專利名稱：：提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提取物。更具體地說，本發(fā)明涉及一些來源于富含脂肪酰胺化合物的海產(chǎn)原料的油提取物，所述脂肪酰胺化合物包括N-?；掖减０?NAE)化合物，例如N-十六酰乙醇酰胺(PEA)和N-花生四烯酰乙醇胺(大麻素，AEA)。
背景技術(shù)：
：N-十六酰乙醇酰胺(PEA)是一種內(nèi)源性脂肪酸酰胺，屬于眾所周知的N-?；掖及?NAE)族，該N-?；掖及纷灏?大麻類"化合物，如N-花生四烯酰乙醇胺(大麻素，AEA)。PEA和AEA有可能治療一些人/動(dòng)物的疾病，包括異常炎癥和/或免疫反應(yīng)及相關(guān)的疼痛(參見Lambert等，2002，評(píng)論)。PEA和其他NAE的歷史和科學(xué)文獻(xiàn)概述a)起源PEA是一種天然生成的脂質(zhì)，在動(dòng)物、海產(chǎn)物和植物源的許多不同細(xì)胞之中可以發(fā)現(xiàn)(參見Lambert等，2002，評(píng)論)。在活的生物體內(nèi)，PEA合成迅速，以響應(yīng)諸如組織損傷或病理學(xué)損害之類的細(xì)胞應(yīng)激源(cellularstressors)，它們往往伴隨著炎癥和疼痛(Darmani等，2005)。雖然PEA在人體中的生物學(xué)功能，尚未完全搞清，但人們一直推測(cè)，PEA是幾種天然的消炎鎮(zhèn)痛化學(xué)藥品化學(xué)物質(zhì)之一(Darmani等，2005)。使用氯仿和甲醇自凍干的綠貽貝(Pemflca"fl/fcw^)肉提取的粗脂，由甘油三酸酯、甾醇酯、甾醇、極性脂、游離脂肪酸及其衍生物，例如?；掖减０?NAE)的復(fù)雜混合物所組成(Sepe等，1998;Murphy等，2002;Murphy等，2003)。PEA和N-硬酯酰乙醇酰胺是貽貝的脂質(zhì)提取物中最大量的NAE，還有很少量的N-肉豆蔻酰(C14:0)-，N-油酰(C18:1)-，N-亞油酰(C18:2)-，和N-花生四烯酰(C20:4;大麻素/AEA)-乙醇酰胺。存在于粗提取物或純化提取物中NAE的性質(zhì)和數(shù)量，可能具有治療學(xué)上的意義，因?yàn)樵谇凹夹g(shù)揭示，在動(dòng)物整體和動(dòng)物組織中的NAE之間，存在著復(fù)雜的協(xié)同作用。例如，動(dòng)物研究數(shù)據(jù)表明，PEA的一些作用可通過AEA，也可能通過其他NAE來介導(dǎo)。而且，已有人報(bào)道了NAE之間的協(xié)同效應(yīng)的證據(jù)(詳見下文)。PEA是一種飽和的十六碳脂肪酸乙醇酰胺(C16:0)，具有以下結(jié)構(gòu):AEA是一種多不飽和的二十碳脂肪酸乙醇酰胺(C20:4)，具有以下c)歷史回顧C(jī)oburn等人(1954)在50年代初，第一次提到了對(duì)PEA的消炎性質(zhì)的興趣，他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)天竺鼠喂以高蛋黃食物可以使他們免遭實(shí)驗(yàn)性過敏癥。隨后研究了從蛋黃分離并提純的PEA，并在動(dòng)物體上驗(yàn)證了其消炎性質(zhì)(參見Lambert等，2002，評(píng)述)。對(duì)NAE的研究興趣，是在1990年代發(fā)現(xiàn)AEA(具有類似于大麻活性成分性質(zhì)的另一種內(nèi)源性NAE)之后而再度激發(fā)的。大麻素受體(稱為CB,和CB2)的克隆以及選擇性CB受體配體的生成，提供了進(jìn)一步加快研究活動(dòng)的工具(Devane等，1992)。自那時(shí)起，對(duì)從動(dòng)物和人體收集的大量身體證據(jù)研究表明，當(dāng)通過不同的施藥途徑給藥時(shí)，PEA具有消炎和鎮(zhèn)痛性。d)臨床前研究b)化學(xué)結(jié)構(gòu):許多研究表明，合成的PEA，在一些動(dòng)物模型內(nèi)具有消炎鎮(zhèn)痛性質(zhì)。一般地，將一種致炎性物質(zhì)，例如角叉菜膠、膠原蛋白或佛波酯，注射到皮下，然后在數(shù)小時(shí)(急性模型)或數(shù)天(慢性模型)內(nèi)觀測(cè)由此產(chǎn)生的病理學(xué)變化和行為變化。迄今為止，這些研究的絕大多數(shù)，都是以急性炎癥的動(dòng)物模型進(jìn)行的(例如，Aloe等，1993;Mazzari等，1996;Conti等，2002;Costa等，2002)。e)臨床試驗(yàn)與動(dòng)物研究相比較，只進(jìn)行了少量的人體臨床試驗(yàn)，來考察PEA的消炎作用。在1970年代初期，在捷克斯洛伐克進(jìn)行了幾個(gè)試驗(yàn)，使用一種商品名為Impulsin的口服制劑(N-2-羥乙基棕櫚酰胺，SPOFAUnitedPharmaceuticalWorks)。第一組試驗(yàn)評(píng)價(jià)了PEA(3次/天/12天)對(duì)降低1345名成人志愿者(年輕男兵或斯柯達(dá)汽車有限公司的雇員，Masek等，1974)呼吸道感染發(fā)生率和嚴(yán)重性的療效。結(jié)果表明，當(dāng)在傳染病事件發(fā)生之前給藥時(shí)，Impulsin有助于防止病毒感染，但不能縮短感染癥狀的持續(xù)時(shí)間。在1973年至1975年期間，還對(duì)總計(jì)1864名年輕男性士兵(相同的給藥方案)，進(jìn)行了一系列類似試驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)，預(yù)防藥Impulsin大大地降低了這一人群中急性呼吸道感染的發(fā)病率(Kahlich等，1979)。