專利名稱：用于細(xì)胞移植的多膜免疫隔離系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于細(xì)胞移植的多膜免疫隔離系統(tǒng)，其可以用于大型動物 和人類而沒有免疫抑制作用。
聯(lián)邦基全沈明
本發(fā)明部分是才艮據(jù)NASA合同NAG 5-12429而使用來自聯(lián)邦政府的 資金而制成的。因此，聯(lián)邦政府對于本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織估測，截止到2000年，在世界范圍內(nèi)超過1.76億人患 有糖尿病。預(yù)測該數(shù)字到2030年會增加超過一倍。在胰島素依賴型或者1 型糖尿病的患者中，自身免疫反應(yīng)破壞胰島的胰島素分泌(3細(xì)胞。注射人 胰島素，盡管有一定的效果，但是不能精確地恢復(fù)正常的葡萄糖平衡，這 會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病和心血管疾病。
近來，細(xì)胞移植已經(jīng)致力于治療多種特征為激素或者蛋白質(zhì)缺失的人 類疾病，如糖尿病、帕金森病、亨廷頓病以及其它疾病。但是，多種技術(shù) 和運(yùn)籌(logistical)難題已經(jīng)阻止了細(xì)胞移植有效地發(fā)揮作用。尤其是， 移植的細(xì)胞必須被保護(hù)起來以免受移植接受者的免疫攻擊。這通常需要具 有相當(dāng)大毒性的有效免疫抑制劑，這種免疫抑制劑會使患者遭受多種嚴(yán)重 的副作用。
一種可替代的方法是將移植的細(xì)胞封入半透膜中。理論上，半透膜被 設(shè)計用于保護(hù)細(xì)胞免受免疫攻擊，同時允許對細(xì)胞機(jī)能/生存非常重要的分 子流入以及所需細(xì)胞產(chǎn)物的流出。這種免疫隔離方法具有兩個主要的潛
10能i)不需要免疫抑制藥物和與之伴隨的副作用的細(xì)胞移植，以及ii)使 用來自各種來源的細(xì)胞，如自體移植物(源自主體(或宿主，接受移植的 動物)干細(xì)胞)、同種異體移植物(源自原代細(xì)胞或者干細(xì)胞)、異種移植 物(豬的細(xì)胞或者其他)，或者基因工程化的細(xì)胞。雖然這種技術(shù)在治療 小型哺乳動物(如嚙齒動物)中是有效的，但是發(fā)現(xiàn)當(dāng)用于治療較大型的 哺乳動物時該技術(shù)沒有效果。
在大型動物模型中已經(jīng)測試了一些免疫隔離系統(tǒng)，但是其中很多實(shí)驗(yàn) 是在自發(fā)性糖尿病對象中實(shí)施或者使用了免疫抑制劑。參見Sun等， "Normalization of diabetes in spontaneously diabetic cynomolgus monkeys by xenografts of microencapsulated porcine islets without immunosuppressant," / C7/w. /"vas/. 98:1417-22 (1996) ; Lanza 等， "Transplantation of islets using microencapsulation: studies in diabetic rodents and dogs," 乂 Mo/, Med 77(1): 206-10 (1999); Calafiore R., "Transplantation of minimal volume microcapsules in diabetic high mammalians,"爿w" 5W. 875: 219-32 (1999); Hering等，"Long term (>100 days) diabetes reversal in immunosuppressed nonhuman primate recipients of porcine islet xenographs，" j膨n'caw / 7hms/ /"w她'ow， 4: 160-61 (2004);和Soon-Shiong 等.，"Insulin independence in a Type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation,"Z^mcd343:950-951 (1994)。另外，其中許多實(shí)驗(yàn)不能以合 適的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重復(fù)。這些實(shí)驗(yàn)缺乏實(shí)驗(yàn)對照和一致性使得科學(xué)解釋復(fù) 雜化并且限制了它們的實(shí)用性。
顯然，還沒有實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞(living cell)的免疫保護(hù)從而治療激素缺失 疾病的承諾。因此，本領(lǐng)域所需要的是可重復(fù)的并且有效的細(xì)胞治療方法， 其可用于大型哺乳動物而無需使用免疫抑制藥物。本發(fā)明滿足了這種需 求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于封裝生物材料的多膜組合物，其包括(a)內(nèi)膜， 其與生物材料生物相容并具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保護(hù)來抵抗主體(或宿主)免疫系統(tǒng)中的抗體；(b)中膜，具 有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)內(nèi)膜來抵抗主體(或宿主)中的化學(xué)物質(zhì)；(c) 外膜，其與主體(或宿主)生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保護(hù)內(nèi)膜 和中膜抵抗主體(或宿主)免疫系統(tǒng)的非特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。中膜還將 內(nèi)膜和外膜結(jié)合起來。
本發(fā)明還涉及一種能夠封裝生物材料的多膜組合物，其包括(a)包 含海藻酸鈉、硫酸纖維素、聚(亞曱基-共-胍)(聚(亞曱基二胍)， poly(methylene-co-guanidine))和氯化鉤的膜；(b)包含聚陽離子的膜；和(c) 包含具有羧酸根基團(tuán)或者硫酸根基團(tuán)的碳水化合物聚合物的膜。聚陽離子 為聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L，D-賴氨酸、聚乙烯亞胺 (polyethylenimine )、聚烯丙胺(polyallyamine)、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨 酸、聚-L,D-鳥氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L,D-天冬氨酸、 聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸(succinylated poly-L-lysine)、琥珀?；?D-賴氨酸、琥珀?；?-L,D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它們的組合。
本發(fā)明還涉及一種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥對象的方法，包括將 足夠量的含有產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的組合物給予對象，其中該組合物是 多膜膠嚢，其包括(a)內(nèi)膜，其與生物材料生物相容并具有足夠的機(jī)械 強(qiáng)度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保護(hù)來抵抗主體免疫系統(tǒng)中的 抗體；(b)中膜，具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)內(nèi)膜來抵抗主體中的化學(xué) 物質(zhì)；(c)外膜，其與主體生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保護(hù)內(nèi)膜 和中膜抵抗主體免疫系統(tǒng)的非特異性免疫應(yīng)答系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及一種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥對象的方法，其包括 將足夠量的含有分泌胰島素的胰島細(xì)胞的組合物給予對象，其中該組合物 是多膜膠嚢，其包括(a)包含海藻酸鈉、硫酸纖維素、聚(亞曱基-共-胍)和氯化鈣的膜;(b)包含聚陽離子的膜；和(c)包含具有羧酸根或者硫酸 基基團(tuán)的碳水化合物聚合物的膜。聚陽離子為聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、 聚-L，D-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L,D-鳥氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯 酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸、 琥珀?；?D-賴氨酸、琥珀?；?L，D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、 聚(乙烯醇)或者它們的組合。
本發(fā)明還涉及一種以不伴隨免疫抑制反應(yīng)的細(xì)胞療法來治療患有糖 尿病或者相關(guān)病癥的大型哺乳動物對象的方法。該方法包括將含有提供胰 島素持續(xù)釋放至少30天的產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法給 予對象。該組合物在持續(xù)釋放期間不會表現(xiàn)出顯著的降解。
本發(fā)明還涉及一種含有生物材料的膠囊，當(dāng)其被引入到具有機(jī)能化 (fonctioning)免疫系統(tǒng)的大型哺乳動物時，分泌生物活性劑至少30天而 不會產(chǎn)生由于免疫系統(tǒng)的免疫攻擊造成的顯著降解。
本發(fā)明還涉及一種使得患者的葡萄糖水平穩(wěn)定至少30天的方法，其 包括將含有胰島素分泌胰島細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法給予患有糖尿病或
者相關(guān)病癥的患者。該細(xì)胞療法不與涉及免疫抑制的其他治療方法一起給予。


