專利名稱：可生物降解的載有血紅蛋白的聚肽囊泡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可生物降解載有血紅蛋白的聚肽囊泡及其制備方法，特別 是血紅蛋白的可生物降解的兩親性嵌段共聚肽囊泡及其制備方法，屬于生 物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輸血對于臨床手術(shù)、抗災(zāi)和戰(zhàn)場救護(hù)是不可缺少的醫(yī)療手段?？咳双I(xiàn) 血不僅面臨血源短缺問題，而且由于血型復(fù)雜，輸血必須進(jìn)行嚴(yán)格的配型， 同時(shí)血液要低溫儲存，保存期短，運(yùn)輸不便，更為嚴(yán)重的是肝炎、艾滋病 等病毒的污染使輸血安全受到威脅。近年來，血液需求量不斷增高，而安 全有效的血源卻日益緊缺。因此，近幾十年來血液代用品一直是國際科學(xué) 界和企業(yè)界關(guān)注的研究開發(fā)熱點(diǎn)。血液代用品，是指具有血紅細(xì)胞功能的 人工制劑。理想的血液代用品應(yīng)當(dāng)具有天然紅細(xì)胞的傳遞氧功能、生物相 容性、安全性和穩(wěn)定性。即1)具有較高的攜氧能力，氧分壓在正常生理 范圍內(nèi)，能有效向組織供氧；2)與血液所有組分具有良好的生物相容性； 3)能維持血液滲透壓、酸堿平衡、粘稠度和血容量；4)無免疫原性(無 致敏原性)、無血液病原微生物污染、無熱源；5)體內(nèi)循環(huán)半壽期在24 h 以上，在正常灌注條件下不產(chǎn)生腎毒性等副作用；6)在低溫條件下，產(chǎn)品 保質(zhì)期大于6個(gè)月；7)具有預(yù)期的可清除性。
研究血液代用品的關(guān)鍵是如何取得血液中紅細(xì)胞的輸送氧的功能。由 于紅細(xì)胞中的血紅蛋白具有高效的載氧能力和維持膠體滲透壓的功能，當(dāng) 前各國都將研制基于血紅蛋白的攜氧劑作為血液代用品研究開發(fā)的主攻方 向。血紅蛋白是一個(gè)四聚體，由四個(gè)亞基(2個(gè)a鏈，2個(gè)P鏈)組成，整個(gè)分子外形像一個(gè)四面體，呈C2點(diǎn)群對稱。血紅素輔基位于分子表面的孔
穴內(nèi)，每個(gè)亞基一個(gè)。四個(gè)氧的結(jié)合部位彼此保持一定的距離，兩個(gè)最近
的鐵原子之間距離為2.5 nm。四個(gè)亞基凹凸互補(bǔ)，形成一個(gè)長寬高分別為 6.4 nm、 5.5 nm、 5nm的四面體(結(jié)構(gòu)見圖2)。但未經(jīng)修飾的血紅蛋白不 能作為血液代用品，因?yàn)橛坞x的血紅蛋白分子容易經(jīng)由血管壁滲出，也容 易與血管內(nèi)皮細(xì)胞的松弛因子NO相吸附，引起血管收縮，造成血壓增高、 代謝異常以及輕度的神經(jīng)性副作用?；谘t蛋白的血液代用品的發(fā)展過 程分為三代。第一代是用小分子修飾血紅蛋白。第二代為血紅蛋白分子與 超氧化物歧化酶等紅細(xì)胞內(nèi)的酶交聯(lián)形成的偶聯(lián)物。這兩種經(jīng)過修飾的血 紅蛋白以單個(gè)的血紅蛋白分子為基本單元，因而無法避免單純血紅蛋白的 缺點(diǎn)，輸入體內(nèi)后往往造成血液滲透壓升高和大量高鐵血紅蛋白的形成， 還可能與NO結(jié)合造成血管收縮、血壓升高，循環(huán)半衰期也太短(10 20h)。 從90年代初期到現(xiàn)在，研究者們致力于第三代紅血球代用品的開發(fā)，它們 與第一代和第二代明顯的區(qū)別是在攜氧單元外面用膜包覆，使之更加接近 紅細(xì)胞的實(shí)際結(jié)構(gòu)，避免攜氧單元與免疫系統(tǒng)直接接觸，這種體系被稱作 HbV (Hemeglobin Vehicle)。用于HbV的膜材目前主要是脂質(zhì)體和白蛋白， 其中又以脂質(zhì)體的研究最多。近年來，用生物降解聚合物作為HbV膜材的 研究受到了越來越多的重視。與脂質(zhì)體相比，生物降解聚合物有著獨(dú)特的 優(yōu)點(diǎn)。首先，聚合物具生物可降解性，在完成輸氧任務(wù)后，最終可降解為 對人體無害的水和C02排出體外；其次，聚合物的結(jié)構(gòu)容易控制，可以通 過控制聚合物的結(jié)構(gòu)來調(diào)控HbV的大小和聚集方式等；最后，聚合物在強(qiáng) 度上也優(yōu)于磷脂膜，所以在相同條件下聚合物膜材的用量要少于磷脂膜。 白蛋白也是一種可生物降解的材料，但作為一種天然蛋白質(zhì)，它的免疫原 性和排異反應(yīng)難以解決。最近申請的中國專利(申請?zhí)?00810050914.3，"一
種生物降解的鍵合了血紅蛋白分子的納米粒子及制法")披露了一種以聚乙 二醇-聚碳酸酯-聚乳酸為載體的紅血球替代物，其中的血紅蛋白分子化學(xué)
5鍵合在聚碳酸酯嵌段上，因而在水體系中以納米膠束的形式存在，血紅蛋 白處于膠束的親水外殼和疏水內(nèi)核之間，雖然有攜氧功能，但在整體構(gòu)造 上同血紅蛋白仍有一定差距。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚肽囊泡來包裹血紅蛋 白，試圖將血紅蛋白包裹在囊泡之中，以求在整體結(jié)構(gòu)上更接近于人體的 血紅細(xì)胞。
本發(fā)明目的之一是提供的可生物降解載有血紅蛋白的聚肽囊泡。其為 一種載有血紅蛋白的可生物降解的兩親性嵌段共聚肽囊泡。如附圖l所示，