在12周試驗(yàn)期間，副作用的發(fā)生率特別低(僅幾個(gè)百分點(diǎn)；Kahlich等，1979)。這些試驗(yàn)的明顯成功，導(dǎo)致Impulsin在前捷克斯洛伐克用于治療急性呼吸道疾病。在市場(chǎng)上使用幾年之后，該藥物不明原因地被撤回，而其原因并非與毒性相關(guān)(參見LoVerme等，2005b，評(píng)論)。隨后的兩次臨床試驗(yàn)，已經(jīng)開始對(duì)PEA治療慢性背痛(lumbosciatalgia)和多發(fā)性硬化癥的療效進(jìn)行考察(參見Lambert等，2002，評(píng)論)。也已已開發(fā)了一種含有帶PEA的"結(jié)構(gòu)化天然脂質(zhì)"的外用霜?jiǎng)?PhysiogelA丄，StiefelLaboratories)，并經(jīng)兩次小規(guī)模的臨床試驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。第一次實(shí)驗(yàn)是觀察研究，指導(dǎo)19位診斷為肛門濕疹的成人患者，涂抹所述霜?jiǎng)┑交继?，為時(shí)6至63天(Rohde&Ghyczy，2003)。該試驗(yàn)經(jīng)過4周之后，68%的患者報(bào)告疼痛、燒灼感和瘙癢減少，21%記錄癥狀惡化。據(jù)報(bào)告，有95%的患者對(duì)這種霜?jiǎng)┠褪苄粤己谩Ｔ诘诙卧囼?yàn)中，對(duì)21例晚期腎衰竭和患有尿毒癥瘙癢的成人患者，涂抹了這種霜?jiǎng)刻靸纱?，為期三?Szepietowski等，2005)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在三周測(cè)試期結(jié)束時(shí)，瘙癢明顯減少(只有不到40%的患者完全不存在)，81%的患者報(bào)告說，患處的干燥癥消除。這種霜?jiǎng)?duì)所有患者均耐受性良好，沒有不良作用的報(bào)告。這些結(jié)果提供了一個(gè)令人鼓舞的征兆，即含有PEA的霜?jiǎng)谥委熎つw炎癥疾病中，可能提供一種替代性的治療選擇方案。f)作用模式有關(guān)PEA可發(fā)揮消炎和鎮(zhèn)痛療效的精確機(jī)理，還沒有完全搞清。人們普遍認(rèn)為，PEA的作用不是通過典型的大麻素受體介導(dǎo)的，這可以解釋PEA缺乏神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的原因。相反，AEA的大多數(shù)作用，似乎都是通過大腦和神經(jīng)末梢中的CB,禾卩/或CB2受體介導(dǎo)。使用AEA的一個(gè)問題是作用于精神的副作用，而這種副作用一般認(rèn)為是通過CB,受體介導(dǎo)的。但是，有證據(jù)表明，這種不良影響，可通過聯(lián)合施用低劑量(低于治療所需量)的AEA和另一種NAE而得以減低或消除(Calignano等，1998;DiMarzo等，2001;DePetrocellis等，2001;LoVerme等，2005b)。例如，當(dāng)PEA和AEA以相同低劑量的組合方式給藥時(shí)，低于鎮(zhèn)痛劑量的PEA和AEA提供了鎮(zhèn)痛效果(Calignano等，2001)。在分子和行為水平上，PEA與人體中的一些重要標(biāo)靶互相作用。由體內(nèi)和體外研究收集的證據(jù)表明，PEA減少浮腫、肥大細(xì)胞增生、嗜中性白血球滲透和炎癥的許多內(nèi)源性介質(zhì)，包括肥大細(xì)胞脫顆粒作用(阻止組胺和血清素的釋放)，環(huán)加氧酶-2(COX-2)活性，內(nèi)皮源性一氧化氮合成酶活性，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和在急性缺氧期間的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(Gulaya等，1998)。此外，PEA可降低炎性疼痛動(dòng)物模型的痛覺過敏(Jaggar等，1998;Farquhar&Smith,2001;Conti等，2002)。最近的數(shù)據(jù)表明，過氧化物酶體增殖激活受體a(peroxisomeproliferator-activatedreceptoralpha)(PPAR-a)對(duì)PEA的消炎作用至關(guān)重要(LoV函e等，2005a)。控制炎性疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法A.涉及慢性炎癥的疾病炎癥是人體局部對(duì)損傷和感染做出的正常反應(yīng)，并以局部發(fā)紅、腫脹、發(fā)熱和疼痛等典型癥狀為特征。正常的炎癥反應(yīng)都是一種急性過程，該過程需解決刺激物移除、啟動(dòng)修復(fù)和組織愈合等問題。在某些情況下，急性炎癥可以發(fā)展為慢性炎癥，而慢性炎癥是影響骨骼和關(guān)節(jié)、呼吸系統(tǒng)、皮膚、胃腸道、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的大量病理學(xué)的關(guān)鍵組成部分。重要的是，急性炎癥和慢性炎癥的潛在過程，是大不相同的。用于治療炎癥和疼痛的非甾體消炎藥(NSAID)流行甚廣，因?yàn)榕c其他消炎藥物相比，其風(fēng)險(xiǎn)狀況更為人接受。然而，長(zhǎng)期使用NSAID，存在一些主要局限性，包括造成胃損傷(潰瘍病和胃腸道出血)、腎損害以及加大出血的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于非甾體消炎藥不改變病情發(fā)展，患者可能需要另外一類藥物——改變病情消炎藥(DMARD;例如，甲氨蝶呤，依那西普(etanercept，皮質(zhì)類固醇)。