作為癌癥的標記物的Seprase的制作方法

文檔序號：6145077閱讀：858來源：國知局

專利名稱：作為癌癥的標記物的Seprase的制作方法
作為癌癥的標記物的Seprase描述本發(fā)明涉及有助于評估癌癥的方法。其公開了人成纖維細胞活化蛋白(FAP/ s印rase)作為不同癌癥類型的通用標記物的用途。S印rase有助于評估與肺有關的癌癥或肺癌(LC)或結腸癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)或結直腸癌(CRC)，而且還可能有助于評估其他特定類型的癌癥。此類特定癌癥類型是例如食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌或前列腺癌。此外，其特別地涉及用于通過測量來源于個體的液體樣品中的s印rase來從所述樣品評估癌癥的方法。s印rase的測量可以例如用于癌癥的早期檢測或用于經歷手術的患者的監(jiān)測。癌癥仍然是主要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，盡管在檢測和治療上已取得進步。癌細胞以癌癥相關標記蛋白的產生為特征。在攜帶癌細胞的個體的組織和體液中都發(fā)現(xiàn)了癌癥相關蛋白。它們的水平在致癌性進展的早期通常很低，在疾病的進展過程中增加，并且只在極少的情況下觀察到蛋白在疾病進展過程中顯示降低的水平。此類蛋白的靈敏檢測是用于診斷癌癥(特別地在癌癥的早期診斷中)的有利的和有前景的方法。最普遍的癌癥類型是乳腺癌 (BC)、肺癌(LC)和結直腸癌(CRC)。用于實體瘤的最重要的治療方法是a)腫瘤的手術切除，b)化學療法，c)使用生物學如抗腫瘤抗體或抗血管生成抗體的療法和d)上述方法的組合。腫瘤的手術切除已被廣泛接受為早期實體瘤的一線療法。然而，大多數(shù)癌癥只有當它們顯示癥狀，即當患者已處于疾病進展的相當晚期時才被檢測到。癌癥的分期是根據(jù)程度、進展和嚴重度對疾病的分類。其將癌癥患者分類，這樣可對治療的預后和選擇進行歸納。按照Duke的分期A至D將CRC的不同分期用于分類。今天， Μ系統(tǒng)是最為廣泛使用的癌癥的解剖學范圍的分類。其代表了國際上接受的統(tǒng)一的分期系統(tǒng)。存在3個基本變量T(原發(fā)性腫瘤的范圍)、Ν(區(qū)域淋巴結的狀態(tài))和M(遠端轉移的存在或不存在)。TNM 標準由 UICC (國際防癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer)), Sobin, L. H. ， ffittekind, Ch. (eds) :TNM Classification of Malignant Tumours,H 6 IK,2002) 公布。一旦 Μ狀態(tài)被確定，患者則被分類至由范圍從I至IV(IV是最晚期疾病的分期) 的羅馬數(shù)字表示的疾病分期。
Μ分期和UICC疾病分期彼此相應，如取自Sobin L.H.和 ffittekind (eds.)(同上)的下表中所示的。TW分期與UICC疾病分期的相互關系
尤其重要的是癌癥例如CRC的早期診斷轉變?yōu)楹玫枚嗟念A后。在CRC中，結腸直腸的惡性腫瘤起于良性腫瘤，即來自腺瘤。因此，最佳預后使患者在腺癌期被診斷。早在Tis、 NO、MO或T1-3 ；NO ；MO期被診斷的患者，如果經適當治療，與對于當遠端轉移已存在時診斷的患者只有10%的5年存活率相比較，在診斷后具有90%以上的機會存活5年。目前的檢測方法(包括成像方法，例如X射線或核共振)在理論上可能至少部分適合用作一般篩查工具。然而，它們極其昂貴，因而對于衛(wèi)生保健系統(tǒng)來說不能承擔其在大量受試者(特別對于無任何腫瘤癥狀的受試者)的普查中普遍和廣泛的使用。因此，本發(fā)明的目的是提供簡單且成本效率的腫瘤評估方法，例如以鑒定懷疑患有癌癥的個體。為此目的，可在體液例如血液或血清或血漿中檢測到的一般腫瘤標記物或一組此類標記物將是令人期待的。許多血清腫瘤標記物已用于臨床應用。例如cytoceratin 19的可溶性30kDa 片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原(carcinoembryogenic antigen) (CEA)、神經元特異烯醇化酶(NSE)和鱗狀細胞癌抗原(SCC)是最突出的LC標記物。然而，它們中沒有一個滿足篩查工具所需的靈敏度和特異性標準(Thomas，L.，Labor和Diagnose (2000) TH BooksVerIagsgese1lschaft, Frankfurt/Main, Germany)。為了具有臨床效果(clinical utility)，作為單個標記物的新型診斷標記物應當可與本領域內已知的其他標記物相當，或更好?；蛘撸绻謩e地將新型標記物單獨使用或與一個或更多個其他標記物組合使用，其應當導致診斷靈敏度和/或特異性的提高。最好通過其受試者工作特性(將在下面進行詳細地描述)評估檢測的診斷靈敏度和/或特異性。全血、血清或血漿是臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來源?？捎兄诳煽康陌?癥檢測或提供早期預后信息的早期腫瘤標記物的鑒定可導致可大大促進該疾病的診斷和管理的方法。因此，存在提高癌癥，特別地LC的體外評估的緊迫臨床需要。提高癌癥例如LC的早期診斷尤其重要，因為對于早期診斷的患者，存活的機會與在疾病的晚期 (progressedstage)診斷的患者相比要高得多。最近已對肺癌中生物化學標記物的臨床功用進行了綜述。(Duffy，M. J. ,Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。CYFRA 21-1目前被認為是當前已知的肺癌腫瘤標記物中最好的標記物。即使這樣，也未在肺組織中顯著地發(fā)現(xiàn)其器官特異性。CYFRA 21-1對于肺癌的靈敏度在95%的針對其他良性肺病的特異性下被描述為在46至61%之間。增加的CYFRA 21_1血清水平還與明顯的良性肝疾病、腎功能不全和浸潤性膀胱癌相關。CYFRA 21-1檢測被推薦用于術后治療監(jiān)測。CEA屬于胎兒癌性抗原類群，通常在胚胎發(fā)生過程中產生。CEA不是器官特異性的并且主要用于結直腸癌的監(jiān)測。除了惡性腫瘤外，還有幾種良性疾病例如肝硬化、支氣管炎、胰腺炎和自身免疫疾病與增加的CEA血清水平相關。在對于良性肺疾病95%的特異性下，其對于肺癌的敏感度據(jù)報導為29-44%。CEA的優(yōu)選用途是肺癌的治療監(jiān)測。NSE是SCLC的腫瘤標記物。通常，發(fā)現(xiàn)增加的NSE血清水平與神經外胚層和神經內分泌瘤相關。還在患者中發(fā)現(xiàn)增加的血清水平與良性肺病和腦病例如腦膜炎或腦的其他炎性疾病以及對頭的跌打損傷相關。雖然對于SCLC (在95%的特異性下)的靈敏度據(jù)報導為60-87%，但對于NSCLC，NSE的性能較差(7-25%的靈敏度)。NSE被推薦用于SCLC的治療監(jiān)測。關于標記物特征和針對提高的肺癌的診斷，公布了使用基于模糊邏輯學的分類算法來組合CYFRA 21-1、NSE和C反應蛋白(CRP)(其為一般炎癥標記物)的血清水平的方法(Schneider, J.，等人，Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者報導了在 95% 的特異性下的92%的靈敏度。然而，在該研究中，例如CYFRA 21-1作為單個腫瘤標記物的靈敏度據(jù)報導在95%的特異性下為72%，這比在許多其他報導的研究中報導的顯著更高。Duffy， Μ. J. , in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225_262才艮導了 46%至61%的靈敏度。由Schneider等人獲得的該異常高的性能引起了一些懷疑，其可能由于幾個因素造成。第一，對照患者群體似乎比患者群體更年輕，即群體年齡不十分匹配，并且患者群體包括許多晚期分期。