圖1:單膜膠嚢的生物相容性。兩個以相同的配方和生產(chǎn)步驟制備的 單膜膠嚢在被移植到正常小鼠(左)和正常雜種狗(右)的腹膜內(nèi)30天 后進(jìn)行拍照。
圖2:在大型動物中多膜膠嚢的生物相容性。示出了在用松散地附著 于網(wǎng)膜的膠嚢治療超過6個月后的正常狗的網(wǎng)膜。
圖3:膠嚢膜的滲透性。該圖說明了作為膠嚢膜的孔徑分布函數(shù)的歸 一化保留時間。
圖4:膠嚢機(jī)械穩(wěn)定性。該圖通過斷裂負(fù)載(ruptureload)隨膠嚢膜 厚度和尺寸變化的繪圖說明兩種不同聚合物濃度的膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度。
13圖5:膠嚢穩(wěn)定性。該圖說明了具有不同化學(xué)成分和膜厚度的兩種膠 嚢作為時間函數(shù)的機(jī)械強(qiáng)度。
圖6:封裝的胰島的周流(或表面灌流，perifiision)。在細(xì)胞周流系 統(tǒng)(cell perifUsion system)中評價釋放胰島素的胰島的分泌水平。獨(dú)立地評 價游離的胰島(未封裝的)、封裝在單膜系統(tǒng)的胰島(封裝的胰島)，和封 裝在多膜系統(tǒng)的胰島(分層封裝)。
圖7:由回收的封裝胰島的胰島素分泌。在細(xì)胞周流系統(tǒng)中檢測在狗 中移植100天后回收的封裝在多層膜膠嚢中的胰島。
圖8:犬的同種異體移植的血糖分析。該圖形是進(jìn)行了全胰切除術(shù)的 犬模型的實(shí)施例。頂部圖像(panel)示出了進(jìn)食后12-18小時收集的靜脈 血糖濃度。下面的圖像示出了皮下給予豬胰島素的每日劑量。
圖9:犬的同種異體移植的體重分析。頂部和底部的圖像引自圖8。 中間的圖像示出了在試驗(yàn)過程中監(jiān)測到的動物體重。
圖10:犬的同種異體移植的果糖胺分析。頂部和底部的圖像引自圖8。 中間的圖像示出了果糖胺的測量值，糖尿病對象的2-3周的平均血糖水平 的指標(biāo)。
圖11:封裝的胰島在犬中的再移植。該圖說明了封裝在多膜系統(tǒng)中 的胰島在犬中的最初同種異體移植和再移植。
圖12:靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(IVGTT)。該圖評價了 (evaluate)之 前接受了封裝在多膜系統(tǒng)中的胰島移植的犬中的靜脈內(nèi)葡萄糖(300 mg/kg)給藥。
具體實(shí)施例方式
把:！
系統(tǒng)。最好是通過細(xì)胞產(chǎn)物(激素、蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)等)治療的任何疾 病都是免疫隔離細(xì)胞移植的候選對象。用于免疫隔離的潛在細(xì)胞類型包括 胰島、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、曱狀旁腺細(xì)胞和分泌凝固因子的細(xì)胞。當(dāng)在細(xì)
14胞治療系統(tǒng)中使用封裝的胰島時，該系統(tǒng)對患有糖尿病的患者提供替代的生物人工胰臟和機(jī)能性治療。
本發(fā)明涉及一種封裝生物材料的多膜組合物，包括(a)內(nèi)膜，其與
生物材料生物相容并具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保持膜中的生物材料并且提
供免疫保護(hù)來抵抗主體(或宿主)免疫系統(tǒng)中的抗體；(b)中膜，具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)內(nèi)膜來抵抗主體中的化學(xué)物質(zhì)；(c)外膜，其與主體(或宿主)生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保護(hù)內(nèi)膜和中膜抵抗主體(或宿主)免疫系統(tǒng)的非特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。中膜還將內(nèi)膜和外膜結(jié)合起來。
多膜組合物是一種含有至少三個膜的組合物。該組合物優(yōu)選是膠嚢或者是具有封裝生物材料能力的組合物。當(dāng)然，其它系統(tǒng)也是行得通的。
內(nèi)膜應(yīng)該與生物材料是生物相容的。也就是，生物材料不能以與可能會殺死或者別的會損害所述生物材料的生物材料相互作用的方式。內(nèi)膜還應(yīng)該具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保持膜內(nèi)的生物材料并且提供免疫保護(hù)以抵抗主體免疫系統(tǒng)的抗體。
中膜具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)內(nèi)膜來抵抗主體中的化學(xué)物質(zhì)。由中膜提供的化學(xué)穩(wěn)定性還同時幫助內(nèi)膜和外膜抵擋主體中化學(xué)物質(zhì)的影響。主體中的常見化學(xué)物質(zhì)包括鈉、鈣、鎂和鉀離子，以及血流中的其他化學(xué)物質(zhì)。中膜是耐受這些化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定的，這使它延遲了膜的退化。這延長了膜的壽命并由此延長了被內(nèi)膜包裹的生物材料的壽命。中膜還將內(nèi)膜和外膜結(jié)合起來，優(yōu)選通過親和結(jié)合。以將膜結(jié)合起來的方式產(chǎn)生交聯(lián)作用，其形成了更緊密和更有粘合力的多膜組合物，并且消除或者降低了膜分離的可能性。
外膜應(yīng)該是與主體生物相容的。因?yàn)橥饽な嵌嗄そM合物中接觸主體的部分，它應(yīng)該是充分生物相容的從而主體不會將組合物當(dāng)作異物(foreignobject)并且排斥或者試圖破壞它。在本文中使用的術(shù)語"生物相容的"表示植入的組合物和其內(nèi)容物(context)的消除主體的各種保護(hù)系統(tǒng)，如免疫系統(tǒng)或者異質(zhì)物體纖維化反應(yīng)的有害作用并且在有意義的時間段保
15持功能的能力。另外，"生物相容的"還表示該組合物和其內(nèi)容物不造成特有的不期望的細(xì)胞毒或者全身作用，如干擾所需的免疫隔離功能性。
外膜還應(yīng)該具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保護(hù)內(nèi)膜抵抗主體的非特異性先天性免疫系統(tǒng)。先天性免疫系統(tǒng)，其包括嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其它，當(dāng)被激活時，可通過吞噬來攻擊多膜組合物或者膠嚢。它還可以刺激抗體的活性從而攻擊組合物內(nèi)部的胰島。
獨(dú)立的膜中的這些特性的組合使組合物以單個膜所不能提供的方式聯(lián)合作用。特別是，每個膜以使得多膜組合物達(dá)到大型動物移植的二分法
目標(biāo)(dichotomy goal)的方式實(shí)現(xiàn)至少一種才幾能。每個膜^皮設(shè)計為滿足最佳的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)同時還保持胰島的健康和機(jī)能性。
例如，為了提高物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提高膜的孔徑會危害到膠嚢的穩(wěn)定性。同樣地，為了提高膠嚢的穩(wěn)定性提高聚合物的濃度會降低物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些二分性(dichotomy)會導(dǎo)致在膠嚢設(shè)計和性能上的折衷。在優(yōu)選系統(tǒng)中，不需要單個膜去折衷它的設(shè)計從而實(shí)現(xiàn)多方面(multi-faceted)的二分法目標(biāo)。每一個膜被設(shè)計為只實(shí)現(xiàn)一項(xiàng)或者兩項(xiàng)特定的任務(wù)?？偟膩碚f，多膜實(shí)現(xiàn)了在大型動物模型中細(xì)胞移植體的二分法目標(biāo)中的大多數(shù)或者全部而不需要免疫抑制。
內(nèi)膜的膜厚度優(yōu)選在約5微米到約100微米的范圍。更加優(yōu)選地，膜厚度在約10微米到約60微米的范圍，并且最優(yōu)選地，厚度在約20微米到約40微米的范圍。 一般，膜越厚提供的機(jī)械強(qiáng)度越大。但是，當(dāng)膜變得過厚，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力開始下降。
中膜通常具有小于約5微米的厚度，優(yōu)選約l-3微米。外膜通常具有范圍在約5微米到約500微米的厚度，優(yōu)選在約100微米到約300微米的范圍；但是，范圍在約10微米到約30微米的外膜厚度也是合適的。
多膜組合物具有孔隙度，其足夠大足以使得從生物材料中釋放出生物活性劑但要足夠小足以阻止來自免疫系統(tǒng)的抗體的進(jìn)入。應(yīng)該防止已知破壞或細(xì)胞的抗體進(jìn)入(可能的話)多膜組合物。例如，抗體IgM，其具有約300千道爾頓(KDa)的分子量，當(dāng)暴露于含有胰島的膠嚢時會是特別致死的?？紤]到已知的抗體，多膜組合物的孔隙度下限(即，大于下限尺
寸的孔的數(shù)量顯著性地降低)應(yīng)該小于300千道爾頓。另外，因?yàn)槟ねǔ１恢瞥呻S機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，孔隙度下限優(yōu)選低于250千道爾頓。這更好地保證了設(shè)計的膜具有非常少甚至沒有大于300千道爾頓的孔。
在另一個方面，孔隙度下限應(yīng)該大于約50千道爾頓以確保生物材料具有自由地從多膜組合物中釋放的能力?？紫抖认孪迌?yōu)選在約50千道爾頓到約250千道爾頓的范圍以允許具有分子量低于約50千道爾頓的分子通過同時防止具有分子量高于約250千道爾頓的分子通過。更優(yōu)選地，孔隙度下限在約80千道爾頓到約150千道爾頓的范圍。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，每一個膜具有不同的孔隙度，內(nèi)膜具有范圍在約50千道爾頓到約150千道爾頓的孔隙度下限，中膜具有范圍在約100千道爾頓到約200千道爾頓的孔隙度下限；外膜具有范圍在約150千道爾頓到約250千道爾頓的孔隙度下限。在其它方面中，具有多樣化的孔隙度的膜有助于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫保護(hù)。
