中的終止密碼子不同于編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中的終止密碼子。在某些實施方式中，該功能通讀蛋白為功能非野生型蛋白。在具體的實施方式中，該功能通讀蛋白為全長非野生型蛋白。在具體的實施方式中，本發(fā)明提供了由包含突變(例如，刪除、插入和/或替換)的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的生產(chǎn)方法，該突變導(dǎo)致由該核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA中的終止密碼子不同于普通終止密碼子(即，編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中的終止密碼子)，該方法包括將包含該核酸序列的細胞與無義抑制劑相接觸?？商娲?，該方法包括將具有該核酸的無細胞萃取物與無義密碼子抑制劑相接觸。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了由包含突變(例如，刪除、插入和/或替換)的基因編碼的功能通讀蛋白的生產(chǎn)方法，該突變導(dǎo)致由該基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的終止密碼子不同于普通終止密碼子(即，編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子)，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑。根據(jù)這些實施方式，該無義密碼子抑制劑通讀該不同的終止密碼子至另一終止密碼子以生成功能通讀蛋白。在具體實施方式中，本發(fā)明提供了由包含基因編碼區(qū)無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白的生產(chǎn)方法，該方法包括將含有該基因的細胞與無義密碼子抑制劑相接觸。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了由包含基因編碼區(qū)無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白的生產(chǎn)方法，該方法包括向有此需要的個體(優(yōu)選人)施用有效量的無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該個體患有或可能患有或易患與該基因的無義突變相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白在細胞中發(fā)現(xiàn)于相應(yīng)野生型蛋白被發(fā)現(xiàn)的相同位置。例如，在某些實施方式中，該功能通讀蛋白和相應(yīng)的野生型蛋白均發(fā)現(xiàn)于細胞表面。在其它實施方式中，該功能蛋白發(fā)現(xiàn)的位置不同于發(fā)現(xiàn)相應(yīng)野生型蛋白的位置。在具體的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白發(fā)現(xiàn)于細胞核，而相應(yīng)的野生型蛋白發(fā)現(xiàn)于細胞質(zhì)或細胞表面。在另一實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白發(fā)現(xiàn)于細胞質(zhì)或細胞表面，而相應(yīng)的野生型蛋白發(fā)現(xiàn)于細胞核。功能通讀蛋白在細胞中/上的位置可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進行檢測/確定。在具體的實施方式中，功能通讀蛋白在細胞中/上的位置可通過免疫焚光進行檢測/確定。在某些實施方式中，如下免疫熒光法被用于檢測/確定功能通讀蛋白在細胞中/上的位置1.在Coplin釭中用PBS使細胞復(fù)水(例如，約5分鐘)。2.用免疫前小鼠血清封閉細胞一段時間(例如，20分鐘)。3.應(yīng)用一抗一段時間。4.在PBS中洗滌玻片2-5次，然后與二抗孵育一段時間。5.通過染色(例如，DAPI染色)鑒定核。6.在數(shù)字共焦熒光顯微鏡上對細胞成像，并以例如IPLab光譜軟件捕獲圖像。7.將染色分類/評分為(0)缺失、(l)核周、(2)外周和(3)表面。8.捕獲圖像，例如在配備了步進馬達、濾光輪裝置(LudiElectronicsProducts,Hawthorne,NY)禾口83,000濾光裝置(ChromaTechnology,Brattleboro:VT)以及SenSys-cooled電荷耦合高分辨率相機(Photometries,Tucson,Az)的Olympyus1X170倒置式表面熒光顯微鏡捕獲圖像。9.對圖4象進行部分去巻積，例如通過IPLab軟件(Scanalytics,Fairfax,VA)對圖像進行部分去巻積。在具體的實施方式中，由本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白為功能CFTR通讀蛋白。在某些實施方式中，通過本領(lǐng)域已知的方法(例如，免疫熒光)檢測/確定該功能CFTR通讀蛋白位于鼻細胞的核周、外周和/或表面。在優(yōu)選的實施方式中，通過免疫熒光檢測/確定該功能CFTR通讀蛋白位于鼻細胞的表面。在具體的實施例中，通過如下免疫焚光法檢測/確定位于核周、外周和/或表面的該功能CFTR通讀蛋白的數(shù)量1.在C叩lin缸中用PBS使鼻細胞復(fù)水(例如，約5分鐘)。2.用免疫前小鼠血清封閉細胞一段時間(例如，20分鐘)。3.用一抗，例如1:100的稀釋的一抗(例如，針對全長CFTR羧基末端4氨基酸的小鼠單克隆抗-CFTR24-l)應(yīng)用一段時間(例如，兩小時)。2304.在PBS中洗滌玻片三次，然后與二抗(例如，山羊抗小鼠IgG，AlexaFluor596，MolecularProbes,Portland,Oregon)孵育一段時間(例如，一小時)。5.通過DAPI染色鑒定核。6.在數(shù)字共焦熒光顯微鏡上對細胞成像，并用例如IPLab光譜軟件捕獲圖像。7.將CFTR染色分類/評分為(0)缺失、(l)核周、(2)外周和(3)表面。在具體的實施方式中，對來自各玻片隨機區(qū)域的至少50個上皮細胞進行評價和評分。8.捕獲圖像，例如在配備了步進馬達、濾光輪裝置(LudiElectronicsProducts,Hawthorne,NY)和83,000濾光裝置(ChromaTechnology,Brattleboro，VT)以及SenSys-cooled電荷耦合高分辨率相機(Photometries,Tucson,Az)的OlympyusIX170倒置式表面熒光顯微鏡捕獲圖像。9.對圖像進行部分去巻積，例如通過IPLab軟件(Scanalytics,Fairfax,VA)對圖像進行部分去巻積。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別僅在該功能通讀蛋白中由所述提前終止密碼子編碼的位置處插入的氨基酸殘基。在其它實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白與相應(yīng)野生型蛋白的區(qū)別在于(i)在該功能通讀蛋白中由提前終止密碼子編碼的位置處插入的氨基酸殘基；以及(ii)在該功能通讀蛋白中由提前終止密碼子編碼的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基。由本發(fā)明的方法生成的功能通讀蛋白的氨基酸序列可通過對包含目標(biāo)核酸序列(即，包含該目標(biāo)無義突變的核酸序列)的細胞生成的蛋白進行測序2來測定。在某些實施方式中，該細胞天然包含該核酸序列。在具體的實施方式中，該細胞為來自于正接受或?qū)⒁邮軣o義密碼子抑制劑的患者的細胞。在其它實施方式中，該細胞經(jīng)工程改造后包含該核酸序列。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白在翻譯該蛋白的RNA中的無義密碼子的對應(yīng)位置處包含酪氨酸、半胱氨酸或色氨酸。在具體的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白在翻譯該蛋白的RNA中的UAA或UAG無義密碼子的對應(yīng)位置包含酪氨酸。在其它實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白在翻譯該蛋白的RNA中的UAG無義密碼子的對應(yīng)位置包含半胱氨酸或色氨酸。下表IO提供了與基因無義突變相關(guān)的疾病的列表。該表提供了與該疾病相關(guān)的基因名稱，該基因中至少編碼區(qū)的核酸的GenBank編號，由該基因編碼的蛋白的GenBank編號，與該疾病相關(guān)的基因中發(fā)現(xiàn)的代表性無義突變，以及有關(guān)與該基因無義突變相關(guān)的疾病的參考文獻。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生成的該功能通讀蛋白在表IO中所述的氨基酸殘基(具有與疾病相關(guān)的基因無義突變)的位置之外的位置包含相應(yīng)野生型蛋白的氨基酸序列。根據(jù)該實施方式，在所述位置的氨基酸殘基并非在相應(yīng)野生型蛋白中發(fā)現(xiàn)的1種氨基酸殘基，而是其它19種氨基酸殘基中的任意一種。因此，例如，對于3-M綜合癥，該功能通讀蛋白在位置1445處可包含除了精氨酸外的任意其它氨基酸殘基。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage238</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage239</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage240</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage241</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage242</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage243</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage244</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage245</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage246</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage247</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage248</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage249</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage250</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage251</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage252</column></row><table>5.6患者群體5.6.1優(yōu)選的個體和遺傳狀況本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù)防、治療和/或控制患有或可能患有或易患(例如，由于環(huán)境和/或遺傳因素)與基因無義突變相關(guān)的疾病(例如，本發(fā)明所述的疾病)的患者(例如，胚胎、胎兒、嬰兒(新生兒至1歲的人)、兒童(l歲至18歲的人)、成年人(18歲或更大的人)和老年人(65歲及以上的人))。在一個實施方式中，該患者為兒童或青少年(5至13歲的人)。在另一實施方式中，該患者為男性。在某些實施方式中，該患者為男性兒童或青少年(5至13歲的人)。在具體的實施方式中，該患者為患有肌肉萎縮癥(如杜興肌營養(yǎng)不良)的男性兒童或青少年(5至13歲的人)。在另一實施方式中，該患者為女性。在具體的實施方式中，該患者為女性兒童或青少年(5至13歲的人)。在具體的實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù)防、治療和/或控制患有或可能患有或易患與基因無義突變相關(guān)的疾病(例如，本發(fā)明所述的疾病)的胚胎或胎兒。根據(jù)該實施方式中，無義密碼子抑制劑被施用至懷孕女性，并通過胎盤到達該胚胎或胎兒。上文表10提供了與基因無義突變相關(guān)的疾病以及基因無義突變的代表性范例的列表。在某些實施方式中，該施用了無義密碼子抑制劑的患者為具有表10所列疾病的患者，其具有與該疾病相關(guān)的一種或多種代表性基因無義突變。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明施用了無義密碼子抑制劑的所述患者在最近數(shù)天、1周、2周、1個月、3個月、6個月或1年內(nèi)未接受另一療法。在具體的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明施用了無義密碼子抑制劑的該患者從未其它實施方式中，根據(jù)本發(fā)明施用了無義密碼子抑制劑的該患者曾在最近分鐘、數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)接受了另一療法。本發(fā)明包括聯(lián)合施用無義密碼子抑制劑與另一類型的療法(例如支持療法和/或鎮(zhèn)痙劑)。對于囊性纖維化，支持療法的范例包括胰腺酶替代品(例如，脂肪酶)、粘液溶解劑(例如，(X鏈道酶)、支氣管擴張劑、類固醇和抗生素。對于杜興肌營養(yǎng)不良，支持療法的范例包括皮質(zhì)類固醇和抗生素。在具體的實施方式中，該患者未以氨基糖苷、惡唑烷酮和/或氯霉素作為抗生素與無義密碼子抑制劑聯(lián)合施用。根據(jù)該實施方式，該無義密碼子抑制劑不是氨基糖苷、惡唑烷酮和/或氯霉素。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明施用了無義密碼子抑制劑的患者對于氨基糖苷、惡唑烷酮和/或氯霉素的無義密碼子抑制活性來說具有難治性。才艮^"該實施方式，可以確定對該種試劑具有難治性的患者，例如通過將來自患者的細胞與氨基糖苷、惡唑烷酮或氯霉素相接觸，并檢查與該疾病相關(guān)的包含無義突變的基因的活性和/或表達來確定。本發(fā)明的方法和組合物還可用于預(yù)防、治療和/或控制患有或可能患有或易患(例如，由于環(huán)境和/或遺傳因素)與基因突變相關(guān)的疾病的患者(例如，胚胎、胎兒、嬰兒(新生兒至l歲的人)、兒童(l歲至18歲的人)、成年人(18歲或更大的人)和老年人(65歲及以上的人))，該基因突變導(dǎo)致由該基因轉(zhuǎn)錄的RNA的終止密碼子不同于編碼相應(yīng)野生型蛋白的RNA中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子。該種疾病的非限制性范例包括脊髓性肌萎縮和嚢性纖維化(例如，囊性纖維化由CFTR基因中的突變3849+10kbC—T引起，由于內(nèi)含子19被識別為外顯子，因而該突變產(chǎn)生84個i咸基對的插入，且在翻譯時，該84個^5威基對插入生成帶有UAA無義突變的28個氨基酸的肽(Highsmith等人,NewEnglandJournalofMedicine331(1):974(1994))。此外，本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù)防、治療和/或控制患有或可能患有或易患(例如，由于環(huán)境和/或遺傳因素)所述疾病的患者(例如，胚胎、胎兒、嬰兒(新生兒至1歲的人)、兒童(l歲至18歲的人)、成年人(18歲或更大的人)和老年人(65歲及以上的人))，在該疾病中患者不表達足量的蛋白和/或可受益于特定蛋白的表達。這些患者曾通過基因療法(有關(guān)基因療法參見5.11節(jié))施用了在編碼區(qū)包含無義突變(在某些實施方式中，該無義突變在編碼區(qū)的5'區(qū)(例如，氨基末端前50、75、100、125、150、175、200、225、250、300或350個氨基酸))的核酸序列，且施用無義密碼子抑制劑抑制了由該核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA的無義密碼子，從而可生成由該核酸序列編碼的功能通讀蛋白。該無義密碼子抑制劑的施用使得人們可以調(diào)節(jié)所生成的功能通讀蛋白的數(shù)量。換言之，當(dāng)無義密碼子抑制劑缺失時，通過例如ELISA等免疫測定檢測可確定僅生成了少量或沒有生成可檢測的功能通讀蛋白。生成的該種功能通讀蛋白對應(yīng)于患者中未足量表達和/或?qū)υ摶颊哂幸娴囊吧偷鞍??？蓮脑摲N療法受益的患者群體的非限制性范例包括患有如下疾病的患者軟骨發(fā)育不全色盲酸性麥芽糖酶缺乏癥腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良Aicardi綜合癥a-l抗胰蛋白酶缺乏馬凡綜合癥Moebius綜合癥黏多糖(貯積)病(MPS)甲髕綜合癥腎性尿崩癥神經(jīng)纖維瘤病雄激素不敏感綜合癥Apert綜合癥心律失常性右心室發(fā)育不良共濟失調(diào)毛細血管擴張Barth綜合癥藍橡皮皰痣綜合癥海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥癌癥貓叫綜合癥囊性纖維化Dcrcurrfs病外胚層發(fā)育不良范可尼貧血進行性肌肉骨化癥X染色體脆弱癥半乳糖血癥Gaucher病血色沉著病血友病亨廷頓舞蹈病Hurler綜合癥低磷酸酯酶癥克蘭費爾特綜合癥尼曼-匹克病成骨不全葉啉癥Prader-Willi綜合癥早衰Proteus綜合癥一見網(wǎng)膜母細胞瘤Rett綜合癥Rubinstein-Taybi綜合癥沙費利波綜合癥Shwachman綜合癥鐮狀細胞(貧血)病史密斯-馬吉利氏綜合癥Stickler綜合癥黑蒙性白癡血小板缺乏合并橈骨缺失(TAR)綜合癥TreacherCollins綜合癥三體結(jié)節(jié)性腦硬化特納綜合癥尿素循環(huán)障礙vonHippel-Lindau病瓦登伯革氏綜合癥克臘比氏病威廉綜合癥Langer-Giedion綜合癥威爾森氏病腦白質(zhì)營養(yǎng)不良長QT綜合癥可被本發(fā)明包括的方法預(yù)防、治療和/或控制的癌癥的具體范例包括但不限于頭、頸、眼、嘴、喉嚨、食道、胸部、骨骼、肺、結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳腺、卵巢、腎、肝、胰和腦的癌癥。其它癌癥包括但不限于以下白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞白血病如成髓細胞、前髓細胞、髓單核細胞、單核細胞、紅白血病和骨髓增生異常綜合癥，慢性白血病，例如但不限于慢性髓細胞(粒細胞)白血病、'度性'淋巴細胞白血病、多毛細胞白血?。徽嫘约t細胞增多癥；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏??；多發(fā)性骨髓瘤，例如但不限于陰燃多發(fā)性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞性白血病、？瓜立性漿和髓外漿細胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血癥；意義未明的單克隆丙種球蛋白?。涣夹詥慰寺”N球蛋白??；重鏈??；骨癌和結(jié)締組織肉瘤，例如但不限于骨組織肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤骨病、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、帕杰特氏骨病、惡性骨巨細胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管性肉瘤(血管肉瘤)、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦肺瘤，例如但不限于膠質(zhì)瘤、星形膠質(zhì)細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、少突膠質(zhì)瘤、非神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤、聽神經(jīng)瘤、顱咽管瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、成松果體細胞瘤、成松果體母細胞瘤、原發(fā)性腦淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小葉(小細胞)癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺癌髓、粘液性乳腺癌、乳腺癌管、乳頭乳腺癌、帕杰特氏病(包括少年帕杰特氏病)和炎性乳腺癌；腎上腺肺瘤，例如但不僅限于嗜鉻細胞瘤和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，例如但不僅限于乳頭或甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和未分化甲狀腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰島瘤、胃泌素瘤、胰高糖素瘤、血管活性腸肽瘤、生長抑素分泌腫瘤以及良性癌或胰島細胞瘤；垂體癌，例如但不限于Cushing病、泌乳素分泌肺瘤、肢端肥大癥和尿崩癥；眼癌，例如但不限于黑色素瘤眼虹膜，如黑色素瘤、脈絡(luò)膜黑色素瘤和睫狀機構(gòu)黑色素瘤及視網(wǎng)膜母細胞瘤；陰道癌，例如鱗狀細胞癌、腺癌和黑色素瘤；外陰癌，如鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤和帕杰特氏??