專利名稱：一種生物多糖微膠囊的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種生物多糖微膠囊在制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞 特異性殺傷能力的物質(zhì)中的用途。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)、唯一己知能夠激活初始T淋巴細(xì)胞的 抗原遞呈細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞攝取腫瘤相關(guān)抗原，加工之后遞呈給T淋巴細(xì)胞并 激活相應(yīng)的CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞，以誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能，發(fā) 揮主動(dòng)免疫的抗腫瘤作用。此框架是目前腫瘤生物治療研究領(lǐng)域普遍接受的理 論基礎(chǔ)，即利用樹突狀細(xì)胞疫苗進(jìn)行抗腫瘤治療。樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗成功的關(guān)鍵是提高樹突狀細(xì)胞對免疫原性較弱的腫 瘤相關(guān)抗原的免疫原性。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行了多方面嘗試，如利用體 外合成的腫瘤抗原多肽、腫瘤全細(xì)胞提取物以及腫瘤抗原核酸等多種形式的抗 原來刺激樹突狀細(xì)胞，但這些方法普遍存在效率低、特異性差、副作用多等問 題。 一般情況下，T淋巴細(xì)胞需要接受樹突狀細(xì)胞反復(fù)刺激才能產(chǎn)生一定腫瘤 殺傷效果，易產(chǎn)生免疫耐受等問題，經(jīng)典方法也難以解決。因此，本領(lǐng)域迫切 需要找到一種可提高抗原性蛋白的免疫原性的有效途徑，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在 的難題。在本發(fā)明人的先期的工作中，已經(jīng)制備了一種生物相容性良好，粒徑小的 生物多糖微膠囊(參見專利ZL200310108684. 9和專利申請200610024132. 3)，該 微膠囊可在酒精溶液中永久保存，也可懸浮在溶液中進(jìn)行保存，時(shí)間可長達(dá)l 年，仍保持穩(wěn)定，而不出現(xiàn)絮凝或分解現(xiàn)象。由于該微膠囊是一種可降解的材 料且性能穩(wěn)定，有較好的應(yīng)用價(jià)值，因此有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和研究， 以期找到新的用途。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種生物多糖微膠囊的用途，用于與抗原或抗原決定簇相偶聯(lián)，制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原 決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)本發(fā)明的另一 目的在于提供一種可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖或提高T淋巴細(xì) 胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)，所述的物質(zhì)含 有生物多糖微膠囊，以及與之相偶聯(lián)的抗原或抗原決定簇。在本發(fā)明的第一方面，提供一種生物多糖微膠囊的用途，用于與一種或多 種抗原或抗原決定簇相偶聯(lián)，制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá) 所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)；其中，所述的生物多糖 微膠囊含50-90%重量的生物多糖，且膠囊的直徑在50-1000納米之間。在另一優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)是共價(jià)偶聯(lián)。在另一優(yōu)選例中，所述的生物多糖微膠囊與抗原或抗原決定簇偶聯(lián)后，促 進(jìn)抗原的遞呈作用。在另一優(yōu)選例中，所述的生物多糖微膠囊與抗原或抗原決定簇偶聯(lián)后，促 進(jìn)T淋巴細(xì)胞對攜帶所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞的殺傷能力。在另一優(yōu)選例中，所述的生物多糖微膠囊是采用以下方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液和20-1000 mM金屬鹽水溶液 分別加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相 密度相同，分別形成生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液，其中所述生 物多糖選自海藻酸鹽、Gellan膠、果膠、果膠酸、卡拉膠；所述的金屬鹽選自 以下金屬離子形成的水溶性鹽K+、 Ca2+、 Ba2+、 Sr2+、 Cu2+、 Fe2+、 Fe3+、 Al3+ 或其組合；b) 對步驟a)得到的生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液在冰浴上 分別用超聲波乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖水/油乳化液和金屬鹽水/油乳化液；c) 在4-35'C混合步驟b)得到的生物多糖乳化液和金屬鹽乳化液5-60分鐘， 形成反應(yīng)混合物；d) 對步驟c)的反應(yīng)混合物離心分層，獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；e) 反應(yīng)產(chǎn)物脫水，然后洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微 膠囊。在另一優(yōu)選例中，所述的生物多糖微膠囊是采用以下方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相密度相同，形成生物多糖水/油混懸液；b) 對a)獲得的生物多糖水/油混懸液進(jìn)行超聲乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖 水/油乳化液；c) 向生物多糖水/油乳化液中滴加體積比為0.5-10%(較佳的1-5%)水相油相 均可溶性酸；然后加入5-50%(較佳的10-40%;更佳的15-30%)有機(jī)溶劑，充分 混合；離心去除油相；獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；d) 向c)獲得的水相反應(yīng)產(chǎn)物中加入體積比為0.1 -2 %(較佳的0.2 -1 %)的水相 油相均可溶性酸，進(jìn)行超聲作用；超聲作用過程中滴加金屬鹽溶液(如 20士20mM;較佳的20士10mM)溶液，充分混合，調(diào)節(jié)PH6-8(較佳的7-8);然后 洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微膠囊。在另一優(yōu)選例中，所述的水相油相均可溶性酸選自醋酸、丙酸、丁酸、 異丙酸、異丁酸、蘋果酸，或其它小分子有機(jī)酸。在另一優(yōu)選例中，如果生物多糖為海藻酸鹽、Gellan膠、果膠、果膠酸， 所述的金屬鹽選自CaCl2、 BaCl2、 SrCl2或其混合物；或者在另一優(yōu)選例中，如果生物多糖為卡拉膠，所述的金屬鹽金屬離子為&+ 離子，濃度為40-500 mM。在另一優(yōu)選例中，所述的表面活性劑為Span65，或表面活性劑為非離子性 表面活性劑，且表面活性劑濃度為5-50 mg/ml;所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、 三氯甲烷。在另一優(yōu)選例中，步驟e)中的脫水用無水乙醇進(jìn)行，洗滌是先用二氯甲垸 洗滌，然后用無水乙醇洗滌。