生物材料可以是任何能夠被膜封裝的材料。通常，生物材料是當(dāng)被引入到對象中時能夠?yàn)閷ο筇峁┮恍┲委熜Ч募?xì)胞或者細(xì)胞群(group )。優(yōu)選地，該生物材料選自由胰島、肝細(xì)胞、脈絡(luò)叢、神經(jīng)細(xì)胞、曱狀旁腺細(xì)胞，和分泌凝固因子的細(xì)胞組成的組。最優(yōu)選地，生物材料是胰島或者其它能夠治療患有糖尿病患者產(chǎn)生胰島素的島(islet )。
生物活性劑是可以從生物材料中釋放或者分泌的任何藥劑。例如，胰島具有分泌生物活性劑胰島素的能力；脈絡(luò)叢具有分泌腦脊液(cerebralfluids)的能力；神經(jīng)細(xì)胞具有分泌如多巴胺的可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的藥劑的能力；曱狀旁腺細(xì)胞具有分泌可以影響對象的鈣和磷代謝的生物活性劑的能力。優(yōu)選地，生物活性劑是胰島素。
主體可以包括任何需要或者其他能夠接受封裝的多膜組合物的對象。雖然主體可以包括小型哺乳動物，如嚙齒動物，但多膜組合物特別適合于大型哺乳動物。優(yōu)選地，該主體是人。雖然多膜組合物應(yīng)該含有內(nèi)膜、中膜和外膜，它可能含有一個或多個附加膜。附加的膜可能是需要的從而為由三膜系統(tǒng)提供的那些特征提供更好的或更多的特征。例如，附加膜可以，獨(dú)立地或者共同地為多膜組合物提供額外的免疫保護(hù)、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物相容性。
本發(fā)明還涉及能夠封裝生物材料的多膜組合物，其包括(a)含有海藻酸鈉、硫酸纖維素、多組分聚陽離子的膜；(b)含有聚陽離子的膜；和(c)包含具有羧酸根基團(tuán)或者硫酸根基團(tuán)的碳水化合物聚合物的膜。
一個膜應(yīng)該含有海藻酸鈉、硫酸纖維素和多組分聚陽離子。該聚陽離子優(yōu)選含有聚(亞曱基-共-胍)與氯化鈣、氯化鈉或者它們的組合中的任意一個的組合。該膜可以是美國專利第5,997,900號所披露的封裝系統(tǒng)，將其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
第二層膜應(yīng)該含有聚陽離子。優(yōu)選地，該聚陽離子選自由聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L,D-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L，D-鳥氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L,D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸、琥珀?；?D-賴氨酸、琥珀?；?L，D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它們的組合組成的組。更優(yōu)選地，該聚陽離子選自由聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L,D-賴氨酸、聚-L-鳥氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L,D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)，和它們的組合組成的組。最優(yōu)選地，該聚陽離子為聚-L-賴氨酸。
第二層膜還優(yōu)選含有至少一種選自由海藻酸鈉、硫酸纖維素和聚(亞曱基-共-胍)組成的組中的化合物。更優(yōu)選地，第二層膜含有聚陽離子和所有三種化合物。最優(yōu)選地，第二層膜含有聚-L-賴氨酸、海藻酸鈉、硫酸纖維素和聚(亞甲基-共-胍)。
第三層膜含有具有羧酸根或者硫酸根基團(tuán)的碳水化合物聚合物。該碳水化合物聚合物優(yōu)選地選自由羧曱基纖維素鈉、低曱氧基果膠、海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸4丐、黃芪膠、果膠酸鈉、K-角叉菜膠和i-角叉菜膠組成的組。更優(yōu)選地，該碳水化合物聚合物選自由海藻酸鈉、海藻酸鉀和海藻酸4丐組成的組。最優(yōu)選地，該碳水化合物聚合物是海藻酸鈉。
第三層膜還優(yōu)選地含有無機(jī)金屬鹽。合適的金屬鹽包括氯化鈣、疏酸
鎂、硫酸錳、乙酸4丐、硝酸鉤、氯化銨、氯化鈉、氯化鉀、氯化膽堿、氯化鍶、葡萄糖酸釣、硫酸4丐、硫酸鉀、氯化鋇、氯化鎂和它們的組合。優(yōu)選地，該無機(jī)金屬鹽選自由氯化4丐、氯化銨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸4丐和它們的組合組成的組。最優(yōu)選地，該無機(jī)金屬鹽是氯化鈞。
在多膜組合物中，第一層膜優(yōu)選為內(nèi)膜，第二層膜優(yōu)選為內(nèi)膜或者中膜，和第三層膜優(yōu)選為外膜。多膜組合物還可以含有一個或者多個附加膜。
優(yōu)選地，多膜組合物是五組分/三層膜的膠囊系統(tǒng)。這五個組分為海藻酸鈉(SA)、硫酸纖維素(CS )、聚(亞甲基-共-胍)(PMCG )、氯化鈣(CaCl2)和聚-L-賴氨酸(PLL)。內(nèi)膜是在小型動物模型中成功實(shí)驗(yàn)過的相同的PMCG-CS /CaCl2-海藻酸鹽膜。該膜被設(shè)計為提供一種免疫隔離和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)之間的合適的平衡。中膜優(yōu)選為增強(qiáng)內(nèi)膜的薄的交織PMCG-CS/ PLL-海藻酸鹽膜。強(qiáng)離子鍵，例如存在于PMCG-CS/ PLL-藻酸鹽系統(tǒng)中的那些，可有助于提供化學(xué)穩(wěn)定性。另外，擁有具有相對大的孔徑的薄膜可有助于使該膜不擾亂內(nèi)膜的免疫隔離和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)之間的平衡。中膜還通過逐步提高中膜的PLL濃度以表觀上地將內(nèi)膜和外膜結(jié)合起來，從而提供內(nèi)膜和外膜的阻抗匹配(impedance match )。 CaCl2/海藻酸鹽外膜保護(hù)兩個內(nèi)部膜的PMCG和PLL抵抗主體免疫系統(tǒng)。該膜提高了膠嚢的生物相容性并且還給穩(wěn)定性和免疫保護(hù)提供了額外的機(jī)械強(qiáng)度。
本發(fā)明還涉及一種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的對象的方法，其包括將足夠量的含有胰島素分泌胰島細(xì)胞的組合物給予對象。該組合物是多膜膠嚢包括(a)內(nèi)膜，其與生物材料生物相容并具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保護(hù)來抵抗對象的免疫系統(tǒng)中的抗體；
(b) 中膜，具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)內(nèi)膜來抵抗對象中的化學(xué)物質(zhì)；
(c) 外膜，其與主體生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保護(hù)內(nèi)膜和中膜抵抗對象的免疫系統(tǒng)的非特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。
19糖尿病和相關(guān)病癥包括，但是不限定于，以下的病癥l型糖尿病、
2型糖尿病、青年成人型糖尿病(MODY)、成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA)、葡萄糖耐量低減(IGT)和空腹血糖受損(IFG)、妊娠期糖尿病和代謝綜合癥X。優(yōu)選地，該方法用于治療1型糖尿病或2型糖尿病。
對象可以是任何患有糖尿病或者相關(guān)病癥的動物。優(yōu)選地，對象是大型哺乳動物，如人。
胰島素分泌胰島細(xì)胞優(yōu)選為胰島，但是，其它能夠產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞也是合適的。優(yōu)選豬或者人的胰島，尤其是如果對象是人。
本發(fā)明還涉及一種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的對象的方法，其包括將足夠量的含有胰島素分泌胰島細(xì)胞的組合物給予對象，其中該組合物是多膜膠嚢，其包括(a)包含海藻酸鈉、硫酸纖維素、聚(亞甲基-共-胍)和氯化鈣的膜；(b)包含聚陽離子的膜；和(c)包含具有羧酸根或者硫酸基基團(tuán)的碳水化合物聚合物的膜。聚陽離子為聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L，D-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L，D-鳥氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L,D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸、琥珀?；?D-賴氨酸、琥珀?；?L，D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它們的組合。除了上述三個膜之外，該多膜組合物還可以含有一個或者多個膜。
本發(fā)明還涉及一種以不伴隨免疫抑制反應(yīng)的細(xì)胞療法來治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的大型哺乳動物對象的方法。該方法包括將含有提供胰島素持續(xù)釋放至少30天的胰島素分泌胰島細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法給予對象。該組合物在持續(xù)釋放期間不會表現(xiàn)出顯著的降解。
在所屬的領(lǐng)域中眾所周知的，細(xì)胞療法是移植人類或動物的細(xì)胞來代替或者修復(fù)受損的或者有障礙的組織和/或細(xì)胞。給予的細(xì)胞的類型在某些方面對應(yīng)于患者中衰退(failing)的器官或者組織。在患有糖尿病或者相關(guān)病癥的患者的狀況中，細(xì)胞療法包括分泌胰島素的細(xì)胞的移植，分泌胰胞的機(jī)能并且在達(dá)到一定條件時(即對象中的 升高的葡萄糖水平)將胰島素釋放到對象中。
細(xì)胞療法通常包括異種(動物)細(xì)胞(例如來自羊、牛、豬和鯊魚) 或者來自人體組織的細(xì)胞提取物的引入。細(xì)胞可以通過植入、移植、注射 或者其他本領(lǐng)域中已知的手段引入。細(xì)胞可以直接引入到主體中或者通過 細(xì)胞封裝或者通過被設(shè)計為欺騙免疫系統(tǒng)識別該新細(xì)胞為主體自身的細(xì)