；子宮頸癌，例如但不限于鱗狀細胞癌和腺癌；子宮癌，例如但不局限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界性胂瘤、生殖細胞腫瘤和間質(zhì)細胞瘤；食道癌，例如但不僅限于鱗狀上皮癌、腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑色素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌和燕麥細胞(小細胞)癌；胃癌，例如但不僅限于腺癌、蕈傘型(息肉)、潰瘍、表淺擴散型、彌散型、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；胃癌，如腺癌、鱗狀細胞癌、類癌、淋巴瘤、胃基質(zhì)瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌肺瘤；肝癌，例如但不僅限于肝細胞癌和肝母細胞瘤，膽囊癌如腺癌；膽管癌，例如但不僅限于乳頭狀、結(jié)核狀和彌漫性；肺癌，例如非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(上皮癌)、腺癌、大細胞癌和小細胞肺癌；睪丸癌，例如但不限于胚組織瘤，精原細胞瘤，退化發(fā)育，經(jīng)典型(典型性)，精母細胞瘤，非精原細胞瘤，胚胎癌，畸胎瘤癌，絨毛膜癌(卵黃囊腫瘤)；前列腺癌，例如但不限于月泉癌、平滑月幾肉瘤以及一黃紋月幾肉瘤；penal癌；口腔癌，例如但不限于鱗狀細胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、黏液表皮樣癌和腺腺樣囊性癌；咽癌，如但不限于鱗狀細胞癌以及疣；皮膚癌，例如包括但不限于基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤、淺表性傳播黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、黑色素瘤雀斑、肢端黑色素瘤；腎癌，例如但不限于腎細胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細胞癌(腎盂和/或輸尿管)；Wilms腫瘤；膀胱癌，例如但不局限于移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌癥包括教液肉瘤、骨源性肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、血管母細胞瘤、上皮癌、嚢腺癌、支氣管癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(該類疾病的綜述可參見Fishman等人，1985，Medicine,第2版，J.B.LippincottCo.;Philadelphia和Murphy等人,1997,InformedDecisions:TheCompleteBookofCancerDiagnosis,Treatment,andRecovery,VikingPenguin,PenguinBooksU.S.A.,Inc.,UnitedStatesofAmerica)?？梢灶A(yù)期本發(fā)明的方法和組合物還可以用來預(yù)防、治療和/或控制因為凋亡失常而引起的癌癥。該類癌癥包括但不限于濾泡性淋巴瘤，具有p53突變的腫瘤，乳腺的激素依賴性腫瘤，前列腺癌和卵巢癌，及癌前病變，如家族性腺瘤性息肉和骨髓增生異常綜合癥。5.6.2患者篩選和細胞系在一個實施方式中，通過預(yù)篩選確定該患者或該患者的親屬具有與遺傳疾病相關(guān)的基因無義突變(即UAA、UGA或UAG)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了篩選患者以鑒別可能對使用無義密碼子抑制劑的療法有響應(yīng)的患者的方法。5.6.2.1短期治療挑戰(zhàn)本發(fā)明提供了根據(jù)所述患者響應(yīng)無義密碼子抑制劑的可能性篩選患有與基因無義突變相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包括向該患者施用無義密碼子抑制劑，然后檢測與該需要預(yù)防、控制和/或治療的疾病相關(guān)的一種或多種藥效學(xué)標(biāo)記。如果該藥效學(xué)標(biāo)記的檢測顯示該患者可能對該無義密碼子抑制劑有響應(yīng)，則可繼續(xù)施用該試劑。在具體實施方式中，該篩選方法包括向該患者短期施用無義密碼子抑制劑，然后檢測與該需要預(yù)防、控制和/或治療的疾病相關(guān)的藥效學(xué)標(biāo)記，接著可選地長期施用該無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該無義密碼子抑制劑的短期施用持續(xù)約5天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑的長期施用持續(xù)約30天、約45天、約80天、約120天、約240天、約1年或直至醫(yī)生認為治療應(yīng)該停止。在具體實施方式中，在該無義密碼子抑制劑TEPD的短期施用和長期施用，與肺功能評價之間有一段約1天、約3天、約5天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天的無治療期。在具體的實施方式中，該無義密碼子抑制劑口服施用。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的與本發(fā)明所述疾病相關(guān)的藥效學(xué)標(biāo)記均可用于本發(fā)明的方法(例如，參見，Politano等人,ActaMyologicaXXIJ:15-21(2003)，其全文在此引用作為參考)。與嚢性纖維化相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于鼻部跨上皮電位差(例如，參見，Standaert等人，PediatricPulmonology57:385-392(2004)和Du等人，J.Mol.Med.50:595-604(2002)，其全文分別在此引用作為參考，以及下文的實施例13)、從鼻部采集的細胞的CFTR蛋白染色和檢測(例如，參見,Wilschanski，等人,N.Engl.J.Med.349:1433-1441(2003)，其全文在此引用作為參考，以及實施例14)、汗液氯離子濃度的變化(例如，參見實施例16)以及肺功能的變化(例如，參見實施例15)。與杜興肌營養(yǎng)不良相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于血清肌酸酐激酶水平(例如，參見下文實施例20中檢測血清肌酸酐激酶水平的方法)以及通過染色進行的肌營養(yǎng)不良檢測(例如，參見，Politano,等人，ActaMyologicaXXII:15-21(2003)，其全文在此引用作為參考，以及實施例17)。與淀粉樣變性相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于淀粉樣(3蛋白的清除，體重增加，腎小球濾過率，室間隔厚度，淀粉樣蛋白的跨組織分配和心臟淀粉樣蛋白負荷，血清中與免疫球蛋白有關(guān)的自由輕鏈(FLC)的k/入比例，以及心臟肌4丐蛋白T和I(cTnT、cTnl)的缺失。與血友病相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于血液凝固活性，組織因子誘導(dǎo)的纖維蛋白形成和tPA介導(dǎo)的纖維蛋白溶解中血塊溶解時間的縮短。與阿爾海默病相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于改變的淀粉樣前體蛋白(APP)亞型的血小板比例；總體的、認知的(通過心理測驗，例如改良的簡易智能狀態(tài)測驗(MMSE)或改良的Hachinski缺血指數(shù)來檢測)、功能和行為的檢測，包括日?；顒雍托袨?，尤其是激動，減少的腦容積缺損(例如，使用MRI測得)。還可參見Caban-Holt等人，Geriatrics.2005.06;Suppl:3-8。與帕金森病相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于帕金森病評定量表(UPDRS)的評分、MMSE、Hamilton-17抑郁、NPI、每日"開"的總時間(TTON)、運動測試、運動障礙評定、患者日記以及(18)F-多巴的攝取。與動月永粥樣石更化癥和家族性高膽固醇血癥相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于降低的膽固醇水平，如降低的MDA-LDL水平和/或增加的高密度脂蛋白膽固醇；血清脂肪酸狀況，血清脂蛋白和血管發(fā)炎的標(biāo)記，降低的血漿同型半胱氨酸濃度，動脈粥樣硬化脈管中的斑塊形成(通過MRI或血管內(nèi)超聲(IVUS))，通過如電子束計算機斷層掃描測得的冠狀動脈鈣化(CAC)，以及通過如頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)對頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)以及頸動脈的咽球片段檢測測得到的減少的動脈阻塞。與^M需癥和巨大癥相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于高度以及生長激素和催乳激素的水平。與甲狀腺功能減退癥和甲狀腺功能亢進癥相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于TT3、TT4和TSH血清水平以及對甲狀腺形態(tài)及大小的評價、骨骼年齡、生長發(fā)育和發(fā)育商數(shù)(DQ)。與視網(wǎng)膜色素變性病相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于二十二石炭六烯酸(DHA)水平，通過Humphrey視野分析儀根據(jù)視野敏感性、30-Hz視網(wǎng)膜電圖幅度以及視覺靈敏度測得的眼功能。與晚發(fā)嬰兒型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉著病相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于基于LINCL臨床評分表的神經(jīng)學(xué)評價和對腦的磁共振成像/磁共振波譜評價。與脊髓性肌萎縮相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于肌肉力量，運動功能和檢查指數(shù)(IFM)的總和，呼吸肌麻痹指數(shù)(IMR)以及并仰臥位用力肺活量/理論指數(shù)(ICV/CT)，通過手持肌力計得到的最大自愿等長收縮以及計算的手臂大分值(加合肘屈曲、手抓力和三點捏力分?jǐn)?shù))，和腿大分值(加262和膝彎曲、膝伸展、擴展和足伸展分?jǐn)?shù))，總運動功能測試量，肺功能檢查，定量肌力測試，和生活質(zhì)量。與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于降低的a-胎兒蛋白，改善的免疫功能以及改善的神經(jīng)功能。與巴特綜合癥相關(guān)的示范性藥效學(xué)標(biāo)記包括但不限于提高的血鉀水平，提高的生長和提高的心理功能。5.6.2.2培養(yǎng)的組織細胞的^^外暴露本發(fā)明l是供了針對患者響應(yīng)無義密碼子抑制劑的可能性篩選患有與基因無義突變相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包括將來自該患者的細胞樣本與該無義密碼子抑制劑接觸，并檢測該無義密碼子抑制劑誘導(dǎo)與該疾病相關(guān)的基因的無義突變的通讀時功能通讀蛋白的表達和/或活性。細胞樣本的非限制性范例包括有核血細胞(例如，外周血淋巴細胞)、皮膚細胞(例如，真皮纖維原細胞)、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及肌肉細胞。在某些實施方式中，該細胞樣本為受到基因無義突變的存在影響的細胞的樣本。所測得的活性將取決于由普通基因編碼的野生型蛋白的功能。例如，參見上文5.5節(jié)描述的檢測。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了針對患者響應(yīng)無義密碼子抑制劑的可能性篩選患有與基因無義突變相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包括將來自該患者的細胞樣本(例如，皮膚細胞樣本，例如，真皮纖維原細胞)在允許該細胞轉(zhuǎn)化為目標(biāo)組織(例如，肌肉細胞)的條件下與該無義密碼子抑制劑相接觸，并檢測所述響應(yīng)。來自可能響應(yīng)該無義密碼子抑制劑的患者的細胞樣本將會產(chǎn)生功能通讀蛋白，因為從該基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子受到抑制。在具^f本的實施方式中，所用的該細胞為從患者分離的成纖維細胞。該類細胞可通過用包含MyoD基因的載4本轉(zhuǎn)染該細胞而分化成為肌肉細胞。本發(fā)明還提供了針對患者響應(yīng)無義密碼子抑制劑的可能性篩選患有與基因無義突變相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包^r對與該疾病相關(guān)的基因測序，將包含了具有相同無義突變的基因的細胞樣本與所述無義密碼子抑制劑相接觸，并檢測當(dāng)該無義密碼子抑制劑誘導(dǎo)了與該疾病相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子的通讀時生成的功能通讀蛋白的表達和/或活性。在某些實施方式中，所用的該細胞樣本為細胞樣本庫的一部分，每個細胞樣本包含與疾病相關(guān)的基因的無義突變。例如，囊性纖維化細胞樣本庫包含細胞樣本，例如，在CTFR基因中具有表10所列舉的無義突變的細胞樣本。細胞樣本可被貯存在-70。C下直至使用，使用時該細胞樣本被解凍并在允許該細胞生長的條件下培養(yǎng)。5.6.2.3熒光素酶測定中的人造基因構(gòu)建體本發(fā)明還提供了針對患者響應(yīng)無義密碼子抑制劑的可能性篩選患有與基因無義突變相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包括對與該疾病相關(guān)的基因測序，將所述無義密碼子抑制劑與已改造成包含報告基因例如熒光素酶(包含與所述疾病相關(guān)的基因的具有所述無義突變的區(qū)域)的細胞相接觸，并檢測當(dāng)該無義密碼子抑制劑誘導(dǎo)了從該基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子的通讀時生成的功能通讀蛋白的表達和/或活性。在某些實施方式中，該報告基因包含目標(biāo)基因的具有該無義突變的區(qū)域的6個核苷酸(在某些實施方式中，9、12、15、21、24、27、30或33個核苷酸)，其中包括該無義突變。該報告基因已改造成包含目標(biāo)基因的具有該無義突變的區(qū)域，從而保留該報告基因的開放閱讀框，且在無義密碼子抑制劑誘導(dǎo)了從該基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的無義密碼子的通讀時該報告基因編碼的蛋白將會形成功能通讀蛋白。上文5.5節(jié)提供了報告基因的范例。任意細胞均可通過工程改造為包含所述報告基因。非限制性的范例包括成纖維細胞、淋巴細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、肌肉細胞和巨嗟細胞?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的分子和細胞生物學(xué)方法(包括定點突變)制備該報告基因，并對細胞進行工程改造(包括磷酸鈣沉淀、電穿孔和脂質(zhì)體)以包含該^a告基因。5.6.3疾病通過抑制4是前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解來預(yù)防、治療和/或控制的疾病包括但不限于遺傳疾病、癌癥、自身免疫疾病、血液疾病、月交原病、4唐尿病、神經(jīng)退行性疾病、增生性疾病、心血管疾病、肺病、炎性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在本發(fā)明的方法范圍內(nèi)的具體遺傳疾病包括但不限于淀粉樣變性、血友病、阿爾海默病、泰伊-薩克斯二氏病、動脈粥樣硬化、巨大癥、侏儒癥、甲狀腺功能減退癥、甲狀腺功能亢進癥、衰老、肥胖、帕金森病、尼曼-匹克病、嚢腫性纖維化、肌肉萎縮癥、心臟病、腎結(jié)石、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、溶酶體貯積病、結(jié)節(jié)性硬化癥、杜興型肌營養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥和馬凡綜合癥。實體腫瘤和其它癌癥均包括在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，該遺傳疾病為自身免疫疾病。在優(yōu)選的實施方式中，該自身免疫疾病為風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或移植物抗宿主病。在另一實施方式中，該遺傳疾病為血液疾病。在優(yōu)選的實施方式中，該血液疾病為血友病、VonWillebrand病、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、b-地中海貧血或腎結(jié)石。在另一實施方式中，該遺傳疾病為膠原病。在另一實施方式中，該膠原病為成骨不全或肝硬化。在另一實施方式中，該遺傳疾病為凈唐尿病。在另一實施方式中，該遺傳疾病為炎性疾病。在優(yōu)選的實施方式中，該炎性疾病為關(guān)節(jié)炎。在另一實施方式中，該遺傳疾病為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在一個實施方式中，該中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為神經(jīng)退行性疾病。在優(yōu)選的實施方式中，該中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮癥、杜興型肌營養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥、阿爾海默病、泰伊-薩克斯二氏病、晚發(fā)嬰兒型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉著病(LINCL)或帕金森病。在另一實施方式中，該遺傳疾病為癌癥。在優(yōu)選的實施方式中，該癌癥為頭頸、眼、皮膚、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳腺、卵巢、腎、肝、胰、腦、腸、心臟或腎上腺的癌癥。在另一優(yōu)選的實施方式中，該癌癥與腫瘤抑制基因有關(guān)(例如，參見Garinis等人2002，HumGen111:115-117;Meyers等人.1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:15587-15591;Kung等人2000，NatureMedicine6(12):1335-1340)。該腫瘤抑制基因包括但不限于APC、ATM、BRAC1、BRAC2、MSH1、pTEN、Rb和p53。在特別優(yōu)選的實施方式中，該肺瘤抑制基因為p53基因。已經(jīng)鑒別出了p53基因中的無義突變，其與癌癥相關(guān)聯(lián)。在p53基因中已鑒定出多個無義突變(例如，參見Masuda等人，2000，TokaiJExpClinMed.25(2):69-77;Oh等人，2000,MolCells10(3):275-80;Li等人，2000，LabInvest.80(4):493-9;Yang等人，1999,ZhonghuaZhongLiuZaZhi21(2):114-8;Finkelstein等人，1998,MolDiagn.3(1):37-41;Kajiyama等人，1998，DisEsophagus.ll(4):279-83;Kawamum等人，1999,LeukRes.23(2):115-26;Radig等人，1998,HumPathol.29(11):1310-6;Schuyer等人，1998,IntJCancer76(3):299-303;Wang-Gohrke等人，1998,OncolRep.5(l):65-8;Fulop等人，1998,JReprodMed.43(2):119-27;Ninomiya等人，1997,JDermatolSci.14(3):173-8;Hsieh等人，1996,CancerLett.100(1-2):107-13;Rail等人，1996,Pancreas.12(1):10隱7;Fukutomi等人，1995,NipponRinsho.53(11):2764-8;Frebourg等人，1995,AmJHumGenet.56(3):608陽15;Dove等人，1995,CancerSurv.25:335-55;Adamson等人，1995,BrJHaematol.89(l):61-6;Grayson等人，1994,AmJPediatrHematolOncol.16(4):341-7;Lepelley等人，1994,Leukemia.8(8):1342-9;Mclntyre等人，1994，JClinOncol.12(5):925-30;Horio等人，1994,Oncogene.9(4):1231-5;Nakamura等人，1992，JpnJCancerRes.83(12):1293-8;Davidoff等人，1992,Oncogene.7(l):127-33;以及Ishioka等人，1991,BiochemBiophysResCommun.177(3):901-6;其披露的內(nèi)容在此全文引用作為參考)。與編碼提前翻譯密碼子，包括但不限于上文所引的參考文獻中描述的無義突變的p53基因相關(guān)的任何疾病都可用本發(fā)明的方法來治療、控制和/或預(yù)防。其它可用本發(fā)明的方法治療、控制和/或預(yù)防的疾病包括實體腫瘤、肉瘤、癌、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、l欠骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽道癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、Wilms腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形膠質(zhì)細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液源性腫瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴細胞B-細胞白血病、急性淋巴細胞的T-細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性早幼并立細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性紅白血病、急性成巨核細胞白血病、急性粒細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病、急性未分化型白血病、慢性粒細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病或多發(fā)性骨髓瘤。