專利名稱：阿爾茨海默病進展的生物標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明總體上涉及組織樣品的體外分析檢測，更具體地涉及用于診斷、預(yù)后或者預(yù)防性/治療性治療癡呆，例如阿爾茨海默病的遺傳多態(tài)性的方面。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的疾病診斷和治療方法基于單獨的臨床數(shù)據(jù)，或者與診斷檢測聯(lián)合構(gòu)成。這樣的傳統(tǒng)實踐經(jīng)常導(dǎo)致對于所開的藥物治療處方的療效并非是最佳的治療選擇，或者導(dǎo)致針對個體受試者的副作用的可能性不能最小化的治療選擇。治療特異診斷學(xué)(又名治療診斷學(xué))是新興的醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，為診斷疾病、選擇正確的治療方案和監(jiān)控受試者的反應(yīng)提供有用的檢測。更確切地說，治療診斷學(xué)對于預(yù)測和評估個體受試者的藥物反應(yīng)是有用的，即個體化醫(yī)學(xué)。治療診斷檢測在選擇治療尤其可能從治療中獲益的受試者或在提供個體受試者的療效早期客觀指征方面也是有用的，從而可以改變治療而最大限度地減少延遲。

藥物遺傳學(xué)建立了個體患者的特定藥物反應(yīng)與遺傳譜之間的相互聯(lián)系，藥物遺傳學(xué)的進展是開發(fā)新的治療診斷方法的基礎(chǔ)。如此，本領(lǐng)域需要對患者間在基因序列和基因表達上的變化進行評估。遺傳譜的常見形式依賴于鑒定稱作單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)的DNA序列變異，其是導(dǎo)致患者之間對個體藥物反應(yīng)不同的一類遺傳突變。由此得出結(jié)論本領(lǐng)域需要對諸如SNP的遺傳突變進行鑒定和表征，其對于鑒定與藥物反應(yīng)、副作用或最佳劑量相關(guān)的受試者基因型是有用的。

癡呆是嚴重影響人們進行日常活動的能力的腦疾病。老年人中最常見的癡呆形式是阿爾茨海默病(AD)，其最初涉及控制思維、記憶和語言的大腦部分。據(jù)估計有450萬之多的美國人罹患AD。預(yù)期隨著人口老齡化，到2050年該數(shù)字將翻兩番。該病通常在60歲之后發(fā)病，隨著年齡的增長而風(fēng)險增加。盡管年輕人也可以患AD，但是不是很常見。大約百分之五的年齡為65至74的男人和女人患AD，并且那些年齡為85或者更老的人中的幾乎一半可能患有這種疾病。AD不是正常老化的一部分。AD的病因還不完全知道并且仍不能被治愈。對于處于AD疾病的早期和中期階段的人們，施用諸如他克林(鹽酸他克林)、多奈哌齊(安理申)、利凡斯的明(艾斯能)或者加蘭他敏(Razadyne，之前稱為Reminyl)的藥物可以暫時延緩AD癥狀的進展。

輕度認知損害(MCI)是正常老化的認知改變與由阿爾茨海默病引起的更嚴重問題之間的過渡階段。MCI即不同于AD也不同于正常的與年齡相關(guān)的記憶改變?；加蠱CI的人們具有進行性的記憶問題，但是他們不經(jīng)歷其它喪失，例如意識錯亂、注意力問題以及語言困難。然而，MCI可以發(fā)展為阿爾茨海默病。因此，本領(lǐng)域需要鑒定和表征用于鑒定與癡呆，例如阿爾茨海默病的發(fā)生和/或進展相關(guān)的受試者基因型的遺傳突變。


發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供新的遺傳突變(即“AD相關(guān)突變”)，其用作生物標記，鑒定與諸如阿爾茨海默病等癡呆的發(fā)生和/或進展相關(guān)聯(lián)的受試者的基因型。本發(fā)明提供諾瓦提斯的化合物------利凡斯的明(艾斯能)在制備藥物中的用途，該藥物用于以降低的毒性或者增加的效力治療給定患者群的阿爾茨海默病，其中患者群的選擇基于本發(fā)明至少一種基因突變的存在。

本發(fā)明還提供治療受試者阿爾茨海默病的方法。獲得受試者位于選自下述至少一種基因AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的遺傳基因座的基因型或者單元型，結(jié)果是該基因型和/或單元型是阿爾茨海默病對藥物反應(yīng)的傾向的指示。然后向受試者施用抗阿爾茨海默病療法，包括但不限于，例如他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏，或者與AD相關(guān)的突變調(diào)節(jié)劑。

本發(fā)明提供鑒定受試者罹患疾病的方法，本發(fā)明阿爾茨海默病相關(guān)突變是該疾病的預(yù)測。獲得受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的至少一種基因的遺傳基因座的基因型或者單元型，并評估該基因型或單元型以確定本發(fā)明突變的存在，以鑒定受試者具有罹患阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測的疾病的傾向。阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測的疾病可以是阿爾茨海默病。

本發(fā)明提供在開始治療前，通過探詢受試者位于至少一種基因的遺傳基因座的基因型和/或單元型而確定哪一個受試者應(yīng)該包含于治療用或者研究用試劑的研究中的方法，其中該至少一種基因選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11，并且然后(i)如果基因型是受試者患阿爾茨海默病的傾向的指示，則將該受試者包含于研究中；(ii)如果基因型不是受試者患阿爾茨海默病的傾向的指示，則將該受試者排除出研究；或者(iii)(i)和(ii)兩者。
[10]本發(fā)明提供確定患有疾病的受試者對治療的反應(yīng)性的方法，即通過獲得受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的至少一種基因的遺傳基因座的基因型或者單元型，并且然后評估基因型和/或單元型以確定本發(fā)明突變或者多態(tài)性的存在，其中突變或者多態(tài)性的存在是個體對疾病的治療響應(yīng)的指示，以鑒定受試者為對疾病的治療有響應(yīng)。
[11]本發(fā)明提供用于在治療前確定哪一個受試者當(dāng)使用化合物治療時將發(fā)展為中毒的方法，即通過獲得受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF1的至少一種基因的遺傳基因座的基因型或單元型(即“本發(fā)明的基因型或單元型”)，然后評估基因型和/或單元型以確定本發(fā)明的突變或者多態(tài)性的存在，其中突變或者多態(tài)性的存在是當(dāng)治療時受試者將發(fā)展為中毒的指示，以便鑒定該受試者為當(dāng)治療時將發(fā)展為中毒的受試者。
[12]本發(fā)明還提供檢測試劑盒，用于(a)確定針對正在使用治療用或者研究用試劑治療的個體何時應(yīng)該終止使用化合物；(b)確定哪一個個體將發(fā)展為中毒；(c)確定當(dāng)使用化合物治療時哪一個個體正發(fā)展為中毒；以及(d)確定當(dāng)使用化合物治療時哪一個個體將發(fā)展為中毒并且不應(yīng)包含于該化合物的研究中。該試劑盒包含容納于容器中適于與體液接觸的試劑以及用于解釋結(jié)果的說明書，該試劑用于檢測由具有包含本發(fā)明突變的序列的基因編碼的多核苷酸或者多肽。
[13]本發(fā)明提供監(jiān)測正在使用化合物治療的受試者中毒的進展或者發(fā)展的方法，即通過(a)提供來自受試者的第一檢測生物樣品；(b)提供來自受試者的第二檢測生物樣品，其在取樣時間上晚于第一檢測生物樣品；(c)將檢測生物樣品與試劑接觸，該試劑用于檢測由具有包含本發(fā)明突變的序列的基因編碼的多核苷酸或者多肽；(d)確定多肽或者多核苷酸在檢測生物樣品中的表達水平；以及(e)比較第一檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平與第二檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平，其中第二檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平相對于第一檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽水平的增加或者降低指示正在使用化合物治療的受試者中毒的進展或者發(fā)展。
[14]本發(fā)明提供用于在使用化合物治療期間或者之后有中毒風(fēng)險的受試者中確定何時應(yīng)該終止使用化合物進行治療的方法，即通過(a)提供檢測生物樣品和標準參考樣品；(b)使檢測生物樣品與試劑接觸，該試劑用于檢測由具有包含本發(fā)明突變的序列的基因編碼的多核苷酸或者多肽；(c)確定多肽或者多核苷酸在檢測生物樣品中的表達水平；以及(d)比較檢測生物樣品中的多核苷酸或者多肽的水平與標準參考樣品中的多核苷酸或者多肽的水平，其中檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平與標準參考生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平之間的相似性指示受試者中毒的發(fā)展，并確定該化合物應(yīng)該終止使用。
[15]本發(fā)明提供用于證實化合物作為治療醫(yī)學(xué)狀況的候選靶標的方法，該醫(yī)學(xué)狀況被預(yù)測為與阿爾茨海默病或者MCI相關(guān)，即通過(a)比較第一和第二群體之間的本發(fā)明每個基因型或者單元型的頻率，其中第一群體是具有醫(yī)學(xué)狀況的個體群，并且第二群體是缺乏醫(yī)學(xué)狀況的個體群；(b)對是否采用化合物治療醫(yī)學(xué)狀況作出決定；其中如果第一群體中的至少一種單元型存在的頻率在統(tǒng)計學(xué)的顯著水平上不同于第二群體中的頻率，那么則作出使用該化合物進行治療的決定，以及如果在第一群體和第二群體之間沒有發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計學(xué)的顯著水平上存在不同頻率的單元型，則作出不使用該化合物的決定。
[16]本發(fā)明也提供用于存儲和分析基因多態(tài)性數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)，具有(a)中央處理單元(CPU)；(b)通訊接口；(c)顯示裝置；(d)輸入裝置；和(e)含有多態(tài)性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，其中多態(tài)性數(shù)據(jù)包括本發(fā)明的單元型。

具體實施例方式 [17]輕度認知損害，或MCI影響認知的許多方面，并且可以分為兩個大概的亞型。一個亞型為遺忘性MCI，其顯著地影響記憶。另一個類型為非遺忘性MCI，其不影響記憶。其它功能，例如語言、注意力和立體視覺能力在任何一種類型中都可能受損。估計MCI確切的普遍性高達年齡超過65歲的非癡呆人群的百分之二十。但是，這些病例的大約三分之一具有與阿爾茨海默病相關(guān)的遺忘性變化。遺忘性(記憶相關(guān)的)MCI每年以10％-15％的速率轉(zhuǎn)化為阿爾茨海默病。
[18]本發(fā)明提供新的遺傳突變(即“AD相關(guān)的突變”)，其用于鑒定受試者與遺忘癥(例如阿爾茨海默病)的發(fā)生和/或進展相關(guān)的基因型。具體地，使用Haploview的病例對照檢測法在單一位點和推斷的單元型區(qū)段上使用Affymetrix 100K基因型分型平臺對來自InDDex(ENA713B IA07)臨床試驗的420名患者的樣品進行基因分型并進行整個基因組的相關(guān)性分析(Barrett等人，Bioinformatics 21263-265(2005))(大體上參見實施例1)。結(jié)果表型是從MCI向AD的轉(zhuǎn)化或者未轉(zhuǎn)化。
[19]本發(fā)明提供了25個AD相關(guān)突變(例如MUT-1至MUT-25)，其總結(jié)于下表1中。表1中的AD相關(guān)突變之前并未與AD相關(guān)聯(lián)，即便其中的一些處于與該疾病相關(guān)聯(lián)的通路中。本發(fā)明的AD相關(guān)突變用于診斷、預(yù)后或者治療性治療諸如阿爾茨海默病的癡呆。一方面，本發(fā)明的AD相關(guān)突變用作AD的診斷性/預(yù)測性標記。另一方面，本發(fā)明的AD相關(guān)突變用作AD預(yù)防或者治療中所使用試劑的靶標。