第二且更至關重要地，在用于模糊邏輯限定詞的確定的訓練集的樣品上檢查算法的性能。因此，這些限定詞嚴格來說是針對該集“特制的”并且不用于獨立的驗證集。在正常情況下，勢必期望用于更大的、獨立的且充分平衡的驗證集的相同算法將導致顯著降低的總體性能。本發(fā)明的任務是調查是否可鑒定可用于評估癌癥疾病的生物化學標記物。特別地，本發(fā)明的發(fā)明者調查是否可在體液中鑒定用于評估不同癌癥類型例如肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和腎癌的生物化學標記物。在本發(fā)明的非常優(yōu)選方面，調查了用于肺癌(LC) 或結直腸癌(CRC)的評估的生物化學標記物的鑒定。令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)標記物s印rase的使用可至少部分地克服現(xiàn)有技術中目前已知的標記物的一些問題。本發(fā)明涉及用于體外評估癌癥的方法，其包括測量樣品中seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性以及將測量結果，特別地測定的濃度和/或活性用于癌癥的評估中。
令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)受試樣品中減少的s印rase多肽和/或其片段的濃度和/或活性與癌癥的風險和/或發(fā)生相關。還發(fā)現(xiàn)seprase是對于單一類型的癌癥無特異性但為許多類型癌癥的標記物(即，一般腫瘤標記物)的標記物。因為s印rase對致瘤過程表現(xiàn)出相當?shù)奶禺愋?，因此新型腫瘤標記物對于不同種類的腫瘤類型具有潛在的臨床效果。本發(fā)明的方法適用于評估許多不同類型的癌癥。已例如分別在特定的癌癥類型如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比較，樣品中seprase或其片段的濃度和 /或活性減少。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，為了體外評估特定癌癥類型例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，為了體外評估癌癥例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，為了體外評估癌癥例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌或膽管癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，為了體外評估癌癥例如肺癌(LC)或結直腸癌(CRC)，測量樣品中s印rase的濃度和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，為了體外評估癌癥例如肺癌(LC)，測量樣品中s印rase的濃度和/或活性。本發(fā)明的一個實施方案涉及區(qū)分可能不患癌癥的個體與可能被分類為“疑似”病例的個體的人群的普查。然后可以例如利用成像方法或其他合適的方法使后一個個體群體經歷進一步的診斷過程。本發(fā)明的另外的實施方案涉及適合于診斷一般性癌癥的腫瘤標記物組或適合于診斷特定腫瘤類型例如肺癌或結腸癌的腫瘤標記物組的改進。本發(fā)明還涉及用于利用生物化學標記物體外評估癌癥的方法，其包括測量樣品中 seprase和特異于癌癥的一個或更多個其他標記物的濃度和/或活性，以及將測量結果，特別地測定的濃度用于癌癥的評估。與seprase組合使用的優(yōu)選標記物在另一個方面是為一般性腫瘤標記物(即不特異于單個腫瘤類型的標記物)的標記物或，在另一方面，是為特定腫瘤的標記物(為特異于單個腫瘤類型的標記物)的標記物。例如用于癌癥例如肺癌或結腸癌的評估的優(yōu)選標記物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。此類標記物可各自單個地使用或以任何組合與s印rase —起使用。如果，根據(jù)本發(fā)明的方法，評估癌癥，則各癌癥的一個或更多個其他標記物優(yōu)選選自 Cyfra 21—1、CEA、NSE、CA19—9、CA125、PSA、ASC、S100A12 禾口 NNMT。因此，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還涉及包括標記物s印rase和例如Cyfra 21-1, CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12和NNMT中的至少一個其他腫瘤標記物的標記物組在評估癌癥例如肺癌和/或結腸癌中的用途。優(yōu)選，本發(fā)明涉及用于利用生物化學標記物評估癌癥例如肺癌或結腸癌的方法，其包括測量樣品中seprase和/或其片段以及一個或更多個其他癌癥標記物，例如肺癌或結腸癌的一個或更多個其他標記物的濃度和/或活性，以及將測量結果，特別地測定的濃
7度用于癌癥評估中。優(yōu)選，一個或更多個其他標記物選自Cyfra 21_1、CEA、NSE、CA19_9、CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還涉及包括至少s印rase和CYFRA 21-1的標記物組在評估癌癥，特別地LC或結腸癌以及更特別地NSCLC或結直腸癌中的用途。本發(fā)明還涉及包括至少s印rase和CEA的標記物組用于評估癌癥，特別地LC或結腸癌，以及更特別地NSCLC或結直腸癌的用途。本發(fā)明還涉及包括至少s印rase和SCC的標記物組用于評估癌癥，特別地LC或結腸癌，以及更特別地NSCLC或結直腸癌的用途。本發(fā)明還涉及s印rase多肽和/或其片段在評估癌癥中的用途，其中減少的 seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。本發(fā)明還涉及s印rase在評估幾種特定類型的癌癥，特別地肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌中的用途。本發(fā)明還涉及抗s印rase多肽和/或其片段的抗體在評估癌癥中的用途，其中減少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。本發(fā)明還涉及用于測量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的試劑在評估癌癥中的用途，其中減少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。本發(fā)明還提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括至少特異性測量 seprase多肽和/或其片段和一個或更多個其他癌癥標記物所需的試劑。本發(fā)明還提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括至少特異地測量 seprase和一個或更多個癌癥標記物(例如上述肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的標記物)所需的試劑，其中其他標記物可各自單個地使用或以其任何組合使用。本發(fā)明還提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括至少分別特異性地測量seprase和CYFRA 21-1所需的試劑和任選地用于進行測量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括至少分別地特異性地測量s印rase和CEA所需的試劑和任選地用于進行測量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括至少分別特異性地測量seprase和SCC所需的試劑和任選地用于進行測量的輔助試劑。