專利名稱：：針對(duì)登革病毒四種血清型的免疫接種方法針對(duì)登革病毒四種血清型的免疫接種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可在患者體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)四種登革病毒(dengue)血清型(serotype)的同源性寸呆護(hù)(protectionhomologue)的方法，包4舌只十所述患者的相繼(s—ntielle)給藥(i)一劑量(unedosede)第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥后至少30天和最長(zhǎng)1年給藥。登革熱是由黃病毒屬的四種病毒導(dǎo)致的，其血清型相似但是從抗原角度看又不同(Giibleretal"1988In:Epidemiologyofarthropod-borneviraldisease.MonathTPM,editor,BocaRaton(FL):CRCPress:223-60;Kautneretal"1997,J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau畫P6rezetal.,1998，Lancet;352:971-977;Vaughnetal.,1997,JInfectDis;176:322-30)。感染登革病毒血清型可以產(chǎn)生不同臨床疾病，從非特異性的病毒性癥狀到致死性的嚴(yán)重出血性疾病。蚊子叮咬后發(fā)生登革熱的潛伏期大約是4天(從3天到14天)。登革熱的特征是雙相熱、頭疼、身體不同部位疼痛、衰竭、皮滲、淋巴結(jié)病和白細(xì)胞減少(Kautneretal.,1997，J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau措ezetal"1998,Lancet;352:971-977)。病毒血癥期與發(fā)熱性疾病相同(Vaughnetal.,1997,J.Infect.Dis.;176:322-30)。登革熱的康復(fù)發(fā)生在7到10天后，但是通常會(huì)有長(zhǎng)時(shí)間的疲乏。常見白細(xì)胞和血小板數(shù)量變化的疾病。出血性登革熱是一種嚴(yán)重的發(fā)熱性疾病，特征是內(nèi)環(huán)境異常和血管通透性的增加導(dǎo)致血容量過低和低血壓(登革中風(fēng)癥狀)，通常伴有嚴(yán)重的內(nèi)出血。出血性登革熱的死亡率在不治療的情況下可以高達(dá)10%,但是在大多數(shù)有經(jīng)-瞼的醫(yī)療中心經(jīng)治療后死亡率僅為l%(WHOtechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosis,treatmentandcontrol,pi-2.WorldHealthOrganization,Geneva,Switzerland)。登革熱的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷是基于病毒分離和/或登革病毒特異性抗原的一企測(cè)。登革熱是僅次于瘧疾的第二類常見熱帶傳染病，超過全球一半的人口(25億)生活在有登革熱流行傳播風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域。估計(jì)每年登革熱患者5000萬(wàn)到l億，出血性登革熱住院患者50萬(wàn)，死亡患者2.5萬(wàn)。登革熱在亞洲、太平洋區(qū)域、非洲、拉丁美洲和加勒比地區(qū)流行。登革病毒感染在超過IOO個(gè)熱帶國(guó)家流行，其中60個(gè)國(guó)家有出血性登革熱的記載(Gubler,2002,TRENDSinMicrobiology.10:100-103;Monath,1994，Proc.Natl.Acad.Sci;91:2395-2400)。一些詳細(xì)描述的因素似乎與登革熱有關(guān)人口增長(zhǎng)；非計(jì)劃和控制的城市化，尤其是同時(shí)伴隨貧窮；空中旅行的增加；缺乏對(duì)蚊子的有效控制以及衛(wèi)生基礎(chǔ)設(shè)施和公共衛(wèi)生的惡化(Gubler，2002，TRENDSinMicrobiology.10:100-103)。對(duì)于旅行者和流浪者，關(guān)于登革熱的警告不斷增加(Shirtcliffeetal.，1998，J.Roy.Coll.Phys.Lond..;32:235-237)。登革熱在熱帶區(qū)域地方性流行期間成為構(gòu)成美國(guó)軍隊(duì)發(fā)熱性疾病的主要原因之一(DeFraitesetal.，1994,MMWR1994;43:845-848)。登革病毒在涉及人類和埃及伊蚊(Je6/M^gy/")的循環(huán)中存在，埃及伊蚊是一種白天叮人的家蚊，喜好叮咬人類。人類的感染開始于感染的埃及伊蚊吸血過程中病毒的注入。唾液中的病毒主要在血管外組織中沉積。潛伏期過后第一類受感染的細(xì)胞是樹突細(xì)胞，此后遷移到淋巴結(jié)(Wuetal，2000,NatureMed;7:816-820)。在皮膚和淋巴結(jié)早期復(fù)制后，在急性發(fā)熱期出現(xiàn)在血液中，通常3-5天。與樹突細(xì)胞一樣，單核細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞是登革病毒的第一批耙細(xì)胞。預(yù)防同種類型的再感染的保護(hù)是徹底的并且通常是持續(xù)終生的，但是不同類型的登革病毒之間的交叉保護(hù)僅持續(xù)幾周或者幾月(Sabin，1952,Am.J.Trop.Med.Hyg;1:30-50)。因此，同一個(gè)個(gè)體可以感染不同的血清型。二次感染登革病毒在理論上是發(fā)生嚴(yán)重登革熱疾病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。然而，出血性登革熱是多因素導(dǎo)致的這些因素包括涉及的病毒抹，以及患者的年齡，免疫狀態(tài)和基因的遺傳缺陷。兩種因素在出血性登革熱的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用伴隨嚴(yán)重病毒血癥的快速病毒復(fù)制(與病毒血癥水平相關(guān)的疾病的嚴(yán)重程度；Vaughneta1,2000,J.Inf，Dis;181:2-9)和伴隨高水平炎癥介質(zhì)釋》文的嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)(RothmanandEnnis,1999,Virogogy;257:1-6)。沒有針對(duì)登革熱的特異性治療。登革熱的治療是對(duì)癥治療，包括臥床休息、用退燒藥和鎮(zhèn)痛藥控制體溫和疼痛，以及足夠的液體攝入量。出血性登革熱的治療需要補(bǔ)充體液損失，替代凝血因子和注射肝素。目前預(yù)防性措施是基于控制傳病媒介和采取個(gè)人防護(hù)措施，這些措施都很難實(shí)施并且成本很高。到目前為止沒有預(yù)防登革熱的疫苗被批準(zhǔn)。