專利名稱：：毛冬青提取物、其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，尤其涉及毛冬青提取物、提取物的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：毛冬青(IlexpubescensHook,etArn)是冬青科冬青屬下的一種植物，為常綠灌木，高約3米。生于山坡、山谷林中或灌叢中。分布于廣東、廣西、安徽、福建、浙江、江西、臺灣等地。毛冬青的根是我國江南一些省區(qū)民間常用藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效。毛冬青藥材標(biāo)準(zhǔn)是以其根基作為入藥部位，并收載于《中華人民共和國藥典》77年版(P:107)，毛冬青膠囊和注射液分別收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)一中藥成方制劑.第七分冊(P:23)和第二十分冊(P:57)，毛冬青片收載于藥監(jiān)局的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)—中藥成方制劑心系分冊(P:497)。經(jīng)近代藥理學(xué)研究證明，毛冬青提取物及其制劑在循環(huán)和血液系統(tǒng)中具有多方面作用。它能顯著提高小鼠常壓耐缺氧能力，增加大鼠離體冠脈流量，減慢心率，增大心博幅度；顯著對抗急性心肌缺血，對抗心電圖ST段上移和T波升高(孟廣生等，毛冬青地上部分對大鼠冠脈流量的影響及抗心肌缺血作用.中藥藥理與臨床.1996,(3):34-35)。毛冬青注射液能使麻醉貓和犬靜脈血壓明顯下降，降壓作用緩慢但持久(董昆山等主編.現(xiàn)代臨床中藥學(xué).中國中醫(yī)藥出版社.1998,p:504-506)。毛冬青能使兔耳皮下血管及肢體肌肉血管血流量增加，能消除去甲腎上腺素或加壓素誘導(dǎo)的血管收縮(中山醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院外科.毛_冬青對兔離體器官血管作用的實驗及其在斷肢再植中的臨床應(yīng)用.中華醫(yī)學(xué)雜志.1974，54(2):97-100)?？诜嘣碥誌lexsaponinB3能顯著降低實驗性小鼠高膽固醇血贈(Kazuyukihidakaetal.Newtriterpenesaponinsfromi7e義/u6esce/s，Chem.Pharm.Bull.1987,35(2):524-529)。毛冬青具有抗血栓作用，連續(xù)口服10天毛冬青提取物(70%甲醇)能顯著地延長實驗性大鼠出血試驗的時間，但對血漿的凝聚時間影響不大；它還能顯著地抑制血小板中丙二醛(malondialhyde)的形成(YongN.Hanetal.AntithromboticactivityofthetriterpenoidsofT7w尸〃力esce/sandtheconversionmethodofthetriterpenoidsofT7e義A/6e5ce"5havingnoantithromboticactivityintothetriterpenoidshavingantithromboticactivity.UnitedStatesPatent4,987,125)。毛冬青注射液對凝血酶誘導(dǎo)的肌動蛋白聚合、肌球蛋白與肌動蛋白微絲的結(jié)合有強(qiáng)烈的抑制作用(黃才等.毛冬青和復(fù)方丹參注射液對豬血小板細(xì)胞骨架蛋白的影響.湛江醫(yī)學(xué)院學(xué)報.1993，11(1-2):9-11)。毛冬青注射液對甘油誘導(dǎo)的大鼠急性腎功能衰竭(ARF)有預(yù)防作用(陳少剛等.毛冬青預(yù)防大鼠甘油致急性腎功能衰竭的初步實驗研究.實用醫(yī)學(xué)雜志.1990，6(4):5-8)。毛冬青注射液對動物S-180腫瘤放射有增敏，且E/0比值達(dá)1.4(吳少雄等.毛冬青(IP)作為放射增敏劑的初步動物實驗研究.癌癥.1990，9(6):512-513)。另外毛冬青提取物能顯著地縮短去勢大鼠陰莖勃起起伏期，在交配能力上，能縮短大鼠撲捉和射精潛伏期，增加撲捉和射精次數(shù)，提示具有抗ED作用(周國偉等.治療勃起功能障礙癥的毛冬青提取物制劑及其制備方法.中國發(fā)明專利.公開號CN1355028A.授權(quán)號ZLOO127593.3)。目前毛冬青制劑主要應(yīng)用于冠心病、高膽固醇血癥、高血壓、血栓閉塞性脈管炎、缺血性腦中風(fēng)、中心性視網(wǎng)膜炎、慢性盆腔炎、輸卵管炎性阻塞、萎縮性鼻炎以及外科感染性外傷等治療，效果良好(董昆山等主編.現(xiàn)代臨床中藥學(xué).中國中醫(yī)藥出版社.1998,p:504-506)。有關(guān)毛冬青提取物或上述提到的膠囊、注射液和片劑有效成分，文獻(xiàn)普遍認(rèn)為是黃酮化合物(中國藥科大學(xué)主編.中藥辭海第一巻.中國醫(yī)藥科學(xué)出版社.1998，p:1100;江蘇新醫(yī)學(xué)院編中藥大辭典(下冊)上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.1998,p:441)，在毛冬青膠囊或注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測定項目中還使用蘆丁為對照的分光光度法測定制劑中總黃酮量，在片劑標(biāo)準(zhǔn)中含量測定指標(biāo)換成了原兒茶醛，但此標(biāo)準(zhǔn)批件中仍有增設(shè)總黃酮含測建議。其實毛冬青提取物或制劑的有效成分并不是黃酮，而是三萜皂甙和木脂素甙。據(jù)調(diào)查，到目前為止國內(nèi)外尚無一篇有關(guān)從毛冬青根部中分離獲得黃酮類單體的報道，至于出現(xiàn)毛冬青含有黃酮成分報道，那可能是早期的化學(xué)成分預(yù)試驗的結(jié)果。