本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測方法，尤其是一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應用于同時檢測單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

單核細胞增多性李斯桿菌病為人畜共患病，可引起皮膚感染、胃腸道紊亂，敗血癥。單核細胞增多性李斯桿菌主要是通過腸道感染，從腸道進入后第一侵害的靶器官是肝。在肝中單核細胞增多性李斯桿菌能大量繁殖，直到機體細胞免疫反應增強后才停止。單核細胞增多性李斯桿菌與結(jié)核菌、弓形蟲蟲體類似可以降低動物母體的細胞免疫的機能，從而使動物孕期母體出現(xiàn)免疫缺陷而導致懷孕動物或人出現(xiàn)早產(chǎn)流產(chǎn)現(xiàn)象、損害神經(jīng)系統(tǒng)(腦炎、腦膜炎)。感染單增性李氏桿菌動物的死亡率高達7％以上。

金黃色葡萄球菌同樣為人畜共患病，不僅為患病動物攜帶該菌，在健康動物的體內(nèi)也可分離到具有致病毒素的菌株。金黃色葡萄球菌可導致動物組織部位化膿，也能引起動物產(chǎn)生肺炎等疾病。由于該細菌感染的動物在產(chǎn)生敗血癥后還會繼發(fā)性的引起腦膜炎，尤其多見于合并左心內(nèi)膜炎的患者，通過細菌栓子經(jīng)血流侵襲腦膜。

腸球菌可引起人和動物感染，且屎腸球菌的感染率呈逐年上升趨勢。腸球菌本身具有較強的耐藥性，不易治愈，此病原菌已受到獸醫(yī)臨床工作者的重視。且單核細胞增多性李斯桿菌，金黃色葡萄球菌與屎腸球菌均可引起動物腦炎。

在內(nèi)蒙古中部地區(qū)一些羊場發(fā)生的以腦炎癥狀為主的感染病例中，分離得到腦源性金黃色葡萄球菌、單核細胞增多性李斯桿菌與屎腸球菌臨床分離株。臨床中單核細胞增多性李斯桿菌引起的動物腦炎病例較為常見，但由金黃色葡萄球菌、屎腸球菌引起動物腦炎病例較為少見。到目前為止，獸醫(yī)臨床對該病的診斷主要依靠病原的分離、鑒定，但是由于病原種類較為復雜，特別是李斯桿菌屬的細菌種類較多，鑒定存在步驟繁瑣、時間長等缺點，并且對單核細胞增多性李斯桿菌的分菌、試驗具有較高的風險性，因此，建立快速、特異的PCR診斷方法對于該病的早期確診和治療具有重要的臨床價值。

目前，國內(nèi)外針對這三種菌建立的多重PCR檢測方法尚未見報道。本試驗根據(jù)單核細胞增多性李斯桿菌Hyl基因與金黃色葡萄球菌NUC基因、屎腸球菌ddl基因序列設計其特異性引物，建立鑒別檢測的多重PCR方法，為開展由金黃色葡萄球菌、單核細胞增多性李斯桿菌、屎腸球菌單一或混合感染性腦炎的快速鑒別診斷提供新的方法。

本發(fā)明根據(jù)三種菌株的特異性基因設計引物，能夠在多重或單一感染的病料中同時檢測到這三種或鑒別其中單一病原，從而為本地區(qū)提供了一種可以快速診斷由此三種病原菌多重或單一感染的多重PCR檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在上述問題，提供一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應用于同時檢測單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明根據(jù)單核細胞增多性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，分別設計了1對特異性引物，在確定引物最佳濃度等反應體系的條件下，進一步確定了多重PCR擴增程序，由此建立了能夠?qū)崿F(xiàn)對單核細胞增多性李斯桿菌鑒定、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌同時檢測或單一鑒別的多重PCR方法。

本發(fā)明提供用于同時檢測單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR引物，引物針擴增的基因分別為單增性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，其特征如下：

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種可同時檢測單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.制備被檢測物的DNA模板并置于反應管中；

b.將單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌引物放入a步驟的反應管中進行多重PCR反應；

所述單核細胞增多性李斯桿菌的引物序列為：

hylA-1:5’-CATATATCTCAAGTGTGGCA-3’

hylA-2:5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGT-3’

所述金黃色葡萄球菌的引物序列為：

NUC-1:5’-GCATCACAAACAGATAACGGCG-3’

NUC-2:5’-TAACCGTATCACCATCAATCGC-3’

所述屎腸球菌的引物序列為：

ddl-1：5’-GGACCCAAGTGGACAGACAG-3’

ddl-2：5’-CTTCACCAGGCAAAGTCGTC-3’