[20]應(yīng)理解，本發(fā)明的某些方面、模式、實施方式、改變和特征在下述內(nèi)容中作了不同程度的詳細描述，以提供對本發(fā)明的本質(zhì)理解。總體上講，這類公開提供了用于診斷和治療有需要的受試者的新的AD相關(guān)突變，包括SNP。因此，本發(fā)明的不同方面涉及編碼本發(fā)明AD相關(guān)突變的多核苷酸，編碼本發(fā)明AD相關(guān)突變多肽的表達載體，以及表達本發(fā)明AD相關(guān)突變多核苷酸和/或AD相關(guān)突變多肽的生物。本發(fā)明的不同方面還涉及診斷/治療診斷方法和試劑盒，其使用本發(fā)明的AD相關(guān)突變來鑒定易患病個體或根據(jù)藥物反應(yīng)、副作用或最優(yōu)藥物劑量對個體進行分類。其它方面，本發(fā)明提供了用于驗證化合物的方法和用于儲存及分析與本發(fā)明AD相關(guān)突變有關(guān)的數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)。因此，下面給出多種說明這些方面的具體實施方式
。
[21]定義下面給出了本說明書中使用的某些術(shù)語的定義。其它術(shù)語的定義可參見美國能源部科學(xué)辦公室主持的人類基因組計劃(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/glossary/)所提供的術(shù)語表。實踐本發(fā)明時，使用許多分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是眾所周知的并闡述于，例如Current Protocols inMolecular Biology，第I-III卷，Ausubel編著(1997)；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；DNA CloningAPractical Approach，第I和II卷，Glover D編著(1985)；OligonucleotideSynthesis，Gait編著(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames & Higgins編著(1985)；Transcription and Translation，Hames & Higgins編著(1984)；Animal Cell Culture，F(xiàn)reshney編著(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning；Methods in Enzymol.系列(Academic Press，Inc.，1984)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells，Miller & Calos編著(Cold Spring HarborLaboratory，NY，1987)；和Methods in Enzymology，第154和155卷，分別由Wu和Grossman，以及Wu等人編著。
[22]本文所使用的術(shù)語“等位基因”指在特定染色體位置(基因座)處特定形式的基因或DNA序列。
[23]本文所使用的術(shù)語“抗體”包括但并不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體及足以使抗體片段與蛋白質(zhì)結(jié)合的生物功能性抗體片段。
[24]本文所使用的術(shù)語“臨床反應(yīng)”指下列的任一種或全部反應(yīng)的定量測量，無反應(yīng)和不利反應(yīng)(即副作用)。
[25]本文所使用的術(shù)語“臨床試驗”指任何設(shè)計用于收集對特定治療的反應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)的研究，且包括但不限于I期、II期、III期臨床試驗。使用標準方法定義患者群并招納受試者。
[26]本文所使用的術(shù)語化合物的“有效量”是足以實現(xiàn)期望的治療和/或預(yù)防效果的量，例如，導(dǎo)致預(yù)防或減少與所治療疾病相關(guān)的癥狀的量，所治療疾病例如是與本發(fā)明鑒定的AD相關(guān)突變多核苷酸及突變多肽有關(guān)的疾病。施用于受試者的化合物的量要取決于疾病的類型和嚴重性以及個體的特征，如健康狀況、年齡、性別、體重和藥物耐受性。其還取決于疾病程度、嚴重性和類型。熟練技術(shù)人員將能夠根據(jù)這些和其它因素確定適合的劑量。通常，足以達到治療或預(yù)防效果的本發(fā)明化合物的有效量范圍為從每天每千克體重約0.000001mg至每天每千克體重約10000mg。優(yōu)選的劑量范圍為每天每千克體重約0.0001mg至每天每千克體重約100mg。本發(fā)明化合物也可以彼此組合施用，或與一種或多種其它治療化合物組合施用。
[27]本文所使用的術(shù)語“表達”包括但不限于下述一種或多種基因轉(zhuǎn)錄為前體mRNA；前體mRNA經(jīng)剪接和其它加工以產(chǎn)生成熟mRNA；mRNA穩(wěn)定性；成熟mRNA翻譯成蛋白質(zhì)(包括密碼子使用和tRNA的有效性)；和(若正確的表達和功能需要的話)翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其它修飾。
[28]本文所使用的術(shù)語“基因”指包含調(diào)控RNA產(chǎn)物生物合成的所有信息的DNA片段，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和其它調(diào)控表達的非翻譯區(qū)。
[29]本文所使用的術(shù)語“基因型”指個體同源染色體對基因座上的一或多個多態(tài)性位點處發(fā)現(xiàn)的核苷酸對的不定型5’-3’序列。在此使用的基因型包括全基因型和/或亞基因型。
[30]本文所使用的術(shù)語“基因座”指與基因或物理或表型特征對應(yīng)的染色體或DNA分子上的位置。
[31]本文所使用的術(shù)語“AD相關(guān)突變的調(diào)節(jié)劑”指與無AD相關(guān)突變的調(diào)節(jié)劑時AD相關(guān)突變多肽的表達水平或生物活性水平相比，改變(例如增加或降低)AD相關(guān)突變多肽的表達水平或生物活性水平的任何化合物。AD相關(guān)突變的調(diào)節(jié)劑可以是小分子、多肽、碳水化合物、脂類、核苷酸或其組合。AD相關(guān)突變的調(diào)節(jié)劑可以是有機化合物或無機化合物。
[32]本文所使用的術(shù)語“突變體”指由于突變造成的野生型的任何可遺傳變異，如單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)。在說明書通篇，術(shù)語“突變體”可與術(shù)語“標記”、“生物標記”、“靶標”互換使用。
[33]本文所使用的術(shù)語“醫(yī)學(xué)狀況”包括但不限于表現(xiàn)為需要治療的一種或多種身體和/或心理癥狀的任何醫(yī)學(xué)狀況或疾病，還包括過去和最近鑒定的疾病或其它紊亂。
[34]本文所使用的術(shù)語“核苷酸對”指見于個體兩拷貝染色體多態(tài)性位點上的核苷酸。
[35]本文所使用的術(shù)語“多態(tài)性位點”指在群體內(nèi)的基因座中在該處發(fā)現(xiàn)至少兩個可改變序列的位置，其中最頻繁出現(xiàn)的有不超過99％的頻率。
[36]本文所使用的術(shù)語“分型的”指當(dāng)適用于基因座中兩個或多個多態(tài)性位點的核苷酸對序列時，存在于基因座單拷貝上的那些多態(tài)性位點的核苷酸組合是已知的。
[37]本文所使用的術(shù)語“多態(tài)性”指個體中或者遺傳變異中DNA序列的差異。認為在超過1％的群體中發(fā)生的遺傳變異對于遺傳連鎖分析是有用的多態(tài)性。序列變體可以遠大于1％的頻率出現(xiàn)，如5％或10％或更大。同時，該術(shù)語還可用于指在個體多態(tài)性位點中觀察到的序列變異。多態(tài)性包括核苷酸取代、插入、缺失和微衛(wèi)星并且可能(但不必須)導(dǎo)致基因表達和蛋白質(zhì)功能上可檢測的差異。
[38]本文所使用的術(shù)語“多核苷酸”指任何RNA或DNA，其可以是修飾或非修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA、為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的RNA、包括DNA和RNA的雜交分子(可能是單鏈，更普遍為雙鏈，或者單鏈和雙鏈區(qū)的混合物)。另外，多核苷酸指包括RNA或DNA或同時有RNA或DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語多核苷酸還包括包含一或多個修飾堿基的DNA或RNA和為穩(wěn)定性或其它原因骨架經(jīng)修飾的DNA或RNA。
[39]本文所使用的術(shù)語“多肽”指包括由肽鍵或修飾的肽鍵(即肽鍵等構(gòu)物)使之互相連接的兩個或多個氨基酸的任意多肽。多肽既指短鏈也指長鏈，短鏈通常指肽、糖肽、寡肽，長鏈通常指蛋白質(zhì)。多肽可包含除了20個基因編碼氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通過如翻譯后加工的天然加工、或用本領(lǐng)域公知技術(shù)進行化學(xué)修飾的修飾氨基酸序列。這些修飾已在基礎(chǔ)教科書和更為詳盡的專題論文、大量研究文獻中詳細介紹。
[40]本文所使用的術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性(SNP)”指在基因組中單一位置上的核苷酸可變性，其中在人群中兩個可變堿基以可觀的頻率(即＞1％)發(fā)生。SNP可發(fā)生在基因內(nèi)或基因組的基因間區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明的SNP探針是與SNP及其側(cè)翼核酸序列互補的寡核苷酸。
[41]本文所使用的術(shù)語“受試者”優(yōu)選哺乳動物如人類，但也可以是動物，例如家養(yǎng)動物(如狗、貓等)，農(nóng)場動物(如牛、綿羊、豬、馬等)及實驗室動物(如獼猴、大鼠、小鼠、豚鼠等)。
[42]本文所使用的向受試者或患者施用試劑或藥物包括自體施用和由他人施用。還應(yīng)理解所述醫(yī)學(xué)狀況治療或預(yù)防的多種模式旨在意味著“實質(zhì)上的”，其包括了完全也包括并非完全的治療或預(yù)防，其中得到了一些生物或醫(yī)學(xué)相關(guān)的結(jié)果。
[43]預(yù)測性醫(yī)學(xué)。一方面，本發(fā)明涉及預(yù)測性醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中出于預(yù)后(預(yù)測)目的使用診斷檢測法、預(yù)后檢測法、藥物遺傳學(xué)和監(jiān)測臨床試驗，因而預(yù)防性地診斷和治療受試者。因此，本發(fā)明的一方面涉及用于確定來自樣品(例如血液、血清、細胞、組織)中的生物標記蛋白質(zhì)和/或核酸表達(例如MUT-1至MUT-25蛋白質(zhì)或者核酸)的診斷檢測法，因而確定受試者是否有可能從MCI轉(zhuǎn)化為AD。
[44]如在下文詳細描述的，本發(fā)明的另一個方面涉及監(jiān)測臨床試驗中試劑(例如藥物、化合物)對生物標記的表達或者活性的影響。
[45]檢測本發(fā)明生物標記蛋白質(zhì)或者基因在樣品中存在與否的示例性方法包括從檢測受試者獲得樣品，并將該樣品與能夠檢測該蛋白質(zhì)或者編碼該生物標記蛋白質(zhì)的核酸(例如mRNA、基因組DNA)的化合物或者試劑接觸，以便在該樣品中檢測出生物標記蛋白質(zhì)或者核酸的存在。用于檢測相應(yīng)于本發(fā)明生物標記基因或者蛋白質(zhì)的mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑是能夠雜交本發(fā)明mRNA或基因組DNA的經(jīng)標記的核酸探針。用于本發(fā)明診斷檢測中的合適的探針是本文公開的探針。
[46]用于檢測生物標記蛋白質(zhì)的優(yōu)選的試劑是能夠結(jié)合生物標記蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選具有可檢測標記的抗體。抗體可以是多克隆抗體，或者更優(yōu)選單克隆抗體?？梢允褂猛暾目贵w，或者其片段(例如Fab或F(ab′)2)。涉及探針或者抗體的術(shù)語“標記的”旨在包括通過偶聯(lián)(即物理連接)可檢測物質(zhì)于探針或者抗體上的探針或者抗體的直接標記，以及探針或者抗體的間接標記，即通過與另一個直接標記的試劑反應(yīng)而實現(xiàn)。間接標記的實例包括使用熒光標記的二抗檢測一抗，以及用生物素末端標記的DNA探針，以便其可由熒光標記的鏈霉抗生物素檢測。
[47]術(shù)語“樣品”旨在包括分離自受試者的組織、細胞和生物流體，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、細胞和流體。更確切地說，本發(fā)明的檢測方法可以用于體內(nèi)以及體外檢測樣品中的生物標記mRNA、蛋白質(zhì)或者基因組DNA。例如體外檢測生物標記mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。體外檢測生物標記蛋白質(zhì)的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光法。體外用于檢測生物標記基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，用于體內(nèi)檢測生物標記蛋白質(zhì)的技術(shù)包括將標記的抗生物標記抗體導(dǎo)入受試者。例如，可以使用放射性生物標記標記抗體，其在受試者體內(nèi)的存在和定位可以通過標準的成像技術(shù)進行檢測。
[48]一個實施方式中，樣品含有來自測試受試者的蛋白質(zhì)分子。作為選擇，樣品可以含有來自測試受試者的mRNA分子或者來自測試受試者的基因組DNA分子。優(yōu)選的樣品是通過常規(guī)方法從受試者分離的血清樣品。
[49]方法還包括從對照受試者獲得對照樣品(例如來自顯示無AD征兆的非癡呆受試者的樣品)，將對照樣品與能夠檢測生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA的化合物或者試劑接觸，以便在樣品中檢測出生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA的存在，以及比較對照樣品中生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA的存在和檢測樣品中生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在。
[50]本文公開的診斷方法還可以用于鑒定具有與異常生物標記表達或者活性(即具有本發(fā)明一種或者多種AD相關(guān)突變/基因)相關(guān)的疾病或者紊亂的患者或者有發(fā)展成上述病癥風(fēng)險的患者。本文使用的術(shù)語“異?！卑ㄆx野生型生物標記表達或者活性的生物標記的表達或者活性。異常表達或者活性包括增加的或者降低的表達或者活性，以及未遵循野生型發(fā)育的表達模式或者亞細胞的表達模式的表達或者活性。例如，異常的生物標記表達或者活性旨在包括其中在生物標記基因中的突變引起生物標記基因低表達或者過表達的情況，以及其中這樣的突變導(dǎo)致無功能生物標記蛋白質(zhì)或者以非野生型方式發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)(例如不與生物標記配體相互作用的蛋白質(zhì)，或者與非生物標記蛋白質(zhì)配體相互作用的蛋白質(zhì))的情形。
[51]另外，本文公開的預(yù)后檢測法可以用于確定受試者是否可以施用試劑(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或者其它藥物候選物)以降低癡呆，例如AD的發(fā)生或者進展的風(fēng)險。因此，本發(fā)明提供用于確定受試者是否可以使用試劑有效治療疾病的方法，該疾病與本發(fā)明的一種或者多種AD相關(guān)突變/基因的增加或降低的基因表達或者活性相關(guān)。
[52]監(jiān)測試劑(例如藥物)對基因表達或者活性的影響不僅可以應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選，而且可以用于臨床試驗。例如，如本文公開的篩選方法確定的試劑調(diào)節(jié)(即增加或者減少)生物標記基因表達、蛋白質(zhì)水平或者上調(diào)活性的效力可以通過檢測使用試劑治療期間分子指征以及分子指征的任何變化而在表現(xiàn)阿爾茨海默病或者MCI相關(guān)癥狀的受試者的臨床試驗中進行監(jiān)測。
[53]例如，但非限制，可以鑒定在細胞中通過使用調(diào)節(jié)基因活性的試劑(例如化合物、藥物或者小分子)治療而受到調(diào)節(jié)的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。臨床試驗中，分離細胞并且制備RNA并分析暗示與癡呆相關(guān)的基因的表達水平?；虮磉_的水平(例如基因表達譜)可以通過如本文公開的Northern印跡分析或者RT-PCR方法定量檢測，或者作為選擇，通過本文公開的方法之一測量蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量而定量檢測。這樣，基因表達譜可以用作指示細胞對試劑生理學(xué)反應(yīng)的分子指征。因此，可以在使用該試劑治療受試者之前和治療期間的多個時間點確定此反應(yīng)的狀態(tài)。