在我們的有效成分研究中，曾分離到木脂素甙類成分丁香樹脂醇-4-0-e-D-葡萄糖甙，該化合物含有酚羥基結(jié)構(gòu)，這在成分預(yù)試驗中也能表現(xiàn)出與黃酮化合物類似的反應(yīng)特征。在國內(nèi)，有不少毛冬青制劑專利獲得公開，曲韻智(CN1686362)、孫民富(CN1759847)先后公開了滴丸處方和制備方法，范友靈等(CN1686251)公開了軟膠囊處方和制備方法，劉露(CN1733013)公開了注射液處方和制備方法；張平(CN1628832)和王偉(CN1813829)先后公開了凍干粉針制備方法，前者的毛冬青提取物經(jīng)聚酰氨柱純化處理，后者經(jīng)大孔樹脂處理，但樣品標(biāo)示的有效成分都稱黃酮。袁海龍等(CN1772020)公開的用大孔樹脂純化毛冬青制備凍干粉針的方法，粉針?biāo)玫奶崛∥镌磉昂看笥?0%，但其皂甙含量以何物計不明確。在袁氏發(fā)明中，凍干粉針劑與市售毛冬青注射液質(zhì)量比較的關(guān)鍵項目含量測定是以"新毛冬青素"計折算，然而"新毛冬青素"究竟是指何物未作任何說明，即使它是毛冬青中的成分之一，用它作對照測定總皂甙在技術(shù)上是否可行，也是需要通過實驗來論證。綜上所述可以了解，國內(nèi)目前公開的毛冬青提取物或制劑都未能涉及到具體皂甙或皂甙成分組合的概念，即使是袁氏專利(CN1772020)提到皂甙，但因其皂甙含量測定用對照物質(zhì)不明或公開不充分等原因，使得對專利所聲稱的皂甙含量數(shù)值難以作出正確與否的判斷。目前，國內(nèi)市場上毛冬青制劑無論是片劑、膠囊還是注射液，他們的生產(chǎn)工藝大多采用傳統(tǒng)提取方法，即為水提醇沉，而該工藝其實對皂甙成分的損失較大，同時雜質(zhì)仍較多，并不是理想的毛冬青類中藥生產(chǎn)工藝。另外這些毛冬青制劑的質(zhì)量體系也不盡相同，如毛冬青膠囊或注射液仍保留以蘆丁作對照測定總黃酮含量，毛冬青片則以原兒茶醛為對照測定微量原兒茶醛，雖然比起測總黃酮有進(jìn)步，但其仍未能夠客觀反映毛冬青制劑內(nèi)在質(zhì)量。鑒于上述背景和情況，研制質(zhì)量穩(wěn)定可控的毛冬青新一代制劑就顯得非常重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是公開一種毛冬青提取物、提取物的制備及應(yīng)用。本發(fā)明一方面，在比較深入研究毛冬青有效成分基礎(chǔ)上，通過對毛冬青提取工藝的系統(tǒng)篩選，根據(jù)其主要有效成分特點，提出了一種比較客觀反映實際狀況的含毛冬青皂甙IlexsaponinAl、Ilexs鄰oninBl和Ilexs鄰oninB3有效成分組合的提取物、提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明公開了一種毛冬青提取物，該提取物中，毛冬青總皂甙以Ilexs鄰oninBl計，K低于50°/。，IlexsaponinAl的重量百分含量不低于4.0%,IlexsaponinBl的重量百分含量為2.57.5%，優(yōu)選3.5%—6%，IlexsaponinB3的重量百分含量為3.08.0%，優(yōu)選3.5%—6.5%。較佳的，提取物中，IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3重量比例為l:(0.61.9):(0.72.0)之間，優(yōu)選1:(0.7—1.4):(0.8—1.5)。上述含量均為以毛冬青提取物總重量為基礎(chǔ)計的重量百分比含量。本發(fā)明第二方面，公開了上述毛冬青提取物的制備方法，其過程包括先用稀醇提取，然后用大孔樹脂純化制備毛冬青提取物。提取工藝過程是用5—10倍藥材重量倍數(shù)的5%~50°/。乙醇水溶液，優(yōu)選20%—30%乙醇水溶液回流提取2次，每次l一5小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06—1.07(70土1(TC下)的濃縮液，靜置，取上清液供上大孔樹脂柱純化處理。提取工藝改進(jìn)的關(guān)鍵點在于采用了稀醇替代了傳統(tǒng)的水提，在研究中發(fā)現(xiàn)，如用水提取，皂甙成分的實際轉(zhuǎn)移率并不是很高，同時因水提產(chǎn)生大量泡沬，使提取液的濃縮成為困難；然而如采用常規(guī)的醇提工藝，則提取液中容易產(chǎn)生難以方便處理的絮狀物(過濾或離心均較難去除)，影響后續(xù)純化工藝的正常開展?，F(xiàn)經(jīng)過大量的實驗，發(fā)現(xiàn)只要保持乙醇水溶液的濃度在50%以下，產(chǎn)生絮狀物的現(xiàn)象就能得到較好的控制，尤其是采用20%—30%乙醇水溶液提取，效果比較理想，有效成分轉(zhuǎn)移率既高，又無絮狀物干擾，同時無大量泡沫，濃縮能順利進(jìn)行。純化工藝過程是取上述澄清的濃縮液上清液過一裝有大孔樹脂(藥材重量的1/2—1/4)的水相層析柱，經(jīng)3—6BV(樹脂床體積倍數(shù))量的水洗滌，用1—4BV量20W—80W乙醇水溶液如20%、40%、60%和80%乙醇溶液梯度洗脫(每種濃度的乙醇水溶液均采用1一4BV量的清洗)，收集40—60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉。上述乙醇的百分比含量均為體積百分比濃度。第三方面，本發(fā)明公開了一種毛冬青制劑，含有上述毛冬青提取物與藥用輔料，其中，毛冬青提取物與藥用輔料的重量比為(48):(62),優(yōu)選(3—4):3。上述毛冬青制劑包括顆粒劑、片劑(包括速釋和緩釋片劑)、膠囊(包括緩釋膠囊)、軟膠囊、干糖漿、滴丸、注射液以及凍干粉針劑等。上述藥用輔料可選用各種常用藥用輔料，如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、低取代羥丙纖維素、羧甲基淀粉納、乙基纖維素、聚乙二醇、丙二醇、大豆油、卵磷脂、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、滑石粉、可溶性淀粉、麥芽糊精、微粉硅膠和矯味劑等。