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟f)將步驟e)獲得的生物多糖微膠囊放入pH4.5-6.2的緩沖液中，與含有水 溶性二胺化合物、水溶性碳二亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺的pH為4-6.9的緩沖 液混合，其中生物多糖微膠囊干重與二胺化合物之比為l克0.1-0.6毫摩爾，在 10-50'C下避光并混合10-30小時(shí)，然后用選自乙二胺四乙酸或檸檬酸的金屬離 子螯合劑溶液處理除去金屬離子。在另一優(yōu)選例中，所述的抗原是腫瘤特異性抗原。在另一優(yōu)選例中，所述的抗原選自癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，癌 抗原CA125，癌抗原Cal53，糖鏈抗原Ca242，惡性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(TSGF)，前列 腺特異抗原PSA，表皮黏蛋白MUC1。在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)通過刺激樹突狀細(xì)胞增殖促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增 殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力。在本發(fā)明的第二方面，提供一種可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對 表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)，所述的物質(zhì)含有生 物多糖微膠囊，以及與之相偶聯(lián)的一種或多種抗原或抗原決定簇；所述物質(zhì)中 抗原或抗原決定簇的含量是0.1-30%(較佳的是0.2-20%;更佳的是0.5-15%)重量； 其中，所述的生物多糖微膠囊含50-90%重量的生物多糖，且膠囊的直徑在 50-1000納米之間。在另一優(yōu)選例中，所述的所述的生物多糖微膠囊是海藻酸鈣微膠囊。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的物質(zhì)的用途，用于制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞 增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的 組合物。在本發(fā)明的第四方面，提供一種組合物，其含有所述的可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞 增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的 物質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體。


圖l.海藻酸轉(zhuǎn)微膠囊的TEM照片。 圖2.海藻酸鈣微膠囊粒徑分布。圖3.激光共聚焦顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞對量子點(diǎn)包埋標(biāo)記海藻酸f5微膠 囊的吞噬作用(激發(fā)波長655 nm)。 A: 30分鐘；B: 12小時(shí)。圖4.海藻酸鈣微膠囊對未成熟樹突狀細(xì)胞刺激后HLA-DR表達(dá)的流式細(xì) 胞術(shù)分析(陰影部分為對照，下同)。a:未加刺激物(陰性對照)；b: 10昭/ml LPS (陽性對照)；c: 0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊；d: 1.2mg/ml海藻酸鈣微膠囊。圖5.自體T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的刺激指數(shù)。圖6.樹突狀細(xì)胞與刺激物共培養(yǎng)14小時(shí)后CD86表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測。 a:未加刺激物(陰性對照；b: 10嗎/ml LPS (陽性對照)；c: 0.6 mg/ml海藻酸鈣 微膠囊；d: 100ng/ml重組CEA蛋白；e: 100 tag/ml重組CEA蛋白和0.6 mg/ml 海藻酸鈣微膠囊混合物；f: 100pg/ml重組CEA蛋白和0.6mg/ml海藻酸f丐微膠囊偶聯(lián)物。圖7. WestemBlot檢測純化重組CEA蛋白質(zhì)。其中，1、 CEA標(biāo)準(zhǔn)品，100 Hg/ml; 2、純化重組蛋白質(zhì)。圖8.樹突狀細(xì)胞被不同刺激物作用14小時(shí)后IL-12誘導(dǎo)表達(dá)。1:不加刺 激物(陰性對照)；2: 10嗎/mlLPS(陽性對照);3: 0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊； 4: 100昭/ml重組CEA蛋白；5: 100pg/ml重組CEA蛋白和0.6mg/ml海藻酸 鈣微膠囊混合物；6: lOOpg/ml重組CEA蛋白和0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊偶 聯(lián)物。圖9.樹突狀細(xì)胞被不同刺激物作用14小時(shí)后TNF-a誘導(dǎo)表達(dá)。不加刺 激物(陰性對照)；2: 10pg/mlLPS(陽性對照)；3: 0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊； 4: 100嗎/ml重組CEA蛋白；5: 100|ig/ml重組CEA蛋白和0.6 mg/ml海藻酸 鈣微膠囊混合物；6: 100pig/ml重組CEA蛋白和0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊偶 聯(lián)物。圖IO.異體T淋巴細(xì)胞與經(jīng)不同刺激的樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)5天后淋巴細(xì)胞 增殖。1: T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(陰性對照I); 2:未加刺激物(陰性對照n); 3:0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊；4: 100 |ag/ml重組CEA蛋白；5: 100 pg/ml重組 CEA蛋白禾0O.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊混合物；6: 100 pg/ml重組CEA蛋白和 0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)物。圖11.T淋巴細(xì)胞對非CEA表達(dá)293細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。1:未經(jīng)刺激物誘導(dǎo)的樹 突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞(陰性對照I); 2: 10 Hg/ml LPS(陽性對照)；3: 0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊；4: 100pg/ml重組CEA蛋白；5: 100昭/ml重組CEA 蛋白和0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊混合物；6: 100 pg/ml重組CEA蛋白和0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)物。圖12. T淋巴細(xì)胞對CEA表達(dá)HCT-8細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。1:未加T淋巴細(xì)胞(陰性 對照I); 2:未經(jīng)樹突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞(陰性對照II); 3:未經(jīng)刺激物誘 導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞(陰性對照III); 4: 10pg/mlLPS(陽性對照)； 5: 0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊；6: 100嗎/ml重組CEA蛋白；7: 100 (itg/ml重組CEA蛋白和0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊混合物；8: 100 |Lig/ml重組CEA蛋白 和0.6mg/ml海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)物。