專利名稱：麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病預(yù)防用疫苗，特別涉及聯(lián)合疫苗技術(shù)，具體涉及麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。

背景技術(shù)：
隨著各種新疫苗的迅速發(fā)展，預(yù)防接種的疫苗越來越多，納入兒童計劃免疫(EPI)中疫苗種類不斷增加，嬰幼兒接種次數(shù)也隨之增多，從出生到入學(xué)前要注射各種疫苗達(dá)22～26次之多，這不僅使防疫部門和兒童的免疫負(fù)擔(dān)大大加重，費(fèi)用增加，同時增加了交叉感染的機(jī)會。為了降低疫苗接種費(fèi)用，減少兒童接種針次，提高免疫覆蓋率，加速實(shí)現(xiàn)疫苗的防病、滅病效果，迫切需要研究開發(fā)聯(lián)合疫苗。1990年WHO等5個國際組織共同發(fā)起并創(chuàng)立了“全球兒童免疫計劃”(CVI)，CVI的宗旨是研究開發(fā)理想的聯(lián)合疫苗，即研究開發(fā)通過一劑或兩劑接種即可預(yù)防多種疾病的聯(lián)合疫苗。
2007年3月5日，溫家寶總理在十屆全國人大會議上指出，今年將擴(kuò)大國家免疫規(guī)劃的范圍，將甲肝、流腦等15種可以通過接種疫苗有效預(yù)防的傳染病納入國家免疫規(guī)劃的范圍。國家免疫規(guī)劃的擴(kuò)容，由6苗防7病擴(kuò)大為14苗防15病，其中疫防的15種傳染病中包括麻疹、腮腺炎、乙型腦炎。但我國目前使用的疫苗大部分還是幾十年前的品種，多是單抗原疫苗，這必定增多接種次數(shù)，影響免疫覆蓋率。要解決這些問題，疫苗品種更新?lián)Q代，研制開發(fā)聯(lián)合疫苗是最好的辦法之一。因此，研究開發(fā)出安全有效的聯(lián)合疫苗，是實(shí)現(xiàn)國家免疫規(guī)劃擴(kuò)容，做好衛(wèi)生防疫工作面臨的重要課題。麻疹、腮腺炎、乙型腦炎是三種由不同病毒引發(fā)的急性傳染病，均具有高度傳染性，可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡，對這三種疾病的預(yù)防是衛(wèi)生防疫工作的重要任務(wù)。
麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗的工藝和生產(chǎn)用原料相似，制品產(chǎn)量大、工藝穩(wěn)定，這三種單價苗接種對象和接種部位相同，免疫程序相近，研制成聯(lián)合疫苗后，按照免疫程序8個月時初免，7歲時加強(qiáng)免疫，給預(yù)防接種帶來很大方便，可以減輕防疫部門及兒童的免疫負(fù)擔(dān)，既減少防疫部門工作量，降低兒童接種費(fèi)用，減少兒童的接種次數(shù)及交叉感染的機(jī)會，同時可以擴(kuò)大接種面，提高免疫覆蓋率，便于醫(yī)案的保管，達(dá)到一針多免的效果，更快更好的實(shí)現(xiàn)國家免疫規(guī)劃的擴(kuò)容。
本發(fā)明專利申請人武漢生物制品研究所于2000年開始進(jìn)行麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的研究工作，2001年本發(fā)明專利申請人將麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗原液，按體積比1∶1∶1的比例進(jìn)行混合的方案，進(jìn)行了該聯(lián)合疫苗200支/批，連續(xù)3批的小規(guī)模試制，并對制成的聯(lián)合疫苗的安全性、病毒滴度及熱穩(wěn)定性、乙腦病毒的免疫原性等四項關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了檢測，結(jié)果均達(dá)到各單價苗要求，結(jié)果見表1、表2。該研究結(jié)果以“乙型腦炎、麻疹、腮腺炎三聯(lián)疫苗的研究”為題，發(fā)表在中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2004年7月第7卷第7期第688-689頁上。
表1聯(lián)合疫苗對乙腦的免疫力試驗
表2聯(lián)合疫苗的病毒滴度及熱穩(wěn)定性
2002年及2005年，本發(fā)明專利申請人按以上小規(guī)模試制方案進(jìn)行了20000支/批，共計4批麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的中試，在對中試聯(lián)合疫苗病毒滴度及熱穩(wěn)定性兩項關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，不僅病毒滴度及熱穩(wěn)定性兩項指標(biāo)波動性大，且均不能達(dá)到各單價苗要求，見表3。說明按原方法制備的聯(lián)合疫苗關(guān)鍵性質(zhì)量指標(biāo)不穩(wěn)定，原麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗技術(shù)方案不適合中試及中試以上的規(guī)?；a(chǎn)。