第四方面，本發(fā)明還公開了用上述方法制備的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的毛冬青提取物、或上述各類毛冬青制劑在制備治療心腦血管和血液系統(tǒng)疾病的藥物或制備治療勃起功能障礙癥的藥物上的應(yīng)用。具體的，上述方法制備的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的毛冬青提取物可用于制備提高動物常壓耐缺氧能力、降壓、降血脂、抗血栓、抗血小板聚集或?qū)π哪X血管缺血性再灌注損傷有較好的保護(hù)作用的藥物；制備治療冠狀動脈硬化性心臟病、缺血性腦中風(fēng)、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎外科感染性外傷或改善男性性功能的藥物。本發(fā)明以毛冬青有效成分為技術(shù)指標(biāo)，對毛冬青提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，確定了毛冬青提取物提取和純化生產(chǎn)工藝；引入現(xiàn)代制藥的"原料藥"概念，建立以毛冬青標(biāo)準(zhǔn)提取物投料的各類新一代中成藥制劑生產(chǎn)工藝。在質(zhì)量方面，建立以毛冬青皂武為指標(biāo)的毛冬青標(biāo)準(zhǔn)提取物及其各類制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。使用這種科學(xué)、合理的標(biāo)準(zhǔn)提取物作為原料，制備毛冬7青各類制劑，其質(zhì)量穩(wěn)定、有效成分重現(xiàn)性良好，優(yōu)勢顯著，為確保毛冬青各類制劑在臨床上安全和有效使用打下更堅實基礎(chǔ)。圖1.IlexsaponinAl化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖2.IlexsaponinBl和IlexsaponinB3化學(xué)結(jié)構(gòu)式R1R2ilexsaponinB1:Glc-Xyl-HilexsaponinB3:Glc-Xyl-Glc圖3.丁香樹脂醇-4-O-P-D-葡萄糖甙化學(xué)結(jié)構(gòu)式具體實施例方式下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如《中國藥典》2005版中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。部分試驗方法一毛冬青總皂甙含量檢測方法以IlexsaponinBl為對照的分光光度法測定毛冬青總皂武含量。毛冬青總皂甙含量測定采用香草醛-硫酸法，具體操作過程是對提取物樣品，使用甲醇溶解，對藥材樣品，則須用甲醇索氏提取5小時；然后在被測樣品溶液中，加入8%香草醛無水乙醇溶液0.5ml、72%硫酸5.Oml,搖勻后置6(TC水浴中加溫10分鐘，然后立即置冰浴冷卻10分鐘，取出后放置5分鐘；以對應(yīng)的試劑作空白，在536nm下測定吸收值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總皂甙含量。二單一皂甙鑒別及含量測定方法用薄層層析鑒別，用高效液相色譜法測定單一皂甙含量。薄層層析鑒別取毛冬青提取物或制劑適量，用甲醇配制成每lml含相當(dāng)于提取物5mg的溶液，作為供試品溶液。另取Ilexs鄰oninAl、IlexsaponinBl和Ilexs即oninB3對照品，加甲醇制成每lml含lmg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各l-2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲垸-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105t:加熱至斑點顯色清晰，置閂光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。高效液相色譜法的皂甙含量測定中，其成分的檢測可以使用紫外或蒸散發(fā)光或視差儀中的一種，色譜柱采用Cu反相柱，柱溫40'C，流動相采用0,2%甲酸溶液乙睛甲醇(47:10-15:45-40);流速1.0ml/min。采用紫外檢測時，檢測波長為205nm;采用蒸散發(fā)光檢測時，Tn二12(TC，Te=130°C，空氣流速1.2SLM;采用視差儀檢測時，視差儀溫度設(shè)置在45°C。實施例1毛冬青提取物中皂甙單體的分離毛冬青中單體成分分離取適量毛冬青提取物，用2-5倍量水溶解分散，與等體積的正丁醇萃取三次，合并正丁醇相，濃縮，得黃色粗總皂甙。再經(jīng)大孔樹脂層析、硅膠柱層、RP-18反相柱層和凝膠柱層反復(fù)分離、精制(具體方法由下列文獻(xiàn)記載KazuyukiHidakaetalNewTriterpensSaponinsfrom/tec—escChem.Pharm.Bull.35(2):524-529,1987)，分別獲得單體i、n、m和iv。單體I:FAB-MS(m/z):1351.72(2M+Na),1005.52(2M-Glu+Na)，687.25(M+Na),663.49(M-1);HRMS(m/z):687.3723(M+Na),理論值687.3720,分子式為C36H56Ou。HNMR(Py-d6)S:1.05(3H，d，30Me)，1.17(3H,s,25Me),1.22(3H,s,26Me),1.40(3H，s，29Me),1.71(3H，s,27Me)，1.73(3H，s,23Me)，2.91(lH,s,H國18),3.07(lH,m，H-19),3.35(lH.brd,H-3),4.03(lH,brs,G-3),4.19(lH,t,G-2),4.27(2H,d,G-4,5),4.34(1H,dd,G-6)，4.43(1H,d，G-6),5.14(1H,brs，19-OH),5.56(lH,s,H-12),6.24(lH,d,G-l)。