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將生物多糖微膠囊與抗原(或抗原 決定簇)相偶聯(lián)后，可有效地促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述 抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力，極大地增強(qiáng)所述抗原(特別是腫瘤 抗原)的免疫原性。生物多糖微膠囊本發(fā)明所述的生物多糖微膠囊含50-90%重量的生物多糖，且微膠囊的直徑 在50-1000納米之間(優(yōu)選在50-900納米之間，更優(yōu)選在50-800納米之間)。所述 的生物多糖可選自海藻酸鈉、果膠、果膠酸和卡拉膠等。所述的生物多糖微膠 囊的制備方法是已知的，例如可以采用在先專利ZL200310108684.9和申請?zhí)?200610024132. 3中所描述的方法，采用這些方法獲得的生物多糖膠囊粒徑接 近，理化性質(zhì)基本相同。本發(fā)明人的研究顯示，所述的生物多糖(如海藻酸鈣)微膠囊可被樹突狀 細(xì)胞吞噬；經(jīng)所述生物多糖微膠囊刺激后樹突狀細(xì)胞表面CD86和HLA-DR表達(dá) 水平上調(diào)，表明所述生物多糖微膠囊具有刺激樹突狀細(xì)胞成熟分化的能力。其 剌激樹突狀細(xì)胞成熟分化的作用機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自分泌細(xì)胞因 子TNF-a來實(shí)現(xiàn)分化誘導(dǎo)。生物多糖微膠囊與抗原的偶聯(lián)物空載生物多糖微膠囊雖可刺激樹突狀細(xì)胞成熟，但無法剌激T淋巴細(xì)胞增 殖。在經(jīng)過大量的研究工作后，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，若是將一種抗原與生物 多糖微膠囊相偶聯(lián)，則可大大促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。并且，將抗原與生物多 糖微膠囊相混和不會(huì)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。因此，本發(fā)明提供一種可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所 述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)，所述的物質(zhì)含有生物多糖 微膠囊，以及與之相偶聯(lián)的抗原或抗原決定簇。所述的偶聯(lián)優(yōu)選的是共價(jià)偶聯(lián)。 所述的生物多糖微膠囊結(jié)構(gòu)中具有豐富的、未參與離子交聯(lián)的游離羧基，從而可用于抗原的共價(jià)偶聯(lián)負(fù)載；并且，其水凝膠性質(zhì)可使負(fù)載的抗原始終處于水環(huán)境中，從而有益于抗原蛋白保持生物構(gòu)象和活性。多種將所述的生物多糖微膠囊與抗原偶聯(lián)的方法均可應(yīng)用于本發(fā)明。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式， 一種制備偶聯(lián)物的方法可以是NHS/EDAC肽鍵合成反應(yīng)， 該反應(yīng)的主要步驟如下將生物多糖微膠囊加入MES緩沖液中超聲作用0.5-5分 鐘，加入NHS和EDAC混合并反應(yīng)；然后加入抗原充分反應(yīng)；之后去除未發(fā)生 偶聯(lián)的游離蛋白，獲得所述的生物多糖微膠囊與抗原的偶聯(lián)物。定性鑒定顯示 該方法具有高的偶聯(lián)效率。通常，所述的抗原在偶聯(lián)物中的含量是0.1-30%重量； 較佳的是0.2-20%重量;更佳的是0.5-15%重量;如1%， 2%， 3%， 5%， 6%， 10% 重量(干重)。"抗原"是指一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的物質(zhì)， 其具有免疫原性(抗原性)和/或反應(yīng)原性。"免疫原性"是指能夠刺激機(jī)體形成 特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。本領(lǐng)域已知或未知的許多抗原均可用于本發(fā) 明，較佳的是疾病相關(guān)抗原。所述的抗原可以是天然的抗原，或是利用基因重 組技術(shù)制備的抗原。含有抗原決定簇的抗原片段也是可以使用的。所述的生物多糖微膠囊可以與一種抗原相偶聯(lián)，也可以與多種抗原相偶聯(lián) 從而發(fā)揮聯(lián)合治療的作用。多條抗原或抗原片段通過共價(jià)鍵(如肽鍵)或偶聯(lián)相 連接形成的抗原多肽在某些情況下也是可用的，例如含有多條抗原或抗原片段 的融合蛋白。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的抗原是腫瘤特異性抗原。腫瘤特異 性抗原是指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)或過度表達(dá)的抗原物質(zhì)，該抗原在腫 瘤細(xì)胞中的表達(dá)大大高于正常細(xì)胞。任何腫瘤特異性抗原均可被用于本發(fā)明， 更優(yōu)選的，所述的抗原選自癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)等。所述的腫瘤 特異性抗原可良好地與所述的生物多糖微膠囊偶聯(lián)，發(fā)揮優(yōu)異的特異性殺腫瘤 細(xì)胞(該腫瘤細(xì)胞表達(dá)所述的腫瘤特異性抗原)的效果。所述的生物多糖微膠囊與抗原的偶聯(lián)物對于促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力是特別有效的， 使得抗原的免疫原性大大提高。即使是如牛血清白蛋白或癌胚抗原這種抗原性 較弱的抗原蛋白，其在與所述的生物多糖微膠囊相偶聯(lián)后也可顯著地促進(jìn)T淋 巴細(xì)胞的增殖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用海藻酸鈣微膠囊可提高負(fù)載蛋白免疫原性的特點(diǎn)，用偶聯(lián)重組CEA蛋白后的微膠囊剌激樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)負(fù)載重組CEA 蛋白的微膠囊可刺激樹突狀細(xì)胞成熟，尤其是負(fù)載重組CEA蛋白的微膠囊刺激 的樹突狀表面HLA-DR和CD86表達(dá)都較單純重組CEA蛋白和微膠囊混合物 刺激高，充分地說明膠囊偶聯(lián)對抗原免疫原性的提高作用大于蛋白和微膠囊的 簡單混合，這是由于CEA在偶聯(lián)之后發(fā)生了質(zhì)和量兩個(gè)方面的變化而導(dǎo)致遞 呈效率的大大提高。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行了T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，可以觀察到CTL 對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8有特異性殺傷作用，顯示海藻酸鈣微膠囊可以顯著增 加CTL的特異性殺傷的能力。即體外實(shí)驗(yàn)表明，海藻酸鈣微膠囊是一種有效 的免疫佐劑，偶聯(lián)重組CEA蛋白可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷CEA腫瘤 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。藥物組合物本發(fā)明還提供一種組合物，其含有所述的物質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載 體。所述組合物可用于促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力。