[54]優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供監(jiān)測使用試劑(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或者通過本文公開的篩選方法鑒定的其它藥物候選物)治療受試者的效力的方法，包括下述步驟(i)在施用試劑前獲得來自受試者的給藥前樣品；(ii)檢測給藥前樣品中基因或者基因組合，由該基因編碼的蛋白質(zhì)，mRNA或者基因組DNA的表達水平；(iii)從受試者獲得一個或者多個給藥后樣品；(iv)確定給藥后樣品中生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA的表達或者活性水平；(v)比較給藥前樣品中生物標記蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA和給藥后樣品中的基因或者基因組合、該基因編碼的蛋白質(zhì)、mRNA或者基因組DNA的表達或活性水平；(vi)因此更改對受試者的試劑的施用。例如，可以期望增加施用的試劑以將基因的表達或者活性降低到較低的水平，即增加試劑的效力以防止AD的發(fā)生或者進展。作為選擇，可以期望降低施用的試劑以將生物標記的表達或者活性降低到比檢測到的水平低的水平，即降低試劑的效力，例如以避免中毒。根據(jù)此實施方式，可以將基因表達或者活性用作試劑效力的指示物，即使是在缺少可觀察到的表型反應(yīng)的情況中。
[55]基因序列變異的鑒定和表在。由于其普遍和廣泛分布的特點，SNP有潛力成為定位人類疾病相關(guān)基因的重要工具。如參見Wang等人，Science2801077-1082(1998)。雖然任何一個變體可能作用甚微，但越來越清楚的是許多常見疾病的發(fā)展風(fēng)險和用于治療這些病況的藥物的代謝實質(zhì)上受潛在的基因組變異的影響。
[56]由于多態(tài)性的存在，將SNP稱為“等位基因的”SNP，物種的一些成員可以具有未突變序列(即原始等位基因)，而其它成員可具有突變序列(即變體或突變等位基因)。
[57]SNP與特定表型間的相關(guān)性并不必然地表示或需要該SNP是該表型的致因。相反，這種關(guān)聯(lián)可能僅僅歸因于SNP和那些實際造成給定表型的遺傳因子之間的基因組鄰近性，以致SNP和所述遺傳因子緊密連鎖。換句話說，SNP可能與“真正的”功能性變體連鎖不平衡(“LD”)。在位于基因組兩個不同位置上的等位基因的關(guān)聯(lián)比預(yù)期的高時，則存在LD(又名等位基因關(guān)聯(lián))。因此SNP由于其與引起特定表型的突變鄰近可以做為有價值的標記。
[58]在描述本發(fā)明多態(tài)性位點時，為了方便以基因的正義鏈作為參照。然而，正如熟練的技術(shù)人員所理解的，包含基因的核酸分子可能是互補的雙鏈分子，因而述及正義鏈上特定位點也指與之互補的反義鏈上的相應(yīng)位點。也就是說，可參照任一鏈上相同的多態(tài)性位點，同時可以將寡核苷酸設(shè)計為和含有多態(tài)性位點的靶片段處的任一鏈特異雜交。因此，本發(fā)明還包括與此處所述基因組變體的正義鏈互補的多核苷酸單鏈。
[59]SNP的鑒定和特征描述。很多不同技術(shù)可以用來鑒定和表征SNP，包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，變性高效液相色譜(DHPLC)進行的異源雙鏈體分析及直接DNA測序和計算機方法。Shi等人，Clin.Chem.47164-172(2001)。公共數(shù)據(jù)庫中有很多序列信息。
[60]目前最常用的SNP分型方法包括雜交，引物延伸和切割法。每種方法都必須和適當(dāng)?shù)臋z測系統(tǒng)連接。檢測技術(shù)包括熒光偏振(Chan等人，Genome Res.9492-499(1999))、焦磷酸鹽釋放的發(fā)光檢測(焦磷酸測序)(Ahmadiian等人，Anal.Biochem.280103-10(2000))、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的切割測試、DHPLC和質(zhì)譜分析(Shi，Clin.Chem.47164-172(2001)；美國專利No.6,300,076 Bl)。美國專利No.6,297,018和No.6,300,063公開了其它檢測和表征SNP的方法。
[61]多態(tài)性也可以用商品化產(chǎn)品來檢測，如INVADERTM技術(shù)(獲自Third Wave Technologies Inc.Madison，Wisconsin，USA)。這一檢測中，當(dāng)特定上游“侵入者”寡核苷酸和部分重疊的下游探針結(jié)合于互補DNA模板時，它們共同形成了特殊的結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)由裂解酶識別并在特定位點剪切，導(dǎo)致探針寡核苷酸5’側(cè)翼的釋放。這個片段繼而作為涉及包含在反應(yīng)混合物中的合成二級靶標和二級熒光標記信號探針的“侵入者”寡核苷酸。也見Ryan D等人，Molecular Diagnosis 4(2)135-144(1999)和Lyamichev V等人，Nature Biotechnology 17292-296(1999)，也參見美國專利No.5,846,717和6,001,567。
[62]也可用錯配檢測技術(shù)來確定多態(tài)性，其包括但不限于用核糖探針的RNA酶保護方法(Winter等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 827575(1985)；Meyers等人，Science 2301242(1985))和識別核酸錯配的蛋白質(zhì)，如E.coli mutS蛋白質(zhì)(Modrich P，Ann Rev Genet 25229-253(1991))。或者，變體等位基因可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等人，Genomics 5874-879(1989)；Humphries等人，出自Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，R.Elles編著，第321-340頁(1996))或變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell等人，Nucl Acids.Res.182699-2706(1990)；Sheffield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86232-236(1989))進行鑒定。聚合酶介導(dǎo)的引物延伸法也可用于鑒定多態(tài)性。幾種此類方法已經(jīng)在專利和科學(xué)文獻中描述，并包括“遺傳比特分析”方法(WO 92/15712)和連接酶/聚合酶介導(dǎo)的遺傳比特分析(美國專利No.5,679,524)。相關(guān)方法公開在WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676和美國專利No.5,302,509和5,945,283中。如美國專利No.5,605,798所述，含有多態(tài)性的延伸引物可通過質(zhì)譜檢測。另一種引物延伸方法是等位基因特異性PCR(Ruafio等人，Nucl.Acids.Res.178392(1989)；Ruafio等人，Nucl Acids.Res.196877-6882(1991)；WO 93/22456；Turki等人，J.Clin.Invest.951635-1641(1995))。另外，可通過用PCT專利申請WO 89/10414所述的等位基因特異性引物組同時擴增多個核酸區(qū)來研究多個多態(tài)性位點。
[63]寡核苷酸的單元型分型和基因型分型。本發(fā)明提供對個體基因進行單元型分型和/或基因型分型的方法和組合物。如本文所使用，術(shù)語“基因型”和“單元型”指分別包含核苷酸對或核苷酸的基因型和單元型，所述核苷酸對或核苷酸出現(xiàn)在一或多個此處描述的多態(tài)性位點處，并也可以任選地包括出現(xiàn)在基因上一或多個其它多態(tài)性位點的核苷酸對或核苷酸。其它多態(tài)性位點可能是現(xiàn)在已知曉的多態(tài)性位點或隨后將發(fā)現(xiàn)的位點。
[64]本發(fā)明的組合物包含寡核苷酸探針和引物，該寡核苷酸探針和引物設(shè)計為與一個或多個包含有或鄰近于多態(tài)性位點的靶區(qū)域特異雜交。本發(fā)明的寡核苷酸組合物在個體基因的基因型分型和/或單元型分型的方法中是有用的。用于在本文描述的多態(tài)性位點建立個體的基因型或單元型的方法和組合物可用于研究多態(tài)性在受蛋白質(zhì)表達和功能影響的疾病病因中的作用、研究靶向藥物的效力、預(yù)測個體對受蛋白質(zhì)表達和功能影響的疾病的易感性和預(yù)測個體對靶向基因產(chǎn)物的藥物的反應(yīng)性。
[65]本發(fā)明的基因型分型寡核苷酸可固定于或合成于如微芯片、珠、玻璃片等的固體表面上。參見例如，WO 98/20020和WO 98/20019。
[66]基因型分型寡核苷酸可與位于此處鑒定的多態(tài)性位點之一的下游一或多個核苷酸處的靶區(qū)域雜交。該寡核苷酸對檢測此處所述多態(tài)性之一的聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法是有用的，因此這種基因型分型寡核苷酸在這里也稱為“引物-延伸寡核苷酸”。
[67]本發(fā)明的直接基因型分型方法。本發(fā)明的基因型分型方法可包括從個體中分離包括目的基因或其片段的兩個拷貝的核酸混合物，并確定在這兩個拷貝中一或多個多態(tài)性位點上核苷酸對的特征。熟練的技術(shù)人員很容易理解，個體中基因的兩個“拷貝”可能是相同的等位基因，或者可能是不同的等位基因。優(yōu)選的具體實施方式
中，基因型分型方法包括鑒定每個多態(tài)性位點處核苷酸對的特征。通常，核酸混合物分離自從個體獲得的生物樣品，比如血樣或組織樣品。合適的組織樣品包括全血、精液、唾液、淚液、尿液、排泄物、汗液、口腔涂片、皮膚和毛發(fā)。
[68]本發(fā)明的直接單元型分型方法。本發(fā)明的單元型分型方法可包括從個體分離僅包含目的基因或其片段兩個拷貝之一的核酸分子，并確定在該拷貝中一或多個多態(tài)性位點處的核苷酸的特征。直接單元型分型方法包括，如CLASPER SystemTM技術(shù)(美國專利No.5,866,404)或等位基因特異性長程PCR(Michalotos-Beloin等人，Nucl.Acids.Res.244841-4843(1996)?？墒褂萌魏文軌蚍蛛x基因或片段的兩個拷貝的方法分離核酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易理解的，任何單個克隆將只提供個體中兩個基因拷貝之一的單元型信息。一個實施方式中，通過鑒定個體中存在基因的每個拷貝中一或多個多態(tài)性位點處分型的核苷酸序列來確定個體的單元型對。優(yōu)選實施方式中，單元型分型方法包括鑒定基因每個拷貝中每個多態(tài)性位點處分型的核苷酸序列。
[69]在基因型分型和單元型分型方法中，可通過直接從基因或其片段的一或兩個拷貝擴增包含有多態(tài)性位點的靶區(qū)域，并通過常規(guī)手段對擴增區(qū)域測序來確定核苷酸(或核苷酸對)在多態(tài)性位點處的特征。個體基因的基因型或單元型也可通過用含有一個或兩個基因拷貝的核酸樣品與核酸陣列或子陣列雜交來確定，例如公開的專利申請WO 95/11995所述。
[70]使用與靶多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性位點的間接基因型分型方法。另外，出現(xiàn)在本發(fā)明任何多態(tài)性位點的等位基因的特征可通過對與那些目的位點處于連鎖不平衡的其它多態(tài)性位點進行基因型分型而間接地鑒定。如上所述，如果在一個位點處存在的特異變體暗示在第二個位點處另一變體的存在，那么將這兩個位點稱為是連鎖不平衡的。(Stevens JC，Mol.Diag.4309-317(1999))。與本發(fā)明多態(tài)性位點處于連鎖不平衡的多態(tài)性位點可位于同一基因區(qū)中或其它的基因組區(qū)中。
[71]靶基因區(qū)的擴增?？墒褂萌魏喂押塑账?定向擴增方法，包括但不限于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)(美國專利No.4,965,188)、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)(Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189-193(1991)；公開的PCT專利申請WO 90/01069)，和寡核苷酸連接試驗(OLA)(Landegren等人，Science 2411077-1080(1988))擴增靶基因區(qū)。在這些方法中用作引物或探針的寡核苷酸應(yīng)該與包含或鄰近于多態(tài)性位點的核酸區(qū)特異性雜交。通常，寡核苷酸長度介于10-35個核苷酸，優(yōu)選地介于15-30個，最優(yōu)選寡核苷酸長度介于20-25個核苷酸。寡核苷酸的精確長度將取決于熟練的技術(shù)人員通常考慮和使用的許多因素。
[72]其它已知的核酸擴增方法可用來擴增靶區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增體系(美國專利No.5,130,238；EP 329,822；美國專利No.5,169,766；公開的PCT專利申請WO 89/06700)和等溫法(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.89392-396(1992))。
[73]等位基因特異性寡核苷酸與靶基因的雜交。靶區(qū)域中的多態(tài)性可在擴增前或后用本領(lǐng)域已知的幾種基于雜交的方法之一來檢測。通常利用等位基因特異的寡核苷酸進行此類方法。等位基因特異的寡核苷酸可用作不同的標記探針對，其中該探針對的一個成員顯示出完全匹配于靶序列的一個變體，而另外一個成員顯示出完全匹配于不同變體。一些實施方式中，可使用一套等位基因-特異的寡核苷酸或寡核苷酸對一次檢測一個以上的多態(tài)性位點。優(yōu)選地，當(dāng)與每個待檢測的多態(tài)性位點雜交時，該套的成員互相之間的溶解溫度在5℃內(nèi)，更優(yōu)選地在2℃內(nèi)。
[74]可通過兩者都在溶液中進行等位基因特異的寡核苷酸與靶多核苷酸雜交，或也可在寡核苷酸或靶多核苷酸以共價或非共價的方式結(jié)合于固相支持物而進行該雜交。例如，通過抗體-抗原相互作用、poly-L-Lys、鏈霉親和素或親和素-生物素、鹽橋、疏水作用、化學(xué)連接、UV交聯(lián)、烘烤等可介導(dǎo)附著。等位基因特異寡核苷酸可直接在固相支持物上合成或在合成后附著于固相支持物。適合用于本發(fā)明檢測方法的固相支持物包括由硅、玻璃、塑料、紙等制成的基質(zhì)，其可塑形成例如孔(如96孔板)、玻片、薄片、膜、纖維、芯片、盤和珠?？商幚?、涂覆、或衍生固相支持物以促進等位基因特異的寡核苷酸或靶核酸的固定。
[75]鑒定群體的基因型和單元型并將其與性狀相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供鑒定人群基因型或單元型的頻率的方法。該方法包括鑒定群體中每個成員存在的基因的基因型或單元型，其中所述基因型或單元型包括該基因中一個或多個遺傳多態(tài)性位點處檢測到的核苷酸對或核苷酸，并計算群體中發(fā)現(xiàn)的基因型或單元型的頻率。該群體可以是參照群體，家族群體，同性群體，群體組，或性狀群體(如展示出目的性狀如醫(yī)學(xué)狀況或?qū)χ委熡蟹磻?yīng)的個體群組)。
[76]本發(fā)明的另一方面，將參照群體中發(fā)現(xiàn)的基因型和/或單元型的頻率數(shù)據(jù)用于鑒定性狀和基因型或單元型之間關(guān)聯(lián)性的方法中。該性狀可以是任何可檢測的表型，包括但不限于對疾病的易感性或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。該方法包括在參照群體中獲得目的基因型或單元型的頻率數(shù)據(jù)，并將該數(shù)據(jù)與展現(xiàn)出該性狀的群體的基因型或單元型頻率數(shù)據(jù)進行比較。可使用上述方法之一通過對群體中每一個體進行基因型分型或單元型分型而獲得參照和性狀群體之一或兩者的頻率數(shù)據(jù)。性狀群體的單元型可直接地或者可選地通過如上所述的預(yù)測基因型或單元型的方法而確定。
[77]通過訪問之前確定的書面或電子形式的頻率數(shù)據(jù)獲得參照和/或性狀群體的頻率數(shù)據(jù)。例如，該頻率數(shù)據(jù)可存在于計算機可及的數(shù)據(jù)庫中。一旦獲取了頻率數(shù)據(jù)，就可以比較參照和性狀群體中的目的基因型或單元型的頻率。