13CNMR(Py-d6)S:39.812(C-l，39.7(文獻(xiàn)值))，29.149(C-2,29.0),78.425(C-3，78.3)，49.295(C-4,49.1),57.058(C-5,56.9),2U10(C-6,21.0),33.928(C-7,33.8),40.470(C-8，40.3)，47.245(C-9，47.1)，37.921(C-10，37.8)，24.307(C-11,24.4),128.582(C-12,128.4)，139.297(C-13，139.2),42.254(C-14,42.1),29.287(C-15，29.1),26.197(C-16,26.0),48.711(C-17，48.6)，54.573(C-18,54.4)，72.690(C-19,72.6),42.169(C-20,42.1),26.728(C-21,26.6),37.688(C-22,37.8)，24.455(C-23,24.4),181.054(C-24,181.0),14.006(C-25,13.9),17.383(C-26，17.3),24.795(C-27，24.7)，177.050(C-28,177.1),27.079(C-29，27.0)，16.724(C-30，16.7);95.862(G-1，95.7)，74.007(G-2，73.8),78.903(G-3，78.7)，71.246(G-4,71.1),79.243(G-5'79.",62.347(G-6,62.2)。經(jīng)上述綜合的光譜分析和文獻(xiàn)(Kazuyukihidakaetal.Atriterpeneandsaponinfromrootsof77ay;w力esce/51,Phytochemistry1987,26(7):2023-2027)數(shù)據(jù)對比，確認(rèn)單體I為毛冬青皂苷甲(IlexsaponinAlorIIexsaponinA)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。單體II:FAB-MS(m/z):789.38(M+Na),1555.75(2M+Na);HRMS(m/z):789.4413(M+Na)，理論值789.4401，分子式為C41H66013。iHNMR(Py-d6)S:0.768(3H,s,24Me)，0.955(3H，s，26Me),0.969(3H,s,25Me),1.001(3H,d,30Me),U32(3H，s,23Me),1.304(3H,s，29Me)，1.610(3H，s，27Me),3.103(1H,d,3-H),3.156(lH,d,18-H),3.554(lH，t,X-l-H)，3.785(lH，brd,G-5-H),5.214(lH，d，X-l-H),5.420(lH,s，12-H)。13CNMR(Py-d6)S:38.792(C-1,38.8(文獻(xiàn)值))，27.057(C-2，27.0)，88.800(C-3,88.9)，39.567(C-4，39.5),55.922(C-5，55.9),18.604(C-6,18.6),33.546(C-7,33.5),40.236(C-8,40.2):47.723(C-9,47.7)，36.997(C-10,36.9)，24.880(C-11，24.8),127.254(C-12,127.2)，139.456(C-13,139.5)，41.116(C-14,42.0),29.224(C-15,29.2),26.707(C-16,26.6),47.904(C-17,47.8),47.394(C-18,47.3),73.434(C-19,73.4),42.997(C-20,42.8),23.956(C-21,23.9),32.410(C-22,32.3)，28.109(C-23,28.0),15.524(C-24,15.5),16.108(C-25，16.1),17.255(C-26,17.2),24.360(C-27，24.3),180.610(C-28，180.7)，29.808(C-29,29.8),16.724(C-30，16.6);3-O-Sugar:105.664(X-l,105.7),83.225(X-2,82.8),77.936(X-3，77.8),71.628(X-4，71.5),66.637(X-5,66.5)，106.004(G-1，105.8),77.012(G-2，76.8),78.202(G-3,78.1),70.938(G-4，70.8),77.936(G-5，77.8),62.644(G-6,62.6)。經(jīng)上述綜合的光譜分析和文獻(xiàn)(Kazuyukihidakaetal.Newtriterpenesaponinsfrom/ex，6escem1,Chem.Pharm.Bull.1987>35(2):524-529)數(shù)據(jù)對比，確認(rèn)單體II為IlexsaponinBl,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。