專利名稱：：一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗及其制備方法。技術(shù)背景產(chǎn)單核細(xì)胞李斯恃菌0^fer^wo朋c;^ge"M，LM，又稱為單核細(xì)胞增生性李斯特菌)是一種胞內(nèi)生長、兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是一種重要的食源性病原菌，能引起人畜共患李斯特菌病。LM對多種畜禽致病，并有較高的致死率，在人群中易感群體為孕婦、嬰兒、老年人和免疫受損者，主要引起腦膜炎、流產(chǎn)以及免疫缺陷病人和新生兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，發(fā)病率雖低，但死亡率高達(dá)30%~70%，因此對LM的研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。鑒于此，人們正在研制安全有效的疫苗用于李斯特菌病的防控。目前，廣泛使用的疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗等類型。減毒活疫苗應(yīng)用減毒或無毒力的活的微生物制成。動物接種后，所獲得的免疫力持久而堅強(qiáng)，但存在殘余毒力以及毒力上返祖的危險?；蚬こ桃呙绶譃槎喾N，其中基因缺失疫苗是在DNA或cDNA水平上缺失與病原體毒力有關(guān)的基因，但不明顯影響其復(fù)制能力，不破壞其作為疫苗株的免疫性，此種疫苗毒力弱，不會返祖，安全性好，但是總體上研制周期長，安全性尚待進(jìn)一步驗證。滅活疫苗研制方法簡單、快捷，目前開發(fā)出的大部分疫苗都屬于這種類型。傳統(tǒng)的滅活苗一般經(jīng)過甲醛滅活或熱滅活處理，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以體液免疫為主，引起的細(xì)胞免疫甚微。對于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌等一類胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫在清除以及產(chǎn)生長效免疫保護(hù)中的作用顯得更為重要。因此，尋求滅活疫苗新的制備技術(shù)有重要意義。細(xì)菌經(jīng)過輻照作用完全失活，失去引起疾病的能力，同時輻照過的細(xì)菌保留了完整的結(jié)構(gòu)特征，能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動全面的防御。最重要的是輻照滅活細(xì)菌可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷寄生著LM的靶細(xì)胞，對其進(jìn)行徹底的清除。所以通過輻照方法生產(chǎn)滅活疫苗簡單安全、成本低、制作周期短，但至今還沒有相關(guān)的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是克服上述經(jīng)傳統(tǒng)方法制備的滅活疫苗的缺陷，提供能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的滅活疫苗的制備方法，即通過6GCo輻照制備產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)一種制備產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗的方法，其特征在于，將產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌經(jīng)6t)Co輻照滅活制得滅活疫苗。上述所說的輻照的條件，具體是細(xì)菌樣品處于冰凍狀態(tài)以^Co輻照源照射，輻照劑量不低于15KGy。輻照方式為靜態(tài)輻照，劑量率60Gy/min。能實現(xiàn)本發(fā)明目的細(xì)菌包括所有的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，具體可以是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌yzuLM1-2，或產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌LM-4。本發(fā)明的另一個目的是,提供通過上述的6DCo輻照制得的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在通過輻照滅活的方法，保留了病原體表面的保護(hù)性抗原成分，能夠激發(fā)保護(hù)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。這些優(yōu)點在研制針對胞內(nèi)病原體的滅活疫苗時顯得尤為重要。說明書附1是輻照滅活LM的電鏡觀察結(jié)果2是免疫攻毒后組織中細(xì)菌分離結(jié)果3是T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗中攻毒后組織中細(xì)菌分離結(jié)果圖具體實施方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實施例和效果實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。菌株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌yzuLM1-2,保藏號CCTCCNO.M206107。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌LM-4，由申請人分離并保存。實施例l:輻照滅活細(xì)菌細(xì)菌準(zhǔn)備yzuLMl-2于BHI平板上劃線，37。C培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種液體BHI培養(yǎng)基，37'C振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收獲菌體，以磷酸鹽緩沖溶液洗滌、懸浮，調(diào)整細(xì)菌濃度至1><101QCFU/ml。輻照滅活新鮮制備的細(xì)菌樣品處于冰凍狀態(tài)以6QCo輻照源照射，輻照劑量為15KGy，輻照方式為靜態(tài)輻照，劑量率為60Gy/min。掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)輻照滅活的yzuLMl-2經(jīng)掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖l所示，未見細(xì)菌表面有明顯的結(jié)構(gòu)損傷。實施例2:輻照滅活疫苗免疫效果評價動物分組及免疫接種將68周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，分別為活菌組、輻照滅活組、熱滅活組、甲醛滅活組和陰性對照組，每組24只小鼠。于第O、7d時分別腹腔注射活菌yzuLM1-2、輻照滅活的yzuLM1-2、熱滅活的yzuLM1-2、甲醛滅活的yzuLMl-2及滅菌PBS。免疫劑量分別為1><103CFUAR、lxl09CFUAR、lxl09CFUAR、lxl09CFU/只和0.1ml/只。