例如，參見//a/r/TO"k/V/""》/es"o//"tem"/A/eJ/c/we,EugeneBraunwald等人編,第491-762頁(第15版，2001)。在一些實施方式中，可以用本發(fā)明的方法預(yù)防、治療和/或控制的疾病包括上文表10列舉的疾病。在某些實施方式中，可以預(yù)防、治療和/或控制的疾病不是腸胃疾病和/或皮膚疾病。在一些實施方式中，可以預(yù)防、治療和/或控制的疾病不是如下疾病的一種或多種基底細胞痣綜合癥(例如，PTCH基因)、偶發(fā)性基底細胞癌(例如，PTCH基因)、黑色素瘤(例如，CDKN2a基因)、交界型大皰性表皮松解癥(例如，LAMB3、LAMC2、LAMA3基因)、泛發(fā)性萎縮性良性大皰性表皮松解癥(例如，COL17A1基因)、營養(yǎng)不良性表皮松解(例如，C0L7A1基因)、良性天皰掩疾病(如ATP2C1基因)、Darier氏癥(例如，ATP2A2基因)、板層狀魚鱗病(例如，TGM1基因)、X畫連鎖魚鱗病(例如，STS基因)、著色性干皮病(例如，XPA、XPC、XPG基因)、Bloom綜合征(例如，BLM基因)、紋狀掌跖角化病(例如，DSP、DSG1基因)、Cockayne綜合癥(例如，ERCC6基因)、眼皮膚白化病(例如，TYR、TYRP1基因)、Hermansky-Pudlack綜合征(例如，HPS1、HPS4基因)、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(例如，ATM基因)、Griscdli綜合癥(例如，RAB27A、MY05A基因)、以及外胚層發(fā)育不良/皮膚脆性(例如，PKP1基因)。在一些實施方式中，該疾病不是如下一種或多種疾病偶發(fā)性食道癌(p53基因)和偶發(fā)性結(jié)腸癌(APC、p53基因)、Barrett's食道癌(p53基因)、遺傳性癌綜合癥、如腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC基因)、遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(MLH1、MSH2基因)、Peutz-Jeghers綜合征(STK11基因)、以及Cowden綜合癥(PTEN基因)。5.7制劑本發(fā)明的方法中可采用包含有效量的無義密碼子抑制劑的藥物組合物和單一單位劑型。個體劑型可適用于通過口服、粘膜(包括舌下、口腔、直腸、鼻部、或陰道)或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、彈丸注射、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))施用。優(yōu)選的藥物組合物和單一單位劑型適用于口服施用。在一個實施方式中，該藥物組合物或單一單位劑型包含有效量的一種或多種無義密碼子抑制劑，和用于制備該無義密碼子抑制劑的合成路徑中的一種或多種雜質(zhì)。在一個實施方式中，該藥物組合物為固^f本口服劑型。在一個實施方式中，該藥物組合物為液體口服劑型。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法包括劑量、單位劑型或藥物組合物的施用，其中該無義密碼子抑制劑是口服生物相容的?？诜┯玫膬?yōu)勢包括便于施用，對給藥方案產(chǎn)生更好的患者適應(yīng)性，臨床效力，更少的并發(fā)癥，住院期更短和節(jié)省總成本。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用包含約35mg至約1400mg、約125mg至約1000mg、約250mg至約1000mg、或約500mg至約1000mg無義密碼子抑制劑的單位劑型。在一個實施方式中，該單位劑型包含無義密碼子抑制劑，和適于在瓶中懸浮于藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中的一種或多種載體或賦形劑。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用包含35mg、50mg、70mg、100mg、125mg、140mg、175mg、200mg、250mg、280mg、350mg、500mg、560mg、700mg、750mg、1000mg或1400mg的無義密碼子抑制劑的單位劑型。優(yōu)選的單位劑型包括約125mg、約250mg或約1000mg的無義突變抑制劑。在一個實施方式中，該單位劑型包含無義密碼子抑制劑，和適于在瓶中懸浮于藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中的一種或多種載體或賦形劑。優(yōu)選的單位劑型為粉末和小袋。盡管推薦本發(fā)明所述的單位劑型貯存于約2"至約8°C,但該單位劑型可在重新配制前在室溫下貯存48小時。在一個實施方式中，可通過直^妻向含有3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的瓶中添加約10mL的水來對250mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噪二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的單位劑型進行重新配制，從而形成濃度約為25mg/mL的懸浮液。對于l，OOOmg的3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的單位劑型，直接向含有3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噪二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的瓶中添加約20mL的水，從而形成濃度約為50mg/mL的懸浮液。在加入水后立即蓋上瓶子，并用手輕柔震蕩至少30秒以實現(xiàn)均勻懸浮。盡管該重新配制的懸浮液在攝入前可在最初的塑料瓶中保存達24小時，但推薦在重新配制后立即施用該藥物。如果在重新配制和給藥之間有超過大約15分鐘的延誤，則推薦用手輕柔搖動該瓶至少30秒。推薦從瓶中直接施用該懸浮液。進一步推薦用水洗涂該瓶一次，并將該洗滌液攝入以確保沒有粉末遺留在該瓶中。用于向患者口服施用的單一單位劑型包括但不限于藥嚢劑；扁嚢劑；片劑；咀嚼片；囊片；膠囊，如軟彈性凝膠膠囊；錠劑；糖錠；分散劑；粉末；溶液；液體劑型，包括懸浮液(例如，水或非水液體懸浮液)；乳劑(例如，水包油乳劑或油包水乳劑)；以及酏劑。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用含有過飽和的其它活性試劑的膠體溶液或溶液?？捎糜诒景l(fā)明方法的特定劑型的彼此的區(qū)分方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，參見Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版,MackPublishing,EastonPA(1990)。本發(fā)明的方法進一步包括施用包含無義密碼子抑制劑的無水藥物組合物和劑型。無水藥物組合物和劑型可采用無水或低含水量的成分并在低水分或低濕度條件下制備。典型的口服劑型可通過充分混合具有無義密碼子抑制活性的化合物和根據(jù)常規(guī)藥物配合技術(shù)的至少一種載體或賦形劑制備得到。賦形劑可根據(jù)需要施用的制劑形式可采取各種形式。例如，適于在口服液體或氣霧劑劑型中^t用的賦形劑包括但不限于水、乙二醇、油、醇、調(diào)味劑(例如，香草精)、防腐劑以及著色劑。適于在固體口服劑型中使用的賦形劑(例如，粉末、片劑、咀嚼片、藥囊劑、膠囊和囊片)的范例包括但不限于淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、結(jié)合劑和崩解劑。特別優(yōu)選的單位劑型為包含有效量的無義密碼子抑制劑的粉劑，其適于在藥學(xué)上可接受的溶劑(例如水、牛奶、^_酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中重新配制并隨后口服施用。在具體實施方式中，該粉劑可任選地包含與該無義密碼子抑制劑聯(lián)合的一種或多種載體或賦形劑。在另一實施方式中，該粉劑可在施用或重新配制前貯存于密封容器中。在另一實施方式中，該粉末被膠囊化(例如，包含在凝膠膠囊中)。用于口服施用的液體制劑的形式可以是例如溶液、糖漿或懸浮液，或是在使用前可用水或其它合適運載體配制的千產(chǎn)品(例如，粉末或顆粒)。該種液體制劑可通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氬化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水運載體(例如，杏仁油、油酯、酒精或分餾的植物油)；以及防腐劑(甲基或丙基-對羥基安息香酸鹽或山梨酸)進行制備。該制劑還可酌情包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?？捎糜诠腆w口服劑型中的賦形劑的范例包括但不限于結(jié)合劑、填充劑、崩解劑和潤滑劑。適用于藥物組合物和劑型的結(jié)合劑包括但不限于玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或其它淀粉、凝膠、阿拉伯樹膠等天然和合成樹膠、藻酸鈉、海藻酸、其它藻酸鹽、粉狀黃芪膠、瓜兒膠、纖維素及其衍生物(例如，乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、預(yù)膠化淀粉、羥丙基甲基纖維素(例如，2208、2906、2910)，粗晶纖維素及其混合物。優(yōu)選的賦形劑包括LitesseUltra(精制右旋糖)甘露醇、表面活性劑(聚乙二醇3350和LutrolmicroF127(poloxamer407粉))、崩解劑(交聚維酮)、硅石粉、Carbopo媳、聚丙烯酸和其它賦形劑(幾基乙基纖維素、香草香精、硬脂酸鎂(非牛)、以及硅膠)。適用于本發(fā)明所公開的藥物組合物和固體劑型的填充劑的范例包括但不限于乳糖、滑石、碳酸鈣(例如，顆?；蚍勰?、微晶纖維素、粉末狀纖維素、葡聚糖、高嶺土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、預(yù)膠化淀粉及其混合物。本發(fā)明藥物組合物的結(jié)合劑或填充劑通常占該藥物組合物或劑型的約50%至約99%重量。適用的微晶纖維素包括但不限于商品名為AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103AVICELRC-581、AVICEL-PH-105(可從FMCCorporation,AmericanViscoseDivision,AvicelSales,MarcusHook,PA購得)的材料及其混合物。一種特定的結(jié)合劑為商品名為AVICELRC-581的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉的混合物。適用的無水或低水分賦形劑或添加劑包括AVICEL-PH-103tm和淀粉1500LM。5.8劑量和給藥方案不希望受限于理論，本發(fā)明的方法部分地包括可最大化地抑制才是前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的無義密碼子抑制劑的特定劑量和給藥方案。本發(fā)明的方法包括治療、預(yù)防和控制可通過抑制提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解來治療、預(yù)防和/或控制的疾病或其癥狀，同時減少或避免不良或不需要的作用(例如，毒性或副作用)。此處所述的劑量和給藥方案的優(yōu)選施用途徑為口服(即，攝入溶液、含有超過活性劑飽和濃度的其它活性試劑的膠體溶液或溶液)。在一個實施方式中，此處所述的劑量或給藥方案的施用途徑為局部(例如，經(jīng)皮膚)施用。此處所述的劑量和給藥方案由于能夠達到或維持具有無義密碼子抑制活性的所述化合物的預(yù)期血漿濃度而被認為是有用的。不希望受限于理論，認為在例如24小時或更長的時間內(nèi)達到并維持無義突變抑制劑相對恒定的血漿濃度會對患者產(chǎn)生有益的治療效果。此處所述的劑量和給藥方案可用于到達并維持具有無義密碼子抑制活性的化合物的該種治療性血漿濃度。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，其中該化合物在12小時或24小時的期間內(nèi)向有此需要的患者施用一、二或三次，其中各次施用優(yōu)選間隔約4-14小時。在具體實施方式中，該無義密碼子抑制劑在早晨、下午和晚上各施用一次。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑在早晨和晚上各施用一次。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑在早晨施用一次、下午施用一次或晚上施用一次。各次劑量之間的優(yōu)選間隔包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14小時。在一個實施方式中，該無義密碼子抑制劑的劑量在24小時的期間內(nèi)逐步升高。在具體實施方式中，所施用的所述二劑量高于(例如，兩倍于)所述第一劑量。在另一實施方式中，所施用的該第一和第二劑量保持恒定，而施用的第三劑量升高(例如，兩倍)。不希望受限于理論，認為該無義密碼子抑制劑的施用存在晝夜變化，其中在晚上施用的劑量所得到的血漿濃度高于在早晨或下午施用劑量所得到的濃度。不希望進一步受限于理論，認為相對于之前的施用劑量倍增晚上施用的劑量會最佳地維持目標(biāo)血漿濃度，同時會降低對該無義密碼子抑制劑的總體暴露。在某些實施方式中，參照以下公式1X、IX、2X在24小時期間內(nèi)施用三個劑量，其中X為具體的起始劑量(例如，4mg/kg、7mg/kg或10mg/kg)。在另一實施方式中，該無義密碼子抑制劑在患者進食(即之前或之后)約10,15、30、45或60分鐘內(nèi)被施用。在一個實施方式中，有效量的無義密碼子抑制劑被散布或混合于食物中。在一個實施方式中，在該無義密碼子抑制劑施用前、施用時或施用后攝取的食物為高脂肪和/或高卡路里和/或高蛋白食物。在一個實施方式中，如果在一個治療周期中形成的不良事件被認為是劑量限制的，則在該治療周期的剩余時間內(nèi)或者直至該不良事件消退，所施用的該第二或第三劑量(例如，晚上的劑量)被減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、75%或完全不施用。特別優(yōu)選的給藥方案為以大約6-、6-和12-小時的間隔(例如，早餐后的7:00AM,午餐后的~1:00PM以及晚餐后的7:00PM)在就餐后30分鐘內(nèi)向患者施用無義密碼子抑制劑。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括以介于0.1mg/kg和500mg/kg、1mg/kg和250mg/kg、1mg/kg和150mg/kg、1mg/kg和100mg/kg、1mg/kg和50mg/kg、1mg/kg和25mg/kg、1mg/kg和20mg/kg、1mg/kg和10mg/kg、或2mg/kg和10mg/kg之間的劑量單次或分次(例如，在24小時內(nèi)三次)向有此需要的患者施用無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，以約2-6mg/kg、約5-9mg/kg、約6-10mg/kg、約8-12mg/kg、約12-16mg/kg或約18-22mg/kg的劑量施用無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，以約3mg/kg、約4mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約10mg/kg、約14mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約50mg/kg、約100mg/kg、約200mg/kg或約300mg/kg的劑量施用無義密碼子抑制劑。在另一實施方式中，前述實施方式中所述的無義密碼子抑制劑的任意劑量在24小時的期間內(nèi)施用一次、兩次或三次。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括持續(xù)療法，其中在特定的時間期限(例如，5、7、10、14、20、24、28、60或120天或更長時間)內(nèi)每天向有此需要的患者施用無義密碼子抑制劑。在一個實施方式中，無義密碼子抑制劑每24小時連續(xù)施用一次、兩次或三次。在另一實施方式中，無義密碼子抑制劑每天、每周、每月或每年連續(xù)施用。在具體的實施方式中，無義密碼子抑制劑每24小時以約4mg/kg、約4mg/kg和約8mg/kg的劑量連續(xù)施用一次、兩次或三次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在具體的實施方式中，無義密碼子抑制劑每24小時以約7mg/kg、約7mg/kg和約14mg/kg的劑量連續(xù)施用三次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在具體的實施方式中，無義密碼子抑制劑每24小時以約10mg/kg、約10mg/kg和約20mg/kg的劑量連續(xù)施用三次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在另一實施方式中，無義密碼子抑制劑每24小時以約8mg/kg的劑量連續(xù)施用兩次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在另一具體的實施方式中，無義密碼子抑制劑在第一周期中每24小時以約4mg/kg、約4mg/kg和約8mg/kg的劑量連續(xù)施用三次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年，然后在第二周期中每24小時以約8mg/kg的劑量施用兩次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在另一具體的實施方式中，無義密碼子抑制劑在第一周期中每24小時以約8mg/kg的劑量施用兩次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年，然后在第二周期中每24小時以約4mg/kg、約4mg/kg和約8mg/kg的劑量連續(xù)施用三次，持續(xù)數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在這些實施方式中，該第一和第二周期可以分開或伴隨一段不施用無義密碼子抑制劑的^^息期。該休息期可持續(xù)數(shù)天、數(shù)月或數(shù)年。在施用無義密碼子抑制劑的各個24小時期間內(nèi)，優(yōu)選以大約6-、6和12-小時的間隔(例如，早餐后的7:00AM、午餐后的1:00PM以及晚餐后的7:00PM)施用三次。一個療程的治療期間可持續(xù)一周、兩周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、十四周、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、一年、兩年、三年、四年、五年或更長。在具體的實施方式中，一個療程的治療期間可以是該個體的終生。該治療期間可被持續(xù)一天、一周、兩周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、十四周、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、一年、兩年、三年、四年、五年或更長的休息期所中斷。這可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員(例如，醫(yī)師)確定。可以理解向有此需要的患者施用的無義密碼子抑制劑的量是根據(jù)/或可以根據(jù)所涉及患者的實際體重或所涉及患者群體(例如，白人男性、白人女性、非裔美國男性、非裔美國女性、亞裔男性或亞裔女性，包括胚胎、胎兒、嬰兒、兒童、成年人和老年人)的平均體重進行計算。5.9血漿濃度在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括在患者體內(nèi)維持無義密碼子抑制劑的血漿濃度O.l(ig/ml至500|ig/ml、0.1|ig/ml至400嗎/ml、0.1嗎/ml至300嗎/ml、0.1嗎/ml至200嗎/ml、0.1|ig/ml至100嗎/ml或2嗎/ml至10嗎/ml約1至72小時、2至48小時或2至24小時，包括向有此需要的患者施用有效量的無義密碼子抑制劑。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括維持無義密碼子抑制劑的血漿濃度大于約0.1(ig/ml、約1pg/ml、約2|ig/ml、約5|ig/ml、約10fig/ml、約15|ig/ml、約20(ig/ml、約25[xg/ml、約30]ag/ml、約40pg/ml、約50|ig/ml、約75pg/ml、約100昭/ml、約125(ig/ml、約150pg/ml、約175嗎/ml、約200|ig/ml、約225(ig/ml、約250(ig/ml、約275嗎/ml、約300嗎/ml、約325jig/ml、約350嗎/ml、約375嗎/ml或約400ng/ml至少約2、4、6、8、12、24、36或48小時，包括向有此需要的患者施用有效量的無義密碼子抑制劑。在某些實施方式中，該施用為口服。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括在患者體內(nèi)維持無義密碼子抑制劑的血漿濃度約O.l嗎/ml至約400(ig/ml至少約2、4、6、8、12或24小時，包括向有此需要的患者以相同或遞增的劑量(例如，此處所述的IX、1X、2X)施用有效量的無義密碼子抑制劑多達每天三次。在某些實施方式中，該施用為口服。在某些實施方式中，通過向有此需要的患者每天三次施用該無義密碼子抑制劑，將患者的無義密碼子抑制劑血漿水平維持在約0.1^g/ml至約400Hg/ml以上至少2、4、6、8、12或24小時。