單體III:13CNMR(Py-d6)S:38.834(C-1,38.8(文獻(xiàn)值))，26.754(C-2,26.8),88.798(C-3,88.8)，39.584(C-4，39.6)，55.918(C-5,55.9)，18.678(C-6，18.7),33.480(C-7，33.5)，40.426(C-8,40.3),47.167(C-9，47.7),36.991(C-10,36.9),24.646(C-11，24.6),127.637(C-12，127.5),138.807(C-13,138.8),42.094(C-14，42.1),29.196(C-15,29.1)，26.754(C-6，26.7)'48.320(C-17，48.3),47.167(C-18，47.1),73.382(C-19，73.4),42.792(C-20,42.6),24.001(C-21,23.8),31.842(C-22，31.7)，28.119(C-23,28.1)，15.660(C-24，15.6),16.017(C-25,16.0),17.457(C-26,17.4)，24.297(C-27,24.3),177.002(C-28,177.1)，29.196(C-29，29.7),16.707(C-30,16.7);3-O-Sugar:106.056(X-l,105.8),83.255(X-2，83.0)，77.977(X-3,77.5)，7L600(X-4,71.5),66.671(X-5，66.7),105.708(G-l,105.8)，77.082(G-2,76.9),78.940(G-3,78.3),70.955(G-4，70.9)，78.273(G-5,77.9),62.614(G-6，62.6);28-O-Sugar:95.789(G-1，95.7),74.064(G-2，73.8)，79.751(G-3，78.7)，70.955(G-4，71.1),79.205(G-5，79.1),62.159(G-6,62.2)。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，確認(rèn)單體III為11exsaponinB3，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。單體IV:^NMR(Py-d6)S:3.22(2H,m,8，8，-H),3.80(6H，s,OCH3x2),3.83(3H,s，OCH3，x2),3.92(lH,m,G-3-H),4.07(2H,m，9，9'-H)，4.25-4.40(7H，m，G-2,4,6，5.9,9,-H),5.78(lH,dd,G-l),6.94(2H,s，2，6-H),6.97(2H,s,2',6'-H)。13CNMR(Py-d6)S:138.42(C-l,133.6(文獻(xiàn)值))，104.91(C-2,104.0),154.00(C-3,152.5)，135.63(C-4,137.1),154.00(C-5，152.5),104.9l(C-6，104.0)，86.54(C-7,85.2)，54.96(C-8,53.6),72.27(C-9，71.2),132.14(C-1，,131.2),104.95(C-2，,103.5)，149.34(C-3',147.8),137.42(C-4，,134.7)，149.34(C-5，，147.8)，104.95(C-6，，103.5),86.51(C-7，，85.0)，54.83(C隱8'，53.5),72.14(C-9，,71.1)，56.76(OMe，x2,56.3),56.55(OMex2,55.9),105.09(G-1,102.7),76.09(G-2,74.0),78.69(G-3,76,4),71.69(G-4,69.8),78.41(G-5,77.1),62.69(G-6，60.8)。經(jīng)和13CNMR光譜測定分析禾口文獻(xiàn)(JuneiKinjoetal.Thefirstisolationoflignantri-andtetra-glycosides.Chem.Pharm.Bull.1991,39(6):1623-1625)比較，確定單體IV為丁香樹脂醇-4-0-e-D-葡萄糖甙，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。從毛冬青提取物中分離得到皂甙單體IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3(結(jié)構(gòu)見圖1和2.)夕卜，還分離獲得了一個雙環(huán)氧木脂素甙類成分丁香樹脂醇-4-O-e-D-葡萄糖甙(結(jié)構(gòu)見圖3.)，該成分因其有酚羥基結(jié)構(gòu)，某些化學(xué)鑒別反應(yīng)結(jié)果可與黃酮類相似。實施例2毛冬青提取物的制備-l取毛冬青飲片100kg，加3(W乙醇500kg，加熱回流提取3小時，第二次提取2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06—1.07(7(TC土10)，過一裝有50kg大孔樹脂水相層析柱，用300kg量的水洗滌，然后用200kg量的40%、60°/。和80%乙醇溶液梯度洗脫，收集40~60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉約4.5kg。提取物中毛冬青總皂甙含量52%，IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3的含量分別為5.1%、3.7%和4.3%,IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3量比例為l:0.73:0.84。實施例3毛冬青提取物的制備-211取毛冬青飲片100kg,加5y。乙醇1000kg，加熱回流提取5小時，第二次提取2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06~1.07(70°C±10),過一裝有50kg大孔樹脂水相層析柱，用300kg量的水洗漆，然后用200kg量的40%、60%和80%乙醇溶液梯度洗脫，收集40一60°/。乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉約4.3kg。提取物中毛冬青總皂武含量51%，IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3的含量分別為4.4%、5.9%禾口6.5%,Ilexs印oninAl、IlexsaponinBl禾口IlexsaponinB3量比例為l:1.3:1.5。