如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過 度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上可 接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒 性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington，s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.， N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分 說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和山梨 醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑 或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動(dòng)物給藥的劑型，所述劑型包括但 不限于注射劑、片劑、乳劑。在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T 淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)施用于 哺乳動(dòng)物(如人)，其中該安全有效量通常至少約l微克/千克體重，而且在大多數(shù) 情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約l微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都 是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。I.材料和方法 1.材料海藻酸鈉Keltone LVCR (NF grade),平均分子量54，000，獲自國際特品 (International Specialty Products, ISP)(香港)有限公司。二氯甲烷、石油醚、冰醋酸購自TEDIA公司。乙醇購自Merck公司，山梨 醇酐三硬脂酸酯(Span65)， HEPES購自Sigma公司。氯化鈣及氫氧化鈉購自 Amersco公司，量子點(diǎn)(Non-targeted Quantum Dots)購自Invitrogen公司。質(zhì)粒pGEM4，含有全長人CEA編碼序列。獲自McGill Cancer Centre。 PcGFP，含有GFP蛋白編碼序列，購自Invitrogen公司。pcDNA-3購自Invitrogen 公司。表達(dá)用細(xì)胞293細(xì)胞購自Invitrogen公司。CEA標(biāo)準(zhǔn)品和CEA單克隆抗體(小鼠抗人CEA)購自Fitzgerald公司。陽離子 聚合物轉(zhuǎn)染試劑多聚乙烯亞胺(PEI)購自Chemicon公司，二抗(山羊抗小鼠 IgG)和免疫印跡反應(yīng)(Western Blot)顯色劑Super Signal West Pica Trial Kit購 自Pierce公司。藻紅蛋白購自杭州奧維生物工程有限公司。小牛血清白蛋白(BSA)購自 Trace NZ Desert Biologicals公司。2-N-嗎啉乙磺酸(MES)、 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 、 N-(3- 二甲基氨丙基)-N，-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自 Sigma-Aldrich公司。人外周血單個(gè)核細(xì)胞來自上海市中心血站，取新鮮人外周血經(jīng)Ficoll離心分 離得到人外周血單個(gè)核細(xì)胞。GM-CSF和IL-4來自R&D公司；谷氨酰胺來自Sigma公司；IL-2來自Peprotech公司。樹突狀細(xì)胞生長培養(yǎng)基RPMI-1640添加10。/。胎牛血清和2mM谷氨酰胺， 另加入30 ng/ml GM-CSF和20 ng/ml IL-4。T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基RPMI-1640添加10。/。胎牛血清和2 mM谷氨酰胺。T淋巴細(xì)胞生長培養(yǎng)基RPMI-1640添加10。/。胎牛血清和2 mM谷氨酰 胺，另加入100ng/mlIL-2。CD14分選磁珠試劑盒購自Miltenyi公司，LPS和刃天青購自Sigma公司； TNF-a購自Peprotech公司，尼龍毛購自上海宇航特種化學(xué)纖維廠。HCT-8細(xì)胞人結(jié)腸癌細(xì)胞株，分泌CEA，獲自中國科學(xué)院上海生命科學(xué) 研究院。HCT-8細(xì)胞生長培養(yǎng)基RPMI-1640添加10%胎牛血清和2 mM谷氨酰 胺。293細(xì)胞貼壁培養(yǎng)基RPMI-1640添加10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺。TNF-a ELISA檢測試劑盒購自U-Cytech公司，IL-12 p70 ELISA檢測試 劑盒購自eBioscience公司。小鼠抗人CD86、 HLA-DR抗體及其同型對照購自Catalog公司。2.海藻酸鈉溶液的配制稱取lg海藻酸鈉加入至100ml超純水中，攪拌6小時(shí)至溶解，加入HEPES至 終濃度為10mM，使用1.5MNaOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.4。溶液分裝于滅菌離心管， 置4'C冰箱。3.酸沉淀法制備海藻酸鈣微膠囊稱取240mg Span65溶解于10ml 二氯甲垸，加入l ml重量體積比為l。/。的海 藻酸鈉溶液(含10mMHEPES， pH 7.4)，再加入石油醚約9 ml調(diào)節(jié)水相和油相比 重相同。超聲作用8分鐘(超聲混合儀來自上海之信儀器有限公司，型號 JYD-卯O，功率300 W)形成乳化液。超聲作用5分鐘時(shí)，緩慢滴加冰醋酸60(Hi1。 加入二氯甲烷5 ml,混合后1600 rpm離心15分鐘(Beckman Model J-6B離心 機(jī))，注射器抽去下層油相，再加入二氯甲烷IO ml，充分混合后再次離心棄去 油相。加入體積分?jǐn)?shù)0.5。/。乙酸溶液15ml，超聲作用8分鐘(功率200W)， 5分鐘時(shí)滴加20mM CaCl2溶液4ml。將液體轉(zhuǎn)入IOO ml燒杯，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至 7.4，室溫?cái)嚢?0分鐘。將溶液轉(zhuǎn)入離心管，加入無水乙醇10ml，混合后2000rpm 離心15分鐘。棄上清，加入無水乙醇15ml后超聲作用3分鐘。相同洗絳過程重 復(fù)3次后二氯甲烷洗滌1次，無水乙醇洗滌2次。溶液棄上清后加入6ml緩沖液， 超聲3分鐘后保存于4"C冰箱。 一4. 包埋量子點(diǎn)的海藻酸鈣微膠囊制備取10pl濃度為2pM的量子點(diǎn)溶液(Invitrogen)，加入IO pl甘油，充分混 合后加入lmlP/。海藻酸鈉溶液(含10mMHEPES，pH7.4)，其余步驟同前述海 藻酸鈣微膠囊制備，制備后熒光顯微鏡觀察。5. CEA重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)和純化(1) 表達(dá)質(zhì)粒rhCEA的構(gòu)建采用內(nèi)切酶EcoR I酶切質(zhì)粒pGEM4得到CEA全長cDNA，與經(jīng)相同內(nèi)切酶 酶切的載體pcDNA-3連接，構(gòu)建含有全長CEA cDNA的新質(zhì)粒pcCEA，構(gòu)建質(zhì) 粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定。使用C端引物 (5 -GAACCTGAGGCTCAGAACACAAC-3 ) 禾0 N 端 弓| 物 (5 -TACTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATCAGAGCAACCCCAACC-3 )， 以 新質(zhì)粒pcCEA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片斷經(jīng)純化后與載體pcDNA-3連接， 構(gòu)建表達(dá)重組CEA蛋白的質(zhì)粒rhCEA。構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及測序鑒 定。