不幸的是，這些藥物的大多數(shù)，它們的安全邊際較窄，它們的特征時(shí)具有會(huì)對(duì)生活質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響的經(jīng)常性不良作用。B.異位性皮炎/濕疹異位性皮炎/濕疹(AD)是慢性皮膚疾病，通常表現(xiàn)為發(fā)紅、發(fā)癢和形成可能導(dǎo)致滲水和結(jié)殼的囊泡。AD影響到至少發(fā)達(dá)國家15%的人，并往往與其他形式的過敏癥，如哮喘和花粉熱hayfever等相關(guān)聯(lián)(Lee,Y-A.等，2000)。外用皮質(zhì)類固醇是治療AD用藥物的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，其中一個(gè)主要的缺點(diǎn)是，長(zhǎng)期外用皮質(zhì)類固醇，有產(chǎn)生不良反應(yīng)的危險(xiǎn)，如皮膚皺縮、口腔和過敏性接觸性皮炎、痤瘡、皮膚色素沉著減少和治療部位毛發(fā)生長(zhǎng)過度等。雖然有許多非甾體類產(chǎn)品是可用的(例如吡美莫司(pimecrolimus)、他克莫司(tacrolimus)、抗生素、環(huán)孢霉素、甲氨蝶呤等)，但它們常常不太有效，而且都有偶爾還很嚴(yán)重的不良反應(yīng)(參見Abramovits，2005，評(píng)論)。例如，吡美莫司和他克莫司，最近收到(美國)聯(lián)邦食品及藥物管理局關(guān)于可能有癌癥風(fēng)險(xiǎn)的黑箱警告(BlackBoxwarnings)。顯然，需要有一些不良反應(yīng)較少的有效的消炎產(chǎn)品。綠貽貝(i^/7mCVi"fl//c"/s)的消炎作用新西蘭綠唇貽貝(Per"aCfl"a"cw/w，NZGLM)的"穩(wěn)定化的"月旨質(zhì)提取物，對(duì)若干不同的炎癥動(dòng)物模型，以及人體的慢性炎癥疾病，已顯現(xiàn)出有益效果(Whitehouse等，1997;Whitehouse等，1999;Shiels&Whitehouse，2000;Tenikoff等，2005;Gibson&Gibson，1998;Emelyanov等，2002;Cho等，2003年；Gruenwald等，2004)。所述穩(wěn)定化，通常需要添加有機(jī)酸，例如酒石酸，以減少在處理之前PUFA(多不飽和脂肪酸)的氧化(WO85/05033;NZ211928)。然而，并非在使用穩(wěn)定化的貽貝脂質(zhì)提取物治療炎癥的所有人體研究中，都報(bào)道積極的結(jié)果(Lau等人，2004;參見Cobb和Ernst，2006，評(píng)論)，或者已經(jīng)能夠證明健康志愿者中炎癥血液標(biāo)標(biāo)記減少(Murphy等，2006)。貽貝專利本
技術(shù)領(lǐng)域：
中貽貝專利涉及貽貝提取物制劑的各個(gè)方面，例如NZ211928描述了一種制劑，通過向懸浮于剛剛收集的懸浮于鹽水中的貽貝肉中添加有機(jī)酸(醋酸，檸檬酸，酒石酸，乳酸)和/或金屬鹽的方法，來穩(wěn)定綠殼貽貝提取物。NZ270754描述了懸浮在魚油中的細(xì)磨貽貝提取物的一種組合物。NZ314867描述了一種從綠殼貽貝提取的與糖胺聚糖相結(jié)合的蛋白質(zhì)提取物。NZ514389描述了以寵物食品的方式向?qū)櫸锸┯镁G殼貽貝提取物，每天每千克動(dòng)物體重施用0.18至114毫克。其他專利描述了富集提取物中選定組分的提取過程，例如NZ32卯18描述了一種通過在水中用蛋白水解酶處理，分離固體殘?jiān)缓髲乃芤褐谢厥崭翁?，以從貽貝中提取肝糖的方法。NZ510407介紹了一種綠殼貽貝提取物，其含有碳水化合物、脂質(zhì)，以除去蛋白質(zhì)組分。NZ328489描述了一種得自綠殼貽貝的蛋白質(zhì)提取物，以及生產(chǎn)所述提取物的方法攪拌苯酚溶液中的貽貝肉45分鐘，然后離心/抽吸上層液，再使用乙醇沉淀出含有產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。上述專利都沒有涉及富集了NAE化合物的提取物的生產(chǎn)，也沒有認(rèn)識(shí)到這些化合物在多種治療中的有效性。商業(yè)化的貽貝制品兩種廣泛銷售的NZGLM制品是Seatone禾BLyprinol。Seatone由從全部貽貝肉得到的穩(wěn)定的凍干粉組成，而Lyprinol是一種從穩(wěn)定的凍干肉(通過超臨界C02流體)，通過添加橄欖油和維生素E而萃取得到的油，其被力卩工成膠囊(PharmalinkInternationalLtd.,CaymanIslands)。Lyprinol包含五種主要脂質(zhì)游離脂肪酸、甘油三酯、甾醇酯s、甾醇及磷脂(Sinclair等，2000;Wolyniak等，2005)。Lyprinol中最大量的游離脂肪酸是棕櫚酸(C16:0)，亞油酸(C18:2n-6),EPA(C20:5n-3)，DHA(C22:6n-3)，棕櫚酸油(C16:ln-7)，C16:ln-9，7，5和肉豆蔻酸(C14:0)(Sinclair等，2000;Wolyniak等，2005)。雖然還鑒定出了許多其他的脂肪酸(合計(jì)約91種)，但單個(gè)而言，這些酸僅存在很少量(低于總脂質(zhì)的5%w/w;Wolyniak等，2005)。"-3PUFA占總脂肪酸的40%，而且EPA和DHA是最大量的(Wolyniak等，2005)。有證據(jù)表明，Lyprinol的消炎活性多數(shù)都在于脂肪酸部分(Whitehouse等，1999;Treschow等，2007)。經(jīng)過Lyprinol的一段療程后，被試人的幾個(gè)促炎化合物的含量降低，所述促炎化合物包括血栓素B2、前列腺素E2和白細(xì)胞介素-1e，類似于使用低劑量"-3多不飽和脂肪酸補(bǔ)充劑后觀察到的情況(Sinclair等，2000)。