表3原工藝聯(lián)合疫苗中試病毒滴度及熱穩(wěn)定性
注2005年版《中華人民共和國藥典》三部規(guī)定，37℃一周病毒滴度下降不得超過1lg

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，使其能夠適合規(guī)?；a(chǎn)。
為使麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的技術(shù)方案能夠適合規(guī)?；a(chǎn)，本發(fā)明對原麻疹腮思腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的各單價疫苗與疫苗保護(hù)劑的混合時間、各單價疫苗的混合比例、聯(lián)合疫苗的配制順序和疫苗保護(hù)劑四項關(guān)鍵工藝做了較大的改進(jìn)和調(diào)整。
本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法包括以下步驟 (1)分別制備病毒效價在5.0～6.0lgCCID50/ml的麻疹疫苗原液、病毒效價在5.5～6.5lgCCID50/ml的腮腺炎疫苗原液和病毒效價在6.8～7.4lgPFU/ml的乙型腦炎疫苗原液； (2)將三種單價疫苗原液分別與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖和人血白蛋白混合，按各單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的體積比10∶1的比例混合，充分混勻后，再加入蛋白含量為20％的人血白蛋白，加入的體積比例為單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的混合液∶20％人血白蛋白＝38∶1至13∶1，即得到麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液； (3)將步驟(2)配制成的麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液，按麻疹單價疫苗液∶腮腺炎單價疫苗液∶乙型腦炎單價疫苗液的體積比為1～3∶1～5∶2～7的比例混合，然后分裝，再冷凍干燥，即制成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。
本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗所選用的3種毒株為麻疹滬191疫苗株、腮腺炎Wm84疫苗株和乙型腦炎SA14-14-2疫苗株。
麻疹滬191疫苗株由中國上海生物制品研究所分離獲得，自1966年批準(zhǔn)作為疫苗株生產(chǎn)麻疹減毒活疫苗已使用40余年，安全性和免疫原性好，在人工封閉區(qū)內(nèi)初免成功者中，大部分免疫持久性達(dá)14年以上。[參見1.戴斌.麻疹疫苗.見盧錦漢等.醫(yī)學(xué)生物制品學(xué).北京人民衛(wèi)生出版社，1995，568-580；2.徐特璋，關(guān)霆，章以浩.麻疹.見耿貫一.流行病學(xué).第二版，北京人民衛(wèi)生出版社，1996，510-539.] 腮腺炎Wm84疫苗株由中國武漢生物制品研究所引進(jìn)國際通用株Jeryl-Lynn經(jīng)原代雞胚細(xì)胞傳代適應(yīng)獲得，該毒株生產(chǎn)的腮腺炎減毒活疫苗已使用十余年，流行病學(xué)調(diào)查顯示抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)96.4-100％，幾何平均滴度(GMT)4.5-6.2，降低發(fā)病率87.5％，對流行性腮腺炎有很好的預(yù)防作用。[參見魏樹源，鐘紹基，李秀蘭.流行性腮腺炎WM84株疫苗的有效免疫反應(yīng).同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2000，29(6)529-531.] 乙型腦炎SA14-14-2疫苗株由中國藥品生物制品檢定所研制，該毒株生產(chǎn)的乙腦減毒活疫苗處于世界領(lǐng)先水平，研究表明SA14-14-2生產(chǎn)毒種及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E區(qū)核苷酸的特性十分穩(wěn)定，[參見賈麗麗，俞永新等流行性乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)毒種(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因穩(wěn)定性研究.Chin J Biologicals January2004，VOl.17No.112-15]。