(2) rhCEA在293細(xì)胞中的表達(dá)純化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和重組CEA蛋白表達(dá)取IO嗎/mlrhCEA質(zhì)粒、0.1 pg/ml pcGFP 質(zhì)粒(GFP為標(biāo)記蛋白)6ml、 lml60嗎/mlPEI混合30分鐘后加至60 ml含 有l(wèi)xl()6/ml 293細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 °C 5% C02條件培養(yǎng)4小時(shí)后 再加入140mlLCHL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。臺(tái)盼藍(lán)法細(xì) 胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率低于90%時(shí)停止培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中重組CEA蛋白檢測取293細(xì)胞培養(yǎng)液與10(Hig/ml CEA標(biāo)準(zhǔn) 品各15nl，與15iil2xSDS混合后沸水加熱5分鐘，進(jìn)行電泳，電泳后蛋白轉(zhuǎn)至醋 酸纖維膜。醋酸纖維膜10%脫脂牛奶中洗滌1小時(shí)后TBST Buffer漂洗3次，加 入l嗎/ml CEA抗體3ml，常溫孵育2小時(shí)，TBST Buffer漂洗3次后加入l)ag/ml二抗5ml，顯色拍照。重組CEA蛋白純化293細(xì)胞培養(yǎng)液1500rpm離心10分鐘后，取上清與 2xBinding Buffer 1:1混合。2ml His樹脂裝柱后，lO倍柱體積的Binding Buffer平 衡洗脫柱，再加入上清與2xBinding Buffer混合液，緩慢過柱后5倍柱體積的 Binding Buffer洗去雜質(zhì)。再用10倍柱體積的500mM咪唑溶液洗脫重組CEA蛋 白，收集洗脫的重組蛋白。經(jīng)純化的重組CEA蛋白使用Western Blot檢驗(yàn)(圖7) ， CEA標(biāo)準(zhǔn)品大小為180 kD，剪切胞內(nèi)片斷后，重組CEA蛋白約為160kD，其與標(biāo)準(zhǔn)品的分子量有差異 的原因是糖基化程度不同。6. 海藻酸鈉微膠囊與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)取l ml海藻酸鈣微膠囊乙醇懸浮液，離心后棄上清。加入l.lml50mM MES(PH6.5)緩沖液(購自Sigma公司)，超聲作用1分鐘(功率200W)。加入新鮮配 制的0.04M NHS(購自Sigma公司)和0.02 M EDAC溶液(購自Sigma公司)300pl， 充分混合。室溫下避光反應(yīng)2小時(shí)后加入100嗎/ml藻紅蛋白100iil或10(Hig/ml重 組CEA蛋白1.5ml或10mg/mlBSA40 |al (終濃度藻紅蛋白6.25(xg/ml，重組CEA蛋 白50嗎/ml， BSA200|ag/ml)。室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，離心除去游離蛋 白后加入相同體積純水。超聲振蕩2分鐘，重新分散偶聯(lián)蛋白的海藻酸鈣微膠 囊，4'C保存。偶聯(lián)熒光蛋白定量取偶聯(lián)熒光蛋白(藻紅蛋白)的海藻酸鈣微膠囊水溶液， 測定565nm光吸收值OD565 ，與熒光蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到偶聯(lián)的熒光蛋白 量，計(jì)算偶聯(lián)效率偶聯(lián)效率=偶聯(lián)熒光蛋白量/反應(yīng)熒光蛋白量。7. 樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)(1)樹突狀細(xì)胞分離取IO ml人外周血單個(gè)核細(xì)胞，1000 rpm離心5分鐘后棄上清，加入IO ml PBS清洗2次，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。取5xl0 個(gè)細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘后棄上清， 加入400pl PBSE(含0.5。/。 BSA， 2 mM EDTA的PBS溶液)和100 pi CD14分選磁 珠，輕彈混合，冰浴30分鐘。加入2mlPBSE, 1000 rpm離心5分鐘，棄上清， 加入500(al PBSE。同時(shí)，超凈臺(tái)安裝磁分離裝置和注射器，500 pl PBSE潤洗注射器后將待分選細(xì)胞加入注射器，500 plPBSE洗滌，洗漆過程重復(fù)3次(洗滌得到的CD14 陰性細(xì)胞可加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，供T淋巴細(xì)胞分離使 用)，洗滌后拆除磁分離裝置，注射器中加入l mlPBSE，接上塞頭，沖出收集 的細(xì)胞，細(xì)胞記數(shù)，得到0014+前體樹突狀細(xì)胞。
細(xì)胞以2xl0Vml的密度接種于六孔板，每孔4\106個(gè)細(xì)胞，加入樹突狀細(xì) 胞生長培養(yǎng)基，37'C5。/。C02培養(yǎng)。
(2) 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)和刺激
樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)第4天半量換液，每孔輕吸l ml培養(yǎng)液舍棄，加入lml含雙 倍生長因子的樹突狀細(xì)胞生長培養(yǎng)液，37°C 5%C02繼續(xù)培養(yǎng)3天，第6天再次 半量換液。
樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)第7天可加入100ng/ml TNF-a或10嗎/ml LPS刺激樹突狀細(xì) 胞成熟。刺激物加入后37'C 5%(302培養(yǎng)14小時(shí)。
成熟樹突狀細(xì)胞輕吹即可漂起，1500 rpm離心2分鐘后棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(3) T淋巴細(xì)胞分離
T淋巴細(xì)胞分離使用尼龍毛柱分離法。
取lg松散無結(jié)團(tuán)的尼龍毛，300 ml蒸餾水清洗6次后加入300 ml0.2M HC1溶液攪拌3小時(shí)，再使用300 ml純水清洗6次，12rC蒸汽滅菌，60 °C烘 烤8小時(shí)以去除剩余水份，將尼龍毛松散塞入5 ml玻璃注射器，填至3 ml刻 度處。在針頭與注射器間接一無菌短塑料管(實(shí)驗(yàn)中可使用止血鉗夾住該段以控 制流速)，即為尼龍毛柱。
尼龍毛柱固定于超凈臺(tái)鐵架，15ml T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基沖洗尼龍毛柱， 在液面高于尼龍毛柱柱面l ml時(shí)夾上止血鉗，37°C 5% C02放置l小時(shí)使柱平 衡。
取分離樹突狀細(xì)胞后的CD14陰性細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞，1500 rpm離心2分 鐘，棄上清，加入3mlT淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
尼龍毛柱再次固定，細(xì)胞加入柱中，打開止血鉗，待液面到達(dá)柱面時(shí)夾上 止血鉗，將收集的液體再次加入柱中。37。C5。/。C02培養(yǎng)1小時(shí)。
尼龍毛柱固定后，打開止血鉗，放出液體，保持流速約3秒每滴，同時(shí)緩 慢加入10ml預(yù)熱至37。C的T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基。流出的細(xì)胞即為T淋巴 細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞經(jīng)1500 rpm離心2分鐘后棄上清，加入5 ml T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基，細(xì)胞記數(shù)后加入T淋巴細(xì)胞生長培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為lxl06/！111， 六孔板每孔加入細(xì)胞2 ml， 37 °C 5% C02培養(yǎng)。
(4) T淋巴細(xì)胞培養(yǎng) -