胞上特定的涂層引入到主體。已經(jīng)使用的兩種常規(guī)的細(xì)胞封裝方法孩丈膠 嚢和大膠嚢。通常，在微膠嚢中，細(xì)胞封閉在小的選擇性滲透的球形容器 中，而在大膠嚢中，細(xì)胞包埋(entrap)到更大的非球形膜中。在封裝方 法中已經(jīng)使用了各種聚合材料來形成膠嚢的膜。
細(xì)胞療法優(yōu)選包括將封裝的細(xì)胞移植到對象的體腔內(nèi)。這個可以通過 在體腔中產(chǎn)生一個外科手術(shù)開口并將封裝的細(xì)胞通過開口引入到體腔內(nèi) 來實(shí)施。這個可以通過似乎簡單(plausibly simple)的技術(shù)來完成，如將 封裝的細(xì)胞傾入漏斗型的裝置中，該裝置運(yùn)送它們穿過開口并且將它們引 入體腔內(nèi)。也可以使用本領(lǐng)域中已知的其它技術(shù)，如皮下注射。
一旦進(jìn)入到體腔內(nèi)，隨后封裝的細(xì)胞可以在體腔內(nèi)自由移動。通常， 封裝的細(xì)胞會停留在對象的網(wǎng)膜上。網(wǎng)膜是被封裝的細(xì)胞的優(yōu)選位點(diǎn)，因 為這里幾乎沒有細(xì)胞干擾網(wǎng)膜機(jī)能的危險。相反，如果封裝的細(xì)胞將其自 身附著于其它器官的外壁，如肝或者腎，就會存在封裝的細(xì)胞破壞這些器 官的機(jī)能，導(dǎo)致其它醫(yī)療事件的可能性。
封裝細(xì)胞療法不與被設(shè)計為抑制機(jī)能化免疫系統(tǒng)或者防止對象的免 疫系統(tǒng)排斥細(xì)胞療法的免疫抑制劑一起給藥。許多細(xì)胞療法需要使用免疫 抑制劑以確保將要被移植的生物材料不被主體的免疫系統(tǒng)攻擊和排斥。盡 管免疫抑制劑提高了主體接受細(xì)胞療法的機(jī)會，但是已經(jīng)充分證明免疫抑 制藥物會對主體造成有害的作用。特別是，免疫抑制劑降低了對象對感染 的抵抗性，使得更難治療感染，并且增大了不可控的出血的可能性。這種 藥物對胰島也是有害。
21本文所使用的術(shù)語"持續(xù)釋放"是指在釋放應(yīng)該發(fā)生的情況下，生物 制劑從生物材料中的連續(xù)釋放。例如，如果生物材料是胰島并且生物劑是 胰島素，那么在移植之后，胰島應(yīng)該在胰島認(rèn)識到主體的葡萄糖水平已經(jīng) 達(dá)到某一點(diǎn)的任何時候連續(xù)將胰島素釋放到主體。在主體中的葡萄糖水平 已經(jīng)^皮保持后，胰島會暫時停止分泌額外的胰島素。但是，當(dāng)主體的葡萄 糖水平又達(dá)到需要胰島素的一點(diǎn)時，暫時停止活動的胰島會重新開始分泌 胰島素。這種類型的連續(xù)釋放是持續(xù)釋放的一個實(shí)例。
持續(xù)釋放的周期應(yīng)該持續(xù)至少30天。優(yōu)選地，它持續(xù)至少60天；更 優(yōu)選地，至少120天；并且最優(yōu)選地，至少180天。組合物能夠提供的胰 島素的持續(xù)釋放越長，患者僅以細(xì)胞療法而被;f幾能化而不需要額外的治療 就越長。例如，如果細(xì)胞療法能夠持續(xù)至少180天，患者則只需要大約每 6個月接受一次加強(qiáng)劑量的治療。這使糖尿病患者顯著增加了自由度來從 事日?；顒佣恍枰仨氝B續(xù)監(jiān)控他們的病癥，校正高或者低的血糖，注 射胰島素或者平衡碳水化合物的攝入以及通過肝臟將葡萄糖規(guī)律的并持 續(xù)的釋放到血液中。這還可通過降低胰島素休克或者酮酸中毒的發(fā)生以及 防止或延緩糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)作使得整體的血糖控制更強(qiáng)。
當(dāng)含有細(xì)胞的組合物被主體的免疫系統(tǒng)有效地攻擊時，免疫系統(tǒng)可以 損害或破壞組合物，造成組合物的顯著降解。存在兩條主體免疫系統(tǒng)攻擊 外來物質(zhì)(foreignmaterial)的主要途徑，在這種情況下組合物含有細(xì)胞。 第一，主體中的白血細(xì)胞可以消耗含有細(xì)胞的組合物或者附著于表面并使 內(nèi)部的生物材料窒息致死(suffocate)。第二，主體的免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生特 異性抗體，其具有穿透組合物的空隙并攻擊內(nèi)部生物材料的能力。這些攻 擊中的任意一種將會造成組合物的某種形式的降解。但是，如果組合物含 有足夠的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，則由免疫系統(tǒng)造成的損害 和組合物的降解會是最小的。在另一個方面，如果組合物不是充分生物相 容或者化學(xué)穩(wěn)定的，并且不具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，組合物會易于受到攻擊 和由于這些攻擊造成的相應(yīng)的破壞。有效的攻擊將會損壞或者破壞組合物 中的生物材料并且使得組合物處于降解的狀態(tài)中。系統(tǒng)《1入到大型哺乳動物如犬模型中時，將 會穩(wěn)定少于一個月。在圖1中可以找到在犬模型中經(jīng)歷了顯著降解的傳統(tǒng) 制造的封裝細(xì)胞的一個實(shí)施方式。圖1描述了以相同配方和加工步驟制備
的兩個單膜微嚢移植到正常的C57/B16小鼠(左邊)和正常的雜種狗的腹 膜內(nèi)。膠嚢在30天后回收并且拍照。嚙齒動物的膠囊沒有表現(xiàn)出降解， 而犬的膠嚢由于膠嚢的破損和由主體的免疫系統(tǒng)所引起的生物材料的破 壞而表現(xiàn)出了顯著的降解。
本發(fā)明還涉及一種含有生物材料的膠嚢，其當(dāng)被引入到具有機(jī)能化免 疫系統(tǒng)的大型哺乳動物時，分泌生物活性劑至少30天而不會產(chǎn)生由于免 疫系統(tǒng)的免疫攻擊而造成的顯著降解。
術(shù)語"膠嚢"是指在封裝系統(tǒng)中使用的任何類型的封裝裝置，包括微 膠嚢和大膠囊。優(yōu)選地，膠嚢是球形膠嚢，如那些在微膠嚢技術(shù)中使用的。 使用特定的裝置和反應(yīng)器可以形成膠囊，如那些在美國專利第5,260,002 和6,001,312號中所披露的，其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
本發(fā)明還涉及一種使得患者的葡萄糖水平穩(wěn)定至少30天的方法，其 包括將含有產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法給予患有糖尿病
或者相關(guān)病癥的患者。該細(xì)胞療法不與伴隨免疫抑制的其他治療方法一起 給予。
如本領(lǐng)域眾所周知的，患有糖尿病或者相關(guān)病癥的患者體內(nèi)所具有的 葡萄糖水平不通過正常機(jī)能的胰腺穩(wěn)定。可以通過含有產(chǎn)生胰島素的胰島 細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定糖尿病患者或者任何遭受不穩(wěn)定葡 萄糖水平的其它類型的患者的葡萄糖水平。細(xì)胞療法可以穩(wěn)定葡萄糖水平 至少30天；優(yōu)選地，至少60天；更優(yōu)選地，至少120天；并且最優(yōu)選地， 至少180天。
存在幾個已知的制備用于可被利用的封裝的細(xì)胞的方法。 一種形式包 括從細(xì)胞將要被用于其中的患者中提取細(xì)胞，然后在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下培養(yǎng)它 們直到它們增殖到移植回患者所需要的水平。然而，還沒有對所有類型的 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，如胰腺細(xì)胞。另外一個步驟使用新鮮分離的動物組織，
23其已經(jīng)被處理并且懸浮在鹽水溶液中。然后將新鮮細(xì)胞的制備物立即注射 到患者體內(nèi)或者在注射前通過冷凍干燥或者在液氮中深度冷凍來保藏。在 使用之前可以針對病原體，如細(xì)菌、病毒，或者寄生蟲才企測細(xì)胞。
豬的胰島細(xì)胞可以從研究實(shí)驗(yàn)室或者當(dāng)?shù)赝涝讏龅玫降呢i或仔豬的
胰腺獲得。優(yōu)選地，豬或者小豬是無特定病原體(SPF)動物，其以捐獻(xiàn)胰 島的目的養(yǎng)殖和監(jiān)控。可選地，新生的胰島，其含有初期的或者沒有完全 發(fā)育的免疫系統(tǒng)、豬胎兒的胰島，其含有在實(shí)驗(yàn)室中成熟的胰島，或者來 源于干細(xì)胞研究的胚胎細(xì)胞，其含有可以在實(shí)驗(yàn)室再生的細(xì)胞，也可以用 于提供胰島。由健康患者提供的人胰島理論上代表了胰島的良好來源并且 趨向于具有更少的免疫問題。但是，目前每年提供的人胰島是不足的，在 實(shí)際措施中有力地妨礙了人類胰島作為胰島的唯一來源。
以下的實(shí)施例用于說明本發(fā)明。這些實(shí)施方式不能被用于限定本發(fā)明 的范圍，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求來確定。
實(shí)施例
履襲遂^:以下的實(shí)施例利用了五組分/三層膜膠嚢系統(tǒng)。該系統(tǒng)提 供了設(shè)計的靈活性從而進(jìn)行系統(tǒng)權(quán)衡研究來優(yōu)化在大型動物中的膠嚢的 性能。系統(tǒng)的5個組分是海藻酸鈉(SA)、硫酸纖維素(CS)、聚(亞甲基-共-胍)(或聚(亞甲基二胍)，PMCG )、氯化鈣(CaCl2)和聚-L-賴氨酸(PLL)。 內(nèi)膜是PMCG-CS/CaCl2-海藻酸鹽(大約100kDa的孔隙度，20-40微米的 厚度)；中膜是薄的交織PMCG-CS/ PLL-海藻酸鹽膜(大約150kDa的孔 隙度，1-3微米的厚度)；外膜是CaCV海藻酸鹽(大約250kDa的孔隙度， 100-300微米的厚度)。
y變襲說^:進(jìn)行以下試驗(yàn)從而優(yōu)化膠嚢。因?yàn)樗械哪?yīng)該一起發(fā)揮 作用，所以在膠嚢已經(jīng)被構(gòu)造后，很難預(yù)測一個膜是怎樣影響另外一個的。 例如，形成中膜的工藝會改變內(nèi)膜的性能。同樣，形成外膜的工藝會改變 中膜和內(nèi)膜的性能。另外，每個膜獨(dú)立的提升的特征不能預(yù)測多膜膠嚢在 移植主體內(nèi)是怎樣一起作用的?；谶@些原因，膠嚢形成物被作為一個具有下表中列出的多個參數(shù)的整體系統(tǒng)來對待，每一個膜作為一個組分。列 出了每個組分(膜)需要的功能，和在構(gòu)造后系統(tǒng)(膠嚢)的整體性能。
膠嚢形成和優(yōu)化中的試劑/步驟
#123456789101112
試劑/ 步驟PA1PA2PC 1RT 1PC 2RT 2PC 3RT 3PA 3PC 4RT 4PA 4
PA^聚陰離子；RT-反應(yīng)時間；PO聚陽離子;
膠嚢設(shè)計參數(shù) 膜形成參數(shù)(見上面的#1-12)