該疫苗經(jīng)過十多年、數(shù)億人次的使用，證明在乙腦非流行區(qū)的保護(hù)率為85-100％，流行區(qū)為86-99％，接種1針1個月后再加強(qiáng)免疫1針至加強(qiáng)免疫后的第6年，中和抗體陽性率仍可維持在57.1-75.0％[參見Yu Yongxin.Safety And EfficacyOf Live Attenuated Japanese Encephalitis Vaccine SA14-14-2In Human Vaccination.National Institute for the Pharmaceutical and Biological Products.July 2006.] 本發(fā)明專利申請人武漢生物制品研究所擁有符合國家菌毒種管理要求，獲國家批準(zhǔn)使用的麻疹滬191疫苗株、腮腺炎Wm84疫苗株和乙型腦炎SA14-14-2疫苗株，建立有這三種毒株的毒種庫，擁有這三種單價疫苗的生產(chǎn)文號，并已長期投入批量生產(chǎn)。
三種單價疫苗原液的制備按2005年版《中華人民共和國藥典》三部的要求，利用現(xiàn)有技術(shù)，在已通過國家GMP認(rèn)證的疫苗生產(chǎn)車間制備符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部要求的三種單價苗原液。
疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的配制方法是將明膠在100℃熱水浴助溶條件下溶于歐氏液，實(shí)時攪拌，待完全溶解、清亮后，0.11MPa30分鐘滅菌，得明膠溶液；將藥用級蔗糖在100℃熱水浴助溶條件下溶于歐氏液，實(shí)時攪拌，使溶解完全，得蔗糖溶液；將上述明膠溶液和蔗糖溶液混合，用歐氏液定容，使明膠濃度為5％～10％，使蔗糖濃度為30％～50％；將混合后的明膠蔗糖溶液用兩層絹布過濾除去殘渣后，0.07MPa30分鐘滅菌，即得明膠蔗糖疫苗保護(hù)劑，于37℃存放備用。
人血白蛋白武漢生物制品研究所生產(chǎn)，蛋白含量為20％的人血白蛋白。
冷凍干燥方法是 (1)預(yù)凍階段疫苗降溫至-40℃以下，保溫2～4小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段； (2)抽真空階段冷凝器溫度在-50℃以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在5pa以下； (3)第一階段干燥擱板溫度控制在-47℃至-15℃，疫苗溫度控制在-47℃至-27℃，干燥15～24小時；第一階段干燥完畢后，待溫度上升至23℃～28℃，升溫時間約7～10小時，進(jìn)入第二階段干燥； (4)第二階段干燥疫苗在23℃～28℃下保溫6～10小時，即凍干完畢，方可停機(jī)，壓膠塞后出柜。
本發(fā)明技術(shù)方案與文獻(xiàn)已公開的技術(shù)方案相比，優(yōu)勢在于1.本發(fā)明制備方法是先將各單價疫苗原液分別與保護(hù)劑混合，制成三種單價疫苗液，然后再將三種單價疫苗液按比例混合。2.本發(fā)明制備方法中三種單價疫苗液的混合比例也與文獻(xiàn)公開的技術(shù)方案不同。3.本發(fā)明配制聯(lián)合疫苗時對單價疫苗液的混合順序沒有要求，可按任何順序混合，不僅使聯(lián)合疫苗制備工藝簡單化，更為重要的是保證了聯(lián)合疫苗主要指標(biāo)“疫苗效價”的穩(wěn)定性。4.本發(fā)明還對疫苗保護(hù)劑中各成分含量進(jìn)行了調(diào)整。而文獻(xiàn)公開的方法中則要求各單價疫苗原液按規(guī)定順序混合，且易導(dǎo)致聯(lián)合疫苗主要指標(biāo)“疫苗效價”不穩(wěn)定，這種配制步驟使聯(lián)合疫苗制備工藝的復(fù)雜程度大大加大，導(dǎo)致主要指標(biāo)“疫苗效價”難以控制，不適宜麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)。
本發(fā)明專利申請人用本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗制備方法在三個不同年份進(jìn)行了20000～50000瓶/批規(guī)模的聯(lián)合疫苗中試，共試制7批，經(jīng)全面檢定，各項指標(biāo)均符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部中各單價苗要求(表5)。
表5本發(fā)明聯(lián)合疫苗中試檢測結(jié)果

用動物昆明鼠進(jìn)行的乙腦免疫原性試驗結(jié)果顯示，用乙腦病毒強(qiáng)毒P3株攻擊(攻擊毒腹腔滴定為600LD50)，本發(fā)明聯(lián)合疫苗ED50＝2.49lgPFU，單價乙型腦炎減毒活疫苗ED50＝2.5lgPFU，均不高于3.0lgPFU，攻擊對照組小鼠死亡率不低于80％，符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部單價乙型腦炎減毒活疫苗免疫原性規(guī)定。說明本發(fā)明聯(lián)合疫苗具有與單價乙型腦炎減毒活疫苗同樣的保護(hù)效果，見表6。