在具體實施方式中，該施用為口服。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，從而在施用后約1至約3小時或約2至約4小時出現(xiàn)T咖x血漿濃度。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，從而使該血漿濃度的平均半衰期tw為約2至約6小時或約3至約6小時。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，該施用的量可在體內(nèi)有效生成相當(dāng)于正常個體中生成的相應(yīng)野生型蛋白量的1%或更多、2%或更多、3%或更多、4%或更多、5%或更多、7%或更多、10%或更多、12%或更多、15%或更多、17%或更多、20%或更多、22%或更多、25%或更多、27%或更多、30%或更多、32%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多或是80%或更多的該種功能通讀蛋白。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，該施用的量有效生成足夠的功能通讀蛋白，從而獲得正常個體中的野生型蛋白的大約1°/0、大約2%、大約3%、大約4%、大約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約35%、大約40%、大約45%、大約50%、大約55%、大約60%或更多的活性。在具體的實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，該施用的量可在體內(nèi)有效生成相當(dāng)于正常個體中生成的CFTR蛋白量的至少約1%或更多、2%或更多、3%或更多、4%或更多、5%或更多、7%或更多、10%或更多、12%或更多、15%或更多、17%或更多、20%或更多、22%或更多、25%或更多、27%或更多、30%或更多、32%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75。/o或更多或是80。/o的該種功能通讀CFTR蛋白。在另一實施方式中，本發(fā)明的方法包括施用無義密碼子抑制劑，該施用的量可在體內(nèi)有效生成相當(dāng)于正常個體中生成的肌營養(yǎng)不良蛋白蛋白量的1%或更多、2%或更多、3%或更多、4%或更多、5%或更多、7%或更多、10%或更多、12%或更多、15%或更多、17%或更多、20%或更多、22%或更多、25%或更多、27%或更多、30%或更多、32%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多或是80%的功能通讀肌營養(yǎng)不良蛋白。5.10治療終點任何本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的本發(fā)明所公開的疾病的治療終點或結(jié)果均可用于本發(fā)明的方法(例如，參見Politano,等人，2003,M，/og/caXW/:15-21，其全文在此引用作為參考)。代表性的治療終點包括但不限于如本發(fā)明所述的，包括實施例中列舉的治療終點。杜興型肌營養(yǎng)不良癥的代表性終點包括但不限于在其它情況下不生成肌營養(yǎng)不良蛋白的肌肉內(nèi)肌營養(yǎng)不良蛋白的生成(例如，骨骼肌細胞的肌膜中肌營養(yǎng)不良蛋白的重新表達)；與相對側(cè)的未處理的肌肉相比，處理的肌肉的肌肉MRI參與方式和肌容積；以及肌肉力量和表現(xiàn)，包括個體肘部和膝屈肌和伸肌和手抓力QMT評分以及通過醫(yī)學(xué)研究委員會(MRC)肌肉力量評分法測定的徒手肌力測試分值。280定量的肌肉力量可以測定，例如通過兒科定量測量系統(tǒng)(PQMS)測定。主要的力量標(biāo)記包括由配對屈肌/伸肌組構(gòu)成的上和下肢的定量肌力法(QMT)分值。嚢性纖維化的代表性終點包括但不限于通過鼻跨上皮電位差(TEPD)評價的CFTR活性；副作用，CFTR蛋白和mRNA的存在，以及肺功能。淀粉樣變性的代表性終點包括但不限于淀粉樣P蛋白的清除；體重增加，腎小球濾過率，室間隔厚度，淀粉樣蛋白的跨組織分配和心臟淀粉樣蛋白負荷，血清中與免疫球蛋白有關(guān)的自由輕鏈(FLCs)的k/X比例，以及心臟肌鈣蛋白T和I(cTnT、cTnl)的缺失。血友病的代表性終點包括但不限于血液凝固活性，組織因子誘導(dǎo)的纖維蛋白形成和tPA介導(dǎo)的纖維蛋白溶解中血塊溶解時間的縮短。阿爾海默病的代表性終點包括但不限于改變的淀粉樣前體蛋白(APP)亞型的血小板比例；總體的、認知的(通過心理測驗，例如改良的簡易智能狀態(tài)測-瞼(MMSE)或改良的Hachinski缺血指數(shù)測得)、功能和行為的檢測，包括日?；顒雍托袨椋绕涫羌?，減少的腦容積缺損(例如，使用MRI測得)。還可參見Caban-Holt等人，Geriatrics.2005.06;Suppl:3-8。帕金森病的代表性終點包括但不限于帕金森病評定量表(UPDRS)的評分、MMSE、Hamilton-17抑郁、NPI、每日"開"的總時間(TTON)、運動測試、運動障礙評定、患者日記以及(18)F-多巴的^聶取。動脈粥樣硬化癥和家族性高膽固醇血癥的代表性終點包括但不限于降低的膽固醇水平，如降低的MDA-LDL水平和/或增加的高密度脂蛋白膽固醇；血清脂肪酸狀況，血清脂蛋白和血管發(fā)炎的標(biāo)記，降低的血漿同型半胱氨酸濃度，動脈粥樣硬化脈管中的斑塊形成(通過MRI或血管內(nèi)超聲(IVUS))，通過如電子束計算機斷層掃描測得的冠狀動脈鈣化(CAC)，以及通過如頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)對頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)以及頸動^c的咽球片^a檢測測得的減少的動l^阻塞。侏儒癥和巨大癥的代表性終點包括但不限于高度以及生長激素和催乳激素的水平。甲狀腺功能減退癥和甲狀腺功能亢進癥的代表性終點包括但不限于TT3、TT4和TSH血清水平以及對甲狀腺形態(tài)及大小的評價，骨骼年齡，生長發(fā)育和發(fā)展商數(shù)(DQ)。視網(wǎng)膜色素變性病的代表性終點包括但不限于二十二碳六烯酸(DHA)水平，通過Humphrey-見野分析4義對視野|文感性、30-Hz視網(wǎng)膜電圖幅度以及視覺靈敏度測得的眼功能。晚發(fā)嬰兒型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉著病的代表性終點包括但不限于基于LINCL臨床評分表神經(jīng)學(xué)評價和對腦的磁共振成像/磁共振波譜評價。脊髓性肌萎縮的代表性終點包括但不限于肌肉力量，運動功能和檢查指數(shù)(IFM)的總和，呼吸肌麻痹指數(shù)(IMR)以及并仰臥位用力肺活量/理論指數(shù)(ICV/CT),通過手持肌力計得到的最大自愿等長收縮以及計算的手臂大分值(總結(jié)肘屈曲、手抓力以及三點捏力分?jǐn)?shù))，和腿大分值(總結(jié)膝彎曲、膝伸展、擴展和足伸展分?jǐn)?shù))，總運動功能測試量，肺功能檢查，定量肌力測試，和生活質(zhì)量。共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的代表性終點包括但不限于降低的a-胎兒蛋白，改善的免疫功能以及改善的神經(jīng)功能。巴特綜合癥的代表性終點包括，但不限于提高的血鉀水平，提高的生長和提高的心理功能。5.11基因療法基因療法指通過向個體施用表達的或可表達的核酸序列進行的治療。本領(lǐng)域中現(xiàn)有的任何基因治療方法均可用于本發(fā)明。以下描述了示范性方法。對于基因療法的一般綜述可參見，Goldspiel等人，1993，ClinicalPharmacy12:488-505;Wu和Wu，1991，Biothempy3:87-95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan,Science260:926-932(1993);以及Morgan和Anderson,1993，Ann.Rev.Biochem.62:191-217;May,1993,TIBTECH11(5):155-215。重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法描述于Ausubel等人(編),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993);以及Kriegler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)。一方面，核酸序列是在適當(dāng)宿主中表達該核酸序列的表達載體的一部分。具體地，這種核酸序列包括可操作地與蛋白編碼區(qū)連接的啟動子(包括外源啟動子)，所述啟動子為可誘導(dǎo)型或組成型，且任選地具有組織特異性。在另一特定的實施方案中，所使用的核酸序列中所述蛋白編碼序列和任意其它目標(biāo)序列與促進該基因組在目標(biāo)位點上發(fā)生同源重組的區(qū)域側(cè)翼連接，從而提供了該蛋白編碼核酸序列的染色體內(nèi)表達(Roller和Sm他ies，1989,Pro"Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935;Zijlstra等人，1989,Nature342:435-438)。所述核酸序列向個體的傳遞可以是直接的，此時該個體直接暴露至該核酸序列或攜帶該核酸序列的載體；也可以是間接的，此時首先在體外以該核酸轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植入該個體。這兩種方法分別被稱為體內(nèi)或體外基因療法。在具體的實施方式中，所述核酸序列被直接施用至體內(nèi)，在其中該核酸序列表達或生成編碼產(chǎn)物。這可通過本領(lǐng)域已知的許多方法中的任一'方法實現(xiàn)，例如，通過將其構(gòu)建為合適核酸表達栽^^的一部分，并例如通過如下方法而將其施用至細胞內(nèi)來實現(xiàn)例如^_用缺陷型或減毒型逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體感染(參見美國專利4,980,286)，或直接注射棵露DNA，或通過微粒轟擊(例如，基因槍法；Biolistic,Dupont)，或通過具有包含該核酸序列的原位支架的基質(zhì)(例如，參見歐洲專利EP0741785Bl和美國專利5,962,427)，或以脂質(zhì)或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包覆，在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z嚢中包封，或通過將其與已知進入細胞核的的肽相結(jié)合進行施用，將其與會遭受受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體相結(jié)合進行施用(例如，參見Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可用于把向特異性表達該受體的細胞類型)等。在另一實施方式中，可形成核酸-配體復(fù)合物，其中該配體包含融合的病毒肽來破壞內(nèi)涵體，從而使核酸避免溶酶體降解。在另一實施方式中，該核酸序列可通過靶向特異性受體在體內(nèi)定向，從而進行細胞特異性攝取和表達(例如，參見PCT公開WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO93/20221)?？商娲?，該核酸序列可被導(dǎo)入胞內(nèi)，并通過同源重組被整合至該宿主細胞DNA中以進行表達(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935;以及Zijlstra等人，1989，Nature342:435-438)。在具體的實施方式中，使用包含編碼預(yù)防或治療性試劑的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller等人，1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。這些逆轉(zhuǎn)錄載體包含正確包裝病毒基因組并整合進入宿主細胞DNA所必需的組件。將在基因療法中使用的所述核酸序列克隆進一種或多種促進該基因傳遞進入個體的載體中。有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更具體的信息可參見Boesen等人，1994,Biotherapy6:291-302,其描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞mdr1基因進入造血干細胞，從而〗吏該干細胞對化療更具耐受力。其它闡述逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因療法中的用途的參考文獻有Clowes等人，1994,J.Clin.Invest.93:644-651;Klein等人，1994,Blood83:1467-1473;Salmons和Gunzberg,1993,HumanGeneTherapy4:129-141;以及Grossman和Wilson,1993，Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3:110-114。腺病毒是可用于基因療法的另一病毒載體。腺病毒是用于向呼吸道上皮細胞傳遞基因的特別受人關(guān)注的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮細胞，并在此引起輕微的疾病。基于腺病毒的傳遞系統(tǒng)的其它靶標(biāo)為肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優(yōu)勢。Kozarsky和Wilson,1993,CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3:499-503中提供了基于腺病毒基因療法的綜述。Bout等人，1994，HumanGeneTherapy5:3-10顯示了腺病毒載體在向恒河猴的呼吸道上皮細胞傳遞基因中的用途。腺病毒在基因療法中的用途的其它實例可參見Rosenfeld等人，1991,Science252:431-434;Rosenfeld等人，1992,Cell68:143-155;Mastrangeli等人，1993,J.Clin.Invest.91:225-234;PCT公布W094/12649;以及Wang等人，1995,GeneTherapy2:775-783。在優(yōu)選的實施方式中，采用腺病毒載體。腺相關(guān)病毒(AAV)也曾被提議用于基因療法(Walsh等人，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300以及美國專利5,436,146)?；虔煼ǖ牧硪环椒òㄍㄟ^諸如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等方法將基因轉(zhuǎn)移進入組織培養(yǎng)中的細胞。該種轉(zhuǎn)移方法通常包括將可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移進入該細胞。然后對該細胞進行選擇，以分離那些攝取并表達該轉(zhuǎn)移基因的細胞。這些細胞隨后被傳遞進入個體。在該實施方式中，該核酸首先^皮導(dǎo)入細胞，隨后4本內(nèi)施用所得的重組細胞。該種導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域任何已知的方法進行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、以帶有該核酸序列的病毒或噬菌體感染、細胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。本領(lǐng)域中已知有多種技術(shù)可用于將外源基因?qū)爰毎?例如，參見Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618;Cohen等人，1993,Meth.Enzymol.217:618-644;Clin.Pharma.Ther.29:69-92(1985))，這些技術(shù)均可用于本發(fā)明，只要受體細胞必要的發(fā)育和生理功能未被破壞。該技術(shù)應(yīng)能將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至該細胞，從而使該核酸可被細胞表達，并優(yōu)選可被其細胞子代繼承和表達。所得的重組細胞可通過本領(lǐng)域已知的各種方法傳遞至個體。重組血細胞(例如，造血干或祖細胞)優(yōu)選通過靜脈內(nèi)施用。預(yù)期使用的細胞的數(shù)量取決于目標(biāo)效果、患者狀態(tài)等，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。用于基因治療目的導(dǎo)入核酸的細胞包括任意理想的、現(xiàn)有的細胞類型，且包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角化細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、巨p藍細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干或祖細胞，尤其是造血干或祖細胞，例如由骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等獲得的造血干或祖細胞等。在優(yōu)選的實施方式中，用于基因療法的所述細胞與該個體自體同源。在重組細胞被用于基因療法的實施方式中，將編碼蛋白的核酸序列導(dǎo)入細胞，從而^_它們可以#:該細胞或其子代表達，隨后將該重組細胞體內(nèi)施用以獲得預(yù)防或治療效果。在具體的實施方式中，^吏用干或祖細胞。任何能被分離并在體外維持的干和/或祖細胞均可用于本發(fā)明的該種實施方式(例如，參見PCT公布WO94/08598;Stemple和Anderson,1992,Cell71:973-985;Rheinwald,1980,Meth.CellBio.21A:229以及Pittelkow和Scott,1986,MayoClinicProc.61:771)。在具體的實施方式中，用于基因療法而被導(dǎo)入的核酸包含可操作地與編碼區(qū)域連接的組成型或組織特異型啟動子。6.實施例以下實施例采用了可用于鑒定具有無義突變抑制活性的化合物的方法。6.1實施例1:促進無義突變抑制和/或調(diào)節(jié)翻譯終止的化合物的鑒定和表晝調(diào)節(jié)提前翻譯終止和/或無義介導(dǎo)的mRNA降解的化合物可通過許多考)中描述了能調(diào)節(jié)任意具有提前翻譯終止密碼子的基因的轉(zhuǎn)錄后表達的化合物的篩選方法。在一個實例中，具有提前終止密碼子的mRNA在體外翻譯并用于歸選測試化合物的庫。在另一實例中，該具有提前終止密碼子的mRNA為具有提前終止密碼子的報告基因。人們開發(fā)了兩種用于高通量篩選的兩種測定法，以鑒定促進無義突變抑制的小分子。各測定法中均采用了熒光素酶，因為這是一種功能報告基因測定法(僅當(dāng)?shù)鞍诪楣δ艿鞍讜r發(fā)光)并且極度靈敏(光強度與nM范圍內(nèi)的熒光素酶濃度成比例)。第一種測定法為基于細胞的熒光素酶報告測定法，第二種為由兔網(wǎng)狀細胞裂解產(chǎn)物和含無義熒光素酶凈艮告mRNA組成的生物化學(xué)測定法。在基于細胞的測定法中，含UGA提前終止密碼子的熒光素酶報告構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染進入293T人胚胎腎細胞。在生物化學(xué)測定法中，含UGA4是前終止密碼子的mRNA被用作體外翻譯反應(yīng)(其采用添加了tRNA、血紅素、肌酸酐激酶、氨基酸、KOAc、Mg(OAc)2和磷酸肌酸的兔網(wǎng)狀細胞裂解產(chǎn)物)的報告體。mRNA的翻譯在來自病毒的前導(dǎo)序列中啟動。合成mRNA可采用T7啟動子和MegaScript體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外制備。在生物化學(xué)和基于細胞的測定法中，已知允許提前終止密碼子通讀的小分子3-[3-(4-異丙基-苯基)-2,5-二氧代-咪唑烷-l-基]-苯甲酸可被用作內(nèi)標(biāo)。6.2實施例2:可提高無義突變抑制并生成功能蛋白的化合物的表征為測定體內(nèi)活性，以測試化合物處理具有含有所述無義UGA的熒光素酶基因的穩(wěn)定細胞系。在添加了lQ/o青霉素-鏈霉素(P/S)和10%胎牛血清(FBS)的標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)基中將細胞生長至70X匯合，并在處理前一天l:l分離。在次日，將細胞另夷蛋白酶化并向96孔組織培養(yǎng)皿的每個j鼓孔中添加40,000個細胞。制備各個化合物的系列稀釋物以生成跨越2log(30)iM至0.3^M)的六點劑量響應(yīng)曲線。各微孔中的DMSO溶劑的終濃度恒定為1%。以1%DMSO處理的細胞作為背景標(biāo)準(zhǔn)，以慶大霉素處理的細胞作為陽性對照。6.3實施例3:無義抑制劑改變化學(xué)修飾劑對28SRRNA中特定核普酸的可及性。前述研究已經(jīng)證明了可降低翻譯精確性的慶大霉素和氨基糖苷家族的其它成員結(jié)合至16SrRNA的A位點。通過化學(xué)足跡、UV交聯(lián)和NMR已顯示慶大霉素結(jié)合在rRNA的A位點(包含核苷酸1400-1410和1490-1500,大腸桿菌編號)的核苷酸1406、1407、1494和1496上(Moazed&Noller，1987,7Va^re327(6121):389-394;Woodcock等人，1991,EMBOJ.10(10):3099-3103;以及Schroeder等人，2000，EMBOJ.19:1-9)。從HeLa細胞制備的核糖體與測試化合物(濃度100(iM)—起孵育，然后以化學(xué)修飾劑(疏酸二甲酯[DMS]或凱托沙[KE])處理?；瘜W(xué)修飾后，以苯酚-氯仿萃耳又rRNA，乙醇沉淀，通過雜交至三個rRNA不同區(qū)域的末端標(biāo)記寡核苷酸進行引物延伸反應(yīng)分析，在6%聚丙烯酰胺凝膠上進行分辨。用于引物延伸的探針涵蓋了整個18S(7個寡核苷酸引物)、28S(24個寡核苷酸引物)和5S(—個引物)rRNA。