[78]當(dāng)分析多態(tài)性時，可進行計算來校正可能偶然發(fā)現(xiàn)的顯著相關(guān)性。對于用于本發(fā)明的統(tǒng)計方法，參見Statistical Methods in Biology，第三版，Bailey NTJ，(Cambridge Univ.Press，1997)；Waterman MS，Introduction to Computational Biology(CRC Press，2000)和Bioinformatics，Baxevanis AD & Ouellette BFF編著(John Wiley & Sons，Inc.，2001)。
[79]另一個實施方式中，檢查不同組別的單元型頻率數(shù)據(jù)以確定它們是否與哈迪-溫伯格平衡一致(D.L.Hartl等，Principles of PopulationGenomics，第三版(Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997)。
[80]另一個實施方式中，使用帶有Bonferroni校正的標準ANOVA檢測或多次模擬基因型表型相關(guān)性并計算顯著性數(shù)值的bootstrap方法進行統(tǒng)計分析。ANOVA用于檢測關(guān)于反應(yīng)變量是否由可以被測量的一個或多個性狀或變量所造成或與之關(guān)聯(lián)的假說。LD Fisher和G vanBelle，BiostatisticsA Methodology for the Health Sciences，第10章(Wiley-lnterscience，New York，1993)。
[81]在預(yù)測單元型對的一個實施方式中，分析包含如下設(shè)定步驟第一，將可能的單元型對中的每一個與參照群中的單元型對比較。通常，在參照群中只有一個單元型對與可能的單元型對匹配，并且將該單元型對分配給該個體。偶爾地，對于個體，僅有一個表現(xiàn)在參照單元型對中的單元型與個體可能的單元型對一致，而這種情況下，將包含這一已知單元型和從可能的單元型對中減去已知單元型得到的新單元型的單元型對分配給個體。
[82]另一個實施方式中，與目的基因型或單元型處于連鎖不平衡的、可檢測到的基因型或單元型可用作替代標記。當(dāng)給定基因的特定基因型或單元型在也顯示潛在代替標記基因型的群體中的頻率比在參照群體中的頻率高時，則表明該特定基因型或者單元型與另一基因型處于連鎖不平衡。如果這種頻率是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，那么該標記基因型是該基因型或單元型的預(yù)測，并且可以用作替代標記。
[83]另一發(fā)現(xiàn)單元型內(nèi)容與臨床反應(yīng)之間相關(guān)性的方法使用基于錯誤-最小化的最優(yōu)化算法(其中之一是遺傳算法)的預(yù)測模型。參見RJudson，“Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry”出自Reviewsin Computational Chemistry，第十章，KB Lipkowitz & DB Boyd編著(VCHPublishers，New York，1997)第1-73頁。模擬退火(Press等人，NumericalRecipes in CThe Art of Scientific Computing，第十章(CambridgeUniversity Press，Cambridge，1992)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(E Rich & K Knight，Artificial Intelligenc，第二版，第十章(McGraw-Hill，New York，1991)、標準梯度下降法(Press等人，見上文第十章)，也可以使用其它整體或局部優(yōu)化方法(見Judson的討論，見上文)。
[84]將受試者基因型或單元型與治療應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選實施方式中，性狀為疾病的易感性、疾病嚴重性、疾病階段或藥物反應(yīng)。這些方法適用于開發(fā)用于所有藥物遺傳學(xué)(其中基因型和治療結(jié)果間有潛在相關(guān)性)應(yīng)用的診斷檢測、治療性治療，包括功效測定、藥物動力學(xué)測定和副作用測定。
[85]另一優(yōu)選實施方式中，目的性狀是患者表現(xiàn)出的對一些治療性治療的臨床反應(yīng)，如，對藥物靶向的反應(yīng)或?qū)︶t(yī)學(xué)狀況治療性治療的反應(yīng)。
[86]為推導(dǎo)出治療的臨床反應(yīng)與基因型或單元型之間的相關(guān)性，從接受治療的個體群(即下文中的“臨床群”)所表現(xiàn)的臨床反應(yīng)中獲得基因型或單元型的數(shù)據(jù)。這一臨床數(shù)據(jù)可通過分析已經(jīng)在進行的臨床試驗的結(jié)果和/或通過設(shè)計并進行一或多種新臨床試驗而獲得。
[87]包括在臨床群中的個體通常按存在的目的醫(yī)學(xué)狀況而分級。這種潛在患者的分級可以使用標準的體檢或者一項或多項實驗室測試來進行。或者，當(dāng)單元型對與疾病易感性或嚴重性之間有強相關(guān)時，可以使用單元型分型進行患者的分級。
[88]將目的治療性治療施用于試驗群體中的每個個體，并且使用一或多種預(yù)定的標準測定每個個體對治療的反應(yīng)。預(yù)期在很多情況下，試驗群體將表現(xiàn)出一系列的反應(yīng)，且調(diào)查者將選擇由多種反應(yīng)組成的應(yīng)答組的數(shù)目(如低、中、高)。另外，在施用治療之前或之后，對試驗群體中每個個體的基因進行基因型分型和/或單元型分型。
[89l然后分析這些結(jié)果以確定多態(tài)性組間臨床反應(yīng)中任何觀察到的變異是否是統(tǒng)計學(xué)上顯著的?？梢杂玫降慕y(tǒng)計分析方法描述在L.D.Fisher& G.vanBelle，Biostatistics A Methodology for the Health Sciences(Wiley-lnterscience，New York，1993)。這個分析也包括關(guān)于基因中的哪些多態(tài)性位點對表型的差異貢獻最為顯著的回歸計算。
[90]在獲得了臨床和多態(tài)性數(shù)據(jù)后，創(chuàng)建個體反應(yīng)與基因型或單元型內(nèi)容之間的相關(guān)性。可通過許多方式產(chǎn)生相關(guān)性。一種方法中，個體根據(jù)其基因表型或單元型(或單元型對)而分組(也指作為多態(tài)性組)，然后計算出每個多態(tài)性組中的成員所表現(xiàn)出的臨床反應(yīng)的平均值和標準偏差。
[91]從上面描述的分析中，預(yù)測臨床反應(yīng)作為基因型或單元型內(nèi)容的函數(shù)的熟練技術(shù)人員可容易地建立數(shù)學(xué)模型。對臨床反應(yīng)和基因的基因型或單元型(或單元型對)之間的關(guān)聯(lián)性的鑒定可作為設(shè)計診斷方法的基礎(chǔ)，從而確定能或不能對治療產(chǎn)生應(yīng)答，或者將以較低水平應(yīng)答從而可能需要更多治療(即較大劑量的藥物)的那些個體。診斷方法可采用多種方式中的一種如，直接DNA測試(即對基因中一或多個多態(tài)性位點的基因型分型或單元型分型)、血清學(xué)檢驗或者體檢測定。唯一的條件是在診斷檢測結(jié)果與潛在基因型或單元型之間有良好的相關(guān)性。一個優(yōu)選實施方式中，這一診斷方法使用上述預(yù)測性的單元型分型方法。
[92]將受試者歸屬于基因型組。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，進行此歸屬決定將包括一定程度的不確定性。因此，將對照組水平的標準偏差用于做出概率確定并且本發(fā)明的方法可應(yīng)用于很大范圍基于概率的基因型組決定。因此，例如但不限于在一個實施方式中，如果測量到的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的2.5標準偏差之內(nèi)，那么該個體可歸屬于該基因型組。另一個實施方式中，如果測量到的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的2.0標準偏差之內(nèi)，那么該個體可以歸屬于該基因型組。又一個實施方式中，如果測量到的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的1.5標準偏差之內(nèi)，那么該個體可以歸屬于該基因型組。再一個實施方式中，如果測量到的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的1.0或更低標準偏差之內(nèi)，那么該個體可以歸屬于該基因型組。
[93]因此該方法允許以不同程度的概率確定應(yīng)將特定受試者歸入哪個組，而此類基因型群組的歸屬隨之能夠確定應(yīng)將該個體歸入何種風(fēng)險范疇。
[94]臨床反應(yīng)與基因型或單倍型間的相關(guān)性。為了推導(dǎo)治療的臨床反應(yīng)以及基因型或單元型之間的相關(guān)性，需要獲得由接受治療的個體群(下文中稱作“臨床群”)表現(xiàn)出的臨床反應(yīng)數(shù)據(jù)?？赏ㄟ^分析已經(jīng)進行的臨床試驗的結(jié)果獲得該臨床數(shù)據(jù)和/或可通過設(shè)計并進行一或多種新臨床試驗獲得臨床數(shù)據(jù)。
[95]不同基因型或者單元型組中如此測定的基因表達產(chǎn)物的標準對照水平將隨之與給定患者基因表達產(chǎn)物的測定水平進行比較。該基因表達產(chǎn)物可以是與特定基因型組相關(guān)的特征mRNA或該基因型或者單元型組的多肽基因表達產(chǎn)物。隨后將根據(jù)測定水平與給定組的對照水平之間的相似程度將患者分類或歸屬于特定基因型組或單元型組。
[96]用于存儲或顯示多態(tài)性數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)。本發(fā)明還提供用于存儲和顯示測定的基因多態(tài)性數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)。該計算機系統(tǒng)包括計算機處理單元、顯示器和含有多態(tài)性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。多態(tài)性數(shù)據(jù)包括在參照群中對給定基因所鑒定的多態(tài)性、基因型和單元型。優(yōu)選實施方式中，該計算機系統(tǒng)能夠產(chǎn)生示出根據(jù)其進化關(guān)系組織的單元型的顯示。計算機可執(zhí)行任何或所有實踐本發(fā)明方法所涉及的分析和數(shù)學(xué)運算。此外，計算機可執(zhí)行產(chǎn)生顯示在顯示器上的視圖(或影像)的程序，使用者借此可以互動觀看并分析大量與基因及其基因組變異相關(guān)的信息，包括染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、以及基因家族、基因表達數(shù)據(jù)、多態(tài)性數(shù)據(jù)、遺傳序列數(shù)據(jù)和臨床群體數(shù)據(jù)(例如一個或多個群體的種族地理起源、臨床反應(yīng)、基因型和單元型的數(shù)據(jù))。本文所述多態(tài)性數(shù)據(jù)可作為相關(guān)數(shù)據(jù)庫的一部分而存儲(例如Oracle數(shù)據(jù)庫的一個進程或一組ASCII靜態(tài)文檔)。這些多態(tài)性數(shù)據(jù)可存儲在計算機硬盤上或可例如存儲在CD-ROM上或在一或多個計算機可讀取的其它存儲裝置上。例如，數(shù)據(jù)可存儲在通過網(wǎng)絡(luò)與計算機通訊的一或多個數(shù)據(jù)庫中。
[97]基于核酸的診斷。本發(fā)明提供用于根據(jù)受試者的遺傳變異類型將其分類的SNP探針。本發(fā)明的SNP探針是寡核苷酸，其在傳統(tǒng)等位基因識別檢測中辨別SNP。某些優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明這一方面的寡核苷酸與SNP的一個等位基因及其側(cè)翼核酸序列互補，但與該SNP的任何其它等位基因及其側(cè)翼核酸序列不互補。本發(fā)明這一實施方式的寡核苷酸可以以多種方式在SNP之間進行辨別區(qū)分。例如，在嚴謹雜交條件下，合適長度的寡核苷酸將與一個SNP雜交而不與任何其它的SNP雜交?？墒褂梅派湫詷擞浕驘晒夥肿訕撕瀬順擞浌押塑账??；蛘?，合適長度的寡核苷酸能用作PCR引物，其中3’末端的核苷酸與含有SNP的一個等位基因而非任何其它等位基因互補。在此實施方式中，PCR擴增的有或無決定了該SNP的單元型。
[98]本發(fā)明的基因組和cDNA片段包括至少一個本文鑒定的多態(tài)性位點，長度至少為10個核苷酸，且范圍可長至全長基因。優(yōu)選地，本發(fā)明片段的長度為100至3000個核苷酸，且更優(yōu)選長度為200至2000個核苷酸，并最優(yōu)選長度為500至1000個核苷酸。
[99]本發(fā)明的試劑盒。本發(fā)明提供了用于對個體基因進行單元型分型和/或基因型分型的核酸和多肽檢測試劑盒。該試劑盒出于對個體分類的目的而用于對個體進行分類。特別地，本發(fā)明包括檢測生物樣品中相應(yīng)于本發(fā)明標記的多肽或核酸的存在的試劑盒，該生物樣品例如是任何體液，包括但不限于血清、血漿、淋巴、囊液、尿液、大便、腦脊髓液、腹水或血液，還包括身體組織的活檢樣品。例如，試劑盒可以包括能夠檢測生物樣品中相應(yīng)于本發(fā)明標記的多肽或編碼多肽的mRNA的標記的化合物或試劑，以及用于測定樣品中多肽或mRNA量的工具，例如與多肽結(jié)合的抗體，或與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合的寡核苷酸探針。試劑盒還可以包括用于解釋使用該試劑盒所獲得的結(jié)果的說明書。
[100]另一個實施方式中，本發(fā)明提供包括至少兩種包裝在單獨容器中的基因型分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可含有其它組分，例如包裝在單獨容器中的雜交緩沖液(其中寡核苷酸用作探針)。或者，當(dāng)寡核苷酸將用于擴增靶區(qū)域時，試劑盒可含有包裝在單獨容器中的聚合酶以及優(yōu)化的用于該聚合酶介導(dǎo)的引物延伸的反應(yīng)緩沖液，例如在PCR的情況中。優(yōu)選的實施方式中，該試劑盒可還包括DNA樣品收集工具。
[101]對于基于抗體的試劑盒，該試劑盒可以包括，例如(1)第一抗體，例如附著在固相支持物上，其結(jié)合對應(yīng)于本發(fā)明標記的多肽；和任選地，(2)不同的第二抗體，其與該多肽或第一抗體結(jié)合且綴合有可檢測標記。
[102]對于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可以包括，例如(1)寡核苷酸，例如帶有可檢測標記的寡核苷酸，其與本發(fā)明標記所對應(yīng)的多肽的編碼核酸序列雜交；或(2)用于擴增對應(yīng)于本發(fā)明標記的核酸分子的引物對。
[103]試劑盒也可以包括，例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包括用于檢測可檢測標記的必需組分，例如酶或底物。該試劑盒也可以含有一個對照樣品或一系列對照樣品，其能夠進行測定并與檢測樣品相比較。試劑盒中的每個組分可以封閉在單個容器中且所有多個容器可以和用于解釋使用該試劑盒進行檢測的結(jié)果的說明書一起放在單個包裝內(nèi)。
[104]本發(fā)明的核酸序列。一方面，本發(fā)明包括一或多個分離的多核苷酸。本發(fā)明還包括其等位變體，也就是該分離多核苷酸的天然發(fā)生的可變形式，其編碼與該多核苷酸所編碼的那些多肽相同、同源或相關(guān)的突變多肽。或者，非天然發(fā)生的變體可由本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)或直接合成技術(shù)生產(chǎn)。
[105]因此，能夠在低嚴謹性下與編碼本發(fā)明突變多肽的任何核酸序列雜交的核酸序列也認為屬于本發(fā)明的范圍。標準分子生物克隆教科書中充分表征了標準嚴謹性條件。參見例如Molecular Cloning A LaboratoryManual第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，& Maniatis編著(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)；DNA Cloning，第一卷和第二卷，D.N.Glover編著(1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait編著(1984)；NucleicAcid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins編著(1984)。