考慮到四種登革熱血清型在全世界中存在并且有報(bào)道稱其與登革出血熱有關(guān)，理想狀態(tài)下，疫苗應(yīng)該能夠防御登革病毒的全部四種血清型。以前實(shí)施過相繼疫苗接種策略，目的是誘導(dǎo)產(chǎn)生不同登革病毒血清型之間的異源性保護(hù)。因此，Price(1968,Am.J.Epid，88:392-397)介紹了防御登革熱的相繼疫苗接種方法，包括登革病毒血清型1和其后登革病毒血清型2的兩次感染，在用登革病毒血清型3和4感染的試驗(yàn)中提供保護(hù)。Whitehead等人(1970，Am.J.Trop.Med.Hyg，19:94國(guó)102)探索確定4種登革病毒血清型中的2或3種相繼一價(jià)感染對(duì)異源性免疫的影響。因此，Gibbons首先感染登革病毒血清型1,2,3或4型。隨后二次感染另外一種不同的血清型，檢測(cè)到的病毒血癥不同，這主要取決于感染的順序，尤其是第一次感染的血清型。更具體地說，最初感染血清型2，3或4后感染血清型1，2或4后再次發(fā)生病毒血癥。Scherer等人(1972,Am.J.Epid，95:67-79)描述了相繼一價(jià)感染，包括首先感染四種登革病毒血清型中的一種，隨后第二次感染，或者甚至第三次感染同種或者不同種的血清型。提出的方案并沒有獲得防御異源性血清型感染的滿意的保護(hù)效果。Halstead等人(1973,Am.J.Trop.Med.Hyg,22:365-374)評(píng)價(jià)了在猴子的一種預(yù)防登革熱的相繼免疫接種方法，包括登革病毒血清型1到4中的不同的2種，3種或者4種血清型的一價(jià)感染。作者得出結(jié)論，通過相繼接種血清型1,2然后4，可以獲得防御血清型3感染的保護(hù)作用。并未描述和建議二價(jià)免疫接種。此外，考慮到相繼免疫接種費(fèi)時(shí)費(fèi)力和效果的隨機(jī)性，作者建議不釆用相繼免疫接種。Halstead等人(1973，Am.J.Trop.Med.Hyg,22:375-381)也發(fā)現(xiàn)兩種不同登革病毒血清型的二價(jià)免疫接種，在防御第三種登革病毒血清型的感染中，不起保護(hù)作用，或者僅僅起部分保護(hù)作用。本發(fā)明的目的是誘導(dǎo)防御4種登革病毒血清型的同源性保護(hù)。發(fā)明人證實(shí),當(dāng)相繼成對(duì)給藥(administr6ss6quentiellementdeuxpardeux)曰于,產(chǎn)生包括中和4種血清型的抗體的免疫反應(yīng)是可能的。發(fā)明人特別顯示了DEN-1，2二價(jià)免疫接種后2個(gè)月二價(jià)免疫接種DEN-3，4在所有免疫接種的猴子中誘導(dǎo)產(chǎn)生防御四種血清型的強(qiáng)烈反應(yīng)。這種方法產(chǎn)生的免疫反應(yīng)數(shù)量和質(zhì)量上更強(qiáng)(包含所有的血清型)。根據(jù)第一個(gè)主題，所以本發(fā)明涉及疫苗組合物，其包含(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，作為防御登革熱(dengue)的相繼給藥的疫苗組合物(composition)的組合(combinaison)，疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥后至少30天和最長(zhǎng)1年給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的一個(gè)實(shí)施方案，所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥后30天到3個(gè)月期間給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥后30天后給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒(i)以二價(jià)疫苗組合物形式給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒(ii)應(yīng)該以二價(jià)疫苗組合物形式給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒林(souche)和ChimeriVaxDEN-1組成的組。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒抹，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-l,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxTMDEN-3。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxTMDEN-4。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第一種和第二種血清型分別是CYDDENl和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4.根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量范圍均是從103到105DICC50。本發(fā)明的另一個(gè)主題是第三種血清型的疫苗登革病毒和第四種血清型疫苗登革病毒的用途，用于制造登革疫苗，以便向曾經(jīng)在至少30天到最多1年前使用過一劑量第一種血清型的革病毒疫苗和一劑量第二種血清型的登革病毒疫苗的患者給藥。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第三和第四種血清型以二價(jià)疫苗組合物的形式給藥。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第一和第二種血清型以二價(jià)疫苗組合物的形式給藥。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒林和ChimeriVaxDEN-1組成的組。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒林，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1，所述疫苗登革病毒血清型2是VChimeriVaxDEN-2。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxDEN-4。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第一種和第二種血清型分別是CYDDENl和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4.根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥后30天到3個(gè)月期間給藥。