這表明，Lyprinol活性的一個(gè)重要因素可能在于其"-3含量，這種可能性與最近的體外試驗(yàn)證據(jù)相一致(McPhee等，2007;Treschow等，2007)。Lyprinol作用的假設(shè)模型，是通過抑制5-脂加氧酶和環(huán)加氧酶(COX)兩種途徑?？紤]到上述概述PEA和其他NAE化合物治療效果的證據(jù)，應(yīng)該理解，富含這些化合物的產(chǎn)品可能是有利的。本發(fā)明的目的，在于解決前面提到的問題，或者至少向公眾提供有用的選擇。所有的參考文獻(xiàn)，包括本說明書中引用的任何專利或?qū)＠暾?qǐng)，均通過引用合并于此。不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)都構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。所述參考文獻(xiàn)的討論的內(nèi)容陳述了其作者的看法，申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用文件的準(zhǔn)確性和正確性的權(quán)利。可清楚地理解，雖然本文引用了許多現(xiàn)有技術(shù)出版物，但該引用并不構(gòu)成這樣的承諾，即任意這些文件在新西蘭或任何其他國家都形成本領(lǐng)域的公知常識(shí)部分。應(yīng)理解，術(shù)語"包括comprise"，在各種管轄范圍之下，可以認(rèn)為是排他的或非排他的含義。在本說明書中，除非另有說明，詞語"包括"具有非排他的含義，也就是說，它將不僅包含其直接提及的列出的組分，而且還包含其他非指明的組分或元件。在使用與方法或工藝中一個(gè)或多個(gè)步驟相關(guān)的詞語"包括comprised"或"包括comprising"時(shí)，該基本原理也適用。本發(fā)明更多的方面和優(yōu)點(diǎn)，將通過下述僅以舉例方式給出的描述，而變得清楚。
發(fā)明內(nèi)容在本說明書中，術(shù)語"海產(chǎn)"，是指在海水或淡水里，或在海水或淡水周圍生活的貝類生物體。所用術(shù)語"N-?；掖及?(NAE)，但還可使用這類化合物技術(shù)上通用的其他名稱，包括"N-?；掖减０?或脂肪酸乙醇酰胺。按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種包含油提取物的組合物，所述油提取物來源于富含脂肪酸酰胺化合物的海產(chǎn)生物體。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種包含油提取物的組合物，所述油提取物來源于富含NAE化合物海產(chǎn)生物體。更好的是，所述提取物富含N-十六酰乙醇酰胺(PEA)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，PEA也具有許多不同的名稱，包括但不限于N-羥乙基棕櫚胺(palmidrol)和N-(2-羥乙基)-十六碳酰胺。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種包含來源于海產(chǎn)生物體的油提取物的組合物，所述海產(chǎn)生物體含有按提取前所述海產(chǎn)生物的肉的濕重測(cè)得的至少0.10微克/克的PEA。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種包含來源于富含NAE化合物的海產(chǎn)生物體的油提取物的組合物，所述海產(chǎn)生物體含有按提取前所述海產(chǎn)生物的肉的濕重測(cè)得至少為0.10微克/克的PEA。如上所述，所述組合物富含一些NAE化合物。舉例來說，所述組合物包括(但不限于)的NAE的量，以提取之前濕肉計(jì)為N-硬酯酰乙醇酰胺(18:0)，70納克/克；N-油酰乙醇酰胺(C18:1)，5納克/克；禾t]N-亞油酰乙醇酰胺(C18:2)，5納克/克；和N-花生四烯酰乙醇酰胺(C20:4，大麻素)，8納克/克。這不應(yīng)視為對(duì)所述組合物的限制，所述組合物可包含其他NAE化合物，包含的NAE量可大于和小于所公開的量。更好的是，所述海產(chǎn)生物體是一種雙殼類軟體動(dòng)物。還更好的是，所述生物體是貽貝類。最好的是，所述生物體是綠貽貝屬(P^7za)或藍(lán)貽貝屬(MwZ/m)(分別為綠貽貝或藍(lán)貽貝)類的貽貝。這不應(yīng)當(dāng)被看作是限制性的，也可包括其它物種，例如，蛤類和牡蠣類。更好的是，所述脂肪酸酰胺化合物包括NAE化合物。更好的是，所述NAE化合物包括N-肉豆蔻酰乙醇酰胺，C14:0;N-棕櫚酰乙醇酰胺(PEA)，C16:0;N-硬酯酰乙醇酰胺，C18:0;N-油酰乙醇酰胺，C18:1;N-亞油酰乙醇酰胺，C18:2;N-花生四烯酰乙醇酰胺(大麻素，AEA)，C20:4;N-二十烯酰乙醇酰胺，C20:1;以及它們的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述油提取物中含有按在提取前所述海產(chǎn)生物體的濕組織測(cè)得含量至少是0.10微克/克的PEA。更好的是，上述PEA含量至少為0.50微克/克。在經(jīng)由選擇的實(shí)施方式中，所述PEA含量可大于3.0微克/克。更好的是，所述油提取物中含有按提取前所述海產(chǎn)生物體的濕組織測(cè)得含量至少是0.008微克/克的AEA。還更好的是，所述含量大于0.01微克/克，所述含量按提取前所述海產(chǎn)生物體的濕組織測(cè)得。在經(jīng)由選擇的實(shí)施方式中，所述AEA含量可大于0.05微克/克。