專利名稱：山羊sh2b1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及山羊SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響，基因多態(tài)性又可分為兩種一種是同義突變多態(tài)性，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿 基的“含義”相同；另一種是非同義突變多態(tài)性，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對(duì)編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對(duì)基因功能有直接的重要影響；尤其對(duì)于無義密碼子突變來說，更可能會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能發(fā)揮，對(duì)個(gè)體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)等。SSCP可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測(cè)出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。胰島素通過促進(jìn)骨骼肌和脂肪組織對(duì)于葡萄糖的攝取以及抑制肝臟葡萄糖的生成以降低血糖。胰島素與胰島素受體結(jié)合并使其活化。胰島素受體酪氨酰(基)使胰島素受體底物(IRS-1，-2，-3，以及-4)磷酸化。IRS蛋白，特別是IRS-I和IRS-2，可以啟動(dòng)和協(xié)調(diào)多個(gè)下游途徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號(hào)途徑。Src同源區(qū)2 (SH2) B接頭蛋白I (SH2B1 ;原名SH2-B)是接頭蛋白家族的一個(gè)成員。SH2B1是一組對(duì)于許多種信號(hào)通路起作用的銜接子，涉及關(guān)于一些受體酪氨酸激酶，包括胰島素受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。SH2B1是一個(gè)異常的內(nèi)源性胰島素致敏物，它能夠直接同時(shí)與胰島素，IRS-I以及IRS-2相結(jié)合，從而通過促進(jìn)胰島素受體催化活性和抑制IRS蛋白的酪氨酸脫磷酸作用來增強(qiáng)胰島素敏感性。在肌肉，肝臟，脂肪組織中，SH2B1形成二聚體，SH2B1 二聚體中的每一個(gè)SH2B1分子可同時(shí)與胰島素受體以及IRS-I (或IRS-2)結(jié)合，介導(dǎo)復(fù)合體的形成，從而保護(hù)IRS蛋白免于酪氨酸脫磷酸化，并刺激胰島素受體的催化活性，從而在整體上激活胰島素受體的下游通路。因此，研究哺乳動(dòng)物SH2B1基因遺傳變異和分子遺傳特征具有重要理論和實(shí)踐意義。
目前，對(duì)于SH2B1基因遺傳變異的研究較少，著重在小鼠和人類肥胖癥上。國內(nèi)外關(guān)于家畜SH2B1基因遺傳變異的研究，除了最近SH2B1基因SNP與中國黃牛生長性狀之外，目前在山羊中還未見相關(guān)報(bào)道。由于SH2B1基因?qū)τ诰S持正常體重，胰島素敏感性以及葡萄糖代謝所必需，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為SH2B1基因SNP與體尺性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國山羊生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用PCR產(chǎn)物混合測(cè)序的方法篩查山羊SH2B1基因的多態(tài)性位點(diǎn)，提供了一種山羊SH2B1基因SNP的篩查和檢測(cè)方法。通過關(guān)聯(lián)分析尋找與山羊體尺性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，以功能SNP作為山羊分子育種和輔助選擇的標(biāo)記，加快良種選育速度和提聞種群品質(zhì)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明根據(jù)SH2B1基因的外顯子設(shè)計(jì)引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物混合并純化，測(cè)序后得到山羊SH2B1基因的部分序列。一種山羊SH2B1基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因多態(tài)性包括在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態(tài)性；在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態(tài)性。上述山羊SH2B1基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法為以包含SH2B1基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)PI、P2為引物，PCR擴(kuò)增山羊SH2BI基因；所述的引物對(duì)Pl為上游引物5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’下游引物5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’所述的引物對(duì)P2為上游引物5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’下游引物5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性45s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為
I.0%。用變性劑對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊SH2B1基因是否有多態(tài)。 所述的聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10 %。所述的根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊SH2B1基因存在多態(tài)性，第7內(nèi)含子4356位點(diǎn)有三種帶型，分別為TT，TC，CC,第9外顯子6033位點(diǎn)有兩種帶型，分別為GG，GA。本發(fā)明對(duì)4個(gè)山羊品種上述兩個(gè)SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，同時(shí)也對(duì)SSCP多態(tài)位點(diǎn)與山羊體尺性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把PCR產(chǎn)物混合測(cè)序篩查SNP與PCR-SSCP結(jié)合起來解決了 SSCP的不穩(wěn)定性，以防突變位點(diǎn)的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測(cè)與山羊生長性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種。


I、圖I是引物Pl擴(kuò)增不同山羊個(gè)體(山羊SH2B1基因第4356位多態(tài)位點(diǎn))PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；2、圖2是引物P2擴(kuò)增不同山羊個(gè)體(山羊SH2B1基因第6033位多態(tài)位點(diǎn))PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；3、圖3是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測(cè)序篩查到的山羊SH2B1基因序列第4356位T-C突變測(cè)序結(jié)果圖；4、圖4是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測(cè)序篩查到的山羊SH2B1基因序列第6033位G-A 突變測(cè)序結(jié)果圖；5、圖5是本發(fā)明山羊SH2B1基因第4356位多態(tài)位點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；6、圖6是本發(fā)明山羊SH2B1基因第6033位多態(tài)位點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明根據(jù)SH2B1基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，分別以4個(gè)山羊群體的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，混合PCR產(chǎn)物并對(duì)其純化，測(cè)序。