物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(T) 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8
免疫保護(hù)(P) 全部 生物相容性 9、 10、 11、 12
球形/中心 1、 2、 3、 4
穩(wěn)定性(S) 5、 6、 7、 8
辰囊控維多膜組合物被設(shè)計為生物相容的，完成有效的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、 提供免疫保護(hù)、為生物材料提供機(jī)械強(qiáng)度，并且提供化學(xué)穩(wěn)定性。
^務(wù)初容使膠嚢的生物相容性取決于將膠嚢的免疫源組分保護(hù)起來 抵抗移植主體。當(dāng)移植到健康的狗中達(dá)6個半月的封裝的胰島的檢測沒有 顯示并發(fā)癥時，證明了膠嚢膜的長期生物相容性。參見圖2。
圖2描繪了在治療超過6個月之后示出的正常狗的網(wǎng)膜(狗在2/l4/01 接受了封裝的胰島，并且在8/14/01處死)。在處死前，在動物中未觀察到 并發(fā)癥，在處死后，在器官中或者器官上未觀察到異常。該圖示出了網(wǎng)膜 的最小的炎癥反應(yīng)和輕微的新生血管形成。觀察到少量的膠嚢(少于1%) 含有不足量的血纖維蛋白和附著于表面的稀少的單核細(xì)胞。從狗中回收的 大多數(shù)膠嚢的表面是干凈的和透明的，以肉眼幾乎看不見但在顯微鏡下是 易于觀察到的。組織反應(yīng)性的證據(jù)是最小的。在內(nèi)臟床(splanchnic bed) 中沒有觀察到任何其他器官系統(tǒng)的介入。膠嚢松散地附著于網(wǎng)膜并且易于被清洗下來，顯示膠嚢錨定在但是不是嵌入到網(wǎng)膜內(nèi)。膠嚢的完整性非常 好，僅觀察到了最小的膠嚢"破壞"。在6個半月之后移出的回收的封裝 胰島仍然是活著的。
#{乾運(yùn)使用交織管模型，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與W/D成比例，其中R是平 均孔徑，D是膜厚度。參見Wang T., "New Technologies for Bioartifical Organs,"爿^/: Ogara， 22， 1: p. 68-74 (1998),其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參 考。膜的孔徑可以使用排阻色譜法來進(jìn)行測量。參見Brissova等.，"Control and measurement of permeability for design of microcapsule cell delivery system," /萬/owed Maf. i 仏，39:61-70 (1998),其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
圖3顯示了具有80KDa(直徑大約為12納米)下限的膠嚢膜的孔徑 分布。該孔徑足夠大足以使葡萄糖和胰島素出入，并足夠小足以阻止免疫 系統(tǒng)以各種方法滲透進(jìn)入胰島所在的膠嚢的核心。該圖顯示了作為膠嚢的 膜的孔徑分布函數(shù)的歸一化保留時間。膠嚢的膜的孔徑通過排阻色譜 (SEC)來確定，排阻色譜測量右旋糖苷(dextran)溶質(zhì)自填滿有微膠嚢
的柱的排出量。測量到的溶質(zhì)排阻系數(shù)值(KsEC)和溶質(zhì)分子的已知大小
可以估測膜的孔徑的分布和膠嚢的滲透性。
^瘦/^護(hù)使用隨機(jī)游走模型，免疫保護(hù)與D2/ ie成比例，其中D 是月莫厚度，R是平均孔徑。參見Wang T.， "New Technologies for Bioartifical Organs," v^ft/ Ogara, 22， 1: p. 68-74 (1998)。 一4殳而言，免疫保護(hù)的目地 是與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪康爻煞幢鹊?。但是，它們對膜厚度和孔徑的依賴的能?是完全不同的，這樣調(diào)整參數(shù)從而同時滿足兩個目地是可能的。
^械/克度通過在膠嚢上施加升高的單軸載荷直到膠嚢破裂來測量膠 嚢的機(jī)械強(qiáng)度。膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度(膜厚度的函數(shù))，可以在幾分之一克到 幾十克的負(fù)荷之間的任何位置進(jìn)行調(diào)整從而滿足移植目地而不改變膠囊 的、滲透斗生。
圖4:膠嚢機(jī)械穩(wěn)定性。該圖通過斷裂負(fù)載(rupture load)隨膠嚢膜 厚度和尺寸變化的繪圖說明了兩種不同聚合物濃度的膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度。曲線的斜率代表了破裂應(yīng)力由此間接地代表了膠嚢膜的固有強(qiáng)度。該圖通過
在膠嚢上施加單軸負(fù)荷來測量膠嚢的機(jī)械破裂強(qiáng)度。實(shí)心圓代表0.6-0.6 海藻酸鹽-CS膠嚢，空心圓表示0.9-0.9海藻酸鹽-CS膠嚢，實(shí)心方形代表 PLL-海藻酸鹽系統(tǒng)。如圖表中所示，雖然某些聚合物比其它的堅(jiān)固，但是 通常發(fā)現(xiàn)越厚的膜傾向于成為越堅(jiān)固的膜。
膠嚢的穩(wěn)定性主要取決于化學(xué)鍵的穩(wěn)定性和膜厚度。大型動 物，如狗的腹腔液(intra peritonea)可以與膠嚢膜發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而削弱 了機(jī)械強(qiáng)度。
圖5說明了具有不同化學(xué)成分和膜厚度的兩種膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度。通過 測量由于在40。C下在狗血漿中培育的1/e因子引起的膠囊喪失其機(jī)械強(qiáng)度 的時間長度來實(shí)驗(yàn)測定穩(wěn)定性。人們相信一個設(shè)計適當(dāng)?shù)哪z囊系統(tǒng)可以在 大型動物的腹膜的不利環(huán)境中維持多年。在圖5中，當(dāng)膠嚢在4(TC下在狗 血漿中培育時，測量作為時間函數(shù)的機(jī)械強(qiáng)度。實(shí)心菱形代表0.6-0.6海 藻酸鹽-CS膠嚢，實(shí)心方形代表0.9-0.9海藻酸鹽-CS膠嚢，空心方形代表 0.6-0.6海藻酸鹽-CS膠嚢。穩(wěn)定性通過隨著時間的最小波動量來示出。在 圖中，0.6-0.6海藻酸鹽-CS膠嚢顯示了最小的波動量并且因此可以被認(rèn)為 是所試驗(yàn)的三種中最穩(wěn)定的膠嚢。
已經(jīng)在切除了胰腺的犬模型中研究了多膜封裝的胰島的生物相容性 和功能能力。動物的尺寸和相應(yīng)的血量可以進(jìn)行血糖和胰島素的每曰估 測、葡萄糖耐受的臨床評價(assessment)以及生物相容性和安全性的估 測。另外，犬模型是廣泛使用的人葡萄糖自我平衡和糖尿病的模型。犬中 全胰切除術(shù)導(dǎo)致內(nèi)生胰島素的完全缺失，因此胰島素濃度的評價可以直接 估測封裝的胰島的機(jī)能和反應(yīng)力。
乂'的涼備研究了平均重量7.6kg的任意性別的雜種犬。該動物住在 符合美國協(xié)會對于動物管理?xiàng)l例(animal care guideline)認(rèn)證的設(shè)備中。所有 的動物管理程序都通過了 Vanderbilt's設(shè)立的動物管理及使用委員會的評 審和核準(zhǔn)。在封裝的胰島腹膜內(nèi)給藥前的17到24天，如以下所描述地進(jìn) 行全胰切除術(shù)。在手術(shù)后階段，基于干重給動物喂飼罐裝飼料的標(biāo)準(zhǔn)飲食(34%蛋白質(zhì)、14.5%脂肪、46%碳水化合物，和5.5%纖維素)。外分泌的 胰腺酶、脂肪酶(70000 U)、淀粉酶(210000 U)和蛋白酶(210000U)與 它們的進(jìn)食一起給藥，從而輔助食物消化并且補(bǔ)償胰腺外分泌功能的缺 失。動物每日接受調(diào)節(jié)劑量的胰島素注射物以在喂飼后12個小時保持血 糖正常，在24小時內(nèi)沒有糖尿。胰島素的需要量通常在0.6-0.9 U/kg常規(guī) 豬(regularpork)和1.0-1.3 U/kgNPH豬的范圍，q24小時(每24小時一 次)。
封襲沐鍵名W給豕.在胰切除術(shù)之后，每日的胰島素需要量可以是穩(wěn) 定的。動物禁食12小時，并使用丙泊酚(Propofol) (4.4 mg.kg, IV)和異 氟烷(具有2%的02,吸入)進(jìn)行全身麻醉。實(shí)施1.5cm的中線剖腹手術(shù)， 并將7.0mm I.D.套管插入到腹膜間隙。 一個漏斗連接到套管的自由端。懸 浮在含有犬清蛋白的改良Hanks溶液中的封裝的胰島在室溫下給藥到腹 部間隙?？偟哪z嚢給藥注入量是150-200ml。立即移出腹膜內(nèi)的套管并封 閉剖腹手術(shù)切口。使動物蘇醒，立即喂飼她/他每日食物配給量(ration)。 該食物配給量從封裝的胰島給藥時起的兩個小時內(nèi)消化的。喂飼食物后的 6到8個小時，收集血液用于測量血糖狀況，在此后的3天每天都實(shí)施收 集。
每"http://式求^#:在緊接著的給藥后階段之后，動物喂飼標(biāo)準(zhǔn)的每日配 給量，以2-3天的間隔進(jìn)行血液的收集用于測定葡萄糖和胰島素。在收集 血液時，稱重動物并且測量一般身體狀況。在封裝的胰島給藥后的2-4周 實(shí)施口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。在18個小時的禁食之后，將18規(guī)格的靜脈留 置針放置在左頸靜脈或右頸靜脈中用來收集血液。在收集了基線(baseline ) 血液樣品以后口服給藥右旋糖(0.7 gm/kg )。在開始的20分鐘以2.5分鐘 間隔收集血液樣品，之后在試^^的3個小時階段中以5和10分鐘間隔收 集血液樣品。使用Beckman葡萄糖II分析儀(Beckman Instruments Palo Alto CA.)通過葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖水平。使用雙抗體系統(tǒng)通過放射 性免疫測定確定血漿中的胰島素。
28在封裝的胰島給藥的那天，停止外源胰島素并且監(jiān)控血液葡萄糖水 平。沒有將免疫抑制藥物給予動物。