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于體外評估癌癥的方法，其包括測量樣品中(a) seprase多肽和/或其片段，(b)任選地一個或更多個其他癌癥標記物的濃度和/或活性，和(c)將步驟(a)和任選地步驟(b)的測量結果用于癌癥的評估，其中減少的s印rase和 /或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。術語“測量”優(yōu)選包括樣品中seprase多肽的定性、半定量或定量測量。在優(yōu)選實施方案中，測量是半定量測量，即，確定s印rase的濃度和/或活性是高于還是低于截止值 (cut-off value) 0如本領域技術人員將理解的，在是_(存在)或否_(不存在)測定中，通常將測定靈敏度設置至匹配截止值?？梢岳绺鶕?jù)健康個體組的檢測來確定截止值。優(yōu) 選地，將截止值設置至導致90 %的特異性，還優(yōu)選地將截止值設置至導致95 %的特異性，或還優(yōu)選地將截止值設置至導致98%的特異性。低于截止值的值可以例如預示癌癥的存在。特別地低于截止值的值可以例如預示著肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的存在。在另外的優(yōu) 選實施方案中，seprase的測量是定量測量。在另外的實施方案中，seprase的濃度和/或活性與基本診斷問題如例如疾病的分期、疾病進展或對治療的反應相關。人wprase(別名成纖維細胞活化蛋白(FAP))是170kDa的具有明膠酶和二肽基肽酶活性的膜結合糖蛋白。其由兩個相同的單體單位(UniProt KB數(shù)據(jù)庫，登錄號 P 27487)(特征在于SEQ ID N0:1(圖3)中給定的序列)組成。S印rase單體包含766 個氨基酸并且具有97kDa(SDS-PAGE)的表觀分子量(Pineiro-Sanchez等人，J.Biol. Chem. 272(1997)7595-7601 ;Park 等人，J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。seprase 的可溶性形式是抗纖溶酶切割酶(antiplasmin-cleaving enzyme) APCE (Lee等人，Blood 103 (2004) 3783-3788 ；Lee 等人，Blood 107 (2006) 1397-1404)。APCE 的 N 末端氨基酸序列相應于s印rase的殘基24至38，預測其在成纖維細胞細胞質內具有前6個N末端殘基，接著是20個殘基的跨膜結構域，然后是734個殘基的細胞外C末端催化結構域(Goldstein 等人，Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19 ；ScanIan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1994)5657-5661)。Pineiro -Sanchez等人(同上)發(fā)現(xiàn)增加的s印rase的表達與人黑色素瘤和癌細胞的侵襲性表型相關。Henry等人，Cl in. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水平的間質s印rase的人結腸腫瘤患者更可能具有侵襲性疾病進展以及轉移或復發(fā)的潛在發(fā)展。因此，本領域的上述文獻中沒有一個表明體液中減少的seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。令人驚訝地，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)體液中s印rase多肽和/或其片段的，特別地APCE 的濃度和/或活性例如酶促活性的確定使得能夠評估癌癥例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌。甚至更令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)與正常對照相比較，樣品中減少的s印rase或其片段的濃度和 /或活性預示著癌癥的風險或發(fā)生。如本文中所使用的，每一個下列術語在該部分中具有與其相關的意義。冠詞“a”和“an”在本文中用于指一個或更多個(即，至少一個)冠詞的語法賓語。例如，“a標記物”意指一個標記物或更多個標記物。術語“至少”用于表示任選地一個或更多個另外的物體可存在。例如，包括至少(標記物)s印rase和CYFRA 21_1的標記物組可任選地包括一個或更多個其他標記物。表述“一個或更多個”表示1至50，優(yōu)選1至20，還優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或15。本文中使用的術語“標記物”或“生物化學標記物”是指被用作靶以分析患者的受試樣品的分子。此類分子靶的實例是蛋白質或多肽。在本發(fā)明中用作標記物的蛋白質或多肽預期包括所述蛋白質的天然發(fā)生的變體以及所述蛋白質或所述變體的片段，特別地免疫學可檢測片段。免疫學可檢測片段優(yōu)選包括所述標記物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20 個連續(xù)氨基酸。本領域技術人員認識到由細胞釋放的或存在于細胞外基質中的蛋白質可在例如炎癥期間被破壞，并且可開始降解或被切割成這樣的片段。某些標記物以無活性的形
9式合成，所述形式隨后可通過蛋白質水解激活。如本領域技術人員將理解的，蛋白質或其片段還可作為復合物的部分存在。這樣的復合物在本發(fā)明的意義上也可用作標記物。標記物多肽的變體由相同基因編碼，但作為備選的mRNA或pre-mRNA剪接的結果，可在它們的等電點(=PI)或分子量(=MW)或兩者上不同。變體的氨基酸序列與相應的標記物序列達到 95%或更多的同一。此外，或備選地，標記物多肽或其變體可具有翻譯后修飾。翻譯后修飾的非限定性實例是糖基化、酰基化和/或磷酸化。Seprase 根據(jù)本發(fā)明，術語“S印rase多肽和/或其片段”是指單體或多聚體，特別地二聚體多肽。此外，術語“S印rase多肽和/或其片段”特別地指s印rase和/或其片段的可溶性形式，特別地抗血纖溶酶切割酶(APCE)以及指以與另一種多肽的復合物的形式存在的 seprase 禾口 / 或 seprase 片段。優(yōu)選在適當?shù)臉悠?，特別地體液中檢測S印rase多肽，特別地s印rase多肽和/或其片段的可溶性形式。優(yōu)選樣品是體液例如血液、血漿、血清、痰、尿、糞便等。優(yōu)選，樣品來自人受試者，例如腫瘤患者或處于腫瘤的風險中的人或懷疑患有腫瘤的人。根據(jù)本發(fā)明，測定seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性。在一個實施方案中，通過使用特異性結合劑從樣品特異性地測量標記物。特異性結合劑是例如s印rase的受體、結合s印rase的凝集素或抗s印rase的抗體。特異性結合劑對于其相應的靶分子具有至少IO7Vmol的親和力。特異性結合劑優(yōu)選對于其靶分子具有IO8Vmol或也優(yōu)選IO9Vmol的親和力。如本領域技術人員將理解的，術語特異性用于表示存在于樣品中的其他生物分子不顯著結合特異于seprase的結合劑。優(yōu) 選，對除了靶分子外的生物分子的結合水平分別導致至多僅為10%或更少，僅為5%或更少，僅為2%或更少或僅為或更少的對于靶分子的親和力的結合親和力。優(yōu)選特異性結合劑將滿足上述關于親和力以及特異性的最低標準。特異性結合劑優(yōu)選是與seprase反應的抗體。術語抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、此類抗體的抗原結合片段、單鏈抗體以及指包含抗體的結合結構域的基因構建體?？墒褂帽３痔禺愋越Y合劑的上述標準的任何抗體片段。