然后，進(jìn)行測(cè)序圖分析和序列比對(duì)篩查出SNP位點(diǎn)；其次，對(duì)待測(cè)群體進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)的PCR-SSCP檢測(cè)；最后，根據(jù)在群體中檢測(cè)到的基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計(jì)分析和體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與山羊體尺性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。一、山羊SH2B1基因部分DNA序列的擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測(cè)I、山羊樣品的采集及處理本發(fā)明采用了 4個(gè)山羊群體共計(jì)315個(gè)個(gè)體，具體為(I)波爾山羊血液樣品72份，采自江蘇省徐州市豐縣梁寨合作種羊場(chǎng)；(2)徐淮白山羊血液樣品81份，采自江蘇省徐州市銅山縣呂梁鄉(xiāng)；(3)海門山羊血液樣品65份，采自江蘇省南通海門；(4)波爾山羊X徐淮白山羊耳組織樣品46份，采自江蘇省徐州市豐縣梁寨合作種羊場(chǎng)。取山羊血樣10mL，加A 0. 5mol/L的EDTA 500 u L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ《M織樣，在70%乙醇保存，冰盒低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，_80°C保存?zhèn)溆谩?、基因組DNA的提取(I)、將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 u L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C ),棄去上清液,重復(fù)上述步驟至上清液透明、
沉淀呈淡黃色。(2)、在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 U L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制:0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH值至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?3)、加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1U L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)、將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 u L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)、加氯仿500iiL,充分混勻20min, 4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中。(6)、加0. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)、4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)、4°C, 12000r/min離心lOmin,棄上清,室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)、干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。耳組織DNA的提取參考文獻(xiàn)Sambrock et al (2002)方法。3、擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)由于GenBank中沒有山羊SH2B1基因序列，所以，本發(fā)明以牛(GenBank NC_007326. 5)序列為參考，利用Primer 5. 0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含山羊SH2B1基因第7內(nèi)含子和第9外顯子的PCR引物；擴(kuò)增第7內(nèi)含子的引物為上游引物5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’下游引物5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’擴(kuò)增第9外顯子的引物為上游引物5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’下游引物5，GCGGGAGTTCTGCGAGTC3，以上述引物對(duì)擴(kuò)增了山羊SH2B1基因第7內(nèi)含子，第9外顯子部分區(qū)域及一部分內(nèi)含子區(qū)域。4、PCR 擴(kuò)增分別以4個(gè)山羊品種的DNA為模版，用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為15 U L，見表I ;PCR總反應(yīng)程序，見表2。表1本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.山羊SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其特征在于所述基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)包括 在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態(tài)性位點(diǎn)； 在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態(tài)性位點(diǎn)。
2.一種檢測(cè)山羊SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含SH2B1基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)Pl和P2為引物，PCR擴(kuò)增山羊SH2B1基因； 所述的引物對(duì)Pl為 上游引物5’ GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’ 下游引物5’ CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’ 所述的引物對(duì)P2為 上游引物5’ CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’ 下游引物5’ GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’ (2)、對(duì)步驟(I)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化、測(cè)序； (3)、對(duì)步驟(2)的純化產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP檢測(cè)首先對(duì)純化的PCR產(chǎn)物分別用變性劑進(jìn)行變性處理，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判定其多態(tài)性位點(diǎn)，所述多態(tài)性位點(diǎn)包括 在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態(tài)性位點(diǎn)，表現(xiàn)為TT，TC，CC三種基因型； 在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態(tài)性位點(diǎn)，表現(xiàn)為GG，GA兩種基因型。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)山羊SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性45s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)山羊SH2BI基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了山羊SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其檢測(cè)方法，以包含SH2B1基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增山羊SH2B1基因，然后進(jìn)行SSCP多態(tài)性的檢測(cè)。其基因多態(tài)性位點(diǎn)包括在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態(tài)性；在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態(tài)性。本發(fā)明把PCR產(chǎn)物混合測(cè)序篩查SNP與PCR-SSCP結(jié)合起來解決了SSCP的不穩(wěn)定性，以防突變位點(diǎn)的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測(cè)與山羊生長性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102703440SQ20121012245
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者劉宣宣, 張春雷, 房興堂, 陳宏 申請(qǐng)人:江蘇師范大學(xué)