[106]重組表達載體。本發(fā)明的另一個方面包括含有一種或者多種編碼突變多肽的核酸序列的載體。在實踐本發(fā)明的過程中，使用許多分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA中的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是眾所周知的并闡述于，例如Current Protocols in Molecular Biology，第I-III卷，Ausubel編著(1997)；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；DNA CloningA Practical Approach，第I和II卷，Glover D編著(1985)；Oligonucleotide Synthesis，Gait編著(1984)；Nucleic AcidHybridization，Hames & Higgins編著(1985)；Transcription andTranslation，Hames & Higgins編著(1984)；Animal Cell Culture，F(xiàn)reshney編著(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning；Methods in Enzymol.系列(Academic Press，Inc.，1984)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells，Miller & Calos編著(Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1987)；和Methods in Enzymology，第154和155卷，分別由Wu & Grossman，以及Wu等人編著。
[107]為了重組表達本發(fā)明的一種或者多種多肽，通過本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)將含有編碼多肽的核苷酸序列的全部或者部分的核酸插入到合適的克隆載體中或者表達載體(即含有所插入的多肽編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需元件的載體)中。
[108]說明書中“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常使用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括發(fā)揮相同功能的其它形式的表達載體，其在技術(shù)上并非質(zhì)粒，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。此類病毒載體允許感染受試者并在該受試者中表達化合物。Becker等人，Meth.Cell Biol.43161-89(1994)。重組表達載體中，“有效連接”旨在指目的核苷酸序列以允許表達該核苷酸序列(例如在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或者在已導(dǎo)入載體的宿主細胞中表達)的方式連接到調(diào)控序列上。術(shù)語“調(diào)控序列”旨在包含啟動子、增強子和其它表達調(diào)控元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)控序列例如公開在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods In Enzymology(AcademicPress，San Diego，Calif.，1990)中。調(diào)控序列包含在許多類型的宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達的那些和僅在某些宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達的那些(例如組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解表達載體的設(shè)計取決于這樣的因素，例如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、期望的多肽的表達水平等等。本發(fā)明的表達載體可以被導(dǎo)入宿主細胞，從而生產(chǎn)由本文公開的核酸編碼的多肽或肽，包括融合多肽(例如突變多肽和源自突變的融合多肽等等)。
[109]表達多肽的宿主細胞。本發(fā)明的另一方面涉及表達多肽的宿主細胞，其含有編碼本發(fā)明一種或者多種突變多肽的核酸。術(shù)語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”可以在本文互換使用。應(yīng)理解這樣的術(shù)語不僅指特定的受試者細胞還指該細胞的后代或者潛在后代。因為由于突變或者環(huán)境影響，在連續(xù)世代中可以發(fā)生某些修飾，事實上這樣的后代與親本細胞不完全相同，但是仍然包括在本發(fā)明使用的術(shù)語的范圍中。宿主細胞可以是任何原核或者真核細胞Sambrook等人Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1989)。
[110]可以通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入原核或者真核細胞中。如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在指多種本領(lǐng)域認可的用于將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣或者氯化鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或者電穿孔法。轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法可以在Sambrook等人MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，1989)和其它實驗指南中找到。本領(lǐng)域已知諸如電穿孔、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等用于將DNA導(dǎo)入細胞的方法，因此方法的選擇依賴于熟練操作者的能力和喜好。
[111]為了制備本發(fā)明的重組細胞，可以載體的形式將期望的同源基因(isogene)導(dǎo)入宿主細胞，以便該同源基因仍然保留染色體外的形式。在這種情況下，細胞將從該染色體外的位置表達該基因。優(yōu)選的實施方式中，同源基因以與存在于細胞中的內(nèi)源基因重組的方式被導(dǎo)入細胞中。用來導(dǎo)入用于重組和用于染色體外維持的基因的載體是本領(lǐng)域已知的，并且任何合適的載體或者載體構(gòu)建體可用于本發(fā)明。
[112]本發(fā)明的重組表達載體可以設(shè)計為在原核細胞或者真核細胞中表達突變多肽。例如，可以在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)等細菌細胞中、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)中、諸如酵母菌的真菌細胞中或哺乳動物細胞狀表達突變多肽。合適的宿主細胞進一步在Goeddel，GeneExpression TechnologyMethods In Enzymology(Academic Press，SanDiego，Calif.，1990)中討論。
[113]在原核細胞中表達多肽最通常是在大腸桿菌中實現(xiàn)，該大腸桿菌包括含有指導(dǎo)融合或者非融合多肽表達的組成型或者誘導(dǎo)型啟動子的載體。典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith &Johnson，Gene 673140(1988))，pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.，USA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.，USA)，其分別將谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合多肽或者多肽A與靶標重組多肽融合。適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amrann等人，Gene 69301315(1988))和pET 11d(Studier等人，GeneExpression TechnologyMethods In Enzymology(Academic Press，SanDiego，Calif.，1990)第60-89頁。其他的策略公開于Gottesman，GeneExpression TechnologyMethods In Enzymology(Academic Press，SanDiego，Calif.，1990)第119-128頁和Wada，等人，Nucl.Acids Res.2021112118(1992))。
[114]多肽表達載體可以是酵母菌表達載體。用于在釀酒酵母(Saccharomyces cerivisae)中表達的載體的實例包括pYepSec1(Baldari等人，EMBO J.6229234(1987))、pMFa(Kurjan & Herskowitz，Cell 30933-943(1982))、pJRY88(Schultz等人，Gene 54113 123(1987))、pYES2(InVitrogen Corporation，San Diego，Calif.USA)和picZ(InVitrogenCorp，San Diego，Calif.，USA)。作為選擇，突變多肽可以在使用桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞中表達。在培養(yǎng)的昆蟲細胞(例如SF9細胞)中可用于表達多肽的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell.Biol.32156 2165(1983))和pVL序列(Lucklow & Summers，Virology 17031 39(1989))?？梢允褂貌溉閯游锉磉_載體例如pCDM8(Seed，Nature 329842 846(1987))或pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J.6187 195(1987))在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明的核酸。用于原核細胞和真核細胞的其它合適的表達系統(tǒng)參見例如Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，第16和17章，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。組織特異性和調(diào)節(jié)發(fā)育的調(diào)控元件是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于使用反義基因調(diào)控基因表達的討論參見例如Weintraub等人，“Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”，Trends in Genetics 1(1)(1986)。
[115]包含本發(fā)明化合物的宿主細胞，例如培養(yǎng)的原核細胞或者真核細胞，可以用于生產(chǎn)(即表達)重組突變多肽。重組多肽的純化是本領(lǐng)域熟知的，并且包括離子交換純化技術(shù)或者親和純化技術(shù)，例如使用化合物的抗體的親和純化。
[116]轉(zhuǎn)基因動物。表達本發(fā)明不同的基因的重組生物，即轉(zhuǎn)基因動物通過使用本領(lǐng)域已知的標準方法而制備。可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備攜帶本發(fā)明構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物。參見例如美國專利No.5,610,053和“The Introduction of Foreign Genes into Mice”及其引用的參考文獻，出自Recombinant DNA，J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski & M.Zoller編著(W.H.Freeman and Company，New York)，第254-272頁。穩(wěn)定表達人同源基因并生產(chǎn)人蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物可以用作生物模型，用于研究涉及異常表達和/或活性的疾病，以及用于篩選和檢測降低這些疾病的癥狀或者作用的多種候選藥物、化合物和治療方案。
[117]基因表達水平的表征。檢測和測量mRNA水平(即基因轉(zhuǎn)錄水平)和多肽基因表達產(chǎn)物水平(即基因翻譯水平)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的且包括使用核苷酸微陣列和涉及質(zhì)譜和/或抗體檢測和定量技術(shù)的多肽檢測方法。也參見Tom Strachan & Andrew Read，Human MolecularGenetics，第二版(John Wiley和Sons，Inc.Publication，New York，1999))。
[118]靶基因轉(zhuǎn)錄的測定?？赡芤远喾N方式進行生物樣品(例如個體組織或體液)中基因表達產(chǎn)物的水平的測定。術(shù)語“生物樣品”旨在包括分離自受試者的組織、細胞、生物液體和其分離物，以及存在于受試者中的組織、細胞和液體。許多表達檢測方法使用分離的RNA。對于體外方法，可以使用任何不選擇性抗mRNA分離的RNA分離技術(shù)從細胞中純化RNA。參見例如Ausubel等人編著，Curr.Prot.Mol.Biol.(John Wiley &Sons，New York，1987-1999)。
[119]一個實施方式中，確定靶基因的mRNA表達產(chǎn)物水平。測定特定mRNA水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的且包括Northern印跡分析、反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR或通過與寡核苷酸陣列或微陣列雜交。其它更多優(yōu)選實施方式中，可通過測定體液或組織樣品(包括但不限于血液或血清)中基因蛋白質(zhì)或多肽表達產(chǎn)物的水平進行表達水平的測定?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)容易地加工大量組織樣品，例如，美國專利No.4,843,155的一步RNA分離方法。
[120]分離的mRNA可以用于雜交或擴增檢測，其包括但不限于Southern或Northern分析、PCR分析和探針陣列。檢測mRNA水平的一個優(yōu)選診斷方法包括將分離的mRNA與核酸分子(探針)進行接觸，該核酸分子可以與由待檢測基因所編碼的mRNA雜交。核酸探針可以是例如全長cDNA或其一部分，例如長度至少為7、15、30、50、100、250或500個核苷酸且足以在嚴謹條件下與編碼本發(fā)明標記的mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸。本文描述了其它適合用于本發(fā)明診斷檢測法的探針。mRNA與探針的雜交表明所討論標記得以表達。
[121]一種形式，將探針固定到固體表面且mRNA與該探針接觸，例如，在Affymetrix基因芯片陣列(Affymetrix，Calif.USA)中的探針。熟練技術(shù)人員很容易改造已知的mRNA檢測法使之適用于檢測由本發(fā)明標記編碼的mRNA水平。
[122]測定樣品中與本發(fā)明標記相應(yīng)的mRNA水平的替代方法包括核酸擴增的方法，例如通過RT-PCR(美國專利No.4,683,202提出的實驗性實施方式)；連接酶鏈式反應(yīng)(Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193(1991))；自主持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878(1990))；轉(zhuǎn)錄擴增體系(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177(1989))；Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi等人，Biol.Technology 61197(1988))；滾環(huán)式復(fù)制(美國專利No.5,854,033)；或任何其它核酸擴增方法，接著使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測擴增的分子。當(dāng)此類核酸分子以很低數(shù)目存在時，這些檢測方案特別適用于檢測核酸分子。如本文所使用的“擴增引物”定義為可以與基因(分別為正鏈和負鏈，或反之亦然)的5’或3’區(qū)退火且在兩者間包括短的區(qū)域的核酸分子對。通常，擴增引物長度為約10-30個核苷酸并位于長度大約50-200核苷酸區(qū)域的兩側(cè)。
[123]實時定量PCR(RT-PCR)是評估基因(例如本發(fā)明的基因，例如含有目的SNP和多態(tài)性的那些)表達水平的一種方法。RT-PCR檢測法利用RNA反轉(zhuǎn)錄酶催化從RNA鏈(包括mRNA鏈)合成DNA鏈?？商禺愋詸z測并定量產(chǎn)生的DNA并且這一方法可用于確定特定物種mRNA的水平。做這些的一種方法是