通過現(xiàn)有技術方法，例如， ^PITijssen, P. , Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam, the whole book，特別地第 43 至 78 頁中描述的方法，產生抗體。此外，本領域技術人員十分了解基于可用于抗體的特異性分離的免疫吸附劑的方法。通過此類方法，可提高多克隆抗體的質量，從而增強它們在免疫測定中的性能。(Tijssen， P.，同上，第108至115頁)。為了達到本發(fā)明中公開的成就，可使用在兔子中產生的多克隆抗體。然而，也很顯然，還可使用來自不同物種例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體以及單克隆抗體。因為單克隆抗體可以以任何需要的量和恒定的性質產生，它們代表了用于臨床常規(guī)測定的開發(fā)的理想的工具。在根據(jù)本發(fā)明的方法中抗seprase的單克隆抗體的產生和應用分別代表了其他優(yōu)選實施方案。適合于檢測s印rase的抗體的優(yōu)選實例公開于Pifieiro-Sdnchez等人，同上，例如抗體D8、D28和D43。正如本領域技術人員現(xiàn)將認識到s印rase已被鑒定為用于評估癌癥優(yōu)選肺癌或結腸癌的標記物。不同的免疫診斷方法可用于獲得可與本發(fā)明的成就相當?shù)慕Y果。例如，可使用產生抗體的備選策略。這樣的備選策略包括除其他以外，合成肽的使用、提供seprase 的表位以進行免疫。備選地，可使用也稱為DNA疫苗接種的DNA免疫。為了進行測量，將獲自個體的樣品在適合于結合劑seprase復合物形成的條件下與s印rase的特異性結合劑一起溫育。這樣的條件不必詳細說明的，因為本領域技術人員無需任何發(fā)明努力就可容易地鑒定這樣的合適的溫育條件。在癌癥優(yōu)選肺癌的評估中測量和使用結合劑seprase復合物的量。本領域技術人員將理解，存在許多測量特異性結合劑 seprase復合物的量的方法，其全都詳細地描述于相關教科書(參見，例如，Ti jssen，P.，同上，或 Diamandis, E. P.,禾口 Christopoulos, T. K. (eds. ), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。優(yōu)選，在夾心類型測定形式中檢測seprase。在這樣的測定中，將第一特異性結合劑用于將seprase捕獲在一側，并且將經標記可被直接或間接檢測的第二特異性結合劑用于另一側。用于夾心類型測定形式的特異性結合劑可以是特異性抗seprase抗體。在一方面，可通過使用不同的捕獲和標記抗體(即，識別s印rase多肽上的不同表位的抗體)進行檢測。在另一個方面，還可使用抗s印rase的相同表位的捕獲和標記抗體進行夾心類型測定。在該實施方案中，只有seprase的二聚體和多聚體形式可被檢測到。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方案，通過使用適合于檢測seprase的酶促活性的檢測方案來從樣品特異性地測量標記物s印rase。酶促活性可以例如是明膠酶活性或肽酶活性。可以例如使用明膠酶的酶譜，通過酶譜法來測定明膠酶活性。可以例如，使用肽底物，通過熒光測定法來測定肽酶活性。用于測量seprase活性的測定法由例如Lee等人(2006)(同上)描述。在本發(fā)明的意義上“癌癥的標記物”和特別地“肺癌的標記物”以及“結腸癌的標記物”是如果與標記物s印rase組合可在癌癥的評估中，例如在一般性癌癥的評估中或在某些癌癥類型的評估中(例如在LC或CRC的評估中)增加相關信息的任何標記物。如果可通過將所述標記物包括入已包含標記物s印rase的標記物組合來分別提高對于癌癥評估的敏感度(在給定的特異性下)或特異性(在給定的靈敏度下)，則信息被認為是相關或為相加值(additive value) 0在優(yōu)選癌癥評估的實施方案中，靈敏度或特異性的提高分別地在ρ = . 05、. 02、. 01或更低的顯著性水平上是統(tǒng)計學上顯著的。優(yōu)選，一個或更多個其他腫瘤標記物選自 CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9, CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。本文中使用的術語“樣品，，是指獲得用于體外評估目的的生物樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選可包括任何體液。優(yōu)選樣品是全血、血清、血漿、支氣管灌洗物 (bronchial lavage)或痰，血漿或血清是最優(yōu)選的。術語“評估癌癥”和特別地“評估肺癌”或“評估結腸癌”用于表示根據(jù)本發(fā)明的方法將(單獨地或與其他標記物或變量，例如由UICC所示的標準(參見上文)一起)例如幫助醫(yī)師確定或確認癌癥特別地LC或CRC的不存在或存在或幫助醫(yī)師預后、檢測復發(fā)(術后患者的隨訪)和/或監(jiān)測治療特別地化學治療。如本領域技術人員將理解的，任何此類評估是在體外進行的。之后棄去患者樣品。患者樣品只用于本發(fā)明的體外診斷方法，并且不將患者樣品的材料轉移回患者體內。通常，樣品是液體樣品，例如全血、血清或血漿。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于利用生物化學標記物評估癌癥例如LC或CRC的方法，其包括測量樣品中seprase的濃度和將測定的濃度和/或活性用于癌癥例如LC或 CRC的評估。本發(fā)明的發(fā)明者已令人驚訝地能夠在顯著百分比的來源于患有癌癥特別地患有肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的患者的樣品中檢測到減少的標記物seprase的濃度和/或活性。更令人驚訝地，他們已能夠證明獲自個體的此類樣品中減少的s印rase的濃度和/或活性可用于癌癥特別地上述癌癥疾病的評估。進行診斷的理想的情形是其中單個事件或過程可在例如感染性疾病中引起各自疾病的情形。在所有其他情況下，正確的診斷可能非常困難，尤其當疾病的病因學未完全弄清楚時，對于許多癌癥類型例如對于LC的情況就是如此。如本領域技術人員將理解的，不存在對于給定的多因子疾病例如LC的診斷既具有100%的特異性同時又具有100%的靈敏度的生物化學標記物。相反，生物化學標記物例如CYFRA 21-1、CEA、NSE，或如本文中所顯示的seprase可用于以某種可能性或預測值例如存在、不存在或嚴重度來評估疾病。因此在常規(guī)臨床診斷中，通常在潛在的疾病的診斷、治療和管理中同時考慮不同的臨床癥狀和生物學標記物?？梢詥蝹€地測定生物化學標記物或在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中使用基于芯片或珠粒的陣列技術同時測量它們。然后例如使用各標記物的個體截止值獨立地解釋生物標記物的濃度，或將它們組合以進行解釋。在另外的優(yōu)選實施方案中，在方法中進行根據(jù)本發(fā)明的癌癥的評估，所述方法包括測量樣品中a) seprase多肽和/或其片段，和b) —個或更多個其他癌癥標記物的濃度和 /或活性，以及c)將測量結果，例如分別在步驟(a)和步驟(b)中測定的濃度用于癌癥的評估。在癌癥的評估中，標記物seprase在一個或更多個下列方面中是有利的篩查；診斷幫助；預后；治療例如化學治療、放射治療和免疫治療的監(jiān)測。篩查篩查定義為就疾病的指標，例如癌癥的存在鑒定個體例如處于風險中的個體的檢測的系統(tǒng)性應用。優(yōu)選篩查群體由已知處于比平均水平更高的癌癥風險中的個體組成。例如，肺癌的篩查群體由已知處于比肺癌的平均風險更高的風險中的個體(如吸煙者、曾吸煙者(ex-smoker)和暴露于鈾、石英和石棉的工人)組成。在優(yōu)選實施方案中，體液例如血清或痰在癌癥例如肺癌或結直腸癌的篩查中用作樣品。對于許多疾病，循環(huán)中沒有單個生物化學標記物可以總是滿足篩查目的所需的靈敏度和特異性標準。這對于癌癥，特別地肺癌似乎也是如此。勢必期望必須將包括多個標記物的標記物組用于癌癥的篩查。本發(fā)明中確定的數(shù)據(jù)表明標記物s印rase將形成適合用于篩查目的的標記物組的構成整體所必需的(integral)部分。本發(fā)明因而涉及s印rase作為癌癥標記物組(即包括seprase和一個或更多個另外的用于癌癥篩查目的的標記物的標記物組)的一個標記物的用途。特別地，本發(fā)明涉及s印rase作為一般性癌癥標記物組中的一個標記物的用途。這樣的標記物組包括標記物s印rase和一個或更多另外的標記物，例如一般性癌癥標記物和/或用于上述類型的癌癥的標記物。