這些實驗中的對照包括DMSO(由DMSO誘導(dǎo)的rRNA可及性變化的對照)、巴龍霉素(18SrRNA結(jié)合的標(biāo)記)以及茴香霉素(28SrRNA結(jié)合的標(biāo)記)。6.4實施例4:基于細胞的疾病模型中的提前終止密碼子的通讀為了說明無義抑制化合物對特定的遺傳性疾病中改變的mRNA的影響，以測試化合物(20nM)處理在氨基酸1282處(W1282X)具有無義密碼子的支氣管上皮細胞系，并用SPQ測定法監(jiān)測CFTR功能作為cAMP-激活的氯離子通道(Yang等人，1993,HumMolGenet.2(8):1253-1261和Howard等人，1996,NatMed.2(4):467-469)。這些實驗證實了這些細胞的cAMP處理導(dǎo)致SPQ熒光的上升，這與CFTR-介導(dǎo)的鹵化物流出相一致。當(dāng)細胞未以測試化合物處理時，或當(dāng)該細胞未以cAMP刺激時，未觀察到熒光的上升。這些結(jié)果表明該種含無義的等位基因在以測試化合物處理后表達的全長CFTR具有和cAMP-刺激的陰離子通道具有相同作用，從而證實了囊性纖維化細胞系在以測試化合物處理時提高了氯離子通道活性。6.5實施例5:含無義的MDX小鼠的原代細胞在以無義抑制劑處理后表達全長肌營養(yǎng)不良蛋白據(jù)顯示mdx小鼠中導(dǎo)致427kDa肌營養(yǎng)不良多肽提前終止的突變是在外顯子23的位置3185處的C轉(zhuǎn)變成了T(Sicinski等人，1989,Sc/e"ce244(4912):1578-1580)。參照已有的描述從l天大mdx小鼠制備小鼠原代骨骼肌培養(yǎng)物(Barton-Davis等人，1999，JC///"ve"104(4):375-381)。在測試化合物(20pM)存在下將細胞培養(yǎng)10天。每四天更換培養(yǎng)基，并參照已有描述通過免疫染色檢測成肌細胞培養(yǎng)物中肌營養(yǎng)不良蛋白的存在(Barton-Davis等人，1999,JC//"/"""/.104(4):375-381)。使用未經(jīng)稀釋的針對肌營養(yǎng)不良蛋白C末端(F19A12)的一級單克隆抗體，并將結(jié)合了若丹明的抗小鼠IgG作為二抗。F19A12抗體將檢測通過無義密碼子抑制生成的全長蛋白。在賓夕法尼亞大學(xué)通過LeicaDMR顯微鏡、數(shù)碼相機和相關(guān)的成像軟件觀察染色。6.6實施例6:MDX小鼠中提前終止密碼子的通讀才艮據(jù)已有的描述(Barton-Davis等人，1999，JC7/"/"ve立104(4):375-381)，將測試化合物通過植入麻醉小鼠皮下的AlZet滲透泵輸入。施用兩種測試化合物劑量。以慶大霉素作為陽性對照，并以僅裝有溶劑的泵作為陰性對照。向泵中加入適當(dāng)?shù)幕衔?，使得計算的組織所暴露的劑量為10!iM和20|iM。慶大霉素的濃度經(jīng)計算達到約200(iM的組織暴露。在初期實驗中，將小鼠處理14天，隨后以克他命麻醉動物并放血。然后切下實驗動物的脛前(TA)肌，冷凍，并用于對結(jié)合進入橫紋肌肌的營養(yǎng)不良蛋白進行免疫熒光分析。TA肌肉中肌營養(yǎng)不良蛋白的存在可參照已有描述通過免疫染色進行檢測(Barton-Davis等人，1999,JC/z'w/"ve"104(4):375-381)。6.7實施例7:3-f5-(2-氟-苯基)-〖l,2,41噁二唑-3-基卜苯甲酸的制備向3-氰基苯甲酸(44.14g，300mmol)的DMF溶液(0.6L)添加K2C03(62.19g，450mmol)，并在室溫下攪拌30分鐘。在20分鐘內(nèi)向該懸浮液添加碘代甲烷(28mL,450mmo1)，將反應(yīng)混合物在室溫下繼續(xù)攪拌4小時。將反應(yīng)混合物注入1.2L冰水，攪拌30分鐘，并濾出沉淀物。將白色濾餅溶解于甲醇(70mL)，并在冷水中重新沉淀。以79%的產(chǎn)率獲得白色粉末狀的目標(biāo)產(chǎn)物(38g，LC/UV純度為99%)。^-NMR(CDC13)S8.85(2H)，8.28(1H),8.02(1H),4.17(3H)。向3-氰基苯曱酸甲酯(50g，310mmol)的乙醇溶液(500mL)在室溫下添加50%羥胺(41mL，620mmol)水溶液。將反應(yīng)混合物在IO(TC下攪拌1小時，并減壓去除溶劑。將油狀殘留物溶解于20/80乙醇/甲苯(50mLx2)，然后再次濃縮。獲得98Q/o純度(LC/UV)的白色粉末狀的目標(biāo)酯(61g，定量產(chǎn)率)。^畫NMR(CDC13)S9.76(1H)，8.24(1H)，7.82(2H),7.51(1H)，5.92(2H)，3.82(3H)。此時向3-(N-羥基亞胺甲?；?-苯甲酸甲酯(60g，310mmol)的無水THF溶液(200mL)中5"C下添加二異丙基乙胺(75mL,434mmo1)，然后在20分鐘內(nèi)向該混合物添加2-氟苯甲酰氯(48.1mL,403mmo1)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時。濾出沉淀物并減壓濃縮濾出液。將殘留物溶解于乙酸乙酯(400mL)，然后用水洗滌(200mLx2)。減壓去除溶劑，在60%乙酸乙酯的己烷溶液中將目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)晶，得到白色固體狀的目標(biāo)產(chǎn)物(81g，83%產(chǎn)率)。'H-NMR(CDCl3)58.18(lH)，8.03(3H)，7.48(2H)，7.18(2H)，5.61卿53.82卿。使用Dean-Stark裝置將溶于甲苯(500mL)的44g的3-(N-2-氟苯甲酰亞胺甲?；?-苯甲酸甲酯在13(TC下回流4小時。將反應(yīng)混合物在5"下攪拌18小時。濾出白色沉淀物并濃縮濾出液，再次在甲苯中結(jié)晶。獲得99%純度(LC/UV)的白色粉固體狀的目標(biāo)噪二唑(38g，92%產(chǎn)率)。'H-NMR(CDC13)58.91(1H)，8.38(1H)，8.15(2H),7.62(2H)，7.35(2H)，3.95(3H)。向3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸甲酯(3.3g，11mmol)的THF溶液(40mL)添加1.5MNaOH水溶液(IOmL，14mmol)。將反應(yīng)混合物在100。C下回流2小時。去除有機溶劑，并用水(50mL)稀釋該水溶液。然后以HC1水溶液酸化。濾出白色沉淀物，以冰水洗滌該白色濾餅，然后用凍干機干燥。獲得98W純度(LC/UV)的白色粉末狀的目標(biāo)酸(3.0g，96%產(chǎn)率)。炫點242。C;IR3000(芳香的C扁H),1710(C=0);丄H-NMR(D6-DMSO)58.31(1H),8.18(2H)38.08(1H)，7.88(2H)，7.51(2H);13C-NMR(D6-DMSO)5172.71,167.38，166.48，161.25，135.80，132.24，131.79，131.79,131.08，130.91，129.81，127.76，125.48，117.38，111.70;19F-NMR(D6-DMSO)S109.7。3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸的藥學(xué)上可接受的鹽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行制備。鈉鹽可按如下制備。向3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸甲酯(33g，111mmol)的THF溶液(400mL)添加1.5MNaOH水溶液(100mL，144mmol)。將反應(yīng)混合物在IO(TC下回流2小時。減壓去除有機溶劑，并在5。C下攪拌該水溶液2小時。濾出白色沉淀物，濃縮濾出液，并再次在水中沉淀。以冰水洗滌該白色濾餅，然96%產(chǎn)率)。6.8實施例8:口服治療無義突變介導(dǎo)的囊性纖維化本實施例4是供了可用于治療無義突變介導(dǎo)的囊性纖維化的給藥方案。3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物作為香草風(fēng)味的粉末提供以用于懸浮。該藥物在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)條件下生產(chǎn)。該制劑可包括結(jié)合劑和懸浮劑、表面活性劑、以及各種在生產(chǎn)過程中提供輔助的少量賦形劑。該混合物可被包裝于40mL塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，用鋁箔封口和白色塑料的、對兒童安全的蓋子進行密封。每個瓶中可包含或125、250或1000mg(總制劑總重量的25.0%)的藥物物質(zhì)?？商娲兀摶旌衔锟芍苽涑扇鐚嵤├?2所述的藥囊劑劑型。賦形劑(及其相對總劑型重量的比例)包括懸浮劑(Litesse⑧Ultra[精制右旋糖]-25.7%)、可提供味道掩飾的結(jié)合劑(甘露醇-25.0%)、表面活性劑(聚乙二醇3350-12.8%和LutrolmicroF127(poloxamer407粉)-3.7%)、崩解劑(交聚維酮-5.0%)，以及每種存在的量少于2%的其它賦形劑(羥基乙基纖維素、香草香精、硬脂酸鎂[非牛]、以及硅膠)。瓶標(biāo)簽上注明藥物物質(zhì)的種類、批次、藥物物質(zhì)的量、以及儲藏條件(例如，室溫或5。C至8。C冷藏)。所述藥物物質(zhì)的劑量基于每公斤患者體重的藥物毫克數(shù)。藥物物質(zhì)的劑量可大約與現(xiàn)有瓶子的大小保持一致。該給藥方案確保總的實際給藥劑量不比理想劑量<50mg或>250mg(即始終在5mg/kg的浮動(assigned)劑量水平之內(nèi))。例如，體重40kg的患者以4mg/kg的劑量進行治療時的計算劑量為160mg。該患者應(yīng)該接受一個250mg瓶(總計250mg)或6.25mg/kg的劑量。這一相同患者在晚上以8mg/kg的劑量治療時，則計算劑量應(yīng)該為320mg,其應(yīng)該接受兩個250mg瓶(總計500mg)或12.5mg/kg的劑量。這一相同患者在晚上以10mg/kg的劑量治療時，則計算劑量為400mg，其應(yīng)該接受兩個250mg瓶(總計500mg)或12.5mg/kg的劑量。這一相同患者在晚上以20mg/kg的劑量治療時，則計算劑量為800mg,其應(yīng)該接受一個1000mg瓶(總計1000mg)或25mg/kg的劑量。該藥物產(chǎn)品的重新配制和給藥均在室溫下進行。在重新配制前無需對藥物產(chǎn)品進行特定的加溫。該藥物產(chǎn)品可以用任何藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)進行重新配制。對于每個250mg瓶，加入~10mL的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑以在總懸浮液中形成約25mg/mL的濃度。對于每個1000mg^f瓦，加入~20mL的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑以在總懸浮液中形成約50mg/mL的濃度。同樣可以制備約150mg/mL的懸浮液。當(dāng)水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑被加入到干的研究試劑中后，立即蓋上瓶子并用手劇烈振蕩約60秒，以形成均勻的懸浮液。盡管該懸浮液可在攝入前于最初的塑料瓶中保存達24小時，但推薦在重新配制后的短時間內(nèi)攝入該藥物。如果在重新配制和給藥之間有超過15分鐘的間隔，則應(yīng)用手劇烈振蕩該瓶約60秒?？沙掷m(xù)施用治療，只要患有或可能患有囊性纖維化的患者需要。表11列舉了3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的示例性每日給藥方案，其中每天以6-、6-和12-小時(例如，-7:00AM、-1:00PM和-7:00PM)的間隔隨食物施用三次。在具體的實施方式中，該患者參照表11連續(xù)14天施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，隨后14天無治療，接著給藥另外14天，隨后又一個14天無治療。在另一具體實施方式中，該患者參照表11連續(xù)14天以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg的三個每曰劑量施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，隨后14天無治療，隨后以10mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的三個每日劑量給藥另外14天，隨后又一個14天無治療。在某些實施方式中，每天采用表11所列舉的單一每日給藥方案。在另一實施方式中，可在不同的天內(nèi)采用表11列舉的不同給藥方案。表ll.給藥方案123方案TID隨食物給藥TID隨食物給藥TID隨食物給藥安排連續(xù)每日施用連續(xù)每日施用連續(xù)每日施用時間劑量'7:00AM4mg/kg7mg/kg10mg/kg-l:OOPM4mg/kg7mg/kg10mg/kg-7:00PM8mg/kg14mg/kg20mg/kg縮寫TID二每日三次患者優(yōu)選在就餐后30分鐘內(nèi)攝入藥物；理想情況下該藥物應(yīng)當(dāng)以約6-、6-和12-小時的間隔(例如，早餐后的7:00AM、午餐后的1:00PM以及晚餐后的7:00PM)攝入?；颊咄ㄟ^如下方式攝入該藥物將所需量的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑注入每個瓶中，將每個瓶子加蓋并振蕩約60秒，然后攝入每次服藥所需量和大小的瓶子中的內(nèi)含物。重新配制藥物的整個劑量應(yīng)當(dāng)一次攝入。攝入后，用水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑將給藥瓶加至半滿，加蓋并振蕩，然后由患者攝入該瓶中的這種水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑。該洗滌步驟進行一次。在某些實施方式中，該藥物作為藥囊劑提供。在這些實施方式中，稱量或測定該藥物的適當(dāng)量，并在施用前與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的溶劑合并。6.9實施例9:口服治療無義突變介導(dǎo)的杜興型肌營養(yǎng)不良癥本實施例提供了可用于治療無義突變介導(dǎo)的杜興型肌營養(yǎng)不良癥的給藥方案。3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物作為香草風(fēng)味的粉末提供以用于懸浮。該藥物在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)條件下生產(chǎn)。該制劑可包括結(jié)合劑和懸浮劑、表面活性劑、以及各種在生產(chǎn)過程中提供輔助的少量賦形劑。該混合物可被包裝于40mL塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，用鋁箔封口和白色塑料的、對兒童安全的蓋子進行密封。每個瓶中可包含或125、250或1000mg(總制劑總重量的25.0%)的藥物物質(zhì)?？商娲?，該混合物可制備成如實施例12所述的藥嚢劑劑型。賦形劑(及其相對總劑型重量的比例)包括懸浮劑(Litesse⑧Ultra[精制右旋糖]-25.7%)、可提供味道掩飾的結(jié)合劑(甘露醇-25.0%)、表面活性劑(聚乙二醇3350-12.8%和LutrolmicroF127(poloxamer407粉)-3.7%)、崩解劑(交聚維酮-5.0%)，以及每種存在的量少于2%的其它賦形劑(羥基乙基纖維素、香草香精、硬脂酸鎂[非牛]、以及硅膠)。瓶標(biāo)簽上注明藥物物質(zhì)的種類、批次、藥物物質(zhì)的量、以及儲藏條件(例如，室溫或5。C至8'C冷藏)。該藥物的劑量基于每公斤患者體重的藥物毫克數(shù)。應(yīng)當(dāng)計算將向患者施用的藥物總毫克數(shù)相對應(yīng)的總體積。例如，如果一位30kg的患者需要4mg/kg，則待傳遞的劑量為30"=120mg。該患者應(yīng)該使用250mg劑量瓶進行給藥。由于在該種250mg劑量瓶中每mL的懸浮液包含250/10=25mg該種藥物，因此該患者在每個4mg/kg劑量下應(yīng)取用120/25=~5mL該懸浮液。同一患者在晚上以8mg/kg劑量治療時，其計算劑量為240mg，并應(yīng)該接受一個250mg瓶(10mL懸浮液)。這些體積的各個劑量的懸浮液應(yīng)該通過塑料口服給藥注射器而從藥物瓶中取出。在轉(zhuǎn)移<10mL(針對250mg瓶)或<20mL(針對1000mg瓶)的部分體積時，應(yīng)當(dāng)以適當(dāng)類型和大小的給藥注射器(例如，Baxa，Exacta-Med校正的無乳膠的塑料口服給藥注射器)從實驗藥物瓶中取出預(yù)定量并使用同一注射器給藥。在重新配制后的同一24小時內(nèi)，可從懸浮液的相同瓶中取出M劑量；然而，重新配制的藥物不應(yīng)為了使用同一物質(zhì)向同一患者多次給藥的目的而儲存超過24小時。如果在1天內(nèi)需要攝入的藥物總量超過10mL(針對250mg瓶)或20mL(針對1000mg瓶)重新配制的藥物，則應(yīng)在每次給藥時使用新一瓶藥物。針對TID給藥方案，可施用如下藥物劑量TID給藥方案125mg藥囊劑中每次服藥所攝入的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4噁二唑-3-基-苯甲酸的量<table>tableseeoriginaldocumentpage298</column></row><table>針對BID給藥方案，可施用如下藥物劑量BID給藥方案125mg藥囊劑中每次服藥所攝入的3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2，4噁二唑-3-基-苯甲酸的量<table>tableseeoriginaldocumentpage298</column></row><table>該藥物產(chǎn)品的重新配制和給藥均在室溫下進行。在重新配制前無需對藥物產(chǎn)品進行特定的加溫。該藥物產(chǎn)品可以用任何藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)進行重新配制。對于每個250mg瓶，加入10mL的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑以在總懸浮液中形成約25mg/mL的濃度。對于每個1000mg瓶，加入20mL的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑以在總懸浮液中形成約50mg/mL的濃度。當(dāng)水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑被加入到干的研究試劑中后，立即蓋上瓶子并用手劇烈振蕩約60秒，以形成均勻的懸浮液。盡管該懸浮液可在攝入前于最初的塑料瓶中保存達24小時，但推薦在重新配制后的短時間內(nèi)才聶入該藥物。如果在重新配制和給藥之間有超過15分鐘的間隔，則應(yīng)再次用手劇烈振蕩該瓶約60秒?？沙掷m(xù)施用治療，只要患有或可能患有有杜興型肌營養(yǎng)不良癥的患者需要。表12列舉了3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的示例性每日給藥方案，其中每天以12-小時(例如，-7:00AM和-7:00PM)的間隔隨食物施用兩次，或以6-、6-和12-小時(例如，-7:00AM、-l:OOPM和-7:00PM)的間隔隨食物施用三次。在具體實施方式中，該患者連續(xù)14或28天以表12所述的給藥方案中的一種施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。在某些實施方式中，每天采用表12所述的單一每日給藥方案。在其它實施方式中，可在不同的天內(nèi)采用表12所述的不同給藥方案。表12.給藥方案1234方案BID隨食物施用TID隨食物施用TID隨食物施用TID隨食物施用安排連續(xù)每日施用連續(xù)每日施用連續(xù)每日施用連續(xù)每日施用時間劑量7:00AM8mg/kg4mg/kg7mg/kg10mg/kg1:00PMOmg/kg4mg/kg7mg/kg10mg/kg7:00PM8mg/kg8mg/kg14mg/kg20mg/kg縮寫TID二每日三次患者優(yōu)選在就餐后30分鐘內(nèi)攝入藥物；理想情況下該藥物應(yīng)當(dāng)以約6-、6-和12-小時的間隔(例如，早餐后的~7:00AM、午餐后的1:00PM以及晚餐后的7:00PM)攝入?；颊咄ㄟ^如下方式攝入該藥物將所需量的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑注入每個瓶中，將每個瓶子加蓋并振蕩約60秒，使用口服給藥注射器從該瓶中取出適當(dāng)量并直接從該給藥注射器中攝入內(nèi)含物。對應(yīng)于所述劑量的重新配制藥物的整個計算體積應(yīng)當(dāng)一次攝入。在藥物攝入后，應(yīng)以與劑量體積等體積的水或其它藥學(xué)上可接受的溶劑注入該給藥注射器，并由患者攝入。該洗滌步驟應(yīng)進行一次。在某些實施方式中，該藥物作為藥嚢劑提供。在這些實施方式中，稱量或測量該藥物適當(dāng)量，并在施用前與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的溶劑合并。不良蛋白水平相對于基線測量值的變化來確定。6.10實施例10:制備3-「5-(2-氟-苯基)-〖l,2，41噁二唑-3-基l-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的無味劑型3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物可提供為粉末以用于懸浮。該藥物在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)條件下生產(chǎn)。該藥物可與結(jié)合劑和懸浮劑、表面活性劑、以及各種在生產(chǎn)過程中提供輔助的少量賦形劑充分混合。該混合物被包裝于40mL塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，該瓶以鋁箔封口和白色塑料的、對兒童安全的蓋子進行密封。