所述多重PCR反應條件為：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共計35個循環(huán)，72℃終延伸5min；

引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2濃度均為10μmol/μL；各引物的體積均為0.5μL、模板體積為1μL、去離子水為6μL、Premix Taq體積為10μL，總體積為20μL。

本發(fā)明與現(xiàn)有普通PCR檢測單核細胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌相比，方法簡單、耗時短、成本低廉，引物檢測靈敏度高，從而為本地區(qū)提供了一種可以快速診斷由此三種病原菌多重或單一感染的新診斷方法，對由這三種菌引起的疾病的監(jiān)測與預防提供了有效的工具，可有效減少經(jīng)濟損失。

附圖說明

圖1：特異性實驗結(jié)果的多重PCR擴增圖，其中各泳道如下，M:Marker；1:無模板陰性對照；2：大腸桿菌DNA；3：鏈球菌DNA；4：金黃色葡萄球菌DNA；5：無模板陰性對照；6：單增李氏桿菌DNA；7：綿羊李斯桿菌DNA；8：巴氏桿菌DNA；9：無模板陰性對照；10：屎腸球菌DNA；11：糞腸球菌DNA；12：芒地場球菌DNA；13：單增李斯桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌混合DNA。

圖2：敏感性實驗結(jié)果的PCR擴增圖，其中各泳道如下，M:Marker；1:無模板陰性對照；2-8:金黃色葡萄球菌DNA濃度分別為116ng-116×10^-4ng；單增李斯桿菌DNA濃度分別為121ng-121×10^-5ng；屎腸球菌濃度分別為107ng-107×10^-5ng。

具體實施方式

實施例1.多重PCR方法

1、試驗菌株

臨床分離菌株：單核細胞增多性李氏桿菌、綿羊李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞場球菌、芒地腸球菌、鏈球菌、巴氏桿菌、大腸桿菌，試驗所用菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

2、主要儀器及試劑

Bio photometer微量核酸檢測儀購自Effendorf公司。DL 600 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PremixTaq購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3、引物設計

根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱性透明質(zhì)酸酶NUC，設計其屬特異性引物NUC-1、NUC-2；根據(jù)單增性李氏桿菌透明質(zhì)酸酶HylA基因，設計其種特異性引物HylA-1、HylA-2。根據(jù)屎腸球菌ddl基因，設計特異性引物ddl-1與ddl-2。引物序列及預期擴增片段長度見下表：

4、多重PCR擴增參數(shù)

引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2濃度均為10μmol/μL，PCR反應條件為：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共計35個循環(huán)，72℃終延伸5min，配置體系各試劑體積見下表。

5、多重PCR特異性試驗

為驗證多重PCR反應的屬特異性和種特異性，選取金黃色葡萄球菌屬外革蘭氏陽性球菌：鏈球菌和桿菌菌屬細菌巴氏桿菌標準株、大腸桿菌分離株；屎腸球菌屬內(nèi)球菌：糞場球菌、芒地腸球菌臨床分離株，以菌株的基因組DNA為模板，進行多重PCR擴增試驗，結(jié)果如圖1所示。由實驗結(jié)果圖可以看出，利用多重PCR方法對獸醫(yī)臨床中常見的病原菌，包括獸疫鏈球菌、巴氏桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、單增性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌進行檢測，只可以檢測出金黃色葡萄球菌、單增性李斯桿菌、屎腸球菌，對獸疫鏈球菌、巴氏桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌均無陽性反應。該多重PCR方法可特異性的擴增出金黃色葡萄球菌、單增性李氏桿菌與屎腸球菌，且將上述三種模板混合后，可檢測出三條條帶，并與單個引物擴增條帶大小相同。

6、多重PCR的敏感性試驗

利用核酸微量檢測儀測得提取的金黃色葡萄球菌和單增李氏桿菌臨床分離株的DNA含量與A₂₆₀/A₂₈₀的比值。用去離子水分別對2種菌的DNA模板進行連續(xù)倍比稀釋(稀釋倍數(shù)為10)，分別以稀釋的不同濃度DNA作為模板，進行多重PCR反應，結(jié)果如圖2所示。

由敏感性實驗結(jié)果圖可以看出多重PCR反應中單增李斯桿菌，金黃色葡萄球菌和屎腸球菌DNA片段，其最低檢測量分別為1.07pg、11.6pg和1.21pg。由此可知，該方法適用于獸醫(yī)臨床對單增性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌感染的診斷，具有特異性強，敏感性高的特點。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。