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥30天給藥。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)具體實(shí)施方案，疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量范圍均是從103到105DICC50。在說明書下文中將進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。定乂"登革病毒"或"DENs"是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(y/av/Wn'Jaew/(y)黃病毒屬CF/av/wVw力。RNA基因組包含5'端的I型帽結(jié)構(gòu)，但是3'端缺乏poly-A尾?；蚪M結(jié)構(gòu)包括以下組件5'端非編碼區(qū)域(NCR)，結(jié)構(gòu)蛋白(衣被膜蛋白(C)，前膜/膜蛋白(prM/M)，被膜蛋白(E)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)，以及3'端非編碼區(qū)域NCR?；蚪M病毒RNA與殼體蛋白結(jié)合形成核殼體。至于其他的黃病毒，DEN病毒基因組編碼翻譯為單個(gè)多聚蛋白的不間斷編碼區(qū)域。"VDV"或"細(xì)胞毒素登革疫苗(vaccindengueVero)"表示一種適用于Vero細(xì)胞的活性減毒登革病毒抹，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的體液免疫，包括在靈長(zhǎng)類和人類誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。"VDV-r是從野生型毒林DEN-l16007中獲得的毒林，其經(jīng)歷PDK細(xì)胞傳11代(DEN-l16007/PDK11),然后在Vero細(xì)胞上于32。C擴(kuò)增，將其RNA純化并轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中。與疫苗毒才朱DEN-l16007/PDK13(在PDK-原代狗腎細(xì)胞-細(xì)胞傳13代)相比，VDV-1毒抹有14種額外的突變。DEN-l16007/PDK13毒抹,也稱作"LAVl"，在瑪希隆大學(xué)的專利申請(qǐng)EP1159968中有詳細(xì)描述，并且保藏在CNCM(國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心)，編號(hào)為1-2480。VDV-1毒林的完整序列在序列SEDIDNO:l中給出。所述的毒才朱可以通過所述序列快速?gòu)?fù)制。VDV-1毒沖朱制備的方法和特征在以SanofiPasteur和疾病預(yù)防控制中心名義提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB2006/001313中描述過。"VDV-2"是獲自野生型毒林DEN-216681的毒林，將野生型毒林DEN-116007在PDK細(xì)胞傳50代(DEN-216681/PDK50),噬斑純化，提取純化RNA然后轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞。然后通過對(duì)Vero細(xì)胞的噬斑純化和擴(kuò)增獲得VDV-2毒林。與疫苗毒抹DEN-216681/PDK53(在PDK細(xì)胞傳53代)相比VDV-2毒林有IO種額外的突變，4種突變是不表達(dá)的。DEN-216681/PDK53毒抹也稱為"LVA2"，在瑪希隆大學(xué)的專利申請(qǐng)EP1159968中有描述，并且保藏于CNCM(微生物培養(yǎng)國(guó)家收藏)，編號(hào)為1-2481。VDV2毒抹的完整序列在序列SEDIDNO:2中給出。VDV-2毒抹可以通過所述的序列快速?gòu)?fù)制。VDV-2毒林制備的方法和特4正在以SanofiPasteur和疾病預(yù)防控制中心名義^是交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB2006/001513中描述過。術(shù)語(yǔ)"ChimeriVaxTM登革病毒"或"CYD，，是指嵌合體黃熱(YF)(f《vrejaune(YF)chim6re)病毒，它包含黃熱病毒的骨架，其中編碼前膜蛋白和被膜蛋白(prolined'e鵬loppe)的序列已經(jīng)被DEN病毒的序列(sequences)所替換。因此，用術(shù)語(yǔ)"CYD-1或CYDDEN-1"描述包含登革熱血清型1毒林(DEN-1)prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術(shù)語(yǔ)"CYD-2或CYDDEN-2"描述包含DEN-2毒林prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術(shù)語(yǔ)"CYD-3或CYDDEN-3"描述包含DEN-3毒抹prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術(shù)語(yǔ)"CYD-4或CYDDEN-4"描述包含DEN-4毒抹prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。這些ChimeriVax登革病毒的制備方法在國(guó)際專利申請(qǐng)WO98/37911和WO03/101397中有詳細(xì)描述，關(guān)于其制備方法的精確描述參考上述專利。實(shí)施例中描述的嵌合體是利用來(lái)自DEN1PU0359，DEN2PR159,DEN3PaH881和DEN4TVP980毒林的prM和E序列產(chǎn)生的。登革病毒的任何毒林都可以用在本發(fā)明中來(lái)構(gòu)建嵌合體。優(yōu)選地，嵌合體黃熱病毒包含減毒(att6nu6e)黃熱毒抹YF17D的骨架(TheilerM,andSmithHH(1937)JExp.Med65,p767畫786.)(YF17D/DEN-1,YF17D/DEN-2,YF17D/DEN-3,YF17D/DEN-4病毒)?？梢允褂玫腨F17D毒林的例子包括YF17D204(YF-Vax，SanofiPasteur,Swifwater,PA，USA;Stamaril,SanofiPasteur,Marcyl，Etoile,France;ARILVAX,Chiron，Speke,Liverpool,UK;FLAVIMUN,BernaBiotech,Bern,Switzerland;YF17D-204France(X15067，X15062);YF17D-204,234US(Riceetal.,1985，Science,229:726-733);或者其他的相關(guān)毒抹YF17DD(Genbanknum6rod,acc6sU17066)YF17D-213(Genbanknum6rod，acc6sU17067)以及Galler等描述的YF17DD(1998,Vaccines16(9/10):1024-1028)。