每個瓶子包含約35mg、約70mg、約125mg、約140mg、約175mg、約250mg、約280mg、約350mg、約560mg、約700mg、約1000mg或約1400mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噪二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。賦形劑(及其相對總劑型重量的比例)任選地包括懸浮劑(Litesse⑧Ultra[精制右旋糖]-25.7%)、可提供味道掩飾的結(jié)合劑(甘露醇-25.0%)、表面活性劑(聚乙二醇3350-12.8%和LutrolmicroF127(poloxamer407粉)-3.7%)、崩解劑(交聚維酮-5.0%)，以及每種存在的量少于2%的其它賦形劑(硅石粉、鞋基乙基纖維素、硬脂酸鎂[非牛]、以及硅膠)。瓶標(biāo)簽上注明藥物物質(zhì)的種類、批次、藥物物質(zhì)的量、以及儲藏條件(例如，室溫或5"C至8。C冷藏)。在施用前，該藥物產(chǎn)品可在適當(dāng)體積的藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中重新配制。6.11實施例11:制備3-『5-(2-氟-苯基)-『l,2,41噁二唑-3-基l-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的調(diào)味劑型3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物可提供為香草風(fēng)味(例如，通過添加香草萃取物)的粉末以用于懸浮。該藥物在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)條件下生產(chǎn)。該藥物可與結(jié)合劑和懸浮劑、表面活性劑、以及各種在生產(chǎn)過程中提供輔助的少量賦形劑充分混合。該混合物被包裝于40mL塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，該瓶以鋁箔封口和白色塑料的、對兒童安全的蓋子進行密封。每個瓶子包含約35mg、約70mg、約125mg、約140mg、約175mg、約250mg、約280mg、約350mg、約560mg、約700mg、約1000mg或約1400mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。賦形劑(及其相對總劑型重量的比例)任選地包括懸浮劑(LitesseUltra[精制右旋糖]-25.7%)、可提供味道掩飾的結(jié)合劑(甘露醇-25.0%)、表面活性劑(聚乙二醇3350-12.8%和LutrolmicroF127(poloxamer407粉)-3.7%)、崩解劑(交聚維酮-5.0%)，以及每種存在的量少于2%的其它賦形劑(硅石粉、羥基乙基纖維素、香草香精、硬脂酸鎂[非牛]、以及硅膠)。瓶標(biāo)簽上注明藥物物質(zhì)的種類、批次、藥物物質(zhì)的量、以及儲藏條件(例如，室溫或5°C至8°C冷藏)。在施用前，該藥物產(chǎn)品可在適當(dāng)體積的藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中重新配制。6.12實施例12:3-『5-(2-氟-苯基)-卩,2,41噪二唑-3-基l-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物的藥嚢劑劑型使用嚢狀物或扁嚢包裝所述混合物，該囊狀物或扁囊具有可包括紙層、鋁箔層和沙林(surlyn)層的多重復(fù)合層。每個扁囊可包含約125mg、約250mg、約500mg或約1000mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。賦形劑(及其相對總劑型重量的比例)任選地包括表13和表14所列其中之一。表13.配方成分3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2，4]噁二唑-3-基]-苯曱酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物L(fēng)itesseUltra聚乙二醇LutrolMicro甘露醇羥乙基纖維素24.7512.8香草香精交聚維酮硅石粉硬脂酸鎂表14.配方成分3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物L(fēng)itesseUltra聚乙二醇25.6512.8LutrolMicro3.7甘露醇25.0鞋乙基纖維素1.5香草香精0-75交聚維酮5.0硅石粉0.1硬脂酸鎂0.5然后在該藥嚢劑上添加標(biāo)簽以注明藥物物質(zhì)的種類、批次、藥物物質(zhì)的數(shù)量、以及儲藏條件(例如，5。C至8。C冷藏)。在施用前，可在適當(dāng)體積的藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，水、牛奶、碳酸飲料、果汁、蘋果醬、嬰兒食品或嬰兒配方)中重新配制適當(dāng)量的藥物產(chǎn)品。6.13實施例13:跨上皮電位差(TEPD)測定跨上皮電位差(TEPD)(也稱為鼻部電位差)測定通過評價跨上皮生物電屬性可提供分泌上皮細胞中直接的鈉和氯運輸?shù)撵`敏評價(Knowles等人,1981,TV.Med305(25):1489-95;Knowles等人，1995,T7zw5:445)。TEPD使用標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)在每個鼻孔中進行(Standaert等人，2004,尸edi^/w.57:385-92)。在該方法中，采用小塑料導(dǎo)管來評價鼻孔中鼻粘膜細胞的跨外細胞膜電位差。TEPD值以毫伏或mV表示。電負性等于或負于-5.0mV的氯電導(dǎo)通常認為在正常范圍內(nèi)。TEPD評價在下鼻甲的內(nèi)層鼻上皮細胞上進行，因為這些細胞比下氣道內(nèi)層的呼吸道上皮細胞更容易接近，且已經(jīng)表明具有相同的離子運輸特征(Knowles等人，1981,爿w.iev.iespz>.Dk124(4):484~90)。TEPD評價還可在直腸上皮細胞和下呼吸道上皮細胞上進行。由于CFTR蛋白在運輸氯離子通過細胞膜中具有作用且由于缺失該種蛋白，因此嚢性纖維化患者具有異常的TEPD氯電導(dǎo)。作為終點，TEPD的優(yōu)勢在于它可以檢測到氯運輸變化，這是在氣道細胞中的CFTR存在、功能活性和頂端位置的數(shù)量整合。此外，CFTR活性的直接測量不可能受到CF支持性治療或姑息治療的影響(可能無需全身施用氨基糖苷抗菌素)。重要的是，有證據(jù)表明TEPD值與肺功能障礙和放射學(xué)異常的程度相關(guān)(Ho等人，1997,Ewr.ie^z>.10(9):2018-22;Fajac等人，1998,iM;,r/12(6):1295-300;Sermet-Gaudelus等人，2005,Jw.J.ie5p//.O//.Care7Wed171(9):1026-1031)。具體地，經(jīng)證實異丙腎上腺素誘導(dǎo)的CFTR氯活性的TEPD評價在測定FEV1和放射性評分上比基因型具有更好的預(yù)測價值(Ho等人，1997，Ewr尺^戸VJ.10(9):2018-22)。在基線條件下，TEPD評價的氯離子通道的活性在患有CF的患者中極不可能自發(fā)地正?；?；在TEPD評價氯離子通道活性方面觀察的任何改善預(yù)期可特別地表示CFTR糾正療法的藥理學(xué)活性。因此，它已經(jīng)成為糾正CFTR障礙的l-2期藥理和基因替代研究的主要終點(Peckham等人，1995,A/C//"89(3):277-84;Wilschanski等人，2003,iV.』^fed349(15):1433-41)。6.14實施例14:CFTR免疫熒光可通過標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)從患者的各個鼻孔采集和處理鼻粘膜刮除物，以通過免疫熒光或CFTRmRNA定量來進行評價CFTR蛋白(Clancy等人,2001,爿附.iM//r.O/.O^eMed163(7):1683-92;Amaral等人，2004,CyW,F/Zww.3Suppl2:17-23)。普通上皮細胞(例如，來自于鼻粘膜刮除物)的免疫熒光染色表面大多數(shù)CFTR蛋白存在于頂端表面。在無義突變介導(dǎo)的CF動物模型中或在患有無義突變介導(dǎo)的CF的患者中，沒有觀察到CFTR染色(例如，在對提前終止突變純合的患者中)或主要在核周區(qū)域觀察到CFTR染色304(例如，在具有阻止正常CFTR胞內(nèi)運輸?shù)腁F508突變的患者中)。在動物模型中和患者中，功能野生型或非野生型CFTR蛋白的成功生成與通過免疫熒光檢測到的頂端表皮CFTR蛋白的再現(xiàn)相關(guān)(Clancy等人，2001,爿m.ie5pz>.CW.O^eMed163(7):1683-92;Wilschanski等人，2003，W乂Med349(75):1433-41)。6.15實施例15:肺功能試驗肺功能試驗(包括FEV1、FVC和MEF25-75)以標(biāo)準(zhǔn)肺活量測定法進行檢測。肺功能(包括MEF25-75、FVC、以及特別地FEVl)評價已被認為是CF患者的確定性臨床終點(FoodandDrugAdministration,第62版，Anti-InfectiveDrugsAdvisoryCommittee.DiscussionofNDAfortobramycinsolutionforinhalation(Tobi)forthemanagementofcysticfibrosispatients.November,1997;Tiddens，2002,Pw/附o/w/34(3):228-31)。已經(jīng)表明FEVl和其它肺功能試驗檢測與疾病嚴(yán)重性相關(guān)，其根據(jù)醫(yī)療服務(wù)利用情況和IV抗生素的使用情況預(yù)測疾病發(fā)病率，并顯示與CF有關(guān)的死亡風(fēng)險(FoodandDrugAdministration,第62版，Anti-InfectiveDrugsAdvisoryCommittee.DiscussionofNDAfortobramycinsolutionforinhalation(Tobi)forthemanagementofcysticfibrosispatients.November,1997)。月市功能試驗易于實施(即使對于僅7歲大的患者)，并采用廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備和技術(shù)?？墒褂眉榷ǖ呐c患者年齡、身高和性別有關(guān)的規(guī)范性方程進行解讀。認為FEVl的改善定量顯示了CF中有意義的臨床益處，并用作a鏈道酶和吸入得妥布霉素的注冊審批的基礎(chǔ)(FoodandDrugAdministration,第62版，Anti-InfectiveDrugsAdvisoryCommittee.DiscussionofNDAfortobramycinsolutionforinhalation(Tobi)forthemanagementofcysticfibrosispatients.November,1997)。6.16實施例16:用3-〖5-(2-氟-苯基)-〖l,2,41噁二唑-3-基l-苯甲酸口服治療無義突變介導(dǎo)的嚢性纖維化的2期研究患者必須滿足以下所有條件，方可有資格被招募進入本研究1.基于確定性異常出汗試驗的文件證明診斷患有CF(通過毛果蕓香堿電離子導(dǎo)入法得到汗水氯化物>60mEq/升(LeGrys,Sweattesting:Samplecollectionandquantitativeanalysis:Approvedguidelines—第2版，NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards2000;第20巻14));2.通過TEPD測得異常氯化物分泌(比使用無氯阿米洛利和異丙基腎上腺素測得的氯化物分泌-5mVTEPD評價更正)；3.在c方r基因的一個等位基因中存在無義突變；4.有文件表明已經(jīng)進行過c/"基因測序；5.年齡^:18歲；6.體重^40kg;7.FEV1上根據(jù)年齡、性別和身高的預(yù)測值的40%(Knudson標(biāo)準(zhǔn))(Knudson，1983，Am.Rev.Respi.rDis.127:725-734);8.室內(nèi)空氣下血氧飽和度(通過脈搏血氧測定法測定)^92%;9.在研究藥物施用和隨訪期中，男性和女性患者愿意(如未手術(shù)絕育)禁止性交或者采用避孕屏障或醫(yī)學(xué)避孕方法；10.懷孕測試為陰性(對于有生育可能的女性)；11.愿意并有能力遵守定期訪問、藥品施用計劃、研究程序(包括TEPD測量、臨床實驗室試驗以及PK取樣)、以及研究限制；12.能夠^是供書面知情同意書；以及13.親自簽署并注明日期的知情同意的證明文件，表明患者已被告知該試馬全的所有相關(guān)方面。出現(xiàn)下列任一條件時不得將患者招募進入本研究1.#^居研究者的觀點，以前的或現(xiàn)發(fā)生的醫(yī)學(xué)疾病(例如，伴發(fā)病、精神疾病、酒精中毒、藥物濫用)、病史、體檢發(fā)現(xiàn)、ECG發(fā)現(xiàn)或?qū)嶒炇耶惓？赡軐颊甙踩胁焕绊?、使治療期或隨訪期不可能完成或可能影響研究結(jié)果的評價；2.在研究治療開始前兩周內(nèi)發(fā)生急性疾病，包括急性上或下呼吸道感染；3.在研究治療開始前2月內(nèi)有肺病主并發(fā)癥的病史(包括近期大量咯血或氣胸)；4.胸部X光篩選異常，其表明具有臨床意義的非CF的活躍性肺病，或者新的重大異常(如肺不張或胸腔積液)，其可能是臨床意義的從屬于CF的活性肺病的指征；5.乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗體檢測或人類免疫缺陷病毒(HIV)檢驗陽性；6.血色素〈10g/dL;7.血清白蛋白〈2.5g/dL;8.肝功能異常(血清總膽紅素>正常的上限，或血清ALT、AST或GGT>大于正常上限的2.0倍)；9.腎功能異常(血清肌氨酸酐>正常上限的1.5倍)；10.懷孕或哺乳；11.固體器官或血液移植史；12.在試驗治療開始前14天內(nèi)接觸另一研究藥物；13.正參與任何其它的治療性臨床試驗；14.正使用噻唑烷二酮過氧化物酶體增殖激活受體y(PPAR力激動劑，例如，羅格列酮(Actos或同等藥物)或吡格列酮(Actos或同等藥物)；15.在試驗治療開始前14天內(nèi)改變了鼻內(nèi)藥物治療(包括使用皮質(zhì)類固醇、色甘酸、異丙托溴銨、苯腎上腺素或羥甲唑啉)；16.在試驗治療開始前14天內(nèi)改變了全身性或吸入性皮質(zhì)類固醇治療；17.在試驗治療開始前14天內(nèi)或試驗治療期間使用或需要吸入性慶大霉素或阿米卡星；或者18.在試驗治療開始前14天內(nèi)需要全身性氨基糖甙類抗生素。3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸以本發(fā)明所述的劑型^是供。參照下文的56日計劃向15名患者(12名來自于在以色列進行的2期試驗，3名來自在美國進行的2期試驗；七名患者為男性，8名為女性；患者的平均年齡為22歲；且所有的患者具有嚢腫性纖維化的多種跡象和癥狀，包括一定程度的肺功能障礙)口服施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg每天三次(TID)施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸14天，然后14天無治療(周期1,共28天)，然后以10mg/kg、10mg/kg和20mg/kg每天三次(TID)施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸14天，然后14天無治療(周期2，共28天)。臨床終點可通過以上所述的方法進行評價。在治療前以及周期1和周期2的14日和28日進行TEPD檢測。在治療前以及周期1和周期2的14日和28日從各名患者的各鼻孔采集鼻粘膜刮除物。在以色列所進行的研究中于治療前、周期2的第1日、周期1的13或14日以及周期2的13日或14日進行肺部檢測，包括測定FEV,、FVC和MEF25.75;在美國進行的研究中于治療前以及周期2的13或14日檢測相同的參數(shù)。7E尸Z)襲e^好乎萄f化。這是各個研究參與者在治療期開始至結(jié)束的TEPD氯電導(dǎo)變化的平均值。例如，假設(shè)三名參與者的TEPD氯電導(dǎo)的變化分別為-7.0mV、-2.0mV和-9.0mV，則這三個參與者的TEPD氯電導(dǎo)的平均變化為-6.0mV。^#襲g^p眾應(yīng)^,惑者f為V6。這是在使用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸治療的末期顯示了TEPD氯電導(dǎo)響應(yīng)的患者的百分比。針對本試驗的目的，氯電導(dǎo)響應(yīng)被定義為至少-5mV的TEPD氯電導(dǎo)提高。例如，對于基線TEPD氯電導(dǎo)值為+1.0mV，治療末期TEPD氯電導(dǎo)值為-6.0mV的患者，其TEPD氯電導(dǎo)提高了-7.0mV，這表示具有氯電導(dǎo)響應(yīng)。7E尸D襲色爭值炎/f圼j2,老^^么悉,^》"。如上文指出，電負性等于或負于-5.0mV的氯電導(dǎo)通常認為在正常范圍內(nèi)。這樣，基線TEPD氯電導(dǎo)值為+1.0mV的患者可被認為具有異常值，因為該值比-5.0mV更具電正性。如果在治療末期，該患者的TEPD氯電導(dǎo)值提高為-6.0mV，表示該值被提高至正常范圍，因為該提升后的值比-5.0mV更具電負性。根據(jù)患者性別、年齡和身高，研究入口的平均FEVi為正常值的66。/。，而研究入口的平均FVC為正常值的80%。本分析中15名患者中的14人具有銅綠假單胞菌的氣道定殖(囊性纖維化患者的常見細菌感染，能導(dǎo)致嚴(yán)重肺炎)。15名患者中的14人還患有胰腺功能不全并需要慢性胰酶替代療法。患者具有較低的體重，研究入口的平均體重為58.3kg。表15顯示了15名患者的TEPD結(jié)果。各個測定的結(jié)果分別顯示為鼻孔最佳值和兩個鼻孔平均值。過去TEPD測驗的結(jié)果通常顯示為鼻孔最佳值。然而，由囊性纖維化治療劑開發(fā)網(wǎng)絡(luò)最近制定的指南推薦同時顯示兩種TEPD結(jié)果?？擅黠@看到具有不同類型的CFTR基因無義突變的患者中TEPD氯電導(dǎo)提高。表15TEPD結(jié)果TEPD氯電導(dǎo)的平均變化鼻孔最佳值兩個鼻孔平均值TEPD氯電導(dǎo)提高2-5mV的患者數(shù)鼻孔最佳值兩個鼻孔平均值TEPD氯電導(dǎo)提高至正常的患者數(shù)鼻孔最佳值兩個鼻孔平均值較低劑量水平結(jié)果P國值-9.0mV<0細-6.7mV<0細9/15(60%)<0.0016/15(40%)0.0058/15(53%)0扁6/15(40%)0.032較高劑量水平結(jié)果p-值-6.4mV0.010-4.4mV0.0238/15(53%)<0扁7/15(47%)《細8/15(53%)0扁7/15(47%)0.016較低和較高3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸劑量水平的治療效果并不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，這表明沒有必要作進一步的劑量提升，且即使較低劑量的3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸也能有效提高TEPD氯電導(dǎo)。還觀察到有關(guān)第二終點的統(tǒng)計上顯著的結(jié)果和正向趨勢。具體地，盡管本試驗未檢測到第二終點方面的統(tǒng)計上的顯著變化，但觀察到了從研究入口至高劑量治療周期末期患者的平均FEV^FVC和體重的統(tǒng)計學(xué)上的顯著提高。表16顯示了該結(jié)果。對于肺功能的變化，一名患者不包括在內(nèi)，因為該患者在高劑量治療周期的末期并未檢測肺功能。表16終點研究入口肺功能(表示為相對性別、年齡和身髙的正常值的百分比)平均FEV,...........................65.8%平均FVC............................80.2%體重58.3kg表17描述了來自這15名患者的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2,4]噁二唑-3-基苯甲酸中期PK參數(shù)。不同性別的PK參數(shù)沒有明顯差異。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage311</column></row><table>此外，盡管未通過生活質(zhì)量問巻來正式檢測患者癥狀的變化，但試驗研究者被要求詢問患者囊性纖維化癥狀的變化。在中期分析包括的15名患者中，6名報告了健康的總體改善，6名報告了咳嗽的減少，IO名報告了粘液厚度的減少和更容易清除粘液。隨后進行以3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸口服治療無義突變介導(dǎo)的囊性纖維化的第二個2期研究方案。該治療以兩個28天的周期施用。每個周期包括連續(xù)14日每日以3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸進行治療，然后計劃為14日無研究藥物給藥期。如果需要，周期2的治療可在周期1的3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]。惡二唑-3-基]-苯甲酸最后劑量后早至10天或晚至28天開始。群組1中的患者將在周期1內(nèi)每日三次分別以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg的劑量以6-、6-和12-小時(±30分鐘)的間隔施用3-[5-(2-氟隱苯基)-[l,2，4]噪二唑-3-基]-苯甲酸。理想情況下每個劑量應(yīng)在就餐后30分鐘(例如，早餐后的7:00AM、午餐后的1:00PM、晚餐后的7:00PM)內(nèi)施用。在第二個周期內(nèi)進行計劃的給藥方案改變，從而使該群組中的每個患者在周期2內(nèi)以8mg/kg的劑量每日兩次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情況下每個劑量應(yīng)在就餐后30分鐘(例如，早餐后的7:00AM和晚餐后的7:00PM)內(nèi)施用。群組2中的患者在周期1內(nèi)以8mg/kg的劑量并以12小時(±30分鐘)的間隔每日兩次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情況下每個劑量應(yīng)在就餐后30分鐘(例如，早餐后的7:00AM和晚餐后的7:00PM)內(nèi)施用。