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Seprase還可能貢獻于用于某些特定類型癌癥例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的標記物組。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優(yōu)選類型的癌癥是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優(yōu)選類型的癌癥是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優(yōu)選類型的癌癥是肺癌、結腸癌。使用包括s印rase的標記物組評估的優(yōu)選類型的癌癥是肺癌(LC)。本數(shù)據(jù)還表明標記物的某些組合在癌癥的篩查中是有利的。例如，參考篩查LC 或CRC的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明還涉及包括s印rase和CYFRA 21-1的標記物組、或包括 s印rase和CEA的標記物組、或包括s印rase和NSE的標記物組、或包括s印rase和CA 19-9 的標記物組、或包括s印rase和CA 125的標記物組、或包括s印rase和PSA的標記物組、或包括s印rase和ASC的標記物組、或包括s印rase和S100A12的標記物組、或包括s印rase 和NNMT的標記物組、或包括s印rase和兩種或更多種選自CYFRA 21-1, CEA,NSE, CA 19-9, CA 125，PSA, ASC, S100A12和NNMT的標記物組的用途。診斷輔助物標記物可以有助于特定器官中良性對惡性疾病的鑒別診斷，幫助區(qū)分不同的組織學類型的腫瘤或在手術前建立基線標記物值。當今，用于檢測癌癥的重要方法是放射學和/或計算機斷層(CT)掃描?？赏ㄟ^ 這些方法顯現(xiàn)小瘤(Small nodule)即可疑組織的小區(qū)域。然而，許多此類小瘤_90%以上 (通過CT)-代表良性組織變化，只有少數(shù)小瘤代表癌性組織。標記物s印rase的使用可有助良性對惡性疾病的區(qū)分。因為作為單個標記物的s印ras可能優(yōu)于其他標記物，例如在LC的情況下優(yōu)于其他標記物，如CEA或NSE，因此勢必期望將s印rase用作診斷輔助物(特別地通過在手術前確定基線值)。本發(fā)明因此還涉及seprase用于在癌癥的手術之前確定基線值的用途。預后預后指標可定義為以一定的可能性預測疾病結果的癌癥患者和它們的腫瘤的臨床、病理學或生物化學特性。它們的主要用途是幫助合理地計劃患者管理，即分別避免對侵襲性疾病的處理不足和對怠惰性疾病(indolent disease)的治療過度。Molina，R.，等人， Tumor Biol. 24(2003)209-218 評估了 CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC 和 NSE 在 NSCLC 中的預后價值(prognostic value) 0在他們的研究中，標記物NSE、CEA和LDH(乳酸脫氫酶)的異常血清似乎表示更短的存活時間。由于S印rase單獨地顯著促進癌癥患者例如LC或CRC患者與健康對照的區(qū)分，因此必需期望其將有助于評估患有癌癥優(yōu)選患有LC或CRC的患者的預后。將最可能把術前 seprase的水平與一個或更多個其他癌癥標記物和/或TNM分期系統(tǒng)組合。在優(yōu)選實施方案中，seprase用于患有LC或CRC的患者的預后。化學治療的監(jiān)測Merle，P.，等人，Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315 已評估了用誘導化療法治療的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21_1血清水平的變化。他們得出 CYFRA 21-1血清水平的早期監(jiān)測可以是III期NSCLC患者中腫瘤反應和存活的有用的預后工具。此外，報告已描述了 CEA在監(jiān)測患有LC的患者的治療中的用途(FukasawaJ.，等人，Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867)。大多數(shù)此類研究是基于回憶的、非隨機化的并且包括少數(shù)患者。如在使用CYFRA 21-1的研究的情況下，CEA研究表明a)CEA水平降低同時接受化學治療的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的結果以及(b) 對于所有患者，CEA水平的增加與疾病的進展相關。預期s印rase將是分別與CYFRA 21-1或CEA至少一樣好的用于化學治療的監(jiān)測的標記物。本發(fā)明因此還涉及s印rase在監(jiān)測處于化學治療中的癌癥患者，優(yōu)選肺癌(LC) 或結腸癌(CRC)患者中的用途。在一個優(yōu)選實施方案中的治療監(jiān)測中，可將對于s印rase 的測量與對于至少一種選自CYFRA 21-1、CEA和/或NSE的標記物的測量組合，然后將其用于肺(LC)癌的評估。隨訪大部分經歷目的在于完全清除癌性組織的手術切除的LC患者日后發(fā)生復發(fā)性或轉移性疾病(Wagner，H.，Chest 117(2000) 110-118 ；Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此類復發(fā)在術后前2至3年內發(fā)生。因為如果檢測得太遲，復發(fā)性/轉移性疾病常常是致命的，因此相當多的研究集中在處于早期，從而潛在地可治療的分期的癌癥復發(fā)上。因此，許多癌癥患者例如LC患者經歷了頻繁包括使用CEA的定期監(jiān)測的術后監(jiān) 測方案。已顯示手術切除術后一年使用CEA的系列監(jiān)測甚至在疑似癥狀或體征不存在的情況下，在大約97%的特異性下以大約29%的靈敏度檢測到早期術后復發(fā)/轉移性疾病 (Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75(2003)973-980)。因此，術后患有 LC 的患者的隨訪是合適的生物化學標記物的用途的最重要的領域之一。由于s印rase在被調查的LC患者中的高度靈敏度，seprase (單獨地或與一個或更多個其他標記物組合)可能極大地幫助 LC患者的隨訪，尤其在術后LC患者的隨訪。包括s印rase和一個或更多個LC的標記物的標記物組合在LC患者的隨訪中的用途代表了本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方案。本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中涉及s印rase在癌癥的診斷領域中的用途。優(yōu)選， seprase分別用于肺癌(LC)、結腸癌(CRC)、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的評估。在另外的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及seprase作為與一個或更多個另外的癌癥標記分子組合的癌癥例如一般性癌癥或特定類型的癌癥(例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌)的標記分子的用途。另外的標記分子可以是癌癥類型非特異性一般性標記分子和/或癌癥類型特異性標記分子，例如肺癌或結腸癌的標記物。Seprase和至少一個另外的標記物用于獲自個體的液體樣品中癌癥例如肺癌或結腸癌的評估。優(yōu)選選擇的可將其與seprase 的測量組合的其他癌癥標記物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA125、CA19-9, PSA、ASC、S100A12 和NNMT。特別地，優(yōu)選選擇的可將s印rase的測量與其組合的其他LC標記物CYFRA 21-1, CEA和/或NSE。用于評估癌癥例如LC的優(yōu)選標記物組包括seprase和至少一個選自CYFRA 21-1和CEA的其他標記分子。