表6本發(fā)明聯(lián)合疫苗中乙型腦炎免疫原性試驗結(jié)果
注單價乙腦苗保護(hù)性試驗結(jié)果判定ED50應(yīng)不高于3.0lgPFU，攻擊對照組小鼠死亡率應(yīng)不低于80％，乙腦攻擊毒病毒量應(yīng)不低于500腹腔滴定的LD50。
用1日齡SPF級乳鼠、體重8.5克～10.5克SPF級昆明鼠、體重220克～250克豚鼠，注射聯(lián)合疫苗后觀察不同動物的反應(yīng)原性，同時設(shè)三種單價疫苗對照，連續(xù)觀察28天。不同動物反應(yīng)原性試驗顯示，注射后5分鐘-10分鐘均未見任何異常反應(yīng)；觀察期28天內(nèi)，聯(lián)合疫苗與三種單價疫苗一樣，均未見反應(yīng)原性增加，三種動物無任何異常反應(yīng)，全部健存，體重增加(表7)。
表7本發(fā)明聯(lián)合疫苗對不同動物的反應(yīng)原性試驗結(jié)果
本發(fā)明聯(lián)合疫苗長期穩(wěn)定性觀察將20050701、20050702批麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗，置4-8℃保存，采用留樣觀察法，每3個月取樣一次，對不同時間(0月、3月、6月、9月、12月、15月、18月)關(guān)鍵性質(zhì)量指標(biāo)，包括病毒滴度、水分、安全性、異常毒性，進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控。結(jié)果顯示(表8)，本發(fā)明聯(lián)合疫苗4℃-8℃保存18個月時，各項關(guān)鍵性質(zhì)量指標(biāo)(病毒滴度、水分、安全性、異常毒性)均符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部單價疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果進(jìn)一步說明，新工藝進(jìn)行麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗規(guī)模化生產(chǎn)，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定，能生產(chǎn)出安全有效的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。結(jié)果見表8。
表8本發(fā)明聯(lián)合疫苗4-8℃保存18個月病毒滴度和水分穩(wěn)定性檢測結(jié)果
效價單位麻疹、腮腺炎為lgCCID50/ml，乙腦為lgPFU/ml 單苗效價標(biāo)準(zhǔn)麻疹≥3.3lgCCID50/ml；腮腺炎≥4.0lgCCID50/ml；乙腦≥5.7lgPFU/ml；水分＜3.0％ 以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗制備方法，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)在規(guī)?；a(chǎn)中存在的病毒效價波動性大、疫苗穩(wěn)定性不好等關(guān)鍵性質(zhì)量問題，本發(fā)明中試規(guī)模制備的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗各項指標(biāo)均符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部各單價苗要求，既保證了中試規(guī)模疫苗效價的穩(wěn)定性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制，見表5、表8，又保持了與單價苗一致的良好免疫應(yīng)答，見表6，同時又不增加反應(yīng)原性，見表7。說明本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗制備方法適合規(guī)?；a(chǎn)。
麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗的工藝和生產(chǎn)用原料相似，制品產(chǎn)量大、工藝穩(wěn)定，這三種單價苗接種對象和接種部位相同，免疫程序相近，研制成聯(lián)合疫苗后，按照免疫程序8個月時初免，7歲時加強(qiáng)免疫，給預(yù)防接種帶來很大方便，可以減少工作量，降低接種費(fèi)用，擴(kuò)大接種面，便于醫(yī)案的保管，同時可大大減少兒童的接種次數(shù)，減少交叉感染的機(jī)會，提高免疫覆蓋率，達(dá)到一針多免的效果。生產(chǎn)成本上，現(xiàn)有的這三種單價苗均為凍干制劑，凍干保護(hù)劑成本較高。本發(fā)明將其制成聯(lián)合疫苗，可大大降低生產(chǎn)成本，另外還可節(jié)約凍干費(fèi)用、包裝費(fèi)用和運(yùn)輸費(fèi)用等。因此，本發(fā)明將單價麻疹、腮腺炎及乙型腦炎疫苗制成聯(lián)合疫苗，既有利于計劃免疫，擴(kuò)大免疫接種面，減輕防疫部門及兒童的免疫負(fù)擔(dān)，又能降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的接種對象為8月齡以上的麻疹、流行性腮腺炎和乙型腦炎易感者。接種本發(fā)明疫苗后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗麻疹病毒、抗腮腺炎病毒和抗乙型腦炎病毒的免疫力，用于預(yù)防麻疹、流行性腮腺炎和乙型腦炎。具體用法和用量為(1)按標(biāo)示量加入疫苗稀釋劑(滅菌注射用水)，待疫苗完全溶解并搖勻后使用。(2)于上臂外側(cè)三角肌下緣附著處皮下注射。(3)8月齡兒童首次注射0.5ml；7歲再注射0.5ml，以后不再免疫。本發(fā)明疫苗的禁忌包括(1)發(fā)熱，患嚴(yán)重疾病、中耳炎、活動性結(jié)核或心臟、腎臟及肝臟等疾病者，急性或慢性感染者。(2)體質(zhì)衰弱，有過敏史或癲癇史者，對雞蛋有過敏史者。(3)先天性免疫缺陷者，近期或正在進(jìn)行免疫抑制劑治療者。(4)妊娠期婦女。(5)注射過免疫球蛋白者，應(yīng)間隔1個月以上再接種本疫苗。



圖1是本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗制備方法的工藝流程圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 本發(fā)明提供的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法如下 1.三種單價疫苗原液的制備在武漢生物制品研究所已通過國家GMP認(rèn)證的疫苗生產(chǎn)車間，按2005年版《中華人民共和國藥典》三部要求，分別 1.1按2005年版《中華人民共和國藥典》三部，P98～99，要求，用麻疹滬191疫苗株接種原代雞胚細(xì)胞，制備病毒效價在5.0lgCCID50/ml～6.0lgCCID50/ml的麻疹疫苗原液； 1.2按2005年版《中華人民共和國藥典》三部，P107～108，要求，用腮腺炎Wm84疫苗株接種原代雞胚細(xì)胞，制備病毒效價在5.5lgCCID50/ml～6.5lgCCID50/ml的腮腺炎疫苗原液； 1.3按2005年版《中華人民共和國藥典》三部，P77～78，要求，用乙腦SA14-14-2疫苗株接種原代地鼠腎細(xì)胞，制備病毒效價在6.8lgCCID50/ml～7.4lgCCID50/ml的乙型腦炎疫苗原液。
2.疫苗保護(hù)劑配制，在潔凈度十萬級車間內(nèi)操作 2.1疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的配制 配制1000ml濃度為8％明膠40％蔗糖的明膠蔗糖疫苗保護(hù)劑 2.1.1稱取明膠84克，在100℃熱水浴助溶下溶于250毫升歐氏液，實(shí)時攪拌，待完全溶解、清亮后，0.11MPa30分鐘滅菌，得明膠溶液250毫升；所用明膠為Fluka公司生產(chǎn)銷售的產(chǎn)品，其貨號為48722，規(guī)格為500克/瓶，批號為1356004。
2.1.2稱取藥用級蔗糖420克，在100℃熱水浴助溶下溶于500毫升歐氏液，實(shí)時攪拌，使溶解完全，得蔗糖溶液500毫升； 2.1.3將以上250毫升明膠溶液和500毫升蔗糖溶液混合，補(bǔ)足歐氏液，使明膠溶液和蔗糖溶液混合后的總體積達(dá)1000毫升，混合后的明膠蔗糖溶液用兩層絹布過濾除去殘渣后，0.07MPa30分鐘滅菌后，即得1000ml 8％明膠 40％蔗糖疫苗保護(hù)劑。37℃存放備用，此液應(yīng)在一周內(nèi)使用。
2.2人血白蛋白由武漢生物制品研究所提供獲國家批簽發(fā)的20％人血白蛋白，2℃-8℃保存?zhèn)溆?。批簽發(fā)，即生物制品批簽發(fā)，是指國家對疫苗類制品、血液制品、用于血源篩查的體外生物診斷試劑以及國家食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的其他生物制品，每批制品出廠上市或者進(jìn)口時進(jìn)行強(qiáng)制性檢驗、審核的制度。檢驗不合格或者審核不被批準(zhǔn)者，不得上市或者進(jìn)口。