任何其它用于人類的顯著減毒的黃熱病毒毒4朱都可以使用。"一價(jià)(monovalent)，，疫苗包含單一登革病毒血清型。"二價(jià)(bivalent)，，疫苗包含兩種不同的登革病毒血清型。"三價(jià)(trivalent)"疫苗包含三種不同的登革病毒血清型。"四價(jià)(t6travalent)"疫苗包含四種不同的登革病毒血清型。術(shù)語(yǔ)"患者"是指可能感染登革熱的個(gè)體(兒童或者成人)，尤其是感染高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，例如，登革熱流行區(qū)域的旅游者或者居住者。發(fā)明人已經(jīng)顯示四種血清型的兩個(gè)相繼二價(jià)給藥的方式可以獲得防御四種血清型的有效同源性保護(hù)。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法在預(yù)防登革熱的免疫接種策略中非常有價(jià)值。因此，發(fā)明人提出在患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生防御4種登革病毒血清型的中和抗體反應(yīng)的方法，包括對(duì)所述患者相繼給藥(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥后至少30天和最長(zhǎng)3個(gè)月給藥。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"疫苗登革病毒"是指能夠誘導(dǎo)特異性同源反應(yīng)的登革病毒的任何病毒形式。優(yōu)選地疫苗登革病毒能夠用在針對(duì)登革病毒感染的人類免疫接種項(xiàng)目中。所以，術(shù)語(yǔ)"疫苗登革病毒，，通常指一種滅活病毒(virusinactiv6)，減毒病毒(vimsatt6nu6),以及重組蛋白，例如登革病毒被膜蛋白。疫苗病毒滅活是指在許可的細(xì)胞中不能復(fù)制。疫苗病毒減毒是指在Huh-7,VERO細(xì)胞和/或C6/C36細(xì)胞中37°C或者39°C生長(zhǎng)后，在相同的培養(yǎng)條件下使用相同的滴度測(cè)定方法，測(cè)定這種病毒的滴度比野生型的最大滴度^氐至少十4咅(untelviruspr6senteuntitrequiestaumoins10foisinf6rieurautitremaximaldutypesauvage)。苗病毒被認(rèn)為是本發(fā)明中所述減毒的?？梢杂糜谌祟惖囊呙绮《居蟹贤斗攀袌?chǎng)的規(guī)則要求的正面益處/危險(xiǎn)系數(shù)。本發(fā)明中使用的疫苗登革病毒優(yōu)選是減毒的，這樣它不會(huì)在人類導(dǎo)致發(fā)病。這種類型的疫苗病毒產(chǎn)生有利的結(jié)果，在大多數(shù)接種的個(gè)體最多只導(dǎo)致適度的(即，中等到低，或者甚至不發(fā)生)不良反應(yīng)，而同時(shí)保留它誘導(dǎo)包含中和抗體的同源性反應(yīng)的能力?？梢杂糜诒景l(fā)明中的疫苗登革病毒的非限制性例子為，滅活登革病毒，減毒登革病毒，如減毒毒才朱VDV-1和VDV-2,例如，申請(qǐng)WO02/66621,WO00/57904,WO00/57908,WO00/507909,WO00/57910,WO02/0950075中描述的毒4朱，以及嵌合體。嵌合體病毒表現(xiàn)上述減毒病毒的特性。任何表達(dá)登革病毒被膜蛋白并且導(dǎo)致誘導(dǎo)包含中和血清型抗體免疫反應(yīng)的嵌合體病毒都可以用在本發(fā)明中，其中所述蛋白衍生自所述血清型。非限制性的實(shí)例為，例如，在W098/37911中所述的ChimeriVax登革病毒，還可以是，例如，在專利申請(qǐng)WO96/40933和WO01/60847中所述的登革病毒/登革病毒嵌合體，疫苗登革病毒血清型1，可以是，例如，疫苗毒抹VDV1或者ChimeriVaxDEN-1,尤其是YF17D/DEN-1病毒，或者其他的DEN-116007/PDK13毒抹。疫苗登革病毒血清型2,可以是，例如，疫苗毒抹VDV2或者ChimeriVaxTMDEN-2，尤其是YF17D/DEN-2病毒，或者其他的DEN-216681/PDK53病毒。疫苗登革病毒血清型3可以是ChimeriVaxDEN-3，尤其是YF17D/DEN-3病毒。疫苗登革病毒血清型4可以是ChimeriVaxTMDEN-4,尤其是YF17D/DEN-4病毒。也可以是"LAV4"或者"DEN畫41036/PDK48"毒林，例如，在PDK細(xì)胞傳代48次減毒的DEN-41036毒抹。這種毒林在瑪希隆大學(xué)的專利申請(qǐng)EP1159968中有描述，并且保藏在CNCM，編號(hào)為1-2483。每種ChimeriVaxTM單價(jià)疫苗登革病毒(血清型1,2,3和4)通過在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增各種血清型制備。更具體地，四種病毒分別在無(wú)血清介質(zhì)中黏附的Vero細(xì)胞上產(chǎn)生。病毒收集物經(jīng)過濾除去細(xì)胞碎片后，通過超濾和層析進(jìn)行沉淀并純化，以便除去宿主細(xì)胞DNA。加入穩(wěn)定劑后，將疫苗毒抹在使用前以冰凍或凍干形式儲(chǔ)藏，然后臨時(shí)進(jìn)行重構(gòu)。同樣的方法適用與四種嵌合體。通過在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增制備VDV1和VDV2毒林。收獲產(chǎn)生的病毒并且通過過濾除去細(xì)胞碎片。通過酶處理消化DNA。通過超濾除去雜質(zhì)。通過濃縮可以提高感染滴度。加入穩(wěn)定劑后，將疫苗毒株在使用前以冰凍或凍干形式儲(chǔ)藏，然后臨時(shí)進(jìn)行重構(gòu)。通過簡(jiǎn)單混合單價(jià)組合物得到多價(jià)組合物。根據(jù)本發(fā)明，四種血清型可以以任何順序給藥，前提是它們是相繼成對(duì)給藥，并且在30天到1年期間內(nèi)，例如30天，45天，60天，3個(gè)月，6個(gè)月，9個(gè)月以及1年，進(jìn)行觀察，有利地在30天到3個(gè)月期間，尤其是l個(gè)月到2個(gè)月期間，兩系列相繼服藥期間進(jìn)行觀察。