實施例4毛冬青提取物的制備-3取毛冬青飲片100kg，加50%乙醇800kg，加熱回流提取l小時，第二次提取2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06—1.07(70°C±10)，過一裝有50kg大孔樹脂水相層析柱，用300kg量的水洗滌，然后用200kg量的40%、60%和80。/。乙醇溶液梯度洗脫，收集40一60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉約4.2kg。提取物中毛冬青總皂武含量53%，Ilexs鄰oninAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3的含量分別為4.1%、5.8%和3.8%,IlexsaponinAl、IlexsaponinBl禾卩IlexsaponinB3量比例為l:1.4:0.9。實施例5毛冬青提取物的制備-4取毛冬青飲片100kg，加2(W乙醇500kg，加熱回流提取3小時，第二次提取2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06~1.07(70'C±10)，過一裝有50kg大孔樹脂水相層析柱，用300kg量的水洗滌，然后用200kg量的40%、60%和80%乙醇溶液梯度洗脫，收集40一60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉約4.7kg。提取物中毛冬青總皂武含量52%，IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3的含量分別為5.1%、4.7%和5.4%,IlexsaponinAl、IlexsaponinBl禾口IlexsaponinB3量比例為1:0.9:1.1。實施例6毛冬青顆粒劑的制備取實施例2制備的提取物2kg,過80目篩網(wǎng)，加等量糊精,充分混和，置干法制粒機(jī)擠壓成條，然后破碎制粒，整粒，得到質(zhì)地脆硬的淡棕色顆粒,分裝成袋,每袋凈重0.5g，相當(dāng)生藥5g。實施例7毛冬青片的制備取實施例2制備的提取物2kg,過80目篩網(wǎng)，加入預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羥丙基纖維素各500、1200、和300g，充分混和，濕法制粒，干燥后加入適量的硬脂酸鎂和膠態(tài)二氧化碳，充分混和，壓制成片，每片重0.5克/片，相當(dāng)生藥4.5g。實施例8毛冬青膠囊的制備取實施例2制備的提取物2kg，過80目篩網(wǎng)，加入1.5kg淀粉，充分混和，濕法制粒，干燥后加入適量的硬脂酸鎂和膠態(tài)二氧化碳，充分混和，裝填膠囊，每粒內(nèi)重0.5g,相當(dāng)生藥4.5g。實施例9毛冬青粉針劑的制備取實施例2制得的浸膏粉，加5倍量水溶解，然后用一半體積的正丁醇萃取三次，合并萃取液濃縮并千燥。取該純化浸膏粉500g(總皂甙含量80%)，加葡萄糖500g，用8000ml滅菌水溶解，滅菌過濾，分裝至小瓶內(nèi)，每瓶4ml，然后冷凍干燥，密封即得。每瓶粉針的總固物0.5g，其中提取物量為250mg。實施例10提取物及其制劑的TLC鑒別試驗取實施例2-5制得的毛冬青提取物及實施例6-9的制劑適量，用甲醇制成每lml含相當(dāng)于提取物5mg的溶液，作為供試品溶液。另取IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3對照品，加甲醇制成每lml含1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各卜2ul,分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)l(TC以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105'C加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。所有供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。實施例11藥理試驗1.毛冬青提取物對成年雄性大鼠交配的影響1.1實驗藥物毛冬青提取物(實施例2制備)給藥前置研缽中研細(xì)，加0.25MCMC蒸餾水研磨，配制成混懸液，備用。苯甲酸雌二醇注射液上海第九制藥廠生產(chǎn)，批號991101。黃體酮注射液上海第九制藥廠生產(chǎn)，批號2000703。丙酸睪酮注射液上海第九制藥廠生產(chǎn)，批號2000601。注射用青霉素鈉華北制藥股份有限公司，批號U0104018。1.2實驗動物SD大鼠，雌雄各半，SPF級。雄性大鼠體重250士10g，雌性大鼠體重190士10g。由中外合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司供應(yīng)，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2003-0002。飼養(yǎng)環(huán)境室溫25±0.5。C，相對濕度60-70%,照度150-200Lux，12小時明暗交替。雄鼠每籠飼養(yǎng)l只。1.3實驗方法1.3.1雌性大鼠準(zhǔn)備50只雌性大鼠在乙醚麻醉下，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后肌注青霉素鈉2萬U.kg—1，每日l次，共3天。卵巢切除約4周后進(jìn)行實驗。實驗前48小時每只皮下注射苯甲酸雌二醇20ug，實驗前4小時每只皮下注射黃體酮注射液500ug。1.3.2雄性大鼠準(zhǔn)備50只雄性大鼠按體重隨機(jī)分組,每組10只。分成空白對照和毛冬青(低、中、高)、丙酸睪酮組，共5組。前4組每天灌胃給予CMC混懸液或藥物1次，每次5ml.kg—'，連續(xù)21天；后1組于第19和20天，皮下注射丙酸睪酮1次(lml.kg—0。