T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)第4天與第7天半量換液，每孔輕吸lml培養(yǎng)液，1500 rpm 離心2分鐘后棄上清，加入l ml含有雙倍生長因子的T淋巴細(xì)胞生長培養(yǎng)液 后轉(zhuǎn)移至原孔，37 °C 5%(:02繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞計(jì)數(shù)可采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)及高通量的刃天青活細(xì)胞計(jì)數(shù)法。刃天青活細(xì) 胞計(jì)數(shù)法如下配制1.2mM刃天青的PBS溶液，過濾滅菌后作為儲(chǔ)存液，使 用時(shí)將儲(chǔ)存液稀釋至200 pM。 96孔板中每孔加入待測細(xì)胞或作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的經(jīng) 過臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)的同種細(xì)胞100)al，每組細(xì)胞設(shè)定3個(gè)以上復(fù)孔，加入刃天青溶液 20 nl，振蕩均勻后讀取605nm光吸收值，37°C 5% C02培養(yǎng)30分鐘后再次讀取 605nm光吸收值，兩者差值與細(xì)胞密度的對數(shù)相關(guān)。
8.海藻酸鈣微膠囊免疫效果測定
(1) 細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)
樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)第6天加入0.6 mg/ml包埋量子點(diǎn)的海藻酸轉(zhuǎn)微膠囊，37°C 5%(:02分別培養(yǎng)0.5小時(shí)和12小時(shí)，激光共聚焦顯微鏡觀察。
(2) 流式細(xì)胞術(shù)檢測樹突狀細(xì)胞表面抗原
培養(yǎng)第六天的樹突狀細(xì)胞和不同刺激物刺激14小時(shí)后的樹突狀細(xì)胞收獲 后，PBS清洗2次，分別加入小鼠抗人CD86， HLA-DR以及相應(yīng)同型對照， 孵育30分鐘，PBS清洗3次后流式細(xì)胞儀檢測。
(3) T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)第6天加入不同刺激物，37°C 5。/。C02培養(yǎng)14小時(shí)后，離心 洗滌兩次收獲細(xì)胞，分別以1:30、 1:100、 1:300的比例與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)， 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)一組不加樹突狀細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞作為空白對照。37°C 5。/。C02培養(yǎng)5天后刃天青法測定各組細(xì)胞密度，計(jì)算刺激指數(shù)剌激指數(shù)(SI) =混合細(xì)胞組細(xì)胞密度/不加樹突狀細(xì)胞T淋巴細(xì)胞組細(xì)胞密度。
(4) ELISA檢測細(xì)胞上清TNF-a和IL-12的表達(dá)
樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)第6天加入不同剌激物，37'C 5%C02培養(yǎng)14小時(shí)后收獲各 組細(xì)胞，ELISA檢測細(xì)胞上清TNF-a和IL-12的表達(dá)。(5)T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)
取293細(xì)胞和HCT-8細(xì)胞分別加入96孔板，每孔加入密度為lx105/ml細(xì)胞 100)^1，以1:30的比例加入不同組樹突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞，37。C5。/。C02培 養(yǎng)5天。刃天青法測定各組細(xì)胞密度。
II.實(shí)施例
實(shí)施例l.海藻酸鈣微膠囊的制備和蛋白質(zhì)負(fù)載
1.電子顯微鏡形態(tài)觀察
海藻酸f丐微膠囊的TEM照片如圖l。海藻酸鈣微膠囊粒徑分布如圖2。 藻紅蛋白偶聯(lián)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)在海藻酸鈣微膠囊中的負(fù)載比例為69.3%。
實(shí)施例2.海藻酸鈣微膠囊與樹突狀細(xì)胞的相互作用
(1) 樹突狀細(xì)胞對海藻酸鈣微膠囊的吞噬
在樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的第6天向未成熟樹突狀細(xì)胞中加入量子點(diǎn)包埋標(biāo)記的 海藻酸鈣微膠囊，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3所示。30分鐘后， 海藻酸鈣微膠囊進(jìn)入樹突狀細(xì)胞內(nèi)，分布離散；12小時(shí)后，膠囊明顯定位于細(xì) 胞內(nèi)特定區(qū)域。
(2) 海藻酸鈣微膠囊對樹突狀細(xì)胞成熟分化的影響
在培養(yǎng)的第6天，向未成熟樹突狀細(xì)胞中分別加入海藻酸鈣微膠囊，劑量 水平為0.6和1.2mg/ml(干重)，以10嗎/mlLPS作為陽性對照，以未加任何刺激
物組作為陰性對照。
作為陽性對照的LPS可通過Toll樣受體信號途徑促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，是 使用最廣泛的刺激物。經(jīng)LPS刺激后，樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、 CD86 及MHC-II類分子上調(diào)，Thl型細(xì)胞因子TNF-a、 IFN-丫及IL-12分泌明顯增多， 刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力提高，激活特異性免疫反應(yīng)。
刺激培養(yǎng)14小時(shí)后對樹突狀細(xì)胞表面抗原CD86和HLA-DR做流式細(xì)胞術(shù) 分析，陰影部分為同型對照結(jié)果。兩種劑量海藻酸鈣微膠囊均可促進(jìn)樹突狀細(xì) 胞表面CD86和HLA-DR(如圖4)的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)效應(yīng)。在劑量達(dá)為 1.2mg/ml時(shí)，樹突狀細(xì)胞表面HLA-DR表達(dá)率為96.5。/。， CD86表達(dá)率為88.9。/0， 兩者均接近陽性對照。MHC-II類分子HLA-DR和共刺激因子CD86的高表達(dá)說明 海藻酸鈣微膠囊具有刺激樹突狀細(xì)胞成熟的作用。實(shí)施例3.海藻酸鈣微膠囊增強(qiáng)偶聯(lián)蛋白質(zhì)抗原免疫原性
利用刃天青法檢測自體T淋巴細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示，刺激比例(樹突狀細(xì)胞: 自體T淋巴細(xì)胞)為1:300時(shí)，200嗎/ml BSA與0.6 mg/ml海藻酸鈣微膠囊的偶聯(lián) 產(chǎn)物和可溶性200嗎/ml BSA對照誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)分別為 1.41士0.07和1,18士0.04;刺激比例為1:100時(shí)，剌激指數(shù)分別為1.5 l士0.07和 1.26士0.04;刺激比例為1:30時(shí)，刺激指數(shù)分別為1.68士0.05和1.51±0.05(圖5)。 因此，BSA經(jīng)海藻酸轉(zhuǎn)微膠囊負(fù)載，其誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞刺激指數(shù)高于單純 BSA(均有P〈0.01)，可提高樹突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞效率；相比之下，濃度為 0.6mg/ml的空載海藻酸鈣微膠囊相應(yīng)于刺激比例為l:300、 1:100、 1:30的刺激 指數(shù)分別為0.97士0.06、 0.98±0.05、 0.97±0.04，未能刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖(P >0.05)。