所以，根據(jù)本發(fā)明的方法可以通過下面描述的實(shí)施方案加以實(shí)施(i)血清型1和2;((i)血清型1和3;((i)血清型1和4;((i)血清型2和3;((i)血清型2和4;((i)血清型3和4;(ii)血清型3和4;或者ii)血清型2和4;或者ii)血清型2和3;或者ii)血清型1和4;或者ii)血清型1和3;或者ii)血清型1和2;根據(jù)具體的實(shí)施方案，所以本發(fā)明覆蓋以下方案-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-3;(li)CYDDEN-2和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-3;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-2-(i)VDV-l和CYDDEN-2;CYDDEN-3和CYDDEN畫4-(i)VDV-l和CYDDEN畫3;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-3;(ii)VDV-1和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-2-(i)CYDDEN-1和YDV-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-3;(ii)VDV-2和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-4;(ii)VDV-2和CYDDEN陽(yáng)3-(i)VDV-2和CYDDEN-3;(ii)CYDDEN-l和CYDDEN-4-(i)VDV-2和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-l和VDV-2-(i)VDV-l和VDV-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-3;(ii)VDV-2和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-4;(ii)VDV-2和CYDDEN-3-(i)VDV-2和CYDDEN-3;(ii)VDV-l和CYDDEN-4-(i)VDV-2和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-3和-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和VDV-2。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"免疫病毒劑量"是指包含"免疫有效量"免疫病毒的組合物，例如，充分誘導(dǎo)產(chǎn)生同源性中和抗體反應(yīng)的病毒量，例如，可以通過以下例1中描述的血清中和實(shí)^^的方法證實(shí)。當(dāng)中和抗體滴度超高或者等于1:10時(shí)，就認(rèn)為血清中和抗體陽(yáng)性。免疫毒林?jǐn)?shù)量通常用病毒噬斑形成單位(PFU)或者50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5Q)，或者50%細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量(DICCsQ)表示。例如，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含10到106DICC50,尤其是從103到1(^DICC5Q的疫苗登革病毒血清型1，2,3,和4型一價(jià)或二價(jià)組合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物或用途中，疫苗登革病毒血清型1,2,3或4每種劑量?jī)?yōu)選在10到106010(:50的范圍內(nèi)，如10，101,102,103，104,105或106DICC50,尤其是在103到1()5DICC5o的范圍內(nèi)。免疫病毒可以使用相同或不同的劑量，其可以根據(jù)使用的疫苗病毒的特性以及獲得免疫反應(yīng)的強(qiáng)度調(diào)整。優(yōu)選地，同源性中和抗體反應(yīng)可以長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)，即，它可以在登革熱血清型(ii)給藥后至少6個(gè)月在血清中檢測(cè)到。在根據(jù)本發(fā)明的相繼給藥中，第三種和第四種血清型的疫苗登革病毒在第一種和第二種血清型疫苗登革病毒給藥后至少30天和最多12個(gè)月給藥。例如，在本發(fā)明中，第三種和第四種血清型疫苗登革病毒在第一種和第二種血清型疫苗登革病毒給藥后30天到1年之間給藥，例如30天，45天，60天，3個(gè)月，6個(gè)月，9個(gè)月或者1年，最好在30天到3個(gè)月，尤其是1個(gè)月到2個(gè)月。一劑量第一種血清型疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型疫苗登革病毒以兩個(gè)一價(jià)組合物的形式同時(shí)給藥或者以單一二價(jià)組合物形式同時(shí)給藥。類似的，一劑量第三種血清型疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型疫苗登革病毒同時(shí)給藥。例如，第三種血清型和第四種血清型以兩個(gè)一價(jià)組合物的形式同時(shí)給藥或者以單一二價(jià)組合物形式同時(shí)給藥。疫苗病毒以疫苗組合物的形式給藥，疫苗組合物可根據(jù)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備。通常，一般為低壓凍干形式的病毒，與藥用賦形劑混合，例如水或者磷酸緩沖鹽溶液，濕潤(rùn)劑或穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)"藥用賦形劑，，意指任何溶劑，分散介質(zhì)，填充劑等，它們?cè)谌祟惡蛣?dòng)物體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生類似過敏反應(yīng)等的不良反應(yīng)。根據(jù)選擇的藥物劑型、方法和服用方法選擇賦形劑。合適的賦形劑和藥物劑型的要求在"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy"中有描述，它是本領(lǐng)域參考書的代表。優(yōu)選地，疫苗組合物以注射劑形式制備，并且可以對(duì)應(yīng)液體溶劑，懸液和乳濁液。特別地，這種組合物包含水溶緩沖液，從而維持pH接近在6至9之間(環(huán)境溫度下用pH計(jì)測(cè)定)。盡管并非必須添加佐劑，然而組合物可以包括這樣的化合物，即疫苗毒林給藥同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生提高、刺激或加強(qiáng)細(xì)胞或體液(humorale)免疫反應(yīng)物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在疫苗領(lǐng)域常規(guī)使用的佐劑中選擇適合本發(fā)明的佐劑。方式給藥，例如胃腸外給藥(尤其是皮內(nèi)注射，皮下注射或者肌內(nèi)注射)。優(yōu)選地，疫苗組合物是可注射組合物，通過在三角肌部位皮下注射給藥。組合物的給藥體積取決于給藥途徑。對(duì)于皮下注射來(lái)說，體積一般是在0.1到l.Oml之間，優(yōu)選大約0.5ml。第一種和第二種血清型的給藥最佳時(shí)期，或優(yōu)選地血清型1到4的給藥最佳時(shí)期是接觸登革病毒之前的大約1到3個(gè)月。在兒童和成人給藥中，這種疫苗可以作為登革病毒感染預(yù)防性治療給藥。