如本領域技術人員將理解的，存在許多使用兩個或更多個標記物的測量以改進調查中的診斷問題的方法。在相當簡單但通常有效的方法中，如果樣品對于至少一種被調查的標記物是陽性的，則假定為陽性結果。這可以例如是當診斷感染性疾病如AIDS時的情況。然而，頻繁地，評估標記物的組合。優(yōu)選，將測量的標記物組的標記物例如s印rase 和CYFRA 21-1的值算術組合，并且使組合的值與基本診斷問題發(fā)生關系?？赏ㄟ^任何合適的現(xiàn)有技術數(shù)學方法來組合標記物值。用于使標記物組合與疾病發(fā)生關系的熟知的數(shù)學方法使用方法如判別分析(DA)(即線性-、二次-、正則化-DA)、核方法(即SVM)、非參數(shù)法(即k-最近鄰分類器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(即邏輯斯蒂回歸、CART、隨機森林法(RandomForest Method)、 Boosting/套袋法(Bagging Methods))、廣義線性模型(即邏輯斯蒂回歸)、基于組成分的方法(Principal Components basedMethod)(即SIMCA)、廣義加法模型、基于模糊邏輯的方法(Fuzzy Logicbased Method)、神經網(wǎng)絡和基于遺傳算法的方法。本領域技術人員在選擇合適的方法評估本發(fā)明的標記物組合中將沒有問題。優(yōu)選，用于使本發(fā)明的標記物組合例如與LC的不存在或存在發(fā)生關系的方法選自DA(即線性_、二次_、正則化判別分析)、核方法(即SVM)、非參數(shù)法(即k-最近鄰分類器)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(Tree-BasedMethod)(即邏輯斯蒂回歸、CART、隨機森林法、Boosting法)或廣義線性模型(即邏輯斯蒂回歸)。關于此類統(tǒng)計方法的詳細內容見于下列參考文獻 Ruczinski，I·，等人，J· of Computational and Graphical Statistics，12 (2003) 475-511 ； Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association84(1989) 165-175 ； Hastie， Trevor, Tibshirani， Robert， Friedman， Jerome， The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics (2001) ；Breiman，L.，F(xiàn)riedman，J. H.， Olshen，R. A.，Stone，C. J. (1984)Classification and regression trees，California Wadsworth ；Breiman, L，Random Forests，Machine Learning，45 (2001) 5-32 ；Pepe，M. S.， TheStatistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical Science Series 28(2003)；禾口 Duda，R. 0.，Hart，P. E.，Stork，D. G.， Pattern Classification, Wiley Interscience，第 2 片反(2001)。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是使用生物學標記物的基本組合的最優(yōu)化多變量截止值來區(qū)分狀態(tài)A與狀態(tài)B (例如區(qū)分患病的與健康的)。在該類型的分析中，標記物不再是獨立的而是形成標記物組。診斷方法的精確性通過其受試者工作特性(ROC)(特別地參見Zweig，Μ. H.，和 Campbell,G.，Clin. Chem. 39(1993)561-577)得到最佳描述。ROC圖是由在整個觀察到的數(shù) 據(jù)范圍內連續(xù)改變決策閾值產生的所有靈敏度/特異性對的曲線。實驗室檢測的臨床性能取決于其診斷精確性或正確地將受試者分類至臨床相關亞組的能力。診斷精確性測量檢測的正確區(qū)分被調查的受試者的兩個不同狀況的能力。此類狀況是例如健康和疾病或良性疾病對惡性疾病。在各情況下，ROC曲線通過在完全的決策閾值范圍內將靈敏度對1-特異性作圖來描述兩個分布之間的重疊。靈敏度或真陽性分數(shù)[定義為(真陽性檢測結果的數(shù)目)/ (真陽性檢測結果的數(shù)目+假陰性檢測結果的數(shù)目)]在y軸上。這也稱為在疾病或病狀存在的情況下的陽性。其只根據(jù)受影響的亞組來計算。假陽性分數(shù)或ι-特異性[定義為 (假陽性結果的數(shù)目)/(真陰性結果的數(shù)目+假陽性結果的數(shù)目)]在X軸上。其是特異性的指數(shù)并且完全根據(jù)未受影響的亞組來計算。因為通過使用來自兩個不同亞組的檢測結果完全分別地計算真陽性分數(shù)和假陽性分數(shù)，因此ROC曲線不依賴于樣品中疾病的流行性 (prevalence)。ROC曲線上的各點代表相應于特定決策閾值的靈敏度/1-特異性對。具有完美區(qū)分(兩個結果的分布中無重疊)的檢測具有通過左上角的ROC曲線，其中真陽性分數(shù)是1.0或100% (完美的靈敏度)，并且假陽性分數(shù)為0(完美的特異性)。無區(qū)分(對于兩組為相同的結果分布)的檢測的理論曲線是從左下角至右上角的45°對角線。大部分曲線落在這兩個極端值之間。(如果ROC曲線完全落在45°對角線以下，這可通過將“陽性”標準從“大于”轉變成“小于”或反之亦然來容易地矯正)。定性地，曲線越接近左上方的角，檢測的總體精確性越高。定量實驗室檢測的診斷精確性的一個優(yōu)選方法是利用單個數(shù)字表示其性能。這樣的總體參數(shù)例如稱為“總誤差(total error)”或備選地“曲線下的面積=AUC”。最普遍的全局測量是ROC曲線下的面積。按常規(guī)，該面積總是大于0. 5 (如果不是，可顛倒決策規(guī)則來使其大于0. 5)。值在1. 0 (兩組的檢測值完全分離)至0. 5 (兩組檢測值之間無顯著分布差異)之間變化。面積不僅取決于曲線的特定部分例如離對角線最近的點或在90%特異性下的靈敏度，而且還取決于整個曲線。這是ROC曲線接近完美曲線(面積=1.0)的程度的定量描述性表述。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于通過分別測量樣品中至少s印rase和CYFRA 21-1以及任選地CEA和/或NSE的濃度，然后使測定的濃度與癌癥例如LC或CRC的存在或不存在發(fā)生關系來提高癌癥例如LC或CRC對健康對照的診斷精確性的方法，當與基于任何單個的單獨調查的標記物的分類相比較時，改進導致更多的患者被正確地分類為患有癌癥，例如LC或CRC對健康對照。