(PE Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，Calif，USA)以及在PCR反應(yīng)期間利用AMPLITAQ GOLDTM DNA聚合酶的5’核酸酶活性來切割特異形式的探針。這被稱作TAQMANTM探針。參見Luthra等人，Am.J.Pathol.15363-68(1998)；Kuimelis等人，Nucl.Acids Symp.Ser.37255-256(1997)；和Mullah等人，Nucl AcidsRes.26(4)1026-1031(1998))。反應(yīng)期間，探針的切割將報告染料和淬滅染料分離，導(dǎo)致報告熒光的增加。通過監(jiān)控報告染料熒光的增加直接檢測PCR產(chǎn)物的累積。Heid等人，Genome Res.6(6)986-994(1996))。核酸靶標的起始拷貝數(shù)越高，越快地觀察到熒光的顯著增加。參見Gibson，Heid & Williams等人，Genome Res.6995-1001(1996)。
[124]測量細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的其他技術(shù)產(chǎn)生用于電泳分析的有限復(fù)雜度的限制性片段庫，如組合限制性雙酶切和分型引物的方法(見例如EP 0534858 A1)，或具有最接近于指定mRNA末端位點的選擇限制性片段的方法(見例如Prashar & Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2)659-663(1996))。
[125]其它方法統(tǒng)計學(xué)上取樣cDNA庫，例如通過對多個cDNA的每一個測序足夠的堿基(例如20-50個堿基)來鑒定每個cDNA，或通過測序短標簽(例如9-10個堿基)，其在相對于限定的mRNA末端途徑類型已知位置上產(chǎn)生。參見例如Velculescu，Science 270484-487(1995)。定量樣品中的cDNA水平并且使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準統(tǒng)計學(xué)方法確定每個cDNA的平均值、平均偏差和標準變差(Norman T.J.Bailey，Statistical Methods In Biology，第三版(Cambridge University Press，1995))。
[126]多肽的檢測免疫學(xué)檢測方法?？梢酝ㄟ^可檢測標記的或可以隨后標記的探針檢測本發(fā)明基因編碼的蛋白質(zhì)的表達。對于探針或抗體而言的術(shù)語“標記的”旨在包括通過偶聯(lián)(即物理連接)可檢測的物質(zhì)到探針或抗體而直接標記探針或抗體，以及通過與直接標記的另一試劑反應(yīng)而間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用熒光標記的二抗檢測一抗以及用生物素末端標記的DNA探針以便其可以用熒光標記的鏈霉親和素進行檢測。通常，探針是識別所表達蛋白質(zhì)的抗體。可以使用多種形式來確定樣品是否含有結(jié)合給定抗體的靶蛋白質(zhì)。用于檢測本發(fā)明的靶多肽的免疫檢測法包括但不限于，例如，點印跡、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片、競爭性和非競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合檢測法、酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)、免疫組化、熒光活化細胞分選(FACS)和其它常用的及科學(xué)和專利文獻中廣泛描述的方法，以及許多商業(yè)使用的方法。熟練技術(shù)人員可以很容易利用已知的蛋白質(zhì)/抗體檢測方法確定細胞是否表達本發(fā)明的標記和該特定多肽表達產(chǎn)物在血液或其身體組織中的相對濃度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)分離來自個體的蛋白質(zhì)。所用的蛋白質(zhì)分離方法可以是例如Harlow & Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988))中所述的那些。
[127]為了生產(chǎn)由所公開基因之一編碼的蛋白質(zhì)的抗體，可通過注射多肽或其部分免疫多種宿主動物。該宿主動物可包括但不限于，兔、小鼠和大鼠。根據(jù)宿主種類，可使用多種佐劑來提高免疫反應(yīng)，該佐劑包括但不限于(完全和不完全)福氏佐劑、礦物膠(例如氫氧化鋁)；表面活性劑例如溶血卵磷脂、普流羅尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白和二硝基苯酚以及潛在可用的人類佐劑，例如卡介苗(BCG)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
[128]單克隆抗體(mAb)是特定抗原的均質(zhì)抗體群，其可以利用供用于通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)來獲得。這些包括但不限于Kohler & Milstein，Nature 256495-497(1975)的雜交瘤技術(shù)；和美國專利No.4,376,110；Kosbor等人，Immunol.Today 472(1983)；Cole等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 802026-2030(1983)的人B細胞雜交瘤技術(shù)以及Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(Alan R.Liss，Inc.，1985)第77-96頁的EBV雜交瘤技術(shù)。
[129]此外，可以使用開發(fā)用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(參見Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature 312604-608(1984)；和Takeda等人，Nature 314452-454(1985))，該嵌合抗體通過剪接具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子基因而產(chǎn)生。嵌合抗體是這樣的分子，其中不同部分來源于不同的動物物種，例如具有鼠單抗來源的可變區(qū)或高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體。
[130]或者，描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No.4,946,778；Bird，Science 242423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward等人，Nature 334544-546(1989))可以改造而適于生產(chǎn)差異表達基因的單鏈抗體。
[131]用于生產(chǎn)“人源化抗體”的技術(shù)可改造而適于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、其片段或衍生物的抗體。該技術(shù)描述于美國專利No.5,932,448；5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,661,016和5,770,429。
[132]可以在諸如Western印跡或免疫熒光技術(shù)等方法中使用抗體或抗體片段來檢測表達的蛋白質(zhì)。此種應(yīng)用中，通常優(yōu)選將抗體或蛋白質(zhì)固定到固相支持物上。適合的固相支持物或載體包括任何能結(jié)合抗原或抗體的支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改良的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵石。
[133]易于檢測的有用方法是夾心ELISA，其存在多種變通形式，所有都意欲用于本發(fā)明的方法和檢測中。如本文所使用，“夾心檢測”旨在包括基于兩點技術(shù)的所有變通形式。免疫熒光和EIA技術(shù)都是本領(lǐng)域充分確立的技術(shù)。然而，也可使用其它報告分子，例如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。如何改變程序以適合所需的應(yīng)用對熟練技術(shù)人員來講是顯而易見的。
[134]通過構(gòu)建微陣列可以進行蛋白質(zhì)的全基因組(即蛋白質(zhì)組)監(jiān)控，微陣列中的結(jié)合位點包括，對多種由細胞基因組編碼的蛋白質(zhì)物質(zhì)特異的固定抗體，優(yōu)選單克隆抗體。優(yōu)選地，對于編碼蛋白質(zhì)的大部分，或至少對于與檢測或確認目的生物網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)的那些蛋白質(zhì)存在抗體。如上所指出，用于制造單克隆抗體的方法是眾所周知的。參見例如Harlow &Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，1988))。優(yōu)選的實施方式中，針對基于細胞的基因組序列設(shè)計的合成肽片段產(chǎn)生單克隆抗體。用該抗體陣列，來自細胞的蛋白質(zhì)與該陣列接觸并且用本領(lǐng)域已知的檢測法測定其結(jié)合。
[135]多肽檢測二維凝膠電泳。二維凝膠電泳是本領(lǐng)域眾所周知的且通常包括沿第一方向的等電聚焦接著是沿第二方向的SDS-PAGE電泳。參見例如Hames等人，Gel Electrophoresis of ProteinsA Practical Approach(IRL Press，New York，1990)；Shevchenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314440-14445(1996)；Sagliocco等人，Yeast 121519-1533(1996)和Lander，Science 274536-539(1996)。
[136]多肽檢測質(zhì)譜分析?？梢允褂觅|(zhì)譜分析技術(shù)(MS)確定靶多肽的特征以及表達水平?；贛S的分析方法學(xué)可用于分析分離的靶多肽以及分析生物樣品中的靶多肽。用于分析靶多肽的MS形式包括電離(I)技術(shù)，例如但不限于基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)、連續(xù)或脈沖電噴射電離(ESI)和相關(guān)方法，例如離子噴射或熱噴射，以及massive cluster impact(MCI)。該離子源可以與檢測形式相匹配，包括線性或非線性反射式飛行時間(TOF)、單極或多極、單或多個扇形磁場、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)、離子阱及其組合，例如離子阱/TOF。對于電離，可以使用多種基質(zhì)/波長組合(例如基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI))或溶劑組合(例如ESI)。
[137]對于質(zhì)譜(MS)分析，可以將靶多肽溶解在適合的溶液或試劑系統(tǒng)。溶液或試劑系統(tǒng)的選擇(例如有機或無機溶劑)將取決于靶多肽的性質(zhì)和所執(zhí)行的MS類型，以及基于本領(lǐng)域眾所周知的方法。例如對于MALDI參見Vorm等人，Anal.Chem.613281(1994)；和對于ESI見Valaskovic等人，Anal.Chem.673802(1995)。肽的MS也描述于例如PCT國際申請No.WO 93/24834和美國專利No.5,792,664。選擇使氣化過程中引入的能量分解靶多肽的風(fēng)險最小化的溶劑。例如，通過在基質(zhì)中包埋樣品可以實現(xiàn)靶多肽分解風(fēng)險的降低。適合的基質(zhì)可以是有機化合物，例如糖(例如戊糖或己糖)或多糖例如纖維素。該化合物熱分解為CO2和H2O以便不形成可以導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)的殘留物?；|(zhì)也可以是無機化合物，例如銨的硝酸鹽，其分解后基本上無殘留。這些和其它溶劑的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如美國專利No.5,062,935。電噴霧MS描述于Fenn等人，J.Phys.Chem.884451-4459(1984)；和PCT申請No.WO 90/14148；且當(dāng)前的應(yīng)用在綜述中進行總結(jié)。參見Smith等人，Anal.Chem.62882-89(1990)；和Ardrey，Spectroscopy 410-18(1992)。
[138]由MS確定的靶多肽的質(zhì)量可以與相應(yīng)的已知多肽質(zhì)量相比較。例如，當(dāng)靶多肽是突變蛋白質(zhì)時，相應(yīng)的已知多肽可以是相應(yīng)的非突變蛋白質(zhì)，例如野生型蛋白質(zhì)。用ESI確定飛摩爾量樣品的分子量是很精確的，因為存在多個離子峰，其全部可以用于質(zhì)量計算。例如已經(jīng)使用ESl MS(Valaskovic等人，Science 2731199-1202(1996))和MALDI MS(Li等人，J.Am.Chem.Soc.1181662-1663(1996))檢測了阿托摩爾水平的蛋白質(zhì)。
[139]基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)。生物樣品(例如體液或組織樣品)中的靶蛋白質(zhì)水平可通過多種質(zhì)譜(MS)方法進行測定，包括但不限于本領(lǐng)域已知的那些技術(shù)，如基質(zhì)輔助激光解吸/離子化、飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及下面進一步詳細說明的表面增強的激光解吸/離子化、飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)。進行MALDI的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Juhasz等人，Analysis，Anal.Chem.68941-946(1996)，并且也參見例如美國專利No.5,777,325；5,742,049；5,654,545；5,641,959；5,654,545和5,760,393描述了MALDI和延時提取方法。眾多用于改善分辨率的方法也是已知的。Hillenkamp等人，Biological Mass Spectrometry，Burlingame & McCloskey編(Elsevier Science Publ.，Amsterdam，1990)第49-60頁描述了MALDI-TOF-MS。
[140]可以使用多種用質(zhì)譜檢測標記的方法。參見Bordeaux MassSpectrometry Conference Report，Hillenkamp編著，第354-362頁(1988)；Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report，Karas & Hillenkamp編著，第416-417頁(1988)；Karas & Hillenkamp，Anal.Chem.602299-2301(1988)；和Karas等人，Biomed Environ.Mass Spectrum 18841-843(1989)。激光束在TOF-MS中的應(yīng)用示于，例如美國專利No.4,694,167；4,686,366；4,295,046和5,045,694，其在此通過整體引用作為參考。其它MS技術(shù)允許高分子量生物聚合物的成功揮發(fā)，而沒有片段化，且使得可以通過質(zhì)譜分析多種生物大分子。
[141]表面增強激光解吸/離子化(SELDI)。使用其它利用新型MS探針元件組成的技術(shù)，該組成具有允許探針元件活躍參與捕獲和錨定特異分析物的表面，描述為親和質(zhì)譜(AMS)。參見SELDI專利U.S.專利No.5,719,060；5,894,063；6,020,208；6,027,942；6,124,137和美國專利申請No.U.S.2003/0003465。已設(shè)計幾類新MS探針元件，具有針對親和捕獲(SEAC)的增強的表面。參見Hutchens & Yip，Rapid Commun.MassSpectrom.7576-580(1993)。通過探究對于蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)和生物特異分子識別哪些是已知的，已將SEAC探針元件成功用于檢索并鎖定不同類的生物聚合物，尤其是蛋白質(zhì)。MS探針元件表面的固定化親和捕捉裝置(即SEAC)決定了分析物在探針表面的位置和親和性(特異性)，從而隨后的MS分析過程是有效的。
[142]通常的SELDI類型中有三個單獨的亞類(1)表面增強的整齊解吸(SEND)，其中探針元件表面(即樣品呈遞工具)設(shè)計為含有能量吸收分子(EAM)而非“基質(zhì)”，從而促進直接(整齊)加入到該表面的分析物的解吸/電離。(2)SEAC，其中探針元素表面(即樣品呈遞工具)設(shè)計為含有化學(xué)明確的和/或生物明確的親和捕捉裝置，以通過多種機制(主要是非共價的)促進分析物特異性或非特異性附著或吸附(所謂的錨定或鎖定)到探針表面。(3)表面增強的光敏附著和釋放(SEPAR)，其中探針元件表面(即樣品呈遞工具)設(shè)計或修飾為含有一或多種化學(xué)明確的交聯(lián)分子，用作共價錨定裝置。決定SEPAR樣品呈遞工具(即探針元件表面)和分析物(例如蛋白質(zhì))之間光敏分子附著點的類型和數(shù)量的化學(xué)特異性可涉及分析物中許多不同殘基或化學(xué)結(jié)構(gòu)中的任何一或多種(例如在蛋白質(zhì)和肽的情況下，His、Lys、Arg、Tyr、Phe和Cys殘基)。
[143]使多肽官能化。也可以修飾目的多肽以促進與固相支持物的結(jié)合。也可以將化學(xué)的或者物理的部分在適當(dāng)?shù)奈恢煤喜⑷攵嚯摹＠?，可以通過添加適當(dāng)?shù)墓倌軋F到多肽的羧基端或者氨基端，或者到肽內(nèi)部的氨基酸上(例如添加到反應(yīng)的側(cè)鏈或者肽骨架上)而修飾目的多肽。然而，技術(shù)人員將明白這樣的修飾(例如合并入生物素部分)可能影響特定試劑與多肽特異性相互作用的能力，并因此將在選擇如何最好修飾目的多肽時考慮此因素(如果相關(guān))。通常存在于多肽中的天然氨基酸也可以含有適合將多肽結(jié)合到固相支持物上的官能團。例如可以使用存在于多肽中的半胱氨酸殘基通過二硫鍵將多肽連接到含有巰基的支持物上，例如具有半胱氨酸殘基結(jié)合于其上的支持物。兩個氨基酸之間可以形成的其它鍵包括但不限于，例如兩個羊毛硫氨酸殘基之間的單硫鍵，羊毛硫氨酸是可以合并入多肽的非天然氨基酸；酸性氨基酸和堿性氨基酸的側(cè)鏈之間通過轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)形成的內(nèi)酰胺鍵，例如Glu的γ羧基(或者Asp的α羧基)與Lys的氨基之間形成的內(nèi)酰胺鍵；或者例如通過Ser的羥基和Glu的羧基(或者Asp的α羧基)之間通過交聯(lián)產(chǎn)生的內(nèi)酯鍵。因此，可以修飾固相支持物以使其含有所需的氨基酸殘基，例如Glu殘基，含有Ser殘基，特別是位于N末端或者C末端的Ser殘基的多肽可以通過形成內(nèi)酯鍵而結(jié)合到固相支持物上。不必將支持物修飾為含有特定的氨基酸(例如期望與多肽中的Ser形成內(nèi)酯樣鍵的Glu)，但是取而代之的可以將支持物修飾為含有易接近的羧基的支持物，因此提供對應(yīng)于Glu的α羧基的功能。
[144]硫羥反應(yīng)(thiol-reactive )的官能團。硫羥反應(yīng)的官能團特別用于將多肽結(jié)合到固相支持物上。硫羥反應(yīng)的官能團是能夠迅速與親核的硫羥部分反應(yīng)以產(chǎn)生共價鍵(例如二硫鍵或者硫醚鍵)的化學(xué)基團。多種硫羥反應(yīng)的官能團是本領(lǐng)域已知的，包括例如鹵代乙?；?，例如碘代乙酰基；重氮酮類；環(huán)氧酮類，α和β不飽和羰基類，例如α烯酮類和β烯酮類和其它反應(yīng)性的邁克爾受體類，例如馬來酰亞胺；?；u類；芐基鹵類等等。參見Greene & Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版(John Wiley & Sons，1991)。
[145]如果需要，可以使用光可裂解(photocleavable)的保護基團封閉硫羥基，該保護基團然后可以被選擇性地例如通過光刻法裂解，以提供用于固定目的多肽的表面活化的部分。光可裂解保護基團是本領(lǐng)域已知的(參見例如公開的國際PCT申請WO 92/10092，以及McCray等人，Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.18239-270(1989))，并且可以使用例如光刻法的膜通過照射表面選定的面積而選擇性地去封閉。
[146]連接體。目的多肽可以直接通過連接體而連接到支持物上?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合將肽或者氨基酸直接或者通過間隔區(qū)而連接到支持物上的連接體。例如，可以通過可變的間隔區(qū)的方式將多肽連接到諸如珠子的支持物上。連接體包括Rink酰胺連接體(參見例如Rink，Tetrahedron Lett.283787(1976))；三苯甲基氯連接體(參見例如Leznoff，Ace Chem.Res.11327(1978))和Merrifield連接體(參見例如Bodansky等人，Peptide Synthesis，第二版(Academic Press，New York，1976))。例如已知三苯甲基連接體。參見例如美國專利No.5,410,068和5,612,474。也已知氨基三苯甲基連接體。參見例如美國專利No.5,198,531。其它連接體包括可以合并入融合蛋白質(zhì)并且在宿主細胞中表達的那些。這樣的連接體可以是選定的氨基酸、酶底物或者任何合適的肽。連接體可以例如通過當(dāng)分離核酸時選擇合適的引物而制備。作為備選，其可以通過翻譯后修飾目的蛋白質(zhì)而添加。適合將肽化學(xué)連接到支持物上的連接體包括游離反應(yīng)基團(例如胺和硫羥基)之間的二硫鍵、硫醚鍵、受阻二硫鍵和共價鍵。
[147]可裂解連接體。連接體可以提供可逆的連接，以便其在給定條件下被裂解。特別地，使用選擇性可裂解連接體，包括光可裂解連接體(參見美國專利No.5,643,722)，酸可裂解連接體(參見Fattom等人，Infect.Immun.60584-589(1992))、酸敏感連接體(參見