因此目標(biāo)人群包括登革病毒首次接種(即，之前未接種過)或者非首次接種的個(gè)體。還可以進(jìn)行疫苗登革病毒血清型1到4的加強(qiáng)給藥，例如，在第三種和第四種血清型給藥后的6月到IO年之間進(jìn)行加強(qiáng)，例如6個(gè)月，1年，3年，5年或10年。本發(fā)明還提供包含4種不同血清型的4種疫苗登革病毒的免疫接種試劑盒，其中每種血清型以疫苗劑量形式提供，或者其中至少2種，或者甚至4種血清型以二價(jià)組合物的形式提供。關(guān)于疫苗劑量或一價(jià)或二價(jià)組合物以及優(yōu)選實(shí)施方案的描述，參照與根據(jù)本發(fā)明的免疫方法相關(guān)的過往描述。通過以下實(shí)施例i兌明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:在猴子體內(nèi)相繼免疫接種在猴子模型中^^測(cè)病毒血癥和免疫原性。尤其是病毒血癥被確定為與人體病毒血癥和疾病嚴(yán)重性相關(guān)的因素之一，因此，構(gòu)成應(yīng)該考慮的一個(gè)重要參數(shù)。而對(duì)于免疫原性在評(píng)價(jià)保護(hù)作用的情況下是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。1.1材料與方法根據(jù)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的歐洲指令開展猴子實(shí)驗(yàn)。對(duì)來(lái)自毛利塔尼亞的短尾猴(獼猴屬)開展免疫接種。免疫接種之前隔離猴子6周。在猴子臂部皮下注射0.5ml疫苗組合物進(jìn)行免疫。使用氯氨酮(ImalgeneMerial)輕微麻醉后，從腹股溝的或隱靜脈穿刺取血。在第0天和28天，分別耳又血樣5ml，用來(lái)評(píng)價(jià)抗體反應(yīng)，同時(shí)，在第2天到第IO天期間，取血樣lml用來(lái)評(píng)估病毒血癥。在冰上取血并且存放在冰上直到血清分離。在4°C離心血液20分鐘，并且將收集的血清存;改在-80"C直到檢測(cè)。測(cè)量病毒血癥PCR)監(jiān)測(cè)免疫接種后病毒血癥。采用位于DEN1和DEN2毒林NS5基因的兩套引物和探針來(lái)分別量化VDV-1RNA和VDV-2RNA。使用位于YF病毒NS5基因的第三套引物和探針來(lái)量化CYDRNA。最后，采用位于E(DEN)/NS-1(YF)基因連接處的四套針對(duì)不同血清型的特異性引物和探針來(lái)量化YFNS5RNA陽(yáng)性的血清型(見表l)。每個(gè)RT-PCT的實(shí)驗(yàn)(essai)，包含7個(gè)質(zhì)粒，受T7啟動(dòng)子控制，該區(qū)域被轉(zhuǎn)錄到體外從而生成一系列的合成RNAs，它們每個(gè)RT-PCT實(shí)驗(yàn)中被包括進(jìn)去作為內(nèi)部參照。采用分光光度法測(cè)定這些合成RNAs，獲得的RNA的數(shù)量轉(zhuǎn)換成RNA拷貝數(shù)并且用GEQ(基因組當(dāng)量)表示。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用MachereyNagel"Nucleospin96virus"RNA提取試劑盒提取0.140ml猴血清，然后用0.140ml(0.090ml，然后0.05ml)去核糖核酸酶的水洗脫純化的RNA。為了避免反復(fù)凍融，應(yīng)該在RNA提取后立即對(duì)5|ul所述RNA產(chǎn)物進(jìn)行第一次定量。剩余的量?jī)龃嬖?7(TC。反應(yīng)混合物除了包含"QiagenQauntitect探針"RT-PCT定量試劑盒(Qiagen)的成分夕卜，還有每種引物lOpicomol,每種才笨4十4picomole以及5(ilRNA，總體積25pl。對(duì)于要檢測(cè)的RNAs，直接將5]ul的純化制品加到反應(yīng)混合物中，不需要進(jìn)行預(yù)先稀釋的步驟。合成RNAs按照1/10比例加到去核糖核酸酶水中稀釋，同時(shí)平行定量5|ul中含有大約10到106GEQ的7份稀釋液，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。在應(yīng)用生物系統(tǒng)ABIPrism700TM設(shè)備上開展定量反應(yīng)，采用以下程序50。C/30min,95°C/15min，然后95°C/15sec-60°C/60sec40個(gè)循環(huán)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中病毒RNA定量的范圍是從2.9到3.3log1()GEQ/ml(800到2000GEQ/ml;4到10GEQ/反應(yīng))，這與PCR的對(duì)象有關(guān)(標(biāo)準(zhǔn)偏差+/-0.3log10)。在本實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn)中確定感染滴度與病毒RNA定量之間的關(guān)系，通過分析0.140ml陰性猴血清樣本(DO)，已知該血清感染免疫接種病毒(CYD或VDV)的顆粒數(shù)量。準(zhǔn)備兩份所述對(duì)照血清稀釋液，分別在5|ul中包含接近1PFU和大約100PFU(分別是2.3和4.3log10PFU/ml)在下面表l中列出了使用的引物和探針，對(duì)每個(gè)試驗(yàn)，按照正義反義引物和探針順序列舉。表1序列YF-NS5sens5'GCACGGATGTAACAGACTGAAGA(23bases)YFNS5anti5'CCAGGCCGAACCTGTCAT(18bases)>YF-NS55'Fan>CGACTGTGTGGTGCGGCCCATC-Tamra(22bas@_CYD1-sens5'CATTGCW3TTGGCCTGOTAA(20b)CYD1-arrti!5'C丌TGGCAAGAGAGAGCTCAAGT(23b〉CYD1-■__5'FairvCC6ATCAAGGATGCGCCATGVTamra(21b)_CYD2-sens5'6TGGGAGTCGTGACGCTGTA(20b)CYD2-antl5'OTTGATGGCGCATCCTTGATC(21b)CYD2__5'Fan>TGGGAGTTATGGTGGGCGCCG-Tamra(21b)_CYD}~~sens'5'AAAACACTTCCATGTCATTTTCATG(25b)CYD3"anti:5'GOTGATGGCGCATCCTTGATC(21WCYD3~__5'FanrfTGCGATAGGAATTATCACACTCTA丁CTGGGAGOTamra(33b)CYD牟'sens5'CTTAGTA丌GTGGATTGGCACGAA(24b)CYManti:5'GCGCCAACTGTGAAACCTAGA(21b)CYD4~__5'-Fan>AGAAACACTTCAATGGCAATGACGTGCAT-Tamra(29b)VCW1-MS5sens5'TCGCAACAGCCTTAACAGC(13b)VDV1-NS5antl'5'ACTATCTCCCTCCCATCCTTC(21b)VDV1-NS5..5'Fan>TTCACACCACTTCCAOMGB/NFQ(16b)__VW2-NS5sens5'AATGACAGACACGACTCC。