在第二個周期內(nèi)進行計劃的給藥方案改變，從而使該群組中的每個患者將在周期2內(nèi)以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg的劑量每日三次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情況下每個劑量應(yīng)在就餐后30分鐘(例如，早餐后的7:00AM、午餐后的1:00PM、晚餐后的7:00PM)內(nèi)施用。6.17實施例17:用免疫熒光和WESTERN印跡檢測肌營養(yǎng)不良蛋白、肌聚糖和肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖的表達在治療前于局部麻醉和清醒鎮(zhèn)靜(在某些情況下可能需要全身麻醉)的情況下進行一只腳的EDB肌肉和上覆皮膚的活組織檢查，并在治療的最后一天進行另一只腳的活組織檢查。該活組織檢查方法采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行(Stedman，2000，HumanGeneTherapy11:777-90)。在該方法中(如有可能)去除整個腹肌。在治療前采集活檢組織時，將肌肉標(biāo)本分為至少3個片段，并將治療最后一天采集的活檢標(biāo)本至少分為2個片段。將活檢標(biāo)本置于用Ringer鹽溶液潤濕的telfa紗布海綿上。在立體解剖顯微鏡下以低倍數(shù)觀察活檢標(biāo)本，以確定纖維取向。在可能時以鋒利的手術(shù)刀以橫截方式(與纖維取向垂直)橫切肌肉，并放置2分鐘以使痙攣停止。然后在液氮冷卻的異戊烷中冷凍該樣本，轉(zhuǎn)移至液氮容器，并在液/氣界面1英寸以上保留2分鐘，從而在浸入液氮之前緩慢冷卻并蒸發(fā)異戊烷，并包入預(yù)先冷卻(于液氮中冷卻并儲存在干冰上)的標(biāo)記了研究編號、位點編號、患者編號、日期、患者姓名首字母以及腳的位置(右側(cè)腳或左側(cè)腳)的金屬薄片中。所有的樣本容器均清晰標(biāo)明個體身份和采集日期。標(biāo)記應(yīng)當(dāng)以能夠防止脫落的方式固定在樣本容器上。進行該操作后立即運送樣本以供分析/培養(yǎng)/主要檢查(centralreview)。為檢測肌營養(yǎng)不良蛋白，可采用3種市售的識別該蛋白C末端、N末端和桿狀區(qū)的抗體。為檢查肌聚糖和肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖復(fù)合物，如有可能采用市售的針對a-、p-、Y-和S-肌聚糖以及(3-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖的抗體。該分析中采用了表面熒光顯微術(shù)。在對正常肌肉標(biāo)本進行熒光強度的校正后，以CCD相機捕獲圖像。將圖像數(shù)字儲存和留存以供進一步考察，并在研究完成時進行最終的評價。還對組織進行處理以使用相同抗體通過Western印跡檢測組織中的肌營養(yǎng)不良蛋白、肌聚糖和P-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖。捕捉顯微鏡圖像并留存以供進一步考察和在研究完成時進行最終的評價。保留剩余肌肉組織樣本以進行DMD中涉及的mRNA和蛋白的驗證試驗。免疫染色和Western印跡可用于蛋白檢測。肌肉活檢通常作為研究過程中診斷和療效測定的一部分在DMD個體上進行。選擇EDB是因為它是日常活動的非必需肌肉，因此該肌肉的取樣不會對該個體產(chǎn)生不利的功能后果。由于很少使用，EDB肌肉不太可能顯示大量的肌肉纖維更換，因此是檢測肌營養(yǎng)不良蛋白的合適組織。由于EDB肌肉易于辨別，可在局部麻醉狀態(tài)下解剖，并提供了足夠進行所需分析的組織數(shù)量，因而EDB肌肉的取樣還提供了其它的實際優(yōu)勢。免疫熒光和Western印跡是在肌肉活檢標(biāo)本上確認全長肌營養(yǎng)不良蛋白的存在或缺失的常規(guī)測試。肌營養(yǎng)不良蛋白的缺失被看作是DMD的確診。肌營養(yǎng)不良蛋白的修復(fù)并定位到肌肉膜被認為是臨床前和臨床藥效活性的直接測量(Barton-Davis,1999,J.Clin.Invest104(4):375-81;Politano,2003,ActaMyol.22(1):15-21)。6.18實施例18:上肢和下肢肌力法上下肢肌力法可通過手持式肌力計根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進行(Beenakker,2001,A^Mr續(xù)Mscw/.Z)/wni11(5):441-6;Hyde,2001,7Vew謹(jǐn)M5rw/.D/soni11(2):165-70)。(根據(jù)個體的基線功能狀態(tài))推薦評價的肌肉組包括髖外展肌、膝伸肌、肘屈肌和伸肌、以及手抓力?？蛇M行雙側(cè)評價，且可從每個肌肉組的每一側(cè)記錄三個測量值。這些參數(shù)可在治療前、治療的第二至最后一天、以及治療后的隨訪期內(nèi)進行監(jiān)測。在治療前和治療期間，該肌力法可在肌肉活檢之前進4亍。314通過手持肌力計進行的肌力法評價是針對可走動和不可走動的個體的肌肉力量的一種靈敏的可重復(fù)的檢測法(Beenakker,2001，A^Mra附船cw/.Z)^o/y/.11(5):441-6;Hyde,2001,A^MrawwcM/.Lfeon/.11(2):165-70)?；加屑I養(yǎng)不良癥的個體的評分信度高(Stuberg，1988，尸一.L198868(6):911-82;Hyde,2001,vVewo附wcm/.11(2):165-70)。與徒手肌力測定相比，肌力法更為靈敏，且對肌肉功能檢測的復(fù)雜性更低(McDonald,1995,/尸/7，，Medie/7"^7.(5Suppl):S70-92)。該測試可由評價者(例如，醫(yī)生或物理治療師)簡單地實施。619實施例19:計時功能試驗計時功能試驗包括從仰臥姿勢站起所需的時間，行走10米所需的時間，以及爬上4級標(biāo)準(zhǔn)大小的階梯所需的時間(Mendell,1989,MJ.Mec/.320(24):1592-7;Griggs,1991,7Ve"ra/.48(4):383-8)。這些參數(shù)可在治療前、治療的第二至最后一天、以及治療后的隨訪期內(nèi)進行監(jiān)測。在治療前和治療期間，該計時功能試驗可在肌肉活檢之前進行。這些試驗(仰臥姿勢站起所需的時間、行走10米所需的時間、以及爬上4級標(biāo)準(zhǔn)大小的階梯所需的時間)提供了對可走動個體的功能能力的附加檢測。這些試驗重現(xiàn)性好、較為常用、易于實施，并能記錄對類固醇治療性介入的響應(yīng)(Mendell，1989,W她d320(24):1592-7;Griggs,1991,*c/z.48(4);383-8)。6.20實施例20:血清CK水平血清CK活性采用市售的NADH連^^妾的動力學(xué)測定(DiagnosticChemicalsLtd.,Oxford,CT)進行評價。血清CK水平可在治療前，治療期第1天(第一劑量前)、第7天、第14天、第21天和第27天，以及治療后的第42天和第56天進行檢測。血清CK在杜興型肌營養(yǎng)不良癥中上升，因此它是該疾病的簡易可測診斷標(biāo)記，并可作為該藥物藥理活性的潛在生物標(biāo)記(Mendell等人，1989,TVew/320(24):1592-1597)。血清CK才是供了對全身肌肉完整性的檢測。在患有DMD的個體中該酶在血清中的濃度會上升50至100倍，且對其水平的檢測可用于進行該疾病的早期診斷(Worton,Themusculardystrophies,在ScriverCR.,BeaudetA丄.,SlyW.S.,ValleD編，Themetabolicandmolecularbasisofinheriteddisease.第8版，第4巻，NewYork:McGraw-Hill,2001:5493-523中)。通過血清CK水平的檢測可以監(jiān)測該疾病的進展，并作為肌肉損傷的標(biāo)記。盡管運動誘導(dǎo)的變化可帶來可變性(Politano,2003,Jcto.22(1):15-21)，但該標(biāo)記仍具有一定優(yōu)勢，因為它用廣泛使用的可靠的測定法可容易地、反復(fù)地和頻繁地評價。已有臨床研究顯示血清CK的下降與類固醇治療中肌肉力量的提升相一致(Reitter,1995,Sra/"Dev.17Suppl:39-43)。6.21實施例21:真皮纖維原細胞及肌肉細胞培養(yǎng)在來自患者的肌肉組織和皮膚進行研究，以確定來自患者的原代肌肉培養(yǎng)中的肌營養(yǎng)不良蛋白生成是否與體內(nèi)的肌營養(yǎng)不良蛋白生成相對應(yīng)。這些實驗評價來自患者的真皮纖維原細胞在以Myo-D-生成表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后體外分化成為肌肉細胞時(Wang,2001,Development128:4623-33)是否響應(yīng)治療而顯示生成肌營養(yǎng)不良蛋白。皮膚細胞應(yīng)答與臨床活性的相關(guān)性可為選擇進行治療的患者，或是為治療DMD的新試劑篩選提供易獲性預(yù)測試驗。細胞可按如下方式培養(yǎng)?；顧z物質(zhì)在運輸過程中儲存于人擴增培養(yǎng)基(或PBS)中，如有需要置于水上以儲存更長時間。如果該組織不在24小時內(nèi)制備，則該物質(zhì)可冷凍于含10%DMSO的人擴增培養(yǎng)基并在液氮(或干冰)中儲存。在準(zhǔn)備組織以建立成肌細胞培養(yǎng)時，以PBS洗涂活檢材料。向培養(yǎng)皿添加足以使該組織潤濕的PBS。用刀片將活檢材料徹底切碎至幾乎均勻懸浮的狀態(tài)。添加每克組織約2ml的膠原酶/分散酶/CaCb溶液，并繼續(xù)破碎數(shù)分鐘(例如，5x5x5mm的肌肉活檢標(biāo)本使用1ml的酶溶液)。將該懸浮液轉(zhuǎn)移至無菌管中，并在37'C下水浴中孵育，直至該混合物成為稀漿狀(例如，約20至30分鐘)。在孵育過程中通過多次上下移液使該懸浮液進一步勻漿化。如有需要，使用注射器上下移液進行附加的重懸浮循環(huán)。向該懸浮液添加8mL的人擴增培養(yǎng)基并混合。將混合物在1200rpm下離心IO分鐘。將細胞團重懸浮于3ml人擴增培養(yǎng)基。將細胞接種到膠原涂覆的6孔平板的一個微孔上，或者，根據(jù)材料的數(shù)量，接種到T25膠原涂覆的瓶中。在37。C和5Q/。C02下培養(yǎng)細胞48小時。去除未吸附細胞，并轉(zhuǎn)移至另一膠原涂覆的微孔中(作為備份)。向第一個微孔添加新鮮的擴增培養(yǎng)基(3ml)。將第一微孔的細胞培養(yǎng)至匯合，并直至獲得兩個匯合的T75瓶。為進行儲存，將細胞從一個T75瓶中移入4個具有1ml冷凍培養(yǎng)基的低溫保存管中冷凍。培養(yǎng)物中的肌原性細胞成分可通過肌間線蛋白染色進行檢測。在肌間線蛋白陽性細胞的百分比太低的情況下，需要預(yù)接種該培養(yǎng)物。6.22實施例22:3-[5-(2-氟-苯基)-「l,2,41噁二唑-3-基l-苯甲酸口服治療杜興型肌營養(yǎng)不良癥的2期研究格被招募進入本研究1.基于5期所表示的臨床表型，及血清CK^^是高和肌肉活檢標(biāo)本中肌營養(yǎng)不良蛋白缺失(以肌營養(yǎng)不良蛋白的C末端部分的抗體進行的肌纖維膜染色呈陰性)，診斷患有杜興型肌營養(yǎng)不良癥(DMD);2.肌營養(yǎng)不良蛋白基因中存在無義突變；3.有文件記載表明進行過肌營養(yǎng)不良蛋白基因測序，或在未進行過該測序時，已將血液樣本發(fā)送用于驗證性肌營養(yǎng)不良蛋白基因測序；4.經(jīng)物理檢查或射線成像證明在雙足上均有EDB肌肉；5.能夠走動；6.男性；7.年齡^5歲；8.已知性活躍的個體愿意在研究藥物施用和隨訪期中禁止性交或者采用避孕屏障或醫(yī)療避孕方法；9.愿意并有能力遵守定期訪問、藥品施用計劃、實驗室試驗、研究限制、以及研究程序(包括肌肉活檢、肌力法、以及PK取樣)；10.當(dāng)年與&18歲時，能夠^是^^書面知情同意書，或當(dāng)年與&7歲時，能夠提供書面知情同意(經(jīng)父母親/監(jiān)護人同意)。如果該個體年^<7歲，可獲取父母/法定監(jiān)護人的同意；以及11.親自簽署并注明日期的知情同意的證明文件(年^^27歲的兒童同樣要求同意)，該證明文件表明該個體/父母/法定監(jiān)護人已被告知該試驗的所有相關(guān)方面。出現(xiàn)下列任一條件時不得將個體招募進入本研究3181.根據(jù)研究者的觀點，以前的或現(xiàn)發(fā)生的醫(yī)學(xué)疾病(例如，伴發(fā)病、精神疾病、酒精中毒、藥物濫用)、病史、體檢發(fā)現(xiàn)、ECG發(fā)現(xiàn)或?qū)嶒炇耶惓？赡軐颊甙踩胁焕绊?、使治療期或隨訪期不可能完成或可能影響研究結(jié)果的評價；2.具有充血性心力衰竭的臨床癥狀和表現(xiàn)(美國心臟病學(xué)院/美國心臟病協(xié)會C階段或D階段)(Hunt,2001,J.爿附.Co〃.CmY&)/.35:2101-13);3.乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗體檢測、或人類免疫缺陷病毒(fflV)檢驗陽性；4.血色素〈10g/dL;5.血清白蛋白〈2.5g/dL;6.GST或總膽紅素異常(>正常的實驗室上限)；7.腎功能異常(血清肌氨酸酐〉正常的實驗室上限的1.5倍)；8.固體器官或血液移植史；9.正在使用免疫抑制療法(非皮質(zhì)類固醇類)；10.在試驗治療開始前28天內(nèi)接觸另一研究藥物；11.正參與任何其它的治療性臨床試驗；12.正使用噻唑烷二酮過氧化物酶體增殖激活受體y(PPAR力激動劑，例如，羅格列酮(Avandia⑧或同等藥物)或吡格列酮(Actos或同等藥物)；13.在研究治療開始前3個月內(nèi)改變了全身性皮質(zhì)類固醇療法(例如，治療的啟動；治療的中止；劑量、進度或類固醇類型的改變)；或者14.在試驗治療開始前3月內(nèi)用全身性氨基糖甙類抗生素治療。3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸以本發(fā)明所述的劑型提供。對每個治療組施用治療28天。對患者的初始群組每日三次以給定的劑量水平(例如，4、4和8mg/kg)的3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸治療28天。如果該初始患者對藥物耐受，則第二組患者每日三次接受更高劑量水平(例如，10、10和20mg/kg)的3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。這樣，每位患者接受了總計84劑量的3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。在28天治療的末期，每位患者將繼續(xù)進行附加的28天無治療。在每個劑量水平下，推薦以6、6和12小時(±30分鐘)間隔每天三次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情況下每個劑量應(yīng)在就餐后30分鐘(例如，早餐后的7:00AM、午餐后的1:00PM、晚餐后的7:00PM)內(nèi)施用。盡管可以理解在門診安排中可能出現(xiàn)不同的給藥方案，但推薦該處方方案(包括給藥間隔和給藥和就餐的關(guān)系)緊隨PK樣本采集的日子。臨床終點可通過如上方法進行評價。向六位患者以早餐時4mg/kg、午餐時4mg/kg和晚餐時8mg/kg的方案每日三次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸，其每日總劑量為16mg/kg。所有的患者均可走動，但具有DMD的特征表現(xiàn)和癥狀，包括一定程度的肌肉功能障礙和提高的CK濃度。未報道嚴(yán)重的藥物相關(guān)不良事件。初步結(jié)果提示所有潛在的藥物相關(guān)不良事件的嚴(yán)重性均較溫和。這種不良事件包括腹瀉l例；腹部疼痛l例；以及脹氣2例。目前尚未在患者的身體檢查、生命體征測量、或心電圖中發(fā)現(xiàn)有安全問題。在血清肝酶、膽紅素、肌酐或脲氮方面未觀察到臨床意義的提高。治療順應(yīng)性良好，患者接受了>95%的預(yù)期的28天低劑量水平的全部藥物治療。未有患者由于不良事件而停止治療。表18描述了來自這6名患者的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸中期PK參數(shù)。在DMD2期研究中的取樣期之間的27天治療間隔中既沒有藥物積累的證據(jù)，也沒有由代謝誘導(dǎo)的藥物水平下降的證據(jù)。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage321</column></row><table>參照如下方案進行額外的2期研究以評價3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸在患有無義突變介導(dǎo)的DMD的患者中的安全性、順應(yīng)性、PK、對全長肌營養(yǎng)不良蛋白表達的影響以及臨床活性。分別在早餐、午餐和晚餐后以4、4、8mg/kg(低劑量)，10、10、20mg/kg(中劑量)，和20、20、40mg/kg(高劑量)的劑量水平口服施用28天的3-[5-(2陽氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。26位男孩(年齡5-13歲；終止密碼子15UGA、6UAG、5UAA;基線血清CK:8,645-49,500IU;類固醇使用19/26)完成了低(11=6)或中(11=20)劑量水平的3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2，4]噪二唑-3-基]-苯甲酸。所有的不良事件和實驗室異常均為輕至中度，且其頻率或嚴(yán)重性沒有劑量相關(guān)性變化。兩種劑量水平下的順應(yīng)性均>98%。第1和第28天的PK顯示隨時間變化血漿暴露穩(wěn)定；然而，在3-[5-(2-氟-苯基)-[1.2,4]噪二唑-3-基]-苯甲酸治療的健康成年志愿者和嚢性纖維化患者中的暴露較低。治療前肌肉活檢組織的肌管培養(yǎng)顯示，在24/24(100%)可評價的患者中，肌營養(yǎng)不良蛋白表達用體外3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸治療表現(xiàn)出劑量依賴性提高。相對于基線，在低和中劑量下的男孩中分別發(fā)生4/6(67%)(90%CI27-94%)和10/20(50%)(90%CI30-70%)的體內(nèi)肌營養(yǎng)不良蛋白表達的治療后提升。在3-[5-(2-氟-苯基)-[l，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸施用過程中血清CK水平明顯下降。在28天的治療中，肌肉力量和計時功能的變化較小，不太明顯。3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸在患有無義突變介導(dǎo)的DMD的男孩中安全地誘導(dǎo)了全長肌營養(yǎng)不良蛋白的體外和體內(nèi)表達，并降低了血清CK水平。盡管低和中劑量水平的3-[5-(2-氟-苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸具有活性，但它們未形成與最大臨床前活性相關(guān)的血漿暴露。對高劑量水平下的另12位男孩的評價正在進行。7.紐本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認識到或能利用常規(guī)實驗確定本發(fā)明所述的發(fā)明的具體實施方式的眾多等同方式。這些等同方式應(yīng)該包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書中所涉及的所有出版物、專利和專利申請均引用作為參考，其引用程度如同每一個單獨的出版物、專利和專利申請?zhí)囟ǖ貑为氁秊閰⒖家粯印?quán)利要求1.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體口服施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該無義密碼子抑制劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25％，且第三劑量為總施用量的50％。2.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體口服施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該無義密碼子抑制劑的有效量足以生成0.1嗎/ml至500昭/ml該試劑的血漿濃度至少2小時。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg,其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，且第三劑量為總施用量的50%。5.如;R利要求2、3或4所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑經(jīng)口服施用至人個體。6.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體口服施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該無義密碼子抑制劑的有效量對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑經(jīng)口服施用至人個體。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg,其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，且第三劑量為總施用量的50%。9.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量足以生成0.1|ig/ml至500(ig/ml該試劑的血漿濃度至少2小時。10.如權(quán)利要求1、2或6所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量不會引起人個體的聽力損失和/或腎衰竭。11.如權(quán)利要求l、2或6所述的方法，其中所述人個體根據(jù)對所述無義密碼子抑制劑發(fā)生響應(yīng)的可能性進行篩選。