1.3.3實驗條件所有實驗動物在實驗前一星期開始，通過控制燈光調(diào)整動物的時差，使其能夠適應(yīng)環(huán)境，即6:00-18:00日光燈照明；18:00-6:00紅燈照明。實驗觀察時全部采用紅色燈光(沒有其它光線照明)，禁聲。籠舍大小55X35X20cm。1.3.4觀察指標(biāo)和數(shù)據(jù)處理撲捉潛伏期自雌鼠投入至雄鼠第一次跨騎行為的時間；撲捉次數(shù)雌鼠投入20分鐘內(nèi)雄鼠撲捉雌鼠的次數(shù)；射精潛伏期自雌鼠投入至雄鼠第一次射精(以跨騎雌鼠后舔自身生殖器為標(biāo)志)的時間；射精次數(shù)雌鼠投入20分鐘內(nèi)雄鼠跨騎雌鼠后，舔自身生殖器次數(shù)。各組間作方差分析，并進(jìn)一步作Student-t檢驗。1.4實驗結(jié)果雌雄大鼠經(jīng)處理或給藥，于第21天晚合籠進(jìn)行實驗觀察。表l.顯示，與空白對照組比較，各給藥組的撲捉潛伏期有不同程度地縮短；撲捉次數(shù)明顯或顯著性增加；射精潛伏期顯著性縮短；射精次數(shù)明顯或顯著性增加。提示毛冬青提取物可提高成年雄性SD大鼠的性欲，增強(qiáng)大鼠的交配能力。表l.毛冬青提取物對大鼠交配的影響(mean±SD，N=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與空白對照組比較，*p<o.05,**p〈acn2.對大鼠實驗性血栓形成的影響2.1實驗藥物毛冬青提取物(實施例2制備)同前；戊巴比妥鈉廣州南方化玻公司進(jìn)口分裝(批號20040303)實驗前用生理鹽水溶解，稀釋至2%濃度備用；肝素鈉注射液常州生化千紅制藥有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為12500單位/2ml/支，試驗前用生理鹽水稀釋至每毫升5單位，備用；阿司匹林阿斯特拉制藥有限公司產(chǎn)品(批號97043005)，臨用前以0.25%CMC蒸餾水配制成2%濃度混懸液，備用。2.2實驗動物SD雄性大鼠，來源同前。雄性大鼠體重280土10g。2.3實驗方法取50只雄性大鼠，按體重和性別隨機(jī)分成毛冬青(低、中、高)、空白對照(CMC)和阿司匹林組，共5組，每組10只。每天灌胃給予藥物或CMC混懸液1次，每次5ml.kg—1，連續(xù)14天。末次給藥lh后，ip戊巴比妥鈉40mg.kg—'麻醉，手術(shù)暴露右側(cè)頸外靜脈和左側(cè)頸總動脈，于動靜脈近心端插入事先準(zhǔn)備好的體外導(dǎo)流管，固定。該導(dǎo)流管由3段管體組成，兩端細(xì)管用硬膜外導(dǎo)管制成，每段長7cm，內(nèi)徑lmm;中段采用硅膠管，長7cm，內(nèi)置5cm長7-手術(shù)絲線(5.0±0.lmg);三段管體連接后，管內(nèi)注滿經(jīng)稀釋后肝素溶液。開放動脈夾后，血液從左頸總動脈經(jīng)該導(dǎo)管后進(jìn)入右頸外靜脈；15min后斷流，立即取出中段管中絲線，精密稱重，計算血栓重量(血栓重量二絲線濕重一絲線原重)。數(shù)據(jù)處理，t檢驗。2.4實驗結(jié)果表2.顯示，大鼠給與高、中、低劑量毛冬青提取物后，體外血栓明顯減少，與空白對照組比較，差異顯著(P<0.05)。提示毛冬青提取物可抑制大鼠體外血栓的形成。表2.毛冬青提取物對大鼠體外血栓形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與空白對照組比較，*P<0.053.對大鼠中動脈栓塞再灌注損傷的影響3.1實驗藥物毛冬青提取物(實施例2制備)同前；水合氯醛(AR):上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，用生理鹽水配制成10%濃度備用。3.2實驗動物SD雄性大鼠，來源同前。雄性大鼠體重260-280g。3.3實驗方法取60只雄性大鼠，按體重隨機(jī)分成空白對照、假手術(shù)和毛冬青低、中、高劑量組5組，每組12只。給藥組，每日灌胃毛冬青提取物一次，連續(xù)9天。假手術(shù)組和造型組給等體積CMC。第10天給藥前，以水合氯醛350mg.kg、ip麻醉，仰臥固定，頸正中切開皮膚，依次暴露右頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈向心端和頸外動脈，在頸內(nèi)動脈下前穿線備用，夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，在穿線后方剪一切口，向切口內(nèi)插入一根帶圓頭的尼龍線，(線長5cm，直徑0.25咖，先端燙成圓頭，圓頭直徑約0.4mm，距圓頭17.5咖處作一黑色記號)抽緊頸內(nèi)動脈處備用線，開放頸內(nèi)動脈上動脈夾，將尼龍線緩緩插入頸內(nèi)動脈，至黑色記號到達(dá)頸內(nèi)動脈分叉處，有輕微阻力為止，扎緊備用線。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露右頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，不閉塞大腦中動脈。術(shù)后嚴(yán)格控制室溫至25-25'C，大鼠體溫維持在36.5-37.5°C。閉塞中動脈2h后，將線栓拉回至頸內(nèi)動脈，使血液再灌注中動脈。逐層縫合創(chuàng)口。造模lh后，灌胃給藥一次。24h后斷頭取腦，稱量手術(shù)側(cè)(右側(cè))半腦濕重。置烘箱中，lKTC烘烤24h至恒重，精確稱量干重，計算腦含水百分比。[腦組織含水量(％)=(濕重—干重)X100/濕重]3.4實驗結(jié)果表3.顯示，與假手術(shù)組比較，造型組大鼠腦含水量顯著增高(P〈0.05);大鼠給予高、中、低劑量毛冬青提取物后，腦組織含水量均不同程度降低，與造型組比較，高劑量組差異顯著(P〈0.05)。提示毛冬青提取物可抑制大鼠實驗性中動脈栓塞再灌注損傷，減輕由此引起的腦水腫。表3.