3.三種單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑的混合 在通過國家GMP認(rèn)證的疫苗生產(chǎn)車間，先將按上述1項制備的三種單價疫苗原液分別加入到2.1項配制的疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖中，加入的體積比例為，各單價疫苗原液明膠蔗糖疫苗保護(hù)劑的體積比為10∶1，充分混勻后，再各加入20％人血白蛋白，加入的體積比例為單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的混合液∶20％人血白蛋白＝38∶1至13∶1，加入量為750ml～250ml，即制成麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液。
4.聯(lián)合疫苗的制備將步驟3配制的麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液，按麻疹單價疫苗液∶腮腺炎單價疫苗液∶乙型腦炎單價疫苗液的體積比為1～3∶1～5∶2～7的比例混合，然后分裝，分裝規(guī)格0.5ml/西林瓶，再冷凍干燥，冷凍干燥步驟方法如下 1.預(yù)凍 1.1溫度疫苗溫度-40℃以下 1.2時間達(dá)到上述溫度后，保溫2～4小時，轉(zhuǎn)入抽真空階段。
2.抽真空階段 冷凝器溫度在-50℃以下時，可啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在5pa以下。
3.第一階段干燥 3.1溫度擱板溫度在-47℃至-15℃，疫苗溫度在-47℃至-27℃； 3.2時間15～24小時。
3.3第一階段干燥完畢后，待溫度上升至23℃~28℃，(升溫時間約7～10小時)，進(jìn)入第二階段干燥。
4.第二階段干燥 疫苗在23℃～28℃下保溫6～10小時，即凍干完畢，方可停機(jī)，壓膠塞后出柜。至此，即制備成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。其規(guī)格為復(fù)溶后每瓶0.5ml，每1次人用劑量為0.5ml；每劑含麻疹活病毒應(yīng)不低于3.0lgCCID50，含腮腺炎活病毒應(yīng)不低于3.7lgCCID50，含乙型腦炎活病毒應(yīng)不低于5.4lgPFU。于8℃以下避光保存和運(yùn)輸，有效期為1年6個月。
實(shí)施例2 制備本發(fā)明聯(lián)合疫苗 在通過國家GMP認(rèn)證的疫苗生產(chǎn)車間內(nèi)操作。
先按實(shí)施例1的步驟1制備病毒效價在5.0lgCCID50/ml的麻疹疫苗原液，制備病毒效價在6.0lgCCID50/ml的腮腺炎疫苗原液，制備病毒效價在7.0lgPFU/ml的乙腦疫苗原液；再按實(shí)施例1的步驟2配制疫苗保護(hù)劑；然后再按實(shí)施例1的步驟2配制的8％明膠40％蔗糖保護(hù)劑1000ml中，加入已制備好的麻疹疫苗原液8600ml，混勻，再加入400ml 20％人血白蛋白，混勻。此時已配制體積為10000ml的單價麻疹疫苗液，內(nèi)含終濃度為0.8％明膠、4％蔗糖、0.8％人血白蛋白。按同樣方法分別配制體積10000ml的單價腮腺炎疫苗液和體積10000ml的單價乙型腦炎疫苗液。最后將以上配制的麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液按麻疹∶腮腺炎∶乙型腦炎＝2∶3∶2的體積比混合，即麻疹疫苗液2000ml+腮腺炎疫苗液3000ml+乙型腦炎疫苗液2000ml配制成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗疫苗液，分裝，按實(shí)施例1的冷凍干燥方法進(jìn)行冷凍干燥，即制備成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。規(guī)格為復(fù)溶后每西林瓶0.5ml，每1次人用劑量為0.5ml；每劑含麻疹活病毒應(yīng)不低于3.0lgCCID50；含腮腺炎活病毒應(yīng)不低于3.7lgCCID50，含乙型腦炎活病毒應(yīng)不低于5.4lgPFU。于8℃以下避光保存和運(yùn)輸，有效期為1年6個月。
權(quán)利要求
1.一種麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，包括以下步驟
(1)分別制備病毒效價在5.0～6.01gCCID50/ml的麻疹疫苗原液、病毒效價在5.5～6.51gCCID50/ml的腮腺炎疫苗原液和病毒效價在6.8～7.41gPFU/ml的乙型腦炎疫苗原液；
(2)將三種單價疫苗原液分別與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖和人血白蛋白混合，具體操作是按各單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的體積比10∶1的比例混合，充分混勻后，再加入蛋白含量為20％的人血白蛋白，加入的體積比例為單價疫苗原液與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的混合液∶20％人血白蛋白＝38∶1至13∶1，即得到麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液；