實(shí)施例4.海藻酸鈣微膠囊的免疫佐劑效果
選擇重組CEA蛋白作為靶蛋白，檢測將其與海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)之后形成 的膠囊的免疫佐劑效果。CD86表達(dá)情況如圖6，空載微膠囊、CEA和負(fù)載有CEA 的微膠囊都表現(xiàn)出刺激能力，但很明顯，偶聯(lián)負(fù)載有CEA的微膠囊的刺激能力 比空載微膠囊和CEA/空載膠囊混合物都顯著更強(qiáng)。HLA-DR表達(dá)情況得出相似 結(jié)論。
收集各組樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)14小時(shí)后上清液，ELISA檢測上清液中IL-12和 TNF-a濃度，結(jié)果如圖8和圖9。不加刺激物的未成熟樹突狀細(xì)胞(陰性對照)細(xì)胞 上清IL-12含量20士3pg/ml， TNF-a含量35士4 pg/ml;加入LPS(陽性對照)細(xì)胞上清 IL-12含量225士17pg/ml， TNF-a含量315士33 pg/ml; 0.6 mg/ml微膠囊刺激的細(xì)胞 上清IL-12含量31士15 pg/ml， TNF-a含量152土9 pg/ml; 100 pg/ml重組CEA蛋 白刺激的細(xì)胞上清IL-12含量46士16pg/ml，TNF-a含量l 1±3 pg/ml; 100嗎/m重 組CEA蛋白和微膠囊混合物刺激的細(xì)胞上清IL-12含量34士20pg/ml， TNF-a含 量10士3pg/ml;重組CEA蛋白和微膠囊偶聯(lián)物刺激的細(xì)胞上清IL-12含量29士16 pg/ml， TNF-a含量125±18 pg/ml。即與未加刺激物(陰性對照)相比，無論是游 離的重組CEA蛋白或海藻酸鈣微膠囊，還是兩者混合或者偶聯(lián)都無法提高樹突 狀細(xì)胞分泌IL-12的能力；但是，海藻酸鈣微膠囊可顯著誘導(dǎo)提高樹突狀細(xì)胞分泌TNF-a，而且在其偶聯(lián)了重組CEA蛋白之后還可以保持，提示海藻酸鈣微膠 囊誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟是通過誘導(dǎo)后者表達(dá)TNF-a實(shí)現(xiàn)的。
為進(jìn)一步檢驗(yàn)重組CEA負(fù)載之后海藻酸f丐微膠囊的免疫佐劑效果，設(shè)計(jì)了 不同刺激物誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟后樹突狀細(xì)胞和異體T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí) 驗(yàn)，結(jié)果如圖10所示。T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)5天后，細(xì)胞密度為9.3士3.2xl0Vml， 未加刺激物樹突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后T淋巴細(xì)胞密度為13.4i0.4xl05 /ml;微膠囊組細(xì)胞密度為14.2士3.1xl05 /ml;重組CEA蛋白組細(xì)胞密度為 21.1±2.9xl05/ml;混合物組細(xì)胞密度為19.3士3.1xl()S/ml;偶聯(lián)物組細(xì)胞密度為 25.0±1.9xl05/m。與膠囊和重組CEA蛋白混合物相比，偶聯(lián)物刺激異體T淋巴細(xì) 胞增殖能力更強(qiáng)。
為檢驗(yàn)海藻酸鈣微膠囊刺激特異性CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，本發(fā)明人選 擇人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8和無CEA表達(dá)的人胚腎293細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞HCT-8 細(xì)胞具有粘附性，貼壁生長形態(tài)類似上皮細(xì)胞，被認(rèn)為是CEA的主要分泌細(xì)胞。 以起始濃度lxl05 /ml與不同組樹突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞以I:30(T淋巴細(xì)胞: 效應(yīng)細(xì)胞)共培養(yǎng)，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖11和圖12顯示。
293細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，未加刺激物誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞刺激的T 淋巴細(xì)胞組(陰性對照)細(xì)胞密度為7.9士l.lxl06 /ml; LPS組(陽性對照)細(xì)胞密度 為7.9士1.7xl()6/ml;微膠囊組細(xì)胞密度為8.8士1.0xl0"ml;重組CEA蛋白組細(xì)胞 密度為7.9士0.5xl0"ml;混合物組細(xì)胞密度為8.8士0.6xl0"ml;偶聯(lián)物組細(xì)胞密 度為7.7il.2xl0"ml。各組細(xì)胞密度無顯著差別，即重組CEA蛋白或海藻酸鈣微 膠囊或兩者的混合物，刺激物誘導(dǎo)刺激的免疫反應(yīng)對293細(xì)胞都沒有顯著的殺 傷效果(PX).05)。
HCT-8細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，HCT-8組(陰性對照I)細(xì)胞密度為 2.2±0.7xl05/ml;純T淋巴細(xì)胞組(陰性對照II)細(xì)胞密度為2.1i0.5x105/ml;未成 熟樹突狀細(xì)胞組(陰性對照III)細(xì)胞密度為2.0士0.4x105 /ml; LPS組(陽性對照)細(xì) 胞密度為0.5士0.1xl0Vml;微膠囊組細(xì)胞密度為1.8士0.5xl0Vml;重組CEA蛋白 組細(xì)胞密度為1.6士0.5xl0Vml;混合物組細(xì)胞密度為1.5土0.3xl05/ml;偶聯(lián)物組細(xì)胞密度為0.4士0.1xl05/ml。與293細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，雖然單純T淋巴細(xì) 胞和未成熟樹突狀誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞對HCT-8細(xì)胞沒有明顯殺傷作用(P >0.05)，但LPS可以顯著增加T淋巴細(xì)胞對HCT-8細(xì)胞的殺傷效果。同時(shí)，單純 重組CEA蛋白或重組CEA蛋白和海藻酸鈣微膠囊的混合物可特異性提高T淋巴 細(xì)胞的殺傷效果，這種殺傷效果在重組CEA蛋白與海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)后更加 顯著。即重組CEA蛋白和海藻酸鈣微膠囊偶聯(lián)后有比兩者的混合物高得多的提 高T淋巴細(xì)胞的特異性殺傷效果(p0.05)。實(shí)施例5海藻酸鋇微膠囊的抗原性和免疫佐劑效果采用ZL200310108684. 9中所描述的方法，制備了海藻酸鋇微膠囊。采用如前述類似的方法，將甲胎蛋白(AFP)的編碼序列構(gòu)建到載體 pcDNA-3中，將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化293細(xì)胞表達(dá)獲得AFP蛋白，并純化。釆用如前述類似的NHS/EDAC肽鍵合成反應(yīng)法，將AFP蛋白與海藻酸鋇微 膠囊相偶聯(lián)，獲得偶聯(lián)產(chǎn)物。檢驗(yàn)該偶聯(lián)AFP蛋白的海藻酸鋇微膠囊的抗原性，并與空載海藻酸鈣微膠 囊和單純AFP蛋白比較，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)AFP蛋白的海藻酸鋇微膠囊誘導(dǎo)的樹突狀細(xì) 胞刺激指數(shù)明顯高于單純AFP (P <0.01)，可提高樹突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞效 率；相比之下，空載海藻酸鋇微膠囊未能刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖(PX).05)。