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase和CYFRA 21-1的濃度，并且將標記物組合用于評估癌癥例如LC或CRC。在根據(jù)本發(fā)明的另外的優(yōu)選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase和CEA的濃度，并且將標記物組合用于評估癌癥例如LC或CRC。在根據(jù)本發(fā)明的另外的優(yōu)選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的濃度，并且將標記物組合用于評估癌癥例如LC或CRC。在根據(jù)本發(fā)明的另外的優(yōu)選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的濃度，并且將標記物組合用于評估癌癥例如LC或CRC。在根據(jù)本發(fā)明的另外的優(yōu)選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和NSE的濃度，并且將標記物組合用于評估癌癥例如LC或CRC。提供下列實施例、參考文獻、序列表和圖來幫助理解本發(fā)明，其真實范圍示于所附權利要中。應當理解，可在所示的方法中進行變動而不背離本發(fā)明的精神。附圖概述

圖1顯示結直腸癌(CRC)患者和健康對照患者以及健康對照中血清s印rase濃度的分布。圖2顯示肺癌(LC)患者和健康對照中血清s印rase濃度的分布。
圖3顯示人s印rase的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。實施例1使用大鼠單克隆抗s印rase抗體(克隆D8、D28和D43)作為s印rase特異性結合分子(Pineiro-Sanchez，Μ. -L.，等人，J. Biol. Chem.，272 (1997) 7595-7601)。單克隆大鼠IgG的生物素化使單克隆大鼠IgG(克隆 D28 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl 中達到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(3. 6mg/ml于DMSO 中)。在室溫下進行 30 分鐘后，將樣品在 Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上進行層析。收集含有生物素化的IgG的級分。單克隆大鼠IgG的地高辛化(Digoxygenylation)使單克隆大鼠IgG (克隆 D8 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, 30mM NaCl，pH 7. 5 中達到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1地高辛-3-0-甲基羰基-ε -氨基己酸-N-羥基丁二酷亞胺活化月旨(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (3. 8mg/ ml 于 DMSO 中)。在室溫下進行 30 分鐘，將樣品在Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上進行層析。收集含有地高辛化的IgG的級分。實施例2用于人血清和血漿樣品中s印rase的測量的ELISA。為了檢測人血清或血漿中的s印rase，發(fā)展了夾心ELISA。在第一測定形式中，將綴合有生物素的抗seprase單克隆抗體和綴合有地高辛(參見實施例1)的等分用于捕獲和檢測抗原(D28XD8形式)。在第二測定形式中，將分別綴合有生物素和地高辛的抗 seprase單克隆抗體D43(參見實施例1)的等分用于捕獲或檢測抗原(D43XD43形式)。將樣品(75 μ 1)與150 μ 1各自含有0. 375 μ g的D28_生物素和D8-地高辛抗體或備選地D43-生物素和D43-地高辛抗體的抗體試劑于溫育緩沖液(40mM磷酸鹽、200mM酒石酸鈉、IOmM EDTA、0. 05%苯酚、0. 聚乙二醇 40000、0· Tween 20,0. 2% BSA,0. 1% 牛IgG和0. 02% 5-溴-5-硝基-1，3- 二噁烷并且調整至pH 7. 4)中混合。在溫育2小時后，將2X100 μ 1的混合物轉移入鏈霉抗生物素涂鋪的微量滴定板的分開的孔中，再溫育另外1小時。用清洗緩沖液(10mMTris、150mM NaCl,0. 05% Tween 20)清洗板3次。在下一步驟中，用30mU/ml的通用綴合緩沖液(Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Germany, Catalog #11684825) Φ W^liftι Φ "HRP fAtx^ (Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany, Catalog#1633716)溫育孔，進行60分鐘，然后如之前一樣進行清洗。^Bffl 100μ 1(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog#12034425)溫育孔進行1小時。加入2N硫酸(50 μ 1)終止顯色并且將藍色轉變成黃色。用ELISA讀數(shù)器在450nm測量0D。所有溫育在室溫下進行。用溫育緩沖液預稀釋人血清或血漿的樣品至 0.15%的終濃度。為了進行校準，將血清池用作標準。用溫育緩沖液將其稀釋至 0. 09/0. 18/0. 27/0. 36/0. 45% 的終濃度以分別產生具有 0. 03/0. 06/0. 09/0. 12/0. 15 單位
17/ml的任意給定的值的標準。通過線性回歸分析計算校正曲線方程，將其用于將孔的吸光度讀數(shù)轉換成相應的濃度值。將結果乘以預稀釋因子以獲得各樣品本身的濃度。實施例3CRC研究群體在第一研究中，使用來源于49孔表征的患有結直腸癌(表1中給出的UICC分類) 的患者的樣品?？鼵RC研究跨UICC分期的樣品的分布與獲自50個明顯健康的無任何已知惡性疾病(=對照組群)的個體的對照樣品相比較，評估表1的樣品。實施例4LC研究群體完全不依賴于第一研究的第二研究集中于非小細胞肺癌(NSCLC)。更具體地，調查患有主要類型的NSCL、腺癌和鱗狀細胞癌的患者。表2a描述了癌癥組群的類型和分期分布。表 2aLC研究LC樣品的類型和分期本研究中的對照組群經特別地定義包括來自表2b中描述的吸煙者和不抽煙者的樣品。對各個體進行肺量測定法(spirometry)肺功能檢測(Miller，Μ. R.等人，Eur. Respir. J. 26 (2005) 319338)。只有供體的結果在正常范圍內時，才將樣品包括在對照組群中。表 2bLC研究對照組群的組成實施例5S印rase區(qū)分癌癥患者與健康對照seprase的血清濃度在癌癥患者與健康對照之間顯著不同，如在兩個研究中發(fā)現(xiàn) 的一樣。在圖1和2中，顯示了使用D28和D8抗體的組合物測定的結果。癌癥患者組群的平均濃度顯著比對照組群的低在CRC和LC研究中分別看到患者中的22. 6和20. 9U/ml對對照中的33. 6和35. 6U/ml。對于對各對照組群產生95%的特異性的截止值，結直腸癌的靈敏度為67%。對于肺癌其為62%。靈敏度對于癌癥的所有分期都相似，如從CRC和LC數(shù)據(jù)(表3和4)可看到的。因此，seprase可用作疾病的早期指示劑。對于肺癌，對于鱗狀細胞癌的靈敏度比對于腺癌的更高(表4)。^t 3CRC研究靈敏度取決于UICC分類