更好的是，所述組合物，包括在油提取物中含有按進(jìn)一步提取前所述海產(chǎn)生物體的干組織測(cè)得含量大于1.0微克/克的PEA。更好的是，所述組合物，包括在油提取物中含有按進(jìn)一步提取前所述海產(chǎn)生物體的干組織測(cè)得含量大于0.09微克/克的AEA。應(yīng)該理解，本發(fā)明油提取物中至少PEA和AEA的含量大大高于現(xiàn)有技術(shù)，現(xiàn)有技術(shù)根本沒有教示PEA含量，或者沒有教示上述含量。在最近的現(xiàn)有技術(shù)中，Sepe等教示了從地中海貽貝的濕組織僅產(chǎn)出0.053±0.0039微克/克PEA和0.0018±0.003微克/克的AEA。要強(qiáng)調(diào)的是，上述數(shù)值是指濕肉中的PEA和AEA含量。應(yīng)理解，降低水分含量(如干燥)的方法，也可濃縮包括PEA和AEA在內(nèi)的活性化合物的含量。本發(fā)明的提取物，在所述脫水工藝完成之前，已經(jīng)大大濃縮。按照據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，海產(chǎn)物原材料的上述脂肪酸酰胺含量，基本如上所述，可以富集。在本專利說明書中，術(shù)語"富集"意思是指，在通過干燥工藝進(jìn)行濃縮之前，提高海產(chǎn)原料中脂肪酸酰胺化合物的含量/量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過收獲、破碎、然后將該海產(chǎn)原料以破碎狀態(tài)保持在4至1(TC溫度下至少24個(gè)小時(shí)，來進(jìn)行富集。在一個(gè)實(shí)施方式中，該原料被保持多達(dá)144個(gè)小時(shí)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過完成上述富集步驟，脂肪酸酰胺化合物的含量/量增加。這被認(rèn)為緣于所述海產(chǎn)原料死后的生化反應(yīng)。出乎意料的是，該過程導(dǎo)致了貽貝肉的脂肪酸酰胺含量大大富集。還有一點(diǎn)出乎意料的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用用上述工藝參數(shù)不會(huì)出現(xiàn)微生物污染到不利于適合人食用該提取物的地步。一般理解是，正常的處理海產(chǎn)原料的程序，需要采取盡可能快的步驟，以防止微生物生長(zhǎng)，例如可采取冷凍或干燥的方法。與現(xiàn)行的實(shí)踐相反，讓所述原料在l(TC下保持?jǐn)?shù)天，在這樣的時(shí)間和溫度下，微生物污染水平依然出乎意料地低。如上所述，富含包括PEA和AEA在內(nèi)的脂肪酸酰胺的所述組合物，還可包括其他化合物(脂肪酸酰胺和其他化合物)。事實(shí)上，發(fā)明者們認(rèn)識(shí)到，除了PEA之外還存在多個(gè)NAE化合物是非常期望的，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)(已公開文獻(xiàn))中對(duì)于NAE的經(jīng)驗(yàn)，NAE之間的協(xié)同作用是普遍的，因此與僅有一種NAE的產(chǎn)品相比，含有多種NAE的產(chǎn)品的效能可大大增加。13在另一實(shí)施例中，所述組合物也包括至少一個(gè)多不飽和脂肪酸(PUFA)化合物。還更好的是，所述PUFA化合物包括"-3型PUFA?？梢岳斫獾剑哂邪ㄖ舅狨０坊衔锖蚉UFA化合物兩者的油提取物，是最可取的。還可以理解到，由于脂肪酸酰胺化合物和PUFA化合物具有不同的化學(xué)性質(zhì)，無法預(yù)料可以獲得這兩種化合物含量都相當(dāng)高的提取物。不過，應(yīng)當(dāng)理解，PUFA化合物對(duì)于本發(fā)明的組合物來說并非必不可少，而且PUFA化合物的存在不應(yīng)視為是限制性的。更好的是，所述油提取物包括至少一種PUFA化合物。還更好的是，PUFA是"-3型的。更好的是，PUFA選自4,7,10，13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA;22:6n3)，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA,20:5n3)，6,9,12,15-十八碳四烯酸酸(OTA，18:4n3)，9,12,15-十八碳三烯酸(ALA，18:3n3)，7,10，13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA,22:5n3)，11,14,17-二十碳三烯酸(ETA,20:3n3),8,11,14,17-二十碳四烯酸(20:4n3)及其組合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，如在所述提取物中所測(cè)，所述DHA含量大于3g/100g。更好的是，如在所述提取物中所測(cè)，所述EPA含量大于5g/100g。更好的是，所述組合物制成口服粉末、溶液、懸浮液、乳劑、油、片劑或膠囊。或者，所述組合物可制成外用制劑，例如霜?jiǎng)?、洗劑、軟膏或油。在另一?shí)施方式中，所述組合物制成作為"功能性食品"施用的固體或液體食物。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種口服或外用制劑，該制劑含有治療有效量的來源于富含脂肪酸酰胺化合物的海產(chǎn)生物體的油提取物。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種口服或外用制劑，該制劑含有治療有效量的來源于富含NAE的海產(chǎn)生物體的油提取物。