免疫后小鼠血清中抗體效價的測定各組小鼠分別在一免后7d，二免后14d、21d眼睚靜脈采血，離心制備血清。方陣實驗確定最佳抗原包被濃度，間接ELISA測定免疫鼠血清中抗體效價。具體方法如下(l)ELISA板中每孔加入10(^15%戊二醛溶液，37'C作用2h,蒸餾水洗滌3次;(2)新鮮培養(yǎng)的yzuLM1-2用PBS洗滌懸浮，調(diào)整細(xì)菌濃度至5xl08CFU/ml，加入上述細(xì)菌懸液50ial/L，37'C烘干；(3)每孔加入200^1封閉液(含1(F。犢牛血清的PBS溶液)，4'C過夜，PBST(含0.05《Tween-20的PBS溶液)洗3次，5min/次;(4)待測血清倍比稀釋，50nl/孔加入板中，37。C孵育1.5h，PBST洗3次，5min/次;(5)加入工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG和IgM，37。C作用1.5h，PBST洗3次，5min/次；(6)加入新鮮配置的OPD顯色液每孔50nl，37'C水浴避光顯色1015min;(7)2M&504終止反應(yīng)，50pl每孔，測定OD柳值。以P/N》2.l判為陽性，以能滿足P/N》2.l的抗體最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為抗體的效價。結(jié)果如表l所示，輻照滅活苗免疫BALB/c小鼠后能產(chǎn)生較高的抗體水平，達(dá)到1:1280，高于其他兩種滅活苗產(chǎn)生的抗體水平，同時也高于活菌免疫后產(chǎn)生的抗體效價。由此說明輻照滅活后細(xì)菌仍保留了較好的免疫原性，與野生型細(xì)菌一樣能夠激發(fā)高水平的抗體。表1.各組滅活苗對BALB/c小鼠血清中抗體的測試結(jié)果血清抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>疫苗的保護(hù)性實驗于二免后第21d各組小鼠腹腔注射新鮮培養(yǎng)的yzuLMl-2(BALB/c小鼠LD50為1.47xl04CFU，攻毒劑量為2.5x106CFU/只，連續(xù)觀察14d，記錄攻毒后各組小鼠死亡情況，計算免疫保護(hù)率。結(jié)果如表2所示，經(jīng)6()0)輻照滅活細(xì)菌制備的滅活苗免疫后產(chǎn)生的保護(hù)率高達(dá)到100%，與活菌免疫相當(dāng)，能夠完全抵抗高劑量野生型細(xì)菌的攻擊；而通過熱滅活和甲醛滅活的方法制備的滅活苗引起的保護(hù)率僅為35%、30%。表2.各組滅活苗對小鼠的免疫保護(hù)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>感染動力學(xué)實驗于攻毒后第1、3、5、7、9、13d每組各撲殺2只小鼠，分離脾臟和肝臟中細(xì)菌攜帶量。陰性對照組帶菌數(shù)目最多，且未出現(xiàn)隨時間明顯減少。在脾臟中，活菌組與輻照滅活組帶菌數(shù)隨時間迅速下降，至第5d脾臟中已分離不到細(xì)菌。熱滅活組和甲醛滅活組排菌速度較慢，分別于第9d、第13d達(dá)到無菌狀態(tài)。在肝臟中，活菌組帶菌數(shù)隨時間迅速下降，至第5d組織達(dá)到無菌。輻照滅活組排菌稍慢，至第7d組織達(dá)到無菌。而熱滅活組和甲醛滅活組分別至第9d、第13d達(dá)到無菌狀態(tài)，結(jié)果如圖2所示。T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗于二免后兩周頸椎脫臼處死小鼠，無菌分離免疫鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液，預(yù)冷PBS溫和洗滌三次，每次10min,以50(^1PBS懸浮，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)；細(xì)胞懸液中加入10pl熒光標(biāo)記的CD3單抗，于4'C閉光作用30min，預(yù)冷PBS溫和洗滌3次，每次10min;流式細(xì)胞儀分選其中T細(xì)胞，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)。分選后的T細(xì)胞以200WPBS懸浮，尾靜脈注射BALB/c小鼠。該小鼠同時腹腔注射2.5xl06CFU新鮮培養(yǎng)的yzuLM1-2。三天后撲殺該小鼠，無菌操作分離心臟、肝臟、脾臟，菌落計數(shù)。結(jié)果如圖3所示，陰性對照組小鼠的脾臟、肝臟、心臟帶菌數(shù)分別為2x107CFU、7.8x106CFU、5.7x103CFU，而陽性小鼠的脾臟、肝臟、心臟帶菌數(shù)分別為5.5x105CFU、6.6x104CFU、2x101CFU，明顯少于陰性對照組，說明保護(hù)性免疫應(yīng)答包括由T細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)作用。實施例3:與實施例l基本相同，不同之處在于，所用的菌種是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌LM-4。其得到的輻照滅活疫苗免疫效果評價效果與實施例2基本相同。本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗制備方法，其特征在于，將產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌經(jīng)60Co輻射滅活。2、根據(jù)權(quán)利要求1所說的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗制備方法，其特征在于，所說的輻射具體是，使細(xì)菌樣品置于冰中以6QCo輻射源照射，輻射劑量不低于15KGy。3、根據(jù)權(quán)利要求2所說的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗制備方法，其特征在于，輻照方式為靜態(tài)輻照，劑量率60Gy/min。4、根據(jù)權(quán)利要求3所說的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗制備方法，其特征在于，輻射劑量為15KGy。5、一種通過權(quán)利要求1的方法制得的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗及其制備方法。所說的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗制備方法，是將產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌經(jīng)⁶⁰Co輻照滅活制備滅活疫苗。通過輻照滅活的方法，保留了病原體表面的保護(hù)性抗原成分，能夠激發(fā)保護(hù)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。這些優(yōu)點在研制針對胞內(nèi)病原體的滅活疫苗時顯得尤為重要。文檔編號A61K39/02GK101264322SQ20081002533公開日2008年9月17日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者林孫,殷月蘭,潘志明,焦新安,慧董申請人:揚州大學(xué)