8b)VDV2-NS5a他5'CCCAAAACCTACTATCTTCAA.C(22b)VW2-NS55'FatThTGGAAGTCGGCACGTGA-MGB/NFQ(17b)中和抗體測(cè)量(血清中和實(shí)驗(yàn))(SN50)習(xí)慣上，使用PRNT50(PFU數(shù)量減少50%中和實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)測(cè)量登革病毒抗體。因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且消耗大量的材料，我們發(fā)明了SN50實(shí)驗(yàn)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)是基于DICC5。試驗(yàn)檢測(cè)的單位數(shù)量減少50%設(shè)計(jì)的。在96孔板上，每個(gè)孔中將0.120ml去補(bǔ)體血清加入到0.480ml稀釋液(ISCOVE4%胎牛血清)。通過將0.150ml血清加入到0.450ml稀釋液中制備6倍系列稀釋液。將2.7log10DICC50/ml的450ul病毒稀釋液加入每個(gè)孔，從而達(dá)到25DICCso/孔。將平板在37。C孵育1小時(shí)。然后，將每種稀釋液各100ul加到96孔板的6個(gè)孔中，這6個(gè)孔在實(shí)驗(yàn)開始前3天接種8000細(xì)胞/孔濃度的Vero細(xì)胞到含有4%胎牛血清的100ulISCOVE培養(yǎng)基中。在37。C,5%(:02存在條件下孵育6天后，用乙醇/丙酮(70/30)混合物在4。C條件下固定細(xì)胞15分鐘，用PBS洗3次，然后在37。C,50ul抗黃病毒單克隆抗體(mAb4G2)的1/2000稀5AO山d8￡aAOSAOads33dS釋液條件下孵育1小時(shí)。然后洗兩次，在37。C,50ul堿性磷酸酶共軛抗鼠IgG抗體的1/1000稀釋液條件下孵育1小時(shí)。加入50ul染色液BCIP/NBT后可以看到溶胞噬斑。采用下面的Karber公式計(jì)算中和抗體滴度log10SN50=d+f/N(X+N/2)，其中d代表導(dǎo)致100%中和的稀釋液(即6陰性復(fù)制，也就是不表現(xiàn)感染的復(fù)制)f代表loglO中的稀釋系數(shù)(例如1:4的稀釋系數(shù)，f=0.6)N代表復(fù)制/稀釋的數(shù)量(N=6)X代表不表現(xiàn)感染癥狀的孔的總數(shù)量，稀釋d例外病毒檢測(cè)的范圍是10SN50(即1.01og10SN50)用來(lái)中和的病毒毒抹是DEN116007,DEN216681,DEN316562或DEN41036毒林。為了對(duì)照，重新滴定最初的病毒稀釋液。SN50實(shí)驗(yàn)測(cè)量的中和滴度與傳統(tǒng)的PRNT50實(shí)驗(yàn)測(cè)量的中和滴度的耳關(guān)系是log10PRNT50=log10SN50+0.2通過計(jì)算線性表達(dá)的幾何平均值確定平均滴度(GMT);習(xí)慣上，滴度低于檢測(cè)閾值的樣本，按照閾值的一半計(jì)算。1.2相繼免疫接種的評(píng)價(jià)免疫接種年齡和體重相當(dāng)?shù)?組猴子，每組4只(見表2)。用23G1針在臂部皮下注射進(jìn)行免疫接種，CYDDEN1到4疫苗的各種血清型劑量為105DICC5。。VDV-1和VDV-2的劑量分別為3.961og。和4.84log10。表2:各組組成和免疫接種步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表3中給出了一次免疫接種(D28)和兩次免疫接種(D84)后得出的免疫原性結(jié)果。表4給出了病毒血癥結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>種VDV-1，2后接種CYD-3,4時(shí)觀察到同樣的反應(yīng)。畫值得注意的結(jié)果是CYD-3,4血清型對(duì)最初免疫接種后CYD-1,2誘導(dǎo)反應(yīng)的強(qiáng)烈刺激作用?？梢杂^察到同源性，但也有異源性的中和抗體的增高。抗-NS-黃熱反應(yīng)對(duì)抗-E反應(yīng)的正面影響可以解釋這種現(xiàn)象，沒有免疫顯性。具有交叉反應(yīng)的E表位可能也發(fā)揮作用。相反，四價(jià)加強(qiáng)免疫后未觀察到這種刺激影響，只是最初免疫接種(此處為3)誘導(dǎo)的顯性E反應(yīng)被加強(qiáng)。-關(guān)于CYD疫苗，CYD-4導(dǎo)致明顯的病毒血癥(表4)，并且沒有觀察到兩次相繼二價(jià)給藥和單次四價(jià)給藥之間的差別(組2和組3)。因此，預(yù)測(cè)兩次二價(jià)免疫接種和單次四價(jià)免疫接種的安全性沒有差別。進(jìn)一步觀察到根據(jù)本發(fā)明的免疫接種方案導(dǎo)致的病毒血癥程度更輕；參見，例如，組2和組3的比較。實(shí)施例2:間隔1個(gè)月對(duì)猴子進(jìn)行相繼免疫接種。比較接種CYD-1，2后接種CYD-3,4和接種CYD-2,3后接種CYD-1,4兩個(gè)方案與前面的實(shí)施例一樣，才企測(cè)猴子模型中的病毒血癥和免疫原性。在本實(shí)施例中，兩次免疫接種之間間隔1個(gè)月，而前一個(gè)實(shí)施例兩次免疫接種之間間隔2個(gè)月。第一次免疫接種使用對(duì)猴子免疫原性最低的兩種疫苗病毒(CYD-2,3)，然后接種兩種免疫顯性的疫苗病毒(CYD-1，4)。2.1材泮+和方法:同實(shí)施例l2.2評(píng)價(jià)間隔一個(gè)月的相繼免疫接種免疫接種年齡和體重相當(dāng)?shù)?組猴子，每組4只(見表5)。與實(shí)施例1類似，用23G1針在臂部皮下注射進(jìn)行免疫接種，CYDDEN1到4疫苗病毒的各種血清型劑量均為105DICC50。表5:各組組成和免疫接種步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表6中給出了一次免疫接種(D28)和兩次免疫接種后得到的免疫原性結(jié)果。病毒血癥結(jié)果與例1中給出的結(jié)果類似，顯示CYD4誘導(dǎo)較弱的病毒血癥并且不同組之間沒有顯著的差別。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>簡(jiǎn)要的說，這些結(jié)果補(bǔ)充了實(shí)施例1得出的結(jié)論，可以總結(jié)如下-根據(jù)本發(fā)明的給藥方案使得定性和定量地提高同源性中和抗體反應(yīng)成為可能，所述中和抗體反應(yīng)是通過四^介疫苗在1個(gè)月間隔期內(nèi)2次免疫接種獲得的。-二價(jià)免疫接種CYD-1，2后1個(gè)月免疫接種CYD-3，4(組2)在全部猴子中均誘導(dǎo)對(duì)抗4種血清型的高同源性反應(yīng)，血清型l和4呈顯性。