應(yīng)房的分,^^僚為了胰島的分離，雜種犬(體重20-28kg)在禁 食18小時之后進(jìn)行全身麻醉。實(shí)施中線剖腹手術(shù)。分離(分辨出，isolate) 胃與十二指腸、脾臟和胰十二指腸的靜脈和動脈，在每個血管周圍放置結(jié) 扎線(ligature )。在接近十二指腸入口的地方確定并且分離主胰管。圍繞 該管放置結(jié)扎線。將18規(guī)格的靜脈留置針插入管中，其尖端向前2-3mm 這樣它就保留在正好在胰腺的管分支前的主體管結(jié)構(gòu)中。將導(dǎo)管縫合到該 管上從而穩(wěn)固其位置。要回收之前，立即將先前放置的血管結(jié)扎線拉緊， 動物安樂死。從所有腹膜和血管的連接處橫切胰腺并且從十二指腸切開。 一旦切離，立即通過事先放置的管的導(dǎo)管將冰冷的Wisconsin大學(xué)(UW-D) 灌注液灌注到胰腺。
實(shí)施可視化檢查以保證整個胰腺都被灌注。得到的腺體放在水上轉(zhuǎn)送 到實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室用膠原酶的UW-D(Crescent化學(xué)品)溶液替代UW-D 溶液。然后將腺體放置于振蕩水域中，并且在40。C消化大約35分鐘。離 解(dissociate)的組織經(jīng)過40(Him網(wǎng)篩過濾，用水冷的介質(zhì)(培養(yǎng)基， meida)清洗幾次從而去除并失活膠原酶。根據(jù)胰島和外分泌組織之間的 密度差異，使用不連續(xù)Ficoll梯度來分離胰島和外分泌組織。在密度離心 之后，收集、清洗胰島，轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加了 10。/。FBS(胎牛血清)和抗生素的組 織培養(yǎng)M199培養(yǎng)基中。在48-72小時的培養(yǎng)過程中，分離的胰島保持它 們完整的外觀并且膠嚢表面保持光滑。
在56個犬胰腺上實(shí)施胰島分離。在下面示出了每個胰腺的平均分離 結(jié)果(未量化的小于50nm的胰島片段)的分布(profile)。除了分離的胰 島的數(shù)量，通過測定胰島的直徑、純度、胰島的生存能力和胰島的功能來 估測分離物的質(zhì)量。因?yàn)槠骄葝u直徑會變化，所以通過計算平均胰島體 積與直徑為150nm的"標(biāo)準(zhǔn)"胰島的體積的比值來將分離產(chǎn)率歸一化。 得到的數(shù)值表示為胰島當(dāng)量值(Equivalent Islet Number, EIN)并且可以使 得不同的分離物進(jìn)行產(chǎn)率比較。用胰島特異性染料雙硫腙染色的樣品來測
29定胰島的純度。染料將胰島染成紅色但是不染色外分泌組織。大部分外分
泌組織在培養(yǎng)開始的24小時中死亡，導(dǎo)致在培養(yǎng)過程中純度升高到大約 95%。
通過用鈣黃綠素AM(將活細(xì)胞染成熒光綠)和溴化乙錠(將死細(xì)胞的核 染成熒光紅)的組合染色的樣品來確定胰島的生存能力。生存能力以l(所 有細(xì)胞死亡)至4 (所有細(xì)胞生活)的等級進(jìn)^f亍記分。5種典型的分離物 的平均值列表如下。
每個胰腺的胰島 435 士38K
胰島直徑 106±3.8pm
胰島當(dāng)量值 0.48 ±0.04
純度 87.3 ±1.2%
生活力 3.5 ±0.1
i,的承成'和溜迷'可以用液滴形成器和化學(xué)反應(yīng)室制造膠嚢，如在 美國專利第5,260,002或者6,001,312號中所^L露的，這二者的全部內(nèi)容 都結(jié)合于此作為參考。
另外一種液滴形成器系統(tǒng)是雙注射器系統(tǒng)，其中兩個或者多個注射器 平行連接并且沒入恒溫槽中從而保持活細(xì)胞健康。含有注射器的恒溫槽可 以為具有約4'C溫度的水水槽，其有助于將細(xì)胞保持在休眠的狀態(tài)。已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胰島處于休眠狀態(tài)時，在移植的過程中會產(chǎn)生較少的損害。通過 在一個注射器上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時可以使另外一個注射器重新補(bǔ)充，這種雙注射 系統(tǒng)提供了連續(xù)的操作。該注射器也可以含有位于注射器內(nèi)部的低轉(zhuǎn)速 (slow-turning)的推進(jìn)器，其有助于保持胰島密度的一致，即胰島在注射 器內(nèi)更加平均地分布。
化學(xué)反應(yīng)裝置包括充滿溶液的，如陽離子溶的液多回路室反應(yīng)器。該 陽離子溶液槽通過陽離子流供給，其連續(xù)地補(bǔ)充溶液并且?guī)ё弑灰胧业?陰離子液滴。具有封入的胰島的連續(xù)的SA/CS液滴會從滴形成器流出，以 設(shè)計好的高度和角度進(jìn)入陽離子流；從而降低或者將胰島偏離中心、液滴 變形和與沖擊(碰撞)相關(guān)的氣泡摻入問題最小化。然后通過聚陽離子流
30將液滴帶入到多回路反應(yīng)器中。該反應(yīng)器有助于控制復(fù)合物(complex) 形成的時間以及消除某些重力沉降作用。膠嚢被帶入到用于連續(xù)操作的具 有相同或者不同聚陽離子溶液的第二回路反應(yīng)器。這促進(jìn)了更嚴(yán)格地控制 膠嚢的直徑、球形以及膜的厚度和均一性。
膠嚢可以被制成直徑范圍在約0.5mm到約3.0mm并且膜厚度范圍在 約0.006mm到約0.125mm。
可以通過在膠嚢上施加增大的單軸負(fù)荷直到膠嚢破裂或者完全被壓 縮成一個平的盤狀物來測量膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度，正如在圖4中描述和先前討 論的。膠嚢的機(jī)械強(qiáng)度(作為膜組分和厚度的函數(shù))，可以調(diào)節(jié)到幾分之 一克到幾百克的負(fù)荷之間的任何位置從而在不顯著改變膠嚢的滲透性下 滿足移植的目地。
開發(fā)并且表征了一系列具有滲透性范圍的膠嚢(孔隙度下限在40 kDa-230kDa的范圍，基于右旋糖苷排出測量法)。膠嚢滲透性可以通過使 用以右旋糖苷分子量作為標(biāo)準(zhǔn)的排阻色語法(SEC)來測量。測量滲透性 和組分濃度可以更好地控制和操縱膠嚢的滲透性。膠嚢膜的表觀孔徑是通 過排阻色語法(SEC)來測定的，其測量從填滿微嚢的柱中的右旋糖苷溶 質(zhì)的排出。通過4吏用中性多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)，在當(dāng)溶質(zhì)的擴(kuò)散^f又由其分子量
大小控制的條件下，可以評價膜的性能?；谌苜|(zhì)排阻系數(shù)(KsEC)的測量
值和溶質(zhì)分子的已知尺寸，可以估計膜的孔徑分布(PSD)。 新型辰襲的體力^^
響^亍^/激的封衷腐扇的腐房#為\^、在胰島分離和直徑、純度和生 存能力測試后，培養(yǎng)胰島48-72小時并且用多膜膠嚢封裝。在細(xì)胞周流系 統(tǒng)中測定游離的胰島和封裝的胰島的胰島素分泌能力，如下所述。在具有 含0.1%的作為周流液的BSA的RPMI 1640的流速為1 ml/分鐘的細(xì)胞周 流儀器中估測封裝的胰島的胰島素分泌。封裝的胰島以2mM葡萄糖周流 30分鐘，拋棄柱流過物。在30分鐘的2mM葡萄糖的周流過程中，30分 鐘的2mM葡萄糖+0.045 mM IBMX (營養(yǎng)物)的周流過程中和60分鐘的 2mM葡萄糖的周流過程中收集周流液的3個孩i小(瞬間，minute )的樣品。
31使用具有犬胰島素標(biāo)準(zhǔn)的Coat-a-Count試劑盒(Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA)重復(fù)檢測樣品的胰島素。分泌的胰島素的量 被歸一化為胰島的數(shù)量。
如通過對胰島素促分泌素的動態(tài)響應(yīng)的測量，封裝的胰島的胰島素分 泌具有與未封裝的游離胰島相似的分部，在胰島素分泌上具有輕微的滯 后。參見圖6。這種在胰島素分泌上的滯后和在去除刺激后胰島素分泌的 停止反應(yīng)出(a)促分泌素進(jìn)入膠嚢并達(dá)到胰島的時間和(b)胰島素離開 膠嚢的時間。
圖6描述了測量分泌胰島素的胰島的分泌水平的細(xì)胞周流系統(tǒng)。分別 測量游離胰島(未封裝的)、封裝在單膜系統(tǒng)的胰島(封裝的胰島)和封 裝在多膜系統(tǒng)的胰島(具有多層的封裝)。在圖中的頂部用黑色棒狀物表 示胰島素分泌的刺激。每3分鐘從周流相(perifusion fraction)中收集的 胰島素通過放射性免疫測定而被定量。胰島的數(shù)量未被歸一化，所以圖表 的關(guān)注點(diǎn)應(yīng)該放在響應(yīng)時間而不是圖的高度上。3幅圖中的響應(yīng)時間的相 似性(只具有微小的延遲)，表示封裝在多膜系統(tǒng)的胰島將會在移植動物 中正常發(fā)揮作用。
#袁的腐房的#雜##全嫂使用全胰切除術(shù)的狗模型，在10個糖 尿病動物中測量了腹膜內(nèi)給藥的封裝的犬胰島(同種異體移植物)的功能 和安全性。糖尿病復(fù)發(fā)(以葡萄糖水平連續(xù)4天高于180mg/dl來確定) 在移植后大約100天在狗1中出現(xiàn)?；厥辗庋b胰島，并且在細(xì)胞周流系統(tǒng) 中使用與在圖6所示的前述移植中所用的相同刺激測試該封裝胰島。參見 圖7。
圖7中的圖顯示出封裝的胰島仍然是存活的，以對高葡萄糖加IBMX 的反應(yīng)作為證據(jù)，但是胰島素分泌能力下降。這些結(jié)果提示由于不充足的 胰島素量糖尿病復(fù)發(fā)，還提示這是由于降低的胰島量或者功能的降低，其 不是同種異體移植物反應(yīng)的結(jié)果。在圖8-10中顯示了狗10的空腹血糖濃度、體重和果糖胺測量值作為
代表性數(shù)據(jù)?；厥盏哪z嚢是干凈和完整的，提示移植物的壽命不再由膠嚢 的穩(wěn)定性所限定，而是由胰島的量的減少而限制。
圖8描述了犬的同種異體移植的血糖分析。已經(jīng)證明封裝在多膜系統(tǒng) 中的胰島的移植在消除已經(jīng)進(jìn)行了全胰切除術(shù)的犬模型(第10號狗)的 糖尿病上的功效。頂部圖像顯示了在進(jìn)食后12-18小時收集的靜脈血糖濃 度。較低圖像顯示了皮下給藥的豬胰島素的每日劑量。較低圖像的棒狀物 的上部顯示了 NPH胰島素，棒狀物的下部顯示了常規(guī)的胰島素。在18和 19天，停止治療從而確認(rèn)狗患有糖尿病。在頂部圖像中可見，當(dāng)胰島素治 療停止時，葡萄糖水平顯著升高。在20天重新開始胰島素治療。在25天 的早晨，又停止胰島素治療。在25天的下午，將封裝在多膜系統(tǒng)中的胰 島移植到犬中，如通過垂直線所示。如在頂部圖像中所顯示的，經(jīng)過200 天，葡萄糖水平以與胰島素治療期間所觀察到的葡萄糖水平可比的或者更 好的水平保持穩(wěn)定。底部圖像確定了在這個時間階段中沒有給予額外的胰 島素治療。
圖9描述了犬同種異體移植的體重分析。頂部和底部圖像來源于圖8。 中部圖片顯示了在試驗(yàn)過程中監(jiān)測到的動物體重。如圖表中所見，在整個 試驗(yàn)階段，犬的體重保持穩(wěn)定。