毛冬青提取物對大鼠中動脈栓塞再灌注損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與造型組比較，*P<0.05;與假手術(shù)組比較，ft#P<0.0權(quán)利要求1.一種毛冬青提取物，其特征在于，所述提取物中，毛冬青總皂甙以IlexsaponinB1計，重量百分含量不低于50％，IlexsaponinA1的重量百分含量不低于4.0％，IlexsaponinB1的重量百分含量為2.5～7.5％，IlexsaponinB3的重量百分含量為3.0～8.0％。2.如權(quán)利要求l所述毛冬青提取物，其特征在于，所述毛冬青提取物中，IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和IlexsaponinB3重量比例為1:(0.6L9):(0.72.0)。3.如權(quán)利要求1所述毛冬青提取物，其特征在于，所述毛冬青提取物由包括下列步驟的方法制得a.用5—10倍藥材重量倍數(shù)的5%~50%乙醇水溶液，回流提取2次，每次l一5小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06—1.07的濃縮液，靜置，取上清液供上大孔樹脂柱純化處理；b.取上述濃縮液的上清液過一裝有大孔樹脂的水相層析柱，經(jīng)3—6BV量的水洗滌，用l一4BV量的20。/。一80。/。乙醇水溶液梯度洗脫，收集40—60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉。4.如權(quán)利要求3所述毛冬青提取物，其特征在于，步驟a中，所述乙醇水溶液體積百分比濃度為20%—30%。5.如權(quán)利要求4所述毛冬青提取物，其特征在于，步驟b中，所述大孔樹脂的裝量為藥材重量的1/2—1/4;所述20°/?！?0%乙醇水溶液為20%、40%、60%和80%的乙醇水溶液。6.如權(quán)利要求1或2所述毛冬青提取物的制備方法，包括下列步驟a.用5—10倍藥材重量倍數(shù)的5%—50%乙醇水溶液，回流提取2次，每次l一5小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.06—1.07的濃縮液，靜置，取上清液供上大孔樹脂柱純化處理；b.取上述濃縮液的上清液過一裝有大孔樹脂的水相層析柱，經(jīng)3—6BV量的水洗滌，用l一4BV量的20o/。一80。/。乙醇水溶液梯度洗脫，收集40—60%乙醇流份，減壓濃縮，真空干燥，得到浸膏粉。7.如權(quán)利要求6所述毛冬青提取物的制備方法，其特征在于，步驟a中，所述乙醇水溶液體積百分比濃度為20%—30%。8.如權(quán)利要求6所述毛冬青提取物的制備方法，其特征在于，步驟b中，所述大孔樹脂的裝量為藥材重量的1/2—1/4;所述20%—80%乙醇水溶液為20%、40%、60%和80%的乙醇水溶液。9.一種毛冬青制劑，含有權(quán)利要求l一5中任一權(quán)利要求所述毛冬青提取物與藥用輔料，其中，毛冬青提取物與藥用輔料的重量比為(48):(62)。10.如權(quán)利要求9所述毛冬青制劑，其特征在于，毛冬青提取物與藥用輔料的重量比(3—4):11.如權(quán)利要求9或IO所述毛冬青制劑，其特征在于，所述毛冬青制劑的制劑類型選自顆粒齊廿、片劑、膠囊、軟膠囊、干糖漿、滴丸、注射液或凍干粉針劑。12.如權(quán)利要求11所述毛冬青制劑，其特征在于，所述片劑為速釋片劑或緩釋片劑；所述膠囊為緩釋膠囊。13.如權(quán)利要求12所述毛冬青制劑，其特征在于，所述藥用輔料選自淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、低取代羥丙纖維素、羧甲基淀粉納、乙基纖維素、聚乙二醇、丙二醇、大豆油、卵磷脂、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、滑石粉、可溶性淀粉、麥芽糊精、微粉硅膠或矯味劑中的一種或多種。14.如權(quán)利要求l一5中任一權(quán)利要求所述毛冬青提取物在制備治療冠狀動脈硬化性心臟病、缺血性腦中風(fēng)、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎或外科感染性外傷的藥物，或制備治療勃起功能障礙癥的藥物上的應(yīng)用。15.如權(quán)利要求9一13中任一權(quán)利要求所述毛冬青制劑在制備治療冠狀動脈硬化性心臟病、缺血性腦中風(fēng)、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎或外科感染性外傷的藥物，或制備治療勃起功能障礙癥的藥物上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，公開了一種毛冬青提取物、提取物的制備及應(yīng)用。本發(fā)明公開的毛冬青提取物中，毛冬青總皂甙以IlexsaponinB1計，重量百分含量不低于50％，IlexsaponinA1的重量百分含量不低于4.0％，IlexsaponinB1的重量百分含量為2.5～7.5％，IlexsaponinB3的重量百分含量為3.0～8.0％。本發(fā)明以毛冬青有效成分為技術(shù)指標(biāo)，對毛冬青提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，確定了毛冬青提取物生產(chǎn)工藝；引入現(xiàn)代制藥的“原料藥”概念，建立以毛冬青標(biāo)準(zhǔn)提取物投料的各類新一代中成藥制劑生產(chǎn)工藝。文檔編號A61K9/20GK101284031SQ200810038468公開日2008年10月15日申請日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日發(fā)明者喬正東,周國偉,張國明,徐曉英,苗成,朱國琴,謝家駿申請人:上海雷允上科技發(fā)展有限公司;上海市中藥研究所