-在本組中，對(duì)血清型l和2的加強(qiáng)效果在l個(gè)月后二次給藥情況下弱于實(shí)施例1中的2個(gè)月后的二次給藥。-當(dāng)首先接種免疫原性低的血清型(CYD-2,3),并用最強(qiáng)的血清型(CYD-1,4)加強(qiáng)接種時(shí)，獲得的反應(yīng)較平衡，血清型l和4呈低顯性(moindredominance)(組3)。這些結(jié)果證實(shí)了實(shí)施例1中得出的結(jié)論，表明兩次二價(jià)相繼免疫接種在所有動(dòng)物中均有效誘導(dǎo)對(duì)抗所有血清型的反應(yīng)，即使在初次免疫接種后僅僅1個(gè)月時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫也有效。權(quán)利要求1、一種疫苗組合物，其包含(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，作為防御登革熱的相繼給藥的疫苗組合物的組合，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥后至少30天和最多1年給藥。2、權(quán)利要求1所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥后30天到3個(gè)月期間給藥。3、權(quán)利要求1或2所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒(i)以二價(jià)疫苗組合物形式給藥。4、權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒(ii)以二價(jià)疫苗組合物形式給藥。5、權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒抹和ChimeriVaxDEN-1組成的組。6、權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。7、權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒林，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹.8、權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。9、權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。10、權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxTMDEN-4。11、權(quán)利要求1-6和8-IO任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中第一種和第二種血清型分別是CYDDEN1和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4。12、權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥后30天給藥。13、權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)所要保護(hù)的疫苗組合物，其中疫苗登革病毒血清型1,2，3和4的每一種的劑量范圍是103到105DICCs。。14、第三種血清型的疫苗登革病毒和第四種血清型疫苗登革病毒的用途，用于制造登革疫苗，以便向曾經(jīng)在至少30天到最多l(xiāng)年前使用過一劑量第一種血清型的革病毒疫苗和一劑量第二種血清型的登革病毒疫苗的患者給藥。15、權(quán)利要求14所要保護(hù)的用途，其中第三種和第四種血清型以二價(jià)疫苗組合物的形式給藥。16、權(quán)利要求14和15任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中第一種和第二種血清型以二價(jià)疫苗組合物的形式給藥。17、權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒抹和ChimeriVaxDEN-1組成的組。18、權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。19、權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒抹，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。20、權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。21、權(quán)利要求14-20任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。22、權(quán)利要求14-21任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxDEN-4。23、權(quán)利要求14-18和20-22任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中第一種和第二種血清型分別是CYDDEN1和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4。24、權(quán)利要求14-23任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，其中第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥后30天到3個(gè)月期間給藥。25、權(quán)利要求24所要保護(hù)的用途，其中第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥后30天后給藥。26、權(quán)利要求14-24任一項(xiàng)所要保護(hù)的用途，疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量范圍是103到105DICC5。。全文摘要本發(fā)明涉及在患者體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)四種登革病毒血清型的同源性保護(hù)的方法，包括對(duì)所述患者的相繼給藥(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥后至少30天和最長(zhǎng)1年給藥。文檔編號(hào)A61K39/12GK101489585SQ200780026376公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日發(fā)明者B·古伊,J·蘭,R·福拉特,V·巴班申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德有限公司