圖IO描述了犬同種異體移植的果糖胺分析。頂部和底部圖像來源于 圖8。中部圖像顯示了果糖胺的測量值，糖尿病對象2-3周的平均血糖水 平的指標(biāo)。400的果糖胺水平大致相當(dāng)于8.0的A1C測量值，其是相似的 指標(biāo)。中部圖像的陰影區(qū)域示出了可接受的果糖胺水平。如這個圖中所示， 在試驗(yàn)期的果糖胺水平降低到可接受的水平內(nèi)。測試的果糖胺水平相當(dāng)于 范圍在6.0(110-120天)至8.0 ( 195-200天)的A1C水平。
再移孩當(dāng)動物復(fù)發(fā)空腹高血糖癥時，可以重復(fù)移植步驟從而保持血 糖量正常。例如，狗7接受了 40,000 EIN/kg，但是只能在大約90天保持 某些類似的葡萄糖控制。然后狗以兩個移植物接受了總量達(dá)63,000 EIN/kg 的第二次劑量的封裝的胰島(鑒于胰島的有效性，以一個月分開給予移植物)。這些結(jié)果類似在具有100,000 EIN/kg的狗6的移植中觀察到的，并 且在提供空腹血糖控制上具有可比的有效性。
圖11示出了 90-110 mg/dl的不補(bǔ)充胰島素或者免疫抑制的狗7的每 日空腹血糖。垂直線示出胰島移植的天數(shù)。頂部圖像示出了指示進(jìn)食后 12-18小時收集的靜脈血糖濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)。較低圖像顯示了皮下給藥的豬 胰島素的每日劑量，棒狀物的上部顯示了 NPH胰島素，棒狀物的下部顯 示了常規(guī)胰島素。該圖顯示了再移植的有效性，這通過第二次移植后的迅 速穩(wěn)定的葡萄糖水平而被證明。
這些數(shù)據(jù)提示如果不比首次移植更好，進(jìn)行再一次移植也無妨。由于 對象的適應(yīng)治療和將血管化降低到最小的能力，人們相信隨后的移植比最 初的移植表現(xiàn)更好。再移植提供了提高的葡萄糖控制，并且在生物相容性 方面在動物中很好地^支接受。已經(jīng)在一個對象上成功地進(jìn)行了 4次再移植； 但是，可以在對象中實(shí)施的再移植的數(shù)量并沒有實(shí)際的限制。
靜脈葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IVGTT): 對所用的動物實(shí)施靜脈葡萄糖耐量 實(shí)驗(yàn)(IVGTT)以測量封裝的胰島的體內(nèi)功能。圖12顯示了狗5的IVGTT 結(jié)果。給先前接受了封裝在多膜系統(tǒng)中的胰島移植的狗在t=0給予靜脈內(nèi) 葡萄糖(300 mg/kg )。從頸靜脈收集靜脈樣品從而測定血糖和胰島素。
大約在105分鐘對象的血糖水平恢復(fù)到正常，其比對照狗6表現(xiàn)出的 平均50分鐘的時間要長，但不是不合理的長。葡萄糖清除率(K值)高， 但仍然在正常的范圍內(nèi)。在以75分鐘的IVGTT基礎(chǔ)上，所有被移植動物 的循環(huán)胰島素值比基礎(chǔ)的平均升高40%,并且在試驗(yàn)的剩余時間里保持在 這個水平上。據(jù)有封裝的胰島的狗不表現(xiàn)出第一相胰島素分泌，其在對照 動物中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)。缺乏響應(yīng)于葡萄糖激發(fā)的胰島素波動(可能是由于IP 移植位點(diǎn)的稀釋效應(yīng))可能會促進(jìn)胰島逐漸喪失分泌充足的胰島素以保持 正常血糖量的能力。
3權(quán)利要求
1. 一種用于封裝生物材料的多膜組合物，包括a. 內(nèi)膜，其與所述生物材料生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以保持所述膜中的所述生物材料并且提供免疫保護(hù)以抵抗主體的免疫系統(tǒng)中的抗體；b. 中膜，其具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)所述內(nèi)膜來抵抗所述主體的化學(xué)物質(zhì)；以及c. 外膜，其與所述主體生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以防護(hù)所述內(nèi)膜和所述中膜抵抗所述主體的非特異性先天免疫系統(tǒng)；其中所述中膜將所述內(nèi)膜和所述外膜結(jié)合起來。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多膜組合物，其中所述多膜組合物具有孔隙度，所述孔隙度足夠大足以使得生物活性劑從所述生物材料釋放但又足夠小足以防止來自免疫系統(tǒng)的抗體的進(jìn)入。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多膜組合物，其中所述孔隙度下限在約50kDa至約250kDa的范圍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多膜組合物，其中每個膜以一種可以使所述多膜組合物滿足大型動物移植物的二分法目標(biāo)的方式實(shí)現(xiàn)至少一種功能。
5. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所迷的多膜組合物，其中所述生物材料選自由胰島、肝細(xì)胞、脈絡(luò)叢、神經(jīng)細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞和分泌凝固因子的細(xì)胞組成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多膜組合物，其中所述生物材料是胰島。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多膜組合物，其中所述的生物活性劑是胰島素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多膜組合物，其中所述主體是大型哺乳動物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的多膜組合物，其中所述大型哺乳動物是人。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多膜組合物，進(jìn)一步包括一個或者多個附加膜。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多膜組合物，其中所述附加膜為所述多膜組合物提供免疫保護(hù)、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性、和/或生物相容性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多膜組合物，其中所述內(nèi)膜的膜厚度在約5微米至約150微米的范圍。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的多膜組合物，其中所述膜厚度在約10微米至約60微米的范圍。
14. 一種能夠封裝生物材料的多膜組合物，包括a. 包括海藻酸鈉、硫酸纖維素、聚(亞甲基-共-胍)和氯化鈣的膜；b. 包括選自由聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L，D-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L，D-鳥氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L,D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸、琥珀?；?D-賴氨酸、琥珀?；?L,D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)以及它們的組合組成的組中的聚陽離子的膜；和c. 包含具有羧酸根基團(tuán)或者硫酸根基團(tuán)的碳水化合物聚合物的膜。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多膜組合物，其中所述聚陽離子選自由聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L，D-賴氨酸、聚-L-烏氨酸、聚-D-鳥氨酸、 聚-L,D-鳥氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)以及它們的組 合組成的組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的多膜組合物，其中所述聚陽離子是聚-L-賴氨酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多膜組合物，其中所述碳7jC化合物聚合物選 自由羧甲基纖維素鈉、低曱氧基果膠、海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、黃芪膠、果膠酸鈉、K-角叉菜膠和l-角叉菜膠組成的組。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的多膜組合物，其中所述碳水化合物聚合物選 自由海藻酸鈉、海藻酸鉀以及海藻酸鈣組成的組。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多膜組合物，其中所述膜(b)進(jìn)一步包括 至少一種選自由海藻酸鈉、硫酸纖維素和聚(亞曱基-共-胍)組成的 組中的化合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多膜組合物，其中所述膜(c)進(jìn)一步包括 選自由氯化4丐、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈣、硝酸4丐、氯化銨、氯化 鈉、氯化鉀、氯化膽堿、氯化鍶、葡萄糖酸4丐、硫酸釣、硫酸鉀、 氯化鋇、氯化鎂、以及它們的組合組成的組中的無機(jī)金屬鹽。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的多膜組合物，其中所述無機(jī)金屬鹽選自由氯 化鈣、氯化銨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈣、以及它們的組合組成的 組。
22. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多膜組合物，進(jìn)一步包括一個或者多個附加膜。