等人，J.Biol.Chem.2664309-4314(1991))和熱敏感連接體。連接可以是例如巰基乙醇或者二硫代赤醇化學(xué)可裂解的二硫鍵、光可裂解的生物素/鏈霉生物素連接、三苯甲基醚基團的異二功能衍生物，其可以通過暴露于酸環(huán)境或者在MS環(huán)境下而被裂解(參見

等人，Tetrahedron Lett.317095(1990))、levulinyl介導(dǎo)的連接，其在幾乎中性的條件下使用

/乙酸鹽緩沖液可以被裂解、精氨酸-精氨酸或者賴氨酸-賴氨酸鍵，任何之一可以被內(nèi)肽酶(例如胰蛋白酶)裂解、可以被焦磷酸酶裂解的焦磷酸鍵、或者核糖核苷酸鍵，其可以使用核糖核酸酶或者通過暴露于堿環(huán)境而被裂解。光敏交聯(lián)連接體，例如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可以用作從固相支持物上裂解多肽的手段。Brown等人，Mol Divers，第4-12頁(1995)；Rothschild等人，Nucl.Acids.Res.24351-66(1996)和美國專利No.5,643,722。其它連接體包括可以被核酶和其它RNA酶裂解的RNA連接體，以及諸如來自人IgG1恒定區(qū)的不同結(jié)構(gòu)域(例如CH1、CH2和CH3)的連接體，參見Batra等人，Mol Immunol30379-396(1993)。
[148]本文還意欲包括任何連接體的組合。例如，在MS條件下可裂解的連接體(例如甲硅烷基連接或者光可裂解連接)可以與在這些條件下不裂解但是可以在其它條件下裂解的連接體(例如抗生物素生物素連接)組合。酸敏感的連接體是特別有用的用于質(zhì)譜，特別是用于MALDI-TOF的化學(xué)可裂解連接體，因為在靶多肽一旦添加3-HPA基質(zhì)溶液的條件中該酸敏感鍵被裂解。酸敏感鍵可以作為單獨的連接體基團(例如酸敏感三苯甲基)而引入，或者可以通過使用二異丙基甲硅烷基引入一個或者多個甲硅烷基橋而合并入合成的連接體中，因此在多肽和固相支持物間形成二異丙基甲硅烷基連接。使用溫和的酸條件，例如1.5％三氟乙酸(TFA)或者3-HPA/1％TFA MALDI-TOF基質(zhì)溶液可以裂解二異丙基甲硅烷基連接。制備二異丙基甲硅烷基連接及其類似物的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如參見Saha等人，J.Org.Chem.587827-7831(1993)。
[149]使用插頭工具(Pin Tool)以固定多肽。使用插頭工具將目的多肽固定在固相支持物上可以特別地有利。插頭工具包含本文公開的那些或者其它本領(lǐng)域已知的。參見例如美國系列申請08/786,988和08/787,639以及國際PCT申請WO 98/20166。
[150]陣列(例如4×4陣列)中的插頭工具可以適用于含有目的多肽的孔。在插頭工具具有附著于每個插頭頂部的官能團，或者具有固相支持物(例如附著于每個插頭的官能化的珠子或者順磁珠子)的情況下，孔中的多肽可以被捕獲(1pmol的容量)。捕獲步驟中，可以保持插頭運動(垂直運動，1-2mm的距離)以增加捕獲的效率。在諸如體外轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)在孔中進行的情況下，插頭的運動可以增加反應(yīng)的效率。而且通過向插頭工具施加電場而可以獲得固定。當(dāng)將電壓施加于插頭工具時，多肽將視其靜電荷而定附著到陽極或者陰極上。
[151]為了更高的特異性，可以修飾插頭工具(有或者無電壓)以使其具有綴合于其上的對目的多肽有特異性的試劑，以便插頭僅結(jié)合目的多肽。例如插頭可以具有附著的鎳離子，以便僅含有聚組氨酸序列的多肽可以被結(jié)合。相似地，插頭可以具有附著于其上的特異抗靶多肽的抗體，或者該抗體附著于珠子上，該珠子反過來附著于插頭上，以便插頭僅結(jié)合含有由該抗體識別的表位的靶多肽。
[152]捕獲的多肽可以通過多種方法進行分析，包括例如光譜測定技術(shù)，例如UV/VIS，IR，熒光，化學(xué)發(fā)光，NMR分光術(shù)，MS或者其它本領(lǐng)域已知的方法，或者這些方法的組合。如果條件阻礙直接分析捕獲的多肽，可以將多肽在使得樣品濃度的優(yōu)勢不喪失的條件下從插頭上釋放或者轉(zhuǎn)移。因此，可以使用最小體積的洗脫液將多肽從插頭上移出，且不損失任何樣品。在多肽結(jié)合于附著在插頭的珠子上時，可以將含有多肽的珠子從插頭上移出并從珠子上直接進行測量。
[153]插頭工具可以用于將目的多肽以空間可定位的方式在陣列上固定。這樣的空間可定位或者預(yù)定位陣列在多種操作(包括例如質(zhì)量控制和氨基酸測序診斷學(xué))中有用。美國申請08/786,988和08/787,639和國際PCT申請WO 98/20166公開的插頭工具是連續(xù)且平行分配的工具，其可用于產(chǎn)生位于固相支持物表面上的多肽的多元陣列。陣列表面可以是具有珠子的平面，或者經(jīng)過幾何學(xué)改變以包括可以含有珠子的孔。另外，MS幾何學(xué)也可以調(diào)整以容納插頭工具裝置。
[154]生物狀態(tài)的其它方面。本發(fā)明的多種實施方式中，可以測定生物活性狀態(tài)的方面，或混合的方面，以便獲得藥物或途徑反應(yīng)?？梢詼y量與細胞功能的特征相關(guān)的蛋白質(zhì)活性，且本發(fā)明的實施方式可以基于此類測定。通過任何適合表征特定活性的功能的、生化或物理方法進行活性測定。當(dāng)活性涉及化學(xué)轉(zhuǎn)變時，可以將細胞蛋白質(zhì)與天然底物接觸，并測定轉(zhuǎn)變率。當(dāng)活性涉及多體單元的結(jié)合(例如活化的DNA結(jié)合復(fù)合物與DNA的結(jié)合)時，可以測定結(jié)合蛋白質(zhì)的量或該結(jié)合的次生結(jié)果，例如轉(zhuǎn)錄的mRNA的量。另外，當(dāng)只知道功能活性時(例如在細胞周期調(diào)控中)，可以觀察該功能的表現(xiàn)。不管已知的還是測定的，蛋白質(zhì)活性的改變形成由本發(fā)明方法分析的反應(yīng)數(shù)據(jù)。替代的且非限制性實施方式中，可由細胞生物狀態(tài)的混合方面形成反應(yīng)數(shù)據(jù)?？梢杂衫缒承﹎RNA豐度變化，某些蛋白質(zhì)豐度變化和某些蛋白質(zhì)活性的改變組建反應(yīng)數(shù)據(jù)。
[155]呈現(xiàn)下述實施例以便更全面地說明本發(fā)明優(yōu)選的實施方式。這些實施例不應(yīng)被理解為限制如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
實施例1.在來自InDDEx試驗的患者中進行AFFYMETRIX 100K基因組掃描 [156]導(dǎo)言和概述。本實施例的目的是描述鑒定本發(fā)明25個AD相關(guān)突變的遺傳關(guān)聯(lián)性研究。在過去的兩年，針對遺傳關(guān)聯(lián)性研究的基因組范圍內(nèi)的分析才僅僅變得可能。使用艾斯能延遲被診斷為阿爾茨海默病的調(diào)查研究(InDDex；ENA713B IA07)臨床試驗追蹤罹患MCI的患者，并且向患者施用或者不同劑量的艾斯能(利凡斯的明)或者安慰劑，并追蹤其向AD的轉(zhuǎn)化。該試驗任選地具有DNA收集的內(nèi)容，其中收集到442份樣品。
[157]為了鑒定促使MCI向AD轉(zhuǎn)化的遺傳變異，來自InDDex(ENA713B IA07)臨床試驗的420份患者樣品使用Haploview的病例對照試驗在單一位點和推定的單元型區(qū)段上使用Affymetrix 100K基因分型平臺進行基因分型并且進行全基因組關(guān)聯(lián)性分析。表型結(jié)果是從MCI向AD轉(zhuǎn)化或者不轉(zhuǎn)化。本研究公平、基因組范圍內(nèi)的方法導(dǎo)致鑒定出之前未與AD關(guān)聯(lián)的突變和基因區(qū)。
[158]用于診斷遺忘性MCI的常用標準包括但不限于例如記憶缺陷；必要的正常判斷、知覺和推理能力；日常生活中大多數(shù)正常的活動；相比較于其它相似年齡和教育背景的人在記憶測試中降低的性能；以及沒有癡呆。遺忘性(記憶相關(guān))MCI的風(fēng)險因素與阿爾茨海默病的那些相同，并且包括家族歷史、遺傳學(xué)和年齡。MCI不同于AD，AD是足以干擾日常功能的嚴重的智力和社會能力的喪失。癡呆發(fā)生于患有阿爾茨海默病的人群，因為健康大腦組織退化，引起記憶和心智能力的穩(wěn)定減退。
[159]方法。從收集的血樣提取DNA。如針對100K平臺的Affymetrix方法所述進行靶標的制備、與微陣列的雜交、掃描和獲取數(shù)據(jù)。最終，442份DNA樣品中的420份成功進行了基因型分型，由于DNA質(zhì)量或者數(shù)量的原因，放棄其它的22份樣品。
[160]基因型數(shù)據(jù)從芯片雜交裝置中的GCOS上載給BMD服務(wù)器，并以Haploview.ped輸入格式，以及匹配的.info格式注釋文件輸出給Linux服務(wù)器。從數(shù)據(jù)庫(datasets)排除調(diào)用率(call rate)＜90％的樣品或者在重復(fù)的HindIII和XbaI試驗間多于一個錯配的樣品。來自ENA713B IA07臨床數(shù)據(jù)庫的結(jié)果(轉(zhuǎn)化/未轉(zhuǎn)化)數(shù)據(jù)合并入基因型數(shù)據(jù)中，并且在每個染色體的基礎(chǔ)上在Haploview中使用下述參數(shù)進行病例對照分析“-nogui-check-assocCC-blockoutput GAB-hwcutoff 0.00001-maxDistance 200”。除此之外使用缺省設(shè)置。每個染色體的輸出文件組裝成單一的基因組范圍的文件，輸入Windows服務(wù)器并合并入SAS。
[161]單一位點和單元型區(qū)段的Top結(jié)果都通過提供的Haploview卡方值排列，且單一位點結(jié)果也通過Fisher氏確切檢驗進行排列，并且用來自Affymetrix數(shù)據(jù)庫的試驗數(shù)據(jù)進行解釋。在對多重檢驗進行Bonferroni罰分(n＝109780指示性檢驗(informative tests))后，沒有單一位點的結(jié)果符合研究范圍的顯著性(p＝0.05)，在Haploviewd的排列檢驗中，任何組合的單一位點和單元型檢測都不符合研究范圍的顯著性閾值(p＝0.05)。
[162]結(jié)果。在整個基因組，與AD轉(zhuǎn)化相關(guān)的等位基因或者單元型中進行單一標記和單元型的分析。結(jié)果通過性別、APOE E4狀態(tài)和處理方法(treatment arm)進行分層。本研究中使用的Affymetrix 100K基因型分型芯片在機制上與用于表達譜的微陣列的相似。這些研究中使用的兩個芯片的設(shè)置提供平均分布在基因組中的＞100,000SNP的基因型數(shù)據(jù)。來自艾斯能InDDex試驗的442份樣品的420份樣品成功地雜交于本研究所使用的基因型分型芯片。通過使用限制性酶消化以及擴增、雜交到芯片和掃描降低了基因組的復(fù)雜性。產(chǎn)生大約480萬個基因型。
[163]基因型QC步驟。Affymetrix 100K陣列通過比較30個冗余的SNP和比較XbaI和HindIII對之間的性別而評估。排除存在多于一個錯配的芯片。如果未命中的芯片＞1個，則排除樣品。分析中包括“每個樣品調(diào)用率”≥90％的芯片。下表2A提供Affymetrix 100K陣列的性能的總結(jié)。
[164]有兩個成功芯片的患者樣品的數(shù)目是420(95％)。具有1次失敗的檢測/芯片的患者樣品的數(shù)目是17(3.9％)。具有2次失敗的檢測/芯片的患者樣品的數(shù)目是5(1.1％)。觀察到的用于本發(fā)明研究的試驗性能的再現(xiàn)性是99.9％。Affymetrix提供的陽性對照的8個樣品也指示對于被調(diào)用的基因型有99.9％的精確率。
[165]如表2B所示，對于人口學(xué)特征、基數(shù)MMSE和AD轉(zhuǎn)化率，完全的臨床研究和基因組掃描研究之間沒有顯著差異。