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種口服或外用制劑，該制劑含有治療有效量的富含PEA的油提取物。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種口服或外用制劑，該制劑含有治療有效量的來源于含有至少0.10微克/克PEA的海產(chǎn)生物體的油提取物，所述含量按提取前海產(chǎn)生物體的肉的濕重測(cè)得。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種口服或外用制劑，該制劑含有治療有效量的來源于富含包括至少0.10微克/克的PEA的NAE化合物的海產(chǎn)生物體的油提取物，所述含量按提取前海產(chǎn)生物體的肉的濕重測(cè)得。更好的是，所述油提取物還包括按提取前海產(chǎn)生物體的肉的濕重測(cè)得至少為0.008微克/克的AEA。更好的是，如上所述的所述制劑，還包括至少一種PUFA。還更好的是，所述PUFA包括"-3脂肪酸。在本發(fā)明者們所設(shè)計(jì)的實(shí)施方式中，所述制劑包括載體物質(zhì)，還可包括公認(rèn)的食品級(jí)抗氧化劑，以幫助被提取的活性化合物長(zhǎng)期穩(wěn)定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是一種口服膠囊，其中該膠囊填充了源于貽貝肉的油提取物。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述制劑是一種外用的霜?jiǎng)┗蛳磩?，其中所述霜?jiǎng)?洗劑包括源于貽貝肉的油提取物。應(yīng)理解，上述制劑是僅僅作為例子提供的，不應(yīng)該被看作是限制性的，因?yàn)閼?yīng)理解，可在不偏離本發(fā)明范圍的條件下生產(chǎn)其它制劑。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過口服或外用基本如上所述的組合物或制劑來治療炎癥及相關(guān)疼痛的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述炎癥是慢性的，而不是急性的。舉例來說，有關(guān)慢性炎癥的疾病包括濕疹/異位性皮炎、哮喘，炎性腸病(包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)，類風(fēng)濕和骨關(guān)節(jié)炎，血管球性腎炎，動(dòng)脈粥樣硬化，阿爾茨海默病和成人呼吸窘迫綜合癥。作為第二個(gè)實(shí)施例，有關(guān)慢性疼痛的疾病包括神經(jīng)性疼痛和關(guān)節(jié)疼痛。在替換實(shí)施方式中，所述炎癥是急性的，包括通過將含有本發(fā)明的組合物或制劑的霜?jiǎng)植客糠蟮綋p傷處的外部，治療軟組織損傷。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過口服或外用基本如上所述的組合物或制劑，來治療與炎癥有關(guān)的疾病的方法。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過口服或外用基本如上所述的組合物或制劑，來緩解炎癥發(fā)展的方法。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過外用基本如上所述的組合物或制劑，來治療皮膚病的方法。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過口服或外用基本如上所述的組合物或制劑，來治療皮膚病的方法。按照本發(fā)明的另一方面，提供一種通過口服或外用基本如上所述的組合物或制劑，來緩解皮膚病癥狀的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，被治療的所述皮膚病，包括異位性皮炎/濕疹和接觸性皮炎。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，緩解的癥狀包括瘙癢、干燥、腫脹，并減少對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施例中，基本如上所述的療法，與至少一種非甾體消炎藥(NSAID)合并使用?？梢栽O(shè)想，所述提取物可提高甚至是低劑量(低于治療所需量)的NSAID的活性，因此，可降低副作用的嚴(yán)重性。此外，本發(fā)明的組合物和制劑也可發(fā)揮增強(qiáng)NSAID活性的作用，因此可具有療效更好以及/或者NSAID的所需給藥量降低的優(yōu)點(diǎn)。按照本發(fā)明的另一方面，提供了基本如上所述的油提取物在制造上述治療用制劑的用途。通過以上說明應(yīng)該意識(shí)到，提供了一種油提取物，其含有的活性化合物的含量大幅提高，所述活性化合物，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