檢驗(yàn)該偶聯(lián)AFP蛋白的海藻酸鋇微膠囊的刺激特異性CTL殺傷攜帶AFP抗 原的腫瘤細(xì)胞的效果，并與空載海藻酸鈣微膠囊和單純AFP蛋白比較，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)偶聯(lián)AFP蛋白的海藻酸鋇微膠囊可顯著提高T淋巴細(xì)胞的特異性殺傷效果。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生物多糖微膠囊，其與一種或多種抗原或抗原決定簇相偶聯(lián)，用于制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)；其中，所述的生物多糖微膠囊含50-90％重量的生物多糖，且膠囊的直徑在50-1000納米之間。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的生物多糖微膠囊是采用 選自以下的方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液和20-1000 mM金屬鹽水溶液 分別加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相 密度相同，分別形成生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液，其中所述生 物多糖選自海藻酸鹽、Gellan膠、果膠、果膠酸、卡拉膠；所述的金屬鹽選自 以下金屬離子形成的水溶性鹽K+、 Ca2+、 Ba2+、 Sr2+、 Cu2+、 Fe2+、 Fe3+、 Al3+ 或其組合；b) 對步驟a)得到的生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液在冰浴上 分別用超聲波乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖水/油乳化液和金屬鹽水/油乳化液；c) 在4-35'C混合步驟b)得到的生物多糖乳化液和金屬鹽乳化液5-60分鐘， 形成反應(yīng)混合物；d) 對步驟c)的反應(yīng)混合物離心分層，獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；e) 反應(yīng)產(chǎn)物脫水，然后洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微 膠囊；或者，所述的生物多糖微膠囊是采用選自以下的方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶 劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相密度相同，形成生物多糖水/油混懸 液；b) 對a)獲得的生物多糖水/油混懸液進(jìn)行超聲乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖 水/油乳化液；c) 向生物多糖水/油乳化液中滴加體積比為0.5-10%水相油相均可溶性酸；然后加入5-50%有機(jī)溶劑，充分混合；離心去除油相；獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；d)向c)獲得的水相反應(yīng)產(chǎn)物中加入體積比為0.1-2y。的水相油相均可溶性 酸，進(jìn)行超聲作用；超聲作用過程中滴加金屬鹽溶液溶液，充分混合，調(diào)節(jié) PH6-8;然后洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微膠囊。
3. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的抗原是腫瘤特異性抗原。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的抗原選自癌胚抗原， 腫瘤提取物，腫瘤抗原多肽，甲胎蛋白，癌抗原CA125，癌抗原Cal53，糖鏈抗 原Ca242，惡性腫瘤相關(guān)物質(zhì)，前列腺特異抗原PSA，表皮黏蛋白MUC1。
5. —種可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決 定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)，所述的物質(zhì)含有生物多糖微膠囊，以及與 之相偶聯(lián)的一種或多種抗原或抗原決定簇；所述物質(zhì)中抗原或抗原決定簇的含 量是0.1-30%重量。其中，所述的生物多糖微膠囊含50一0%重量的生物多糖，且膠囊的直徑在 50-1000納米之間；
6. 如權(quán)利要求5所述的物質(zhì)，其特征在于，所述的生物多糖微膠囊是采用 選自以下的方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液和20-1000 mM金屬鹽水溶液 分別加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相 密度相同，分別形成生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液，其中所述生 物多糖選自海藻酸鹽、Gellan膠、果膠、果膠酸、卡拉膠；所述的金屬鹽選自 以下金屬離子形成的水溶性鹽K+、 Ca2+、 Ba2+、 Sr2+、 Cu2+、 Fe2+、 Fe3+、 Al3+ 或其組合；b) 對步驟a)得到的生物多糖水/油混懸液和金屬鹽水/油混懸液在冰浴上 分別用超聲波乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖水/油乳化液和金屬鹽水/油乳化液；c) 在4-35'C混合步驟b)得到的生物多糖乳化液和金屬鹽乳化液5-60分鐘， 形成反應(yīng)混合物；d) 對步驟c)的反應(yīng)混合物離心分層，獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；e) 反應(yīng)產(chǎn)物脫水，然后洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微膠囊；或者，所述的生物多糖微膠囊是采用選自以下的方法制備的a) 將重量體積比為0.8-3%生物多糖水溶液加入溶有表面活性劑的有機(jī)溶 劑中，加入礦物油，混合，直到油相與水相密度相同，形成生物多糖水/油混懸 液；b) 對a)獲得的生物多糖水/油混懸液進(jìn)行超聲乳化，形成穩(wěn)定的生物多糖 水/油乳化液；c) 向生物多糖水/油乳化液中滴加體積比為0.5-10%水相油相均可溶性酸； 然后加入5-50%有機(jī)溶劑，充分混合；離心去除油相；獲得水相反應(yīng)產(chǎn)物；d) 向c)獲得的水相反應(yīng)產(chǎn)物中加入體積比為0.1-2。/。加水相油相均可溶性 酸，進(jìn)行超聲作用；超聲作用過程中滴加金屬鹽溶液溶液，充分混合，調(diào)節(jié) PH6-8;然后洗滌除掉表面活性劑和油相物質(zhì)，得到生物多糖微膠囊。
7. 如權(quán)利要求6所述的物質(zhì)，其特征在于，其特征在于，所述的抗原是腫 瘤特異性抗原。
8. 如權(quán)利要求7所述的物質(zhì)，其特征在于，所述的所述的生物多糖微膠囊 是海藻酸鈣微膠囊。
9. 權(quán)利要求6-8任一所述的物質(zhì)的用途，用于制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提 高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的組合物。
10. —種用于促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗 原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的組合物，其特征在于，其含有權(quán)利要求6-8 任一所述的物質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物多糖微膠囊的用途，用于與抗原或抗原決定簇相偶聯(lián)，制備促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖或提高T淋巴細(xì)胞對表達(dá)所述抗原或抗原決定簇的細(xì)胞特異性殺傷能力的物質(zhì)。
文檔編號A61K39/00GK101314035SQ20081003983
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者沈炳謙 申請人:沈炳謙