(3)將步驟(2)配制成的麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液，按麻疹單價疫苗液∶腮腺炎單價疫苗液∶乙型腦炎單價疫苗液的體積比1～3∶1～5∶2～7的比例混合，然后分裝，再冷凍干燥，即制成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖的配制方法是將明膠在100℃熱水浴助溶條件下溶于歐氏液，實(shí)時攪拌，待完全溶解、清亮后，0.11MPa30分鐘滅菌，得明膠溶液；將藥用級蔗糖在100℃熱水浴助溶條件下溶于歐氏液，實(shí)時攪拌，使溶解完全，得蔗糖溶液；將上述明膠溶液和蔗糖溶液混合，用歐氏液定容，使明膠濃度為5％～10％，使蔗糖濃度為30％～50％；將混合后的明膠蔗糖溶液用兩層絹布過濾除去殘渣后，0.07MPa30分鐘滅菌，即得明膠蔗糖疫苗保護(hù)劑，于37℃存放備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液的混合比例為麻疹單價疫苗液∶腮腺炎單價疫苗液∶乙型腦炎單價疫苗液的體積比為1～3∶1～5∶2～7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的冷凍干燥的方法是
(1)預(yù)凍階段疫苗降溫至-40℃以下，保溫2～4小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段；
(2)抽真空階段冷凝器溫度在-50℃以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在5pa以下；
(3)第一階段干燥擱板溫度控制在-47℃至-15℃，疫苗溫度控制在-47℃至-27℃，干燥15～24小時；第一階段干燥完畢后，待溫度上升至23℃～28℃，升溫時間約7～10小時，進(jìn)入第二階段干燥；
(4)第二階段干燥疫苗在23℃～28℃下保溫6～10小時，即凍干完畢，方可停機(jī)，壓膠塞后出柜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的冷凍干燥的方法是
(1)預(yù)凍階段疫苗降溫至-40℃以下，保溫2～4小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段；
(2)抽真空階段冷凝器溫度在-50℃以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在5pa以下；
(3)第一階段干燥擱板溫度控制在-47℃至-15℃，疫苗溫度控制在-47℃至-27℃，干燥15～24小時；第一階段干燥完畢后，待溫度上升至23℃～28℃，升溫時間約7～10小時，進(jìn)入第二階段干燥；
(4)第二階段干燥疫苗在23℃～28℃下保溫6～10小時，即凍干完畢，方可停機(jī)，壓膠塞后出柜。
6.按權(quán)利要求1至5中任一項所述的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法制備的麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。
全文摘要
一種麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗的制備方法，其步驟包括(1)分別制備麻疹疫苗原液、腮腺炎疫苗原液和乙型腦炎疫苗原液；(2)將三種單價疫苗原液分別與疫苗保護(hù)劑明膠蔗糖和人血白蛋白混合，得麻疹、腮腺炎、乙型腦炎三種單價疫苗液；(3)將三種單價疫苗液，按麻疹單價疫苗液∶腮腺炎單價疫苗液∶乙型腦炎單價疫苗液的體積比1～3∶1～5∶2～7的比例混合，分裝，冷凍干燥，即制成麻疹腮腺炎乙型腦炎聯(lián)合減毒活疫苗。本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)中各單價疫苗與疫苗保護(hù)劑的混合時間、各單價疫苗的混合比例、聯(lián)合疫苗的配制順序和疫苗保護(hù)劑四項關(guān)鍵工藝做了較大的改進(jìn)和調(diào)整，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有制備工藝簡單、疫苗效價穩(wěn)定性、成本低廉、適合規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K39/295GK101618213SQ20081004825
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者李萍萍, 賈麗麗, 楊曉明, 方志正, 董關(guān)木, 孫凌聰, 玲 易, 桂金柱, 呂文利, 岳廣智, 劉曉娜, 夏莉莉, 鋼 劉, 胡德祥, 胡志雄, 王志偉, 徐宏山, 劉欣玉 申請人:武漢生物制品研究所