23. —種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的對象的方法，包括將足夠量的 含有產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的組合物給予所述對象，其中所述組合 物是多膜膠嚢，包括a. 內(nèi)膜，其與所述生物材料生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng) 度以保持所述膜中的所述生物材料并且提供免疫保護(hù)以抵抗所述對 象的免疫系統(tǒng)中的抗體；b. 中膜，其具有足夠的化學(xué)穩(wěn)定性以增強(qiáng)所述內(nèi)膜來抵抗所 述對象中的化學(xué)物質(zhì)；以及c. 外膜，其與所述主體生物相容并且具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以 保護(hù)所述內(nèi)膜和所述中膜抵抗所述對象的非特異性先天免疫系統(tǒng)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述糖尿病或者相關(guān)病癥選自由 l型糖尿病、2型糖尿病、青年成人型糖尿病(MODY)、成人隱匿 性自身免疫糖尿病(LADA)、葡萄糖耐量低減(IGT)和空腹血糖 受損(IFG)、妊娠期糖尿病和代謝綜合癥X組成的組。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述對象是大型哺乳動物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述大型哺乳動物是人。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多膜膠嚢具有孔隙度，所述 孔隙度足夠大足以使胰島素從所述產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞釋放但是 足夠小足以防止來自免疫系統(tǒng)的抗體的進(jìn)入。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述孔隙度下限在約50千道爾 頓至約250千道爾頓的范圍。
29. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中每個膜以一種使所述多膜組合物 滿足大型動物移植物的二分法目標(biāo)的方式實(shí)現(xiàn)至少 一種功能。
30. —種治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的對象的方法，包括將足夠量的 含有產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞的組合物給予所述對象，其中所述組合 物是多膜膠囊，包括a. 包括海藻酸鈉、硫酸纖維素、聚(亞曱基-共-胍)和氯化鈣的膜；b. 包括選自由聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚-L,D-賴氨酸、聚 乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L,D-鳥氨酸、 聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L,D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚 -L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀?；?L-賴氨酸、 琥珀酰化聚-D-賴氨酸、琥珀?；?L，D-賴氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰 胺、聚(乙烯醇)、以及它們的組合組成的組中的聚陽離子的膜；和c. 包含具有羧酸根基團(tuán)或者硫酸根基團(tuán)的碳水化合物聚合物 的膜。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述聚陽離子選自由聚-L-賴氨 酸、聚-D-賴氨酸、聚-L,D-賴氨酸、聚-L-鳥氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚 -L，D-鳥氨酸、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)、以及它們的組 合組成的組。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述聚陽離子是聚-L-賴氨酸。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述碳水化合物聚合物選自由羧 曱基纖維素鈉、低甲氧基果膠、海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、黃芪膠、果膠酸鈉、K-角叉菜膠和l-角叉菜膠組成的組。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中碳水化合物聚合物選自由海藻酸 鈉、海藻酸鉀和海藻酸鉀組成的組。
35. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述膜(b)進(jìn)一步包括至少一 種選自由海藻酸鈉、硫酸纖維素和聚(亞曱基-共-胍)組成的組中的 成分。
36. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述膜(c)進(jìn)一步包括選自由 氯化4丐、硫酸鎂、碌u酸錳、乙酸釣、硝酸鈣、氯化銨、氯化鈉、氯 化鉀、氯化膽堿、氯化鍶、葡萄糖酸鉤、硫酸鉤、硫酸鉀、氯化鋇、 氯化鎂、以及它們的組合組成的組中的無機(jī)金屬鹽。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述無機(jī)金屬鹽選自由氯化鈣、 氯化銨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈣、以及它們的組合組成的組。
38. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，進(jìn)一步包括一個或者多個附加膜。
39. —種以不涉及免疫抑制的細(xì)胞療法治療患有糖尿病或者相關(guān)病癥的 大型哺乳動物對象的方法，所述方法包括將含有提供至少30天的胰島素持續(xù)釋放的產(chǎn)生胰島素的胰島 細(xì)胞的組合物的細(xì)胞療法給予所述對象，其中所述組合物在所述持 續(xù)釋放過程中未表現(xiàn)出顯著的降解。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述持續(xù)釋放階段持續(xù)至少60 天。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述持續(xù)釋放階段持續(xù)至少120 天。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述持續(xù)釋放階段持續(xù)至少180 天。
43. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述組合物是多膜組合物。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述多膜組合物包括至少三個 膜，所述膜中的每一個包含至少一種選自由海藻酸鈉、硫酸纖維素、 聚(亞甲基-共-胍)、氯化釣和聚-L-賴氨酸組成的組中的化合物。
45. —種含有生物材料的膠嚢，當(dāng)所述膠嚢引入到具有機(jī)能化免疫系統(tǒng) 的大型哺乳動物中時，分泌生物活性劑至少30天而不產(chǎn)生由所述免 疫系統(tǒng)的免疫攻擊而造成的顯著降解。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的膠嚢，其中所述生物劑是胰島素。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的膠嚢，其中所述大型哺乳動物是人。
48. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的膠嚢，其中所述膠嚢分泌所述生物活性劑至 少60天。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的膠嚢，其中所述膠嚢分泌所述生物活性劑至 少120天。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的膠嚢，其中所述膠嚢分泌所述生物活性劑至 少180天。
51. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的膠嚢，其中所述膠嚢是多膜膠嚢。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的膠嚢，其中所述多膜膠嚢包括至少三個膜， 所述膜的每一個包括至少一種選自由海藻酸鈉、^L酸纖維素、聚(亞 甲基-共-胍)、氯化媽和聚-L-賴氨酸組成的組中的化合物。
53. —種穩(wěn)定患者的葡萄糖水平至少30天的方法，包括將含有產(chǎn)生胰島 素的胰島纟田月包的組合物的細(xì)胞療法給予患有糖尿病或者相關(guān)病癥的 患者，其中所述細(xì)胞療法并不是與涉及免疫抑制的附加治療一起給予的。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述葡萄糖水平穩(wěn)定至少60天。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述葡萄糖水平穩(wěn)定至少120天。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述葡萄糖水平穩(wěn)定至少180天。
57. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述組合物是多膜組合物。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述多膜組合物包括至少三個 膜，所述膜的每一個包括至少一種選自由海藻酸鈉、硫酸纖維素、 聚(亞曱基-共-胍)、氯化4丐和聚-L-賴氨酸組成的組中的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫隔離封裝系統(tǒng)，其保護(hù)細(xì)胞移植物并因此在不需要免疫抑制的情況下使細(xì)胞發(fā)揮機(jī)能和存活。該免疫隔離系統(tǒng)是多組分、多膜膠囊，對于在大型動物模型中的可重復(fù)的機(jī)能其可以使多個設(shè)計參數(shù)獨(dú)立地優(yōu)化。
文檔編號A61K9/50GK101466360SQ200780020922
公開日2009年6月24日 申請日期2007年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者王贛駿 申請人:命生公司