[166]單元型分析。對于每一個單元型，評估病例和對照的所有單元型頻率。檢測每個單元型與AD轉(zhuǎn)化的關(guān)聯(lián)性。通過p值(卡方值)對所有的相關(guān)性排序以確定追蹤的優(yōu)先順序。對于單元型區(qū)段評估，使用Gabriel等人，Science 2962225-2229(2002)的方法在整個基因組中鑒定了16,858個單元型區(qū)段。
[167]下表3總結(jié)了通過單元型區(qū)段評估(即本發(fā)明單元型)觀察到的15個高關(guān)聯(lián)性。






[168]通過單一位點和單元型評估觀察到的遺傳關(guān)聯(lián)性的組合結(jié)果，通過卡方值結(jié)果排序，總結(jié)于下表4中。





[169]如表5所示，高遺傳關(guān)聯(lián)性涉及的SNP位于GRIA1(谷氨酸受體，離子型，AMPA1)，AK5(腺苷酸激酶5)，SLC1A3(溶質(zhì)載體蛋白家族1(膠質(zhì)細胞高親和性谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白)，成員3)，BAI3(腦特異性血管發(fā)生抑制劑3)和CACNA2D1(鈣通道，電壓依賴型，α2/δ亞基1)中或者與其鄰近。

[170]單一標記關(guān)聯(lián)性。針對MCI向AD轉(zhuǎn)化的單一遺傳標記關(guān)聯(lián)性在109,768個標記中進行評估。在72例病例和347例對照中比較等位基因的頻率。表6中總結(jié)了鑒定為與MCI向AD轉(zhuǎn)化關(guān)聯(lián)的首要的25個單一位點基因突變(本發(fā)明的生物標記)。



等同方案 [171]本發(fā)明的一或多個實施方式的細節(jié)在上面所附的說明書中列出。盡管任何與本文所述方法和材料相似或相當(dāng)?shù)哪切┛梢杂糜趯嵺`或檢測本發(fā)明，但現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將從說明書和權(quán)利要求中顯而易見。在說明書和所附權(quán)利要求中，除非上下文明確另行規(guī)定，否則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)對象。除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解相同的含義。本文引用的所有參考通過整體引用在此作為參考，并且為了所有的目的以相同的程度在此引入，就如同每一單個出版物、專利或?qū)＠暾垶榱怂心康木唧w及單獨地指示為以其整體引入作為參考一樣。
[172]本發(fā)明不限于這一申請中所述的具體實施方式
，這些實施方式僅作為本發(fā)明個別方面的舉例說明。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對這一發(fā)明進行許多修改和改變而不背離其精神和范圍。根據(jù)前面的說明，除了本文列舉的那些以外，本發(fā)明范圍內(nèi)的功能性等效方法和工具對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。該修改和改變旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明只被所附權(quán)利要求的用語，以及與該權(quán)利要求所主張的全部范圍等同體所限定。
權(quán)利要求
1.利凡斯的明(艾斯能)在制備以降低的毒性或者增加的效力治療給定受試者群體的阿爾茨海默病的藥物中的用途，其中受試者群體的選擇基于選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24；MUT-25的至少一種基因突變的存在。
2.治療受試者的阿爾茨海默病的方法，包括下述步驟
(a)獲得受試者位于選自下述至少一種基因AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的遺傳基因座的基因型或者單元型，其中該基因型和/或單元型是罹患阿爾茨海默病傾向的指示；和
(b)向該受試者施用抗阿爾茨海默病療法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該抗阿爾茨海默病的療法選自他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏和美金剛胺。
4.權(quán)利要求2的方法，其中基因型是具有至少一個等位基因含有選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24；MUT-25的遺傳多態(tài)性和/或突變的雜合基因型。
5.權(quán)利要求2的方法，其中基因型是具有至少一個等位基因含有MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25的突變和/或多態(tài)性的純合基因型。
6.權(quán)利要求2的方法，其中抗阿爾茨海默病的療法是施用治療有效量的試劑，該試劑增加或者降低包含選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25的遺傳突變或者多態(tài)性的基因的表達水平。
7.鑒定受試者罹患疾病的方法，該疾病由表1中鑒定的阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測，包括步驟
(a)獲得受試者位于選自下述至少一種基因AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的遺傳基因座的基因型或者單元型；
(b)評估該基因型和/或單元型以確定選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25的突變或者多態(tài)性的存在，其中存在的突變或者多態(tài)性是受試者罹患該疾病的傾向的指示，該疾病由表1中鑒定的阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測；和
(c)鑒定該受試者為具有罹患該疾病的傾向，該疾病由表1中鑒定的阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測。
8.權(quán)利要求7的方法，其中由表1中鑒定的阿爾茨海默病相關(guān)突變所預(yù)測的疾病是阿爾茨海默病。
9.在開始治療前確定受試者是否應(yīng)該包括于治療用或者研究用試劑的研究中的方法，包括
(a)探詢受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的至少一種基因的遺傳基因座的基因型和/或單元型；
(b)然后
(i)如果基因型是受試者患阿爾茨海默病傾向的指示，則將該受試者包含于研究中；
(ii)如果基因型不是受試者患阿爾茨海默病傾向的指示，則將該受試者排除出研究；或者
(iii)(i)和(ii)兩者。
10.確定罹患疾病的受試者對治療的反應(yīng)性的方法，包括步驟
(a)獲得受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的至少一種基因的遺傳基因座的基因型或者單元型；
(b)評估該基因型和/或單元型以確定選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25的突變或者多態(tài)性的存在，其中突變或者多態(tài)性的存在是受試者對疾病的治療響應(yīng)的指示；和
(c)鑒定該受試者為對疾病的治療有響應(yīng)。
11.用于在治療前確定當(dāng)使用化合物治療時受試者將發(fā)展為中毒的方法，包括
(a)獲得受試者位于選自AK5；BAI3；BBX；C18orf20；C5orf3；CACNA2D1；CCDC2；CD47；CNTNAP5；GRIA1；LAMA3；LOC131368；LRRC19；MGC27434；NFKBIZ；PIK3C3；SLC1A3；SPAG16；ST3GAL3；TEK和TNFSF11的至少一種基因的遺傳基因座的基因型或單元型；
(b)評估該基因型和/或單元型以確定選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25的突變或者多態(tài)性的存在，其中突變或者多態(tài)性的存在是受試者當(dāng)使用化合物治療時將發(fā)展為中毒的指示；和
(c)鑒定該受試者為當(dāng)使用化合物治療時將發(fā)展為中毒的受試者。
12.監(jiān)測正在使用化合物治療的受試者的中毒的進展或者發(fā)展的方法，包括
(a)提供來自受試者的第一檢測生物樣品；
(b)提供來自受試者的第二檢測生物樣品，其在取樣時間上晚于第一檢測生物樣品；
(c)將檢測生物樣品與試劑接觸，該試劑用于檢測由具有包含突變的序列的基因所編碼的多核苷酸或者多肽，該突變選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25；
(d)確定多肽或者多核苷酸在檢測生物樣品中的表達水平；以及
(e)比較第一檢測生物樣品中的多核苷酸或者多肽的水平與第二檢測生物樣品中的多核苷酸或者多肽的水平，其中第二檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平相對于第一檢測生物樣品中的多核苷酸或者多肽水平的增加或者降低指示正在使用化合物治療的受試者的中毒的進展或者發(fā)展。
13.確定在使用化合物治療期間或者之后有中毒風(fēng)險的受試者何時應(yīng)該終止使用化合物治療的方法，包括步驟
(a)提供檢測生物樣品；
(b)使檢測生物樣品與試劑接觸，該試劑用于檢測由具有包含突變的序列的基因所編碼的多核苷酸或者多肽，該突變選自MUT-1；MUT-2；MUT-3；MUT-4；MUT-5；MUT-6；MUT-7；MUT-8；MUT-9；MUT-10；MUT-11；MUT-12；MUT-13；MUT-14；MUT-15；MUT-16；MUT-17；MUT-18；MUT-19；MUT-20；MUT-21；MUT-22；MUT-23；MUT-24和MUT-25；
(c)確定多肽或者多核苷酸在檢測生物樣品中的表達水平；以及
(d)比較檢測生物樣品中的多核苷酸或者多肽的水平與標準參考樣品中的多核苷酸或者多肽的水平，其中檢測生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平和標準參考生物樣品中多核苷酸或者多肽的水平之間的相似性指示該受試者中毒的發(fā)展，并確定該化合物應(yīng)該終止使用。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及組織樣品的體外分析檢測，更具體地涉及與輕度認知損害向癡呆，例如阿爾茨海默病(AD)轉(zhuǎn)化相關(guān)聯(lián)的遺傳多態(tài)性的方面。本發(fā)明提供了用于診斷、預(yù)后或者治療性治療癡呆，例如阿爾茨海默病的AD相關(guān)突變。
文檔編號A61K45/00GK101516401SQ200780035365
公開日2009年8月26日 申請日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月21日
發(fā)明者J·B·辛格 申請人:諾瓦提斯公司