，至少有益于關(guān)節(jié)靈活性。還提供了相關(guān)的口服和外用制劑，以及用于治療各種與炎癥相關(guān)疾病和癥狀的方法。目前迫切需要一些與目前的醫(yī)藥品相比，可長(zhǎng)期使用且不良作用更少的有效的消炎產(chǎn)品。本發(fā)明的提取物可應(yīng)對(duì)這一需求?？梢栽O(shè)想，每日施用包含富含NAE的海產(chǎn)原料提取物的食品或制劑，提出了一種預(yù)防或治療炎癥的理想療法。通過下面僅以舉例方式給出的說明，并參照附圖，本發(fā)明更多方面將變得清楚，其中圖1是典型的綠貽貝cfl"a//cw/w提取物的LC/MS(液相色譜/質(zhì)譜)色譜圖示出了時(shí)間二10分鐘時(shí)的含有PEA(下方圖中箭頭所指)的峰。所述峰的相對(duì)大小表明，PEA占到總離子流(上方圖)相當(dāng)大的部分，提示在所述提取物中存在大量的PEA。具體實(shí)施例方式以下提供的實(shí)施例，表示由本發(fā)明人生產(chǎn)和設(shè)計(jì)的與富含NAE的油提取物相關(guān)的各種制劑。實(shí)施例1通過以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的試驗(yàn)來測(cè)定用商業(yè)方式從新西蘭水域收獲的藍(lán)貽貝(Mj^7mecfw/!'s)和綠唇貽貝(PemacflWfl"cw/船)中的PEA含量(試驗(yàn)1)。第二次試驗(yàn)是以模擬工業(yè)規(guī)模測(cè)定尸emflc朋fl/Zc"/w中的PEA和AEA含量(試驗(yàn)2)。方法PEA和AEA的含量，是通過LC/MS法，在從新鮮收獲的藍(lán)貽貝和綠貽貝的干肉提取的粗脂質(zhì)中測(cè)定出來的，并以Pg/g濕肉計(jì)(見下表1;Giuffrida等，2000)。通過如圖1所示的LC/MS確認(rèn)了cawa//^/^的脂質(zhì)提取物中存在PEA，圖中的箭頭標(biāo)示PEA峰。結(jié)果表l三種不同貽貝種類口P的NAE含量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注l:NAE含量是通過由脂質(zhì)提取物數(shù)據(jù)進(jìn)行反算(back-calculation)確定的。注2:NAE含量是使用基于試驗(yàn)1數(shù)據(jù)(表l)的換算系數(shù)估計(jì)得到的。結(jié)論-試驗(yàn)1和21)c"wa/Zcw/w中的PEA含量比兩種藍(lán)貽貝的都高。因?yàn)镻emacfl"a/Zc"/w在同等重量的基礎(chǔ)上含稍多的肉，因此有略高的干物質(zhì)比例，這至少是其相對(duì)于藍(lán)貽貝具有較高PEA含量的部分原因。2)AEA在Pemaca"a/Zc"/ws中的含量也比藍(lán)貽貝(M少"/t^g"〃，謂-"c/afc)高，盡管其絕對(duì)含量較低。實(shí)施例2記載了一種在提取前富集新鮮ca皿/ZcM/^中內(nèi)源性NAE含量的方法。在本實(shí)施例中，將采取商業(yè)方式收集的均質(zhì)的/完整的貽貝肉，在實(shí)驗(yàn)室中，如下所述，在不同條件下進(jìn)行孵育。在大氣壓力下，于4或1(TC，好氧或厭氧條件下，孵化0至144小時(shí)。在整個(gè)試驗(yàn)期間間隔進(jìn)行組織pH值的監(jiān)測(cè)。在孵化期結(jié)束時(shí)，冷凍所述組織，隨后進(jìn)行凍干。實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格控制，盡量減少潛在混雜因素，如貽貝各批次、冷凍或凍干條件的差異等。測(cè)定凍干貽貝中的NAE和"-3含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用均質(zhì)貽貝經(jīng)l(TC以及需氧條件下孵化高達(dá)144小時(shí)制得的干肉，與從同一批貽貝均質(zhì)化后立即冷凍后制得的干肉相比，其PEA和AEA含量要高5至10倍。本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，在相同的干貽貝樣品中，主要多不飽和脂肪酸"-3(DHA(二十二碳六烯酸)，EPA(二十碳五烯酸)和ALA(a-亞麻酸))，甚至在孵化144小時(shí)之后都還保留。此外，在干燥產(chǎn)品中的微生物量，在規(guī)定的有關(guān)時(shí)間和溫度下，都出乎意料地低。實(shí)施例3如上所述，我們都知道，本發(fā)明的油提取物富含NAE化合物，所述NAE化合物包括但不限于PEA。例如，本發(fā)明的提取物含有PEA、AEA和/或多不飽和脂肪酸。在脂質(zhì)提取物中的含量數(shù)據(jù)預(yù)期為3.0-57.0微克/克或更高的PEA;0.1-5.2微克/克或更高的大麻素；以及/或者至少3克/100克的DHA，和至少5克/100克的EPA。實(shí)施例4在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，描述了一種口服制劑。例如，一種典型的口服制劑，包括包含在膠囊內(nèi)的本發(fā)明的貽貝脂質(zhì)提取物(油)，具有或不具有載體脂質(zhì)和抗氧化劑。對(duì)于成年人的設(shè)計(jì)劑量為，每天用藥1-2次，每次約1-4個(gè)膠囊。可以預(yù)期，這一給藥方式將減輕由慢性炎癥，尤其是涉及關(guān)節(jié)的慢性炎癥(關(guān)節(jié)炎)引起的疼痛和腫脹。實(shí)施例5在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的油提取物用于外用制劑。例如，一種外用制劑，包括含有本發(fā)明的脂質(zhì)提取物(油)的霜?jiǎng)?洗劑，可具有或不具有載體脂質(zhì)和抗氧化劑。其他可用于霜?jiǎng)?洗劑的物質(zhì)，包括但不限于以下物質(zhì)丙二醇、水、甘油、甘油酯、氫化卵磷脂、甜菜堿、羥乙基纖維素、卡波姆鈉(sodiumcarbomer)、鯊烯(squaline)、黃原膠。霜?jiǎng)┩夥蟮交继幟刻?-3次，以減緩皮膚干燥，發(fā)紅，腫脹，瘙癢和減少皮膚增厚。實(shí)施例6在另一實(shí)施例中，如上所述的口服或外用制劑用于治療急性炎癥。在一個(gè)實(shí)施例中，該提取物可在炎癥發(fā)作4小時(shí)之內(nèi)給藥(如軟組織損傷)，以減少癥狀的嚴(yán)重度和縮短可能的痊愈時(shí)間。