12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量等于在包含以下步驟的報告基因測定中抑制無義密碼子的量(a)將所述試劑與具有包含報告基因的核酸序列的細胞相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的表達和/或活性。13.治療、控制和/或預(yù)防與基因無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有此需要的人個體口服施用有效量的無義密碼子抑制劑，其中該試劑的有效量是足以生成有效量的由該包含無義突變的基因編碼的功能通讀蛋白的量。14.如權(quán)利要求13所迷的方法，其中所述功能通讀蛋白的有效量是預(yù)防所述疾病或其癥狀發(fā)作、發(fā)展和/或惡化所必需的蛋白量。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述功能通讀蛋白的有效量是減少所述疾病或其癥狀的延續(xù)時間和/或嚴(yán)重性所必需的蛋白量。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述功能通讀蛋白的有效量是在所述疾病的動物模型中生成的在該動物模型中具有治療和/或預(yù)防益處的量o17.如權(quán)利要求13所迷的方法，其中所述功能通讀蛋白的有效量等于包含所述疾病相關(guān)基因的細胞所生成的量。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細胞所生成的功能通讀蛋白的量為包含編碼相應(yīng)野生型蛋白的基因的相同物種和類型的細胞所生成的量的約1%、約5%、約10%、約15%或約25%。19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg，其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%,且第三劑量為總施用量的50%。20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑的有效量可生成0.1|ig/ml至500|ig/ml該試劑的血漿濃度至少2小時。21.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑不會引起人個體的聽力損失和/或腎衰竭。22.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。23.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述人個體根據(jù)對無義密碼子抑制劑發(fā)生響應(yīng)的可能性進行篩選。24.如權(quán)利要求1、2、6或13所述的方法，其中所述無義密碼子抑制劑為3-[5-(2-氟-苯基)-[l,2,4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。25.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體施用有效量的下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X、Y和Z獨立地選自N、S、O和C，其中X、Y或Z中至少一個為雜原子；&為氫、CrC6烷基、或Na+、或Mg2、R2獨立地為缺失；氳；-01=^-011基團；氰基基團；C廣C6烷基，其任選地被羥基基團取代；或羰基基團，其任選地被氫、羥基或C,-C4烷氧基取代；R:、獨立地為缺失、卣素、羥基、C廣C6烷基、C廣C4烷氧基或硝基基團；R4獨立地為缺失，氬，C,-C6烷基，或與W—起時，R4可以是鍵，且W與R4和W所連接的雜環(huán)形成一個十一至十三元雜三環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；W選自(a)C2-C6炔基，其任選地被苯基取代；(b)CrC8直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個或多個獨立地選自如下的基團取代Q-C6烷基；卣素；-C(O)-NH-苯基，其中苯基任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或C廣C4烷基基團取代；五至六元雜環(huán)；CVC8芳基，其任選地被一個或多個獨立地選自羥基、面素、C廣C4烷基、C廣C4卣烷基、C廣Q烷氧基或任選地被一個或多個CVQ烷基取代的氨基的基團取代；芳氧基，其任選地被一個或多個獨立地選自如下的基團取代羥基、鹵素、CrQ烷基基團、d-C4卣烷基基團、Q-C4烷氧基基團或任選地被一個或多個Q-C4烷基基團取代的氨基基團；(c)C2至Cs烯基;(d)C3-C8環(huán)烷基，任選地被CrC6烷基取代；(e)C6-Q芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代羥基；卣素；CVC4直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或羥基基團取代；C廣Q烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或苯基基團取代；C3-Cs環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的Q-C4烷基基團取代；CVC8芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團取代；芳氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代羥基、囟素、C廣C4烷基基團、C,-C4卣烷基基團、C,-C4烷氧基基團、或被一個或多個獨立選擇的C廣Q烷基基團任選地取代的氨基基團；五至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代C「C4烷基、氧代、或任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代的CVCs芳基羥基、卣素、Q-C4烷基基團、CVQ卣烷基基團、C廣C4烷氧基基團、或被一個或多個獨立選擇的CrC4烷基基團任選地取代的氨基基團；萘基基團，其任選地被氨基或氨烷基或烷氧基基團取代；-C(O)-NRxRy基團；-C(O)-Rx基團；異"引咮-l,3-二酮基團；硝基基團；氰基基團；-S03H基團；烷疏基基團；烷基磺酰基團；-NRx-C(O)-Rz基團；-NRxRy基團；-NRx-S02-Rz基團；-NRx-C(0)-NRxRy基團；-NRx-C(0)0-Rz基團；(f)CurCi4芳基基團，其任選地被一個或多個獨立地選自卣素、氨基基團或氨烷基基團、或坑氧基基團的基團取代；(g)-C(O)-NRxRy基團；(h)五或六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的如下的基團取代氧代基團；卣素；C廣C4烷基基團；C廣C4烷氧基基團；C廣C4卣烷基基團；CrC4鹵烷氧基基團；芳氧基基團；-NRxRy基團；烷硫基基團；-C(0)-Rx基團；或C6至Q芳基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的閨素、CVC4烷基基團、C,-C4烷氧基基團取代；(i)具有二至三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雜環(huán)基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素、氧代基團、d-C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、或C廣C4烷氧基基團取代；(j)或W與R4，包括當(dāng)R4是一個鍵時，與R4和W所連接的雜環(huán)一起形成一個十一至十三元雜-三環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其中Rx為氫、C廣C6烷基基團，或Rx和Ry以及它們所連接的原子一起形成四至七元義友環(huán)或雜環(huán)；R》,為氫、C廣C6烷基基團；任選地被一個或多個獨立地選擇的Q-Q烷基基團取代的芳基基團，或Rx和Ry與它們所連接的原子一起形成四至七元石友環(huán)或雜環(huán)；和Rz為d-Q烷基，其任選地被芳基或卣素取代；或芳基，其任選地被卣素、C,-C6烷基或d-C6烷氧基取代。26.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體施用有效量的下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C廣C4烷基基團，其中W、X、Y和Z中至少一個為N;n為0、1、2或3;R！為氰基基團；氨基甲酰，其任選地被一個或兩個CrC4烷基基團取代；或羰基基團，其任選地被幾基、C廣C4烷基、或d-C4烷氧基基團取代；R為羥基基團；卣素；Q-C4烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或羥基基團取代；Q-C4烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或苯基基團取代；Q-C8環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團取代；-Rb基團；-O-Rb基團；五至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的Q-C4烷基、氧代、或-Rb基團取代；具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；羰基基團，其任選地被鞋基、C!-C4烷基、或d-C4烷氧基基團取代；氨基甲?；?，其任選地被一個或兩個C,-C4烷基基團取代；硝基基團；氰基基團；任選地被輕基、CrQ烷基、或-Rt、基團取代的硫代；磺酰基，其任選地被羥基、CrQ烷基、或-Rb基團取代；氨基，其任選地被一個或兩個獨立選擇的CpC4烷基、磺?；螋驶鶊F取代，其中所述氨基磺?；芜x地被羥基、Q-Q烷基、或-Rb基團取代，且其中所述氨基羰基基團任選地被CVC4烷基、d-Ct卣烷基、苯甲酰氧基或被-Rb基團任選地取代的氨基基團取代；或者兩個R基團與它們所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]二氧雜或2,3-二氫-苯并[1，4]二噁唑基基團，其中-Rb為QrC8芳基，任選地被一個或多個如下基團取代羥基、卣素、C廣C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、C廣Q烷氧基基團、或任選地被一個或多個C廣Q烷基基團取代的氨基基團。27.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體施用有效量的下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Ai為C、CH或N;V和X獨立地選自N或C;W選自N、C或CH;其中V、W或X中至少一個為N，且其中當(dāng)W為N時，V或X中至少一個也是N;Y和Z獨立地選自N、C、C-Rc、C=0、C=S，其中Rc為H、CH3或NH2;前提是，當(dāng)Y或Z之一為OO或C二S時，另一個可選自NH、S或O;Rt為羧基、氰基或羰基基團，任選地被C,-C4烷氧基基團取代；R2缺失或為硝基；Ar!為d至C4烷基，任選地被R基團取代；(:6至01()芳基，其任選地被一個、兩個或三個獨立選擇的R基團取代；五至十元雜環(huán)，其任選地被一個、兩個、三個獨立選擇的R基團取代；或與Ar2和An和Ar2所連^t妻的雜環(huán)一起形成選自Arw的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；或與Ar3和Ar!和Ar3所連接的雜環(huán)一起形成選自Arv3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar2缺失或與Ar!和An和Ar2所連接的雜環(huán)一起形成選自Ar"2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar3缺失或與Ari和Ari和Ar3所連接的雜環(huán)一起形成選自Arw的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；Ar4缺失，或為C廣C4烷基、C廣Q烷氧基、或C廣C4硫烷基，其中的任何一個與A一起形成四至七元石炭環(huán)或雜環(huán)；R為氫；-Ra基團；或兩個R基團，其中R還可包括氧基團，與它們所連接的苯基或雜環(huán)一起形成選自RR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其中Ar!-2和Ar!-3選自十一至十四元雜-三環(huán)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其任選地被一個或多個鹵素、C廣C4烷基基團、d-C4卣烷基基團、任選地被卣素或C廣C4烷氧基基團取代的C廣C4烷氧基基團、C廠C4閨烷氧基基團、或任選地被羰基基團(被C廣Q烷基基團取代)取代的氨基基團取代；RR為九至十元雙環(huán)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其任選地被一個或多個卣素、Q-C4烷基基團、C廣C4卣烷基基團、C,-C4烷氧基基團、氧代基團或C,-C4卣烷氧基基團取代；Ra選自羥基基團；卣素；C廣C4烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的離素或羥基基團取代；C廣C4烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的鹵素或苯基基團取代；C4-Q環(huán)烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的Q-C4烷基基團取代；-Rb基團；-O-Rb基團；四至六元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團、氧代或-Rb基團取代；具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；羰基，其任選地被羥基、CrQ烷基或CVC4烷氧基基團取代；氨基甲酰，其任選地被一個或兩個C,-Q烷基基團取代；硝基基團；氰基基團；任選地被羥基、CrC4烷基基團或-Rb基團取代的硫代；磺?；淙芜x地被羥基、CrC4坑基基團或-Rb基團取代；或氨基，其任選地被一個或兩個獨立選擇的Q-C4烷基、磺酰基或羰基基團取代，其中的所述氨基磺酰基基團任選地被幾基、CVQ烷基或-Rb基團取代，且其中的所述氨基羰基被C廣C4烷基、C廣C4囟烷基、苯甲酰氧基或任選地被-Rb基團取代的氨基基團取代；和其中-Rb為CVC8芳基，其任選地被一個或多個如下基團取代羥基、卣素、C廣Q烷基基團、CrQ卣烷基基團、C廣C4烷氧基基團、或任選地被一個或多個CVC4坑基基團取代的氨基基團。28.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，該方法包括向有此需要的人個體施用有效量的下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Y和Z獨立地選自N或C;W為N或CH;n為0、1、2或3;R,為氳，被羧基基團任選地取代的Q至Q芳基，或當(dāng)Z為N時R,缺失;R2為氫；Q至Q芳基，其任選地被一個、兩個或三個獨立選擇的Ra基團取代；四至七元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C6烷基基團取代，或三至七元雜環(huán)；或當(dāng)Y為N時R2缺失；R獨立地選自卣素；羧基基團；Q-C6烷基基團，其任選地被四至七元雜環(huán)、C6-C8芳氧基基團或氨基基團取代，其中該四至七元雜環(huán)、C6-Q芳氧基基團或氨基基團任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣C6烷基或C6-C8芳基基團取代，其中該C6-C8芳基基團任選地和獨立地被一個或多個Q-C6烷基基團取代；C廣C6烷氧基；C6-Q芳氧基；CVQ芳基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素、C廣C4烷基、CVQ卣烷基、氧代、C!-C4烷氧基或d-C4卣烷氧基基團取代；氨基基團，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C6-C8芳基或d-C6烷基基團(其任選地被羥基、C6-C8芳基或具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元環(huán)取代)取代；羰基基團，其被五至六元雜環(huán)基團取代；四至七元雜環(huán)基團，其任選地被一個或多個C,-C4烷基或氧代基團取代；具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)；或雙R基團，其中R還可包括氧代基團，與它們所連接的雜-雙環(huán)一起形成具有三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的十二至十三元雜環(huán)；和其中Ra為卣素；Q-C6烷基；Q-C6烷氧基，其任選地被一個或多個獨立選擇的卣素基團取代；C6-Q芳基；四至七元雜環(huán)，其任選地被一個或多個獨立選擇的氧代基團取代；羰基，其任選地被羥基或C,-C6烷氧基基團取代；氨基甲酰基；氨基，其任選地被獨立選擇的C,-C6烷基基團取代，其中該C廣Q烷基基團任選地被一個或多個獨立選擇的卣素或鞋基基團取代；或兩個Ra基團，其中Ra還可包括氧代基團，與它們所連接的C6至Q芳基基團一起形成具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)，其中該具有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的九至十元雜環(huán)任選地被一個或多個獨立選擇的卣素取代。29.生成有效量的由包含無義突變的核酸序列編碼的功能通讀蛋白的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X為卣素；R為d-C8烷基基團；C,-C4鹵烷基基團；-OR!基團；或氨基基團，其任選地被一個或兩個獨立選擇的R2基團取代；R為CrQ烷基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的Ra基團取代；-Rb基團；吡咯烷基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基或氧代基團取代；哌啶基，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣Q烷基基團，苯甲基基團，或羧基基團(其任選地被一個或多個烷基或Q-Q烷氧基基團取代)取代；四氫呋喃基團；四氫吡喃基團；四氫萘基基團；或茚滿基基團；R2為氫，d-C6烷基基團；C!-C4卣烷基基團；C廣Q烷氧基基團；-Rb基團；嘧啶基基團；吡啶基基團；任選地被-Rb基團取代的磺?；鶊F；或兩個R2與它們結(jié)合的氨基一起形成任選地被苯基取代的嗎啉基基團、吡咯烷基基團、異吲哚基基團、或哌嗪基基團；其中Ra為卣素；C,-C4烷氧基基團；氨基甲酰基，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣C4烷基或C廣C4烷氧基基團取代；膦?；鶊F，其任選地被一個或兩個獨立選擇的C廣C4烷基或d-Q烷氧基基團取代；嗎啉基基團；吡啶基基團；或-Rb基團；和其中Rb為QrC8芳基，其任選地被一個或多個獨立地選自如下的基團取代羥基；囟素；C廣C4烷基基團；CrC4卣烷基基團；C廣C4烷氧基基團；或氨基基團，其任選地被一個或多個獨立選擇的C廣C4烷基基團取代。30.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物口服施用至人個體。31.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。32.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的有效量介于每天O.lmg/kg和500mg/kg,其被分為三個劑量，第一和第二劑量分別為總施用量的25%，且第三劑量為總施用量的50%。33.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的有效量足以生成0.1(ig/ml至500pg/ml該試劑的血漿濃度至少2小時。34.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的有效量不會引起人個體的聽力損失和/或腎衰竭。35.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述人個體根據(jù)對該化合物發(fā)生響應(yīng)的可能性進行篩選。36.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的有效量等于在包含以下步驟的報告基因測定中抑制無義密碼子的量(a)將所述試劑與具有包含報告基因的核酸序列的細胞相接觸，其中該報告基因包含提前終止密碼子；和(b)檢測由該報告基因編碼的功能通讀蛋白的表達和/或活性。37.如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物對革蘭氏陰性微生物和/或革蘭氏陽性微生物不顯示出明顯的抗菌活性。38.預(yù)防、治療和/或控制與無義突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括在有此需要的人個體中通過如權(quán)利要求25、26、27、28或29所述的方法生成有效量的功能通讀蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及由包含無義突變的核酸序列編碼的功能蛋白。本發(fā)明還涉及包含無義突變的核酸序列編碼的功能蛋白的生產(chǎn)方法，以及該蛋白在預(yù)防、控制和/或治療與基因無義突變相關(guān)的疾病中的用途。文檔編號A61P1/00GK101505739SQ200780020127公開日2009年8月12日申請日期2007年3月29日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者任宏宇,保羅·肯尼迪,加里·M·卡普,埃倫·M·韋爾奇,尼爾·G·阿姆斯泰德,杰姆士·J·高杉,理查德·G·王爾德,穆英春,薩米特·海拉華特,藍登·米勒,陳光明,黃承佑申請人:Ptc醫(yī)療公司