LC研究靈敏度取決于類型和分期使用只檢測seprase的二聚體或多聚體形式的2個D43抗體的測定的結果與其密切相關(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例6用于CRC和LC的其他標記物的靈敏度除了 seprase以外，我們在CRC和LC研究樣品中測定了 10個其他熟知的腫瘤標記物。在該情況下使用可商購獲得的檢測試劑盒。為了在它們之間進行公平比較，將被調查的各標記物的截止值設置為在各自研究的對照組群中產生95%的特異性。表5提供了各標記物對于兩種癌癥類型的檢測的靈敏度?？鼵RC和LC的不同癌癥標記物靈敏度 S印rase對于CRC和LC顯示相似的靈敏度。總體上，其平均為64. 5%，為在所有評估的標記物中觀察到的最高值。只有Cyfra 21_1具有相同的平均靈敏度。然而，Cyfra 在CRC的檢測中不如s印rase有效。與這兩者相比較，通過所有其他測量的腫瘤標記物顯示的性能相當差。實施例7標記物組合如果各組的至少一個標記物超過某個閾值，則個體被分類為患有癌癥。通常，此類截止值與用于單個標記物情況的值不同，但類似地對于各組合物產生95 %的特異性。兩個最顯著的標記物s印rase和Cyfra 21-1的組合顯著地提高了癌癥的檢測并且在LC研究中產生80%的靈敏度。實施例8使用Seprase作為腫瘤標記物進行的不同癌癥與年齡匹配的健康對照的區(qū)分在該研究中，測量來自患有不同癌癥疾病的良好表征的患者的樣品(樣品編號和 UICC分類提供于表6中)。通過將表6的樣品與264個年齡匹配的對照患者相比較來進行評估，所述對照患者是無任何已知惡性疾病的明顯健康的個體。在該對照組群中，測定截止值，獲得95%的特異性。不同癌癥實體中的靈敏度
在食道癌、頭頸癌、胃癌和膽管癌中以及對于LC和CRC (表5中顯示的數(shù)據(jù))獲得了對于s印rase的高靈敏度。已發(fā)現(xiàn)s印rase對于胰腺癌和腎癌的良好靈敏度。還發(fā)現(xiàn) seprase在子宮頸癌、卵巢癌和乳腺癌的評估中的較低的靈敏度。盡管在篩查設置(在95% 的特異性下)中在乳腺癌中具有相對較低的靈敏度(18%)，但s印rase還可被認為是乳腺癌的復發(fā)監(jiān)測的有吸引力的標記物。常規(guī)用于該期望的用途的標記物CA 15-3和CEA在乳腺癌集合中分別只顯示6%和11%的靈敏度，這低于標記物s印rase。
權利要求
用于體外評估癌癥的方法，其包括測量樣品中下列物質的濃度和/或活性a)seprase多肽或其片段，b)任選地一個或更多個其他癌癥標記物，和c)在癌癥的評估中使用步驟(a)和任選地步驟(b)的測量結果，其中減少的seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。
2.權利要求1的方法，其用于評估特定癌癥類型。
3.權利要求2的方法，其中特定癌癥類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌。
4.權利要求2或3的任一項的方法，其中特定癌癥類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌或乳腺癌。
5.權利要求2至4的任一項的方法，其中特定癌癥類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌或腎癌。
6.權利要求2至5的任一項的方法，其中特定癌癥類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌或膽管癌。
7.權利要求2至6的任一項的方法，其中癌癥是肺癌(LC)或結直腸癌(CRC)。
8.權利要求2至7的任一項的方法，其中癌癥是肺癌(LC)。
9.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物是癌癥類型非特異性一般性癌癥標記物。
10.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物是癌癥類型特異性癌癥標記物。
11.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物選自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
12.權利要求11的方法，其中所述一個或更多個其他標記物是CYFRA21-1。
13.權利要求11的方法，其中所述一個或更多個其他標記物是CEA。
14.權利要求1至13的任一項的方法，其中樣品是體液樣品。
15.權利要求1至14的任一項的方法，其中樣品是血液、血清或血漿樣品。
16.權利要求1至15的任一項的方法，其中樣品是人樣品。
17.權利要求1至16的任一項的方法，其中測量s印rase多肽和/或其片段的濃度。
18.權利要求17的方法，其中通過免疫學方法測量濃度。
19.權利要求1至18的任一項的方法，其中測量seprase多肽的二聚體或多聚體形式。
20.權利要求1至19的任一項的方法，其中測量seprase多肽的單體形式。
21.權利要求1至21的任一項的方法，其中測量s印rase多肽和/或其片段的酶促活性。
22.權利要求21的方法，其中測量抗血纖溶酶切割活性。
23.seprase多肽和/或其片段在癌癥的評估中的用途，其中減少的s印rase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。
24.抗s印rase抗體和/或其片段在癌癥的評估中的用途，其中減少的s印rase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。
25.用于測量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的試劑在癌癥的評估中的用途，其中減少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。
26.權利要求23至25的任一項在肺癌特別地NSCLC的評估中或在結腸癌特別地結直腸癌(CRC)的評估中的用途。
27.包括s印rase多肽和/或其片段以及一個或更多個其他癌癥標記物的標記物組在癌癥的評估中的用途，其中減少的seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌癥。
28.權利要求27的用途，其中一個或更多個標記物是癌癥類型非特異性和/或癌癥類型特異性標記物。
29.權利要求28的用途，其中一個或更多個其他標記物在肺癌或結腸癌的評估中是肺癌標記物。
30.權利要求27至29的任一項的用途，其中一個或更多個其他標記物選自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
31.權利要求27至30的任一項的用途，其中標記物組包括至少s印rase和/或其片段和 CYFRA 21-1。
32.用于進行根據(jù)權利要求1至22的任一項的方法的試劑盒，所述試劑盒包括特異性地測量seprase多肽和/或其片段以及一個或更多個其他癌癥標記物所需的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及有助于評估癌癥的方法。其公開了人成纖維細胞活化蛋白(FAP/seprase)作為不同癌癥類型的通用標記物的用途。Seprase有助于與肺有關的癌癥或肺癌(LC)或結腸癌例如非小細胞肺癌(NSCLC)或結直腸癌(CRC)，而且還可能其他特定類型的癌癥的評估。此類特定癌癥類型是例如食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌。此外，其特別地涉及用于通過測量來源于個體的液體樣品中的seprase來從所述樣品評估癌癥的方法。seprase的測量可以例如用于癌癥的早期檢測或用于經歷手術的患者的監(jiān)測。
文檔編號G01N33/574GK101896818SQ200880119930
公開日2010年11月24日申請日期2008年12月8日優(yōu)先權日2007年12月10日
發(fā)明者J·P·科錢, J·卡爾, M·塔克, M·羅斯勒, W·羅林格申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司

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