實(shí)施例7在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的油提取物用于功能性食品。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，為了降低包括上述炎性疾病在內(nèi)的炎癥疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，可以食用這種食品。例如，該產(chǎn)品可以是由消費(fèi)者或通過所述產(chǎn)品制造商加入(例如混合)到各種食物產(chǎn)品中的，處于準(zhǔn)備使用狀態(tài)的本發(fā)明的油提取物。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的油提取物被霧化以生產(chǎn)微球體，并通過制造商添加到一些食品中。實(shí)施例8本發(fā)明的油提取物可以與非甾體消炎藥聯(lián)合給藥。例如，將一種低劑量的非甾體消炎藥和一種口服劑量的本發(fā)明提取物用于治療慢性炎癥(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎；成人劑量在相同的時(shí)間服用1-4粒膠囊，頻度同所述非甾體消炎藥)。本發(fā)明的提取物增強(qiáng)了低劑量非甾體消炎藥消炎作用，從而減少不良副作用的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例9通過與現(xiàn)有技術(shù)的商品(尸ewflcawa/fcw/w制品；記載于US6083536和US6346278)相比較，對(duì)本發(fā)明提取物做了進(jìn)一步研究。本發(fā)明提取物富含包括諸如PEA和AEA之類的NAE化合物的脂肪酸酰胺。本發(fā)明提取物還包括諸如EPA和DHA之類的多不飽和脂肪酸。本發(fā)明提取物中每一關(guān)鍵組分的相對(duì)量，都與商業(yè)化的貽貝制品進(jìn)行了對(duì)比(見下表2)。表2比較數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>商業(yè)化貽貝制3.30.23.14,90.70.4P3叩1乙醇酰胺通過液相色譜法和質(zhì)譜分析法(LC/MS;三級(jí)四級(jí)質(zhì)譜)進(jìn)行定量。2w-3脂肪酸轉(zhuǎn)化成它們的脂肪酸甲酯，并按照經(jīng)驗(yàn)證的方法(AOAC#963.22)，通過氣相色譜法定量。3毎粒膠囊含有50毫克PeA7Mc""a"cu/tw提取物，100毫克橄欖油和0.225毫克d-a-生育酚。表2所列數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的提取物，相對(duì)于商業(yè)化貽貝制品，含有相當(dāng)高含量的NAE(高17倍的PEA，高26倍的AEA)和"-3(尤其是DHA和EPA)。應(yīng)該理解，使用本發(fā)明組合物的制劑，可以簡(jiǎn)單地是未經(jīng)稀釋的提取物，也可以是與其他配料相混合，從而以不同程度稀釋上述組分，但上述組分含量仍高于商業(yè)化貽貝制品。僅通過舉例的方式對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行了描述，應(yīng)該理解，只要不脫離所附權(quán)利要求書中限定的范圍，可對(duì)其進(jìn)行修改和補(bǔ)充。參考文獻(xiàn)1.Calignano,A.，LaRana,G.,Giuffrida,A.&Piomelli,D.(1998)Controlofpaininitiatedendogenouscannabinoids._/Vart/re，3何277-281.2.Calignano,A.,LaRana，G.,&Piomelli,D.(2001).Antinociceptiveactivityoftheendogenousfattyacidamide,palmitoylethanolamide.￡Wo/efl"JoMrwa/0/尸/flnwaco/ogy，4/9(2-3),191-198.3.Cho,S.H.,Jung,Y.B.,Seong,S.C.,Park,H.B.,Byun，K.Y.,Lee，D.C.,etal.(2003).ClinicalefficacyandsafetyofLyprinol,apatentedextractfromNewZealandgreen-lippedmusselCawa/Zcw/—inpatientswithosteoarthritisofthehipandknee:amulticenter2-monthclinicaltrial."/m畫wo/ogie，35(6),212-216.4.Cobb，C.S.,&Ernst,E.(2006).Systematicreviewofamarinenutriceuticalsupplementinclinicaltrialsforarthritis:theeffectivenessoftheNewZealandgreen-lippedmusselcawa/Zcw/ws.C7/m'cfl/版謂a"/柳25(3),275-284.5.Coburn，A.F.，C.E.Graham,andJ.Haninger.1954.Theeffectofeggyolkindietsonanaphylacticarthritis(passiveArthusphenomenon)intheguineapig.Jowmfl/o/五x/e"'mew,fl/A/et/Zcz'w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日2006年12月20日發(fā)明者安德魯·約翰·桑賽姆,查爾斯·愛德華·威廉姆斯申請(qǐng)人:新西蘭適華利營養(yǎng)有限公司