該囊泡的內(nèi)部水相中含有CO保護(hù)的血紅蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚 賴氨酸-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽構(gòu)成；其中聚賴氨酸段的分子量在 5000~10000范圍，聚苯丙氨酸段的分子量在800~2000范圍，囊泡的直徑大 小在0.5-10 nm范圍，血紅蛋白在囊泡中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10 50%。
本發(fā)明的另一目的是提供這種載有血紅蛋白的可生物降解的兩親性嵌 段共聚肽囊泡的制備方法，包括以下步驟
1) 合成端氨基的聚(N-芐氧羰基賴氨酸)
以正己胺為引發(fā)劑，引發(fā)N-芐氧羰基賴氨酸N-羰基羧酸酐開環(huán)聚合得 到聚(N-芐氧羰基賴氨酸)，所用的聚合溶劑為甲苯、氯仿、二氯甲烷、四 氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)，'其用量是N-芐氧羰基 賴氨酸N-羰基羧酸酐單體質(zhì)量的5 30倍，反應(yīng)24 120小時(shí)，聚合溫度為 25~40。C;
2) 合成聚(N-芐氧羰基賴氨酸)和聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物 以端氨基的聚(N-芐氧羰基賴氨酸)為引發(fā)劑，引發(fā)苯丙氨酸N-羰基
羧酸酐開環(huán)聚合得到目標(biāo)物；所用聚合溶劑為甲苯、氯仿、二氯甲烷、四 氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)，其用量是聚(N-芐氧 羰基賴氨酸)和苯丙氨酸N-羰基羧酸酐單體總質(zhì)量的10 50倍，反應(yīng)12~72小時(shí)，聚合溫度為25~40°C;
3) 將側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽脫保護(hù)得到聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩 嵌段共聚物
將含側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽溶于四氫呋喃、二氧六環(huán)、三氟乙酸、 硝基甲烷、苯、二氧化硫或它們的混合溶劑中，側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽 的質(zhì)量濃度為2 20%，通入溴化氫氣體，鼓泡反應(yīng)10~30分鐘，繼續(xù)冰浴 攪拌反應(yīng)1 12小時(shí)，然后用乙醚沉降，過濾，真空干燥，得到聚賴氨酸和 聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物；
4) 在緩沖溶液中用得到的聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩嵌段兩嵌段共聚 肽形成的囊泡包裹CO保護(hù)的血紅蛋白，形成載有血紅蛋白的囊泡，其具體
步驟是
① 將血紅蛋白溶于pH值為6.8 4.0的PBS緩沖溶液中，濃度l 5mg/ml;
② 取上述血紅蛋白溶液，置于三口容器中，加入摩爾濃度為0.05~0.5 mol/1的抗壞血酸(L-Asc)/PBS溶液，使抗壞血酸與血紅蛋白的摩爾比為
4~20;
③ 在攪拌條件下，在液面上方通過一氧化碳?xì)饬?，或者直接在溶液?br> 通CO氣體鼓泡，持續(xù)1~4小時(shí)，待紫外檢測550 nm左右的峰不再變化為 止，得到鮮紅色的CO保護(hù)血紅蛋白(CO-Hb)溶液；
取CO-Hb溶液，濃度為1^5mg/ml，將pH值調(diào)到6.8 4.0，再加入 所述的兩嵌段共聚肽，該兩嵌段共聚肽的質(zhì)量為溶液中CO-Hb質(zhì)量的0.5~2 倍，攪拌12 24小時(shí)，整個(gè)過程中體系用氮?dú)獗Ｗo(hù)；
⑤將步驟④的得到的溶液離心分離，離心轉(zhuǎn)速5000-10000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間 5~30分鐘，并用PBS溶液洗滌，洗滌后取上層清液用紫外光譜掃描，至洗 出液在400 600 nm無吸收峰為止，將離心下來的膠束仍分散于PBS溶液中 避光保存?zhèn)溆谩?br> 有益效果本發(fā)明使用聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物作為囊體材料。它具有兩親性，又能夠直接溶解在水溶液中，因而容易自組裝成 為微米級的囊泡，克服了以往囊泡制備過程中需要有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)，較好 地保持了蛋白質(zhì)的生物活性。它有較低的臨界膠束濃度，穩(wěn)定性比脂質(zhì)體 包裹血紅蛋白的體系要好得多。
本發(fā)明使用的囊體材料本身是聚氨基酸，具有與蛋白質(zhì)相類似的化學(xué) 結(jié)構(gòu)，和細(xì)胞、組織以及其它生物成分具有良好的相容性；同時(shí)易受酶 的作用，降解生成無毒的多肽或氨基酸，被人體吸收，因而具有優(yōu)良的生 物降解性；另外通過改變材料的組成不僅可以改變材料的降解速度，而 且可以改變所形成的囊泡的大小。所形成的囊泡具有中空結(jié)構(gòu)，對其中 的血紅蛋白起隔離和保護(hù)作用，避免了血紅蛋白被血液中的其它氧化劑氧 化，或者被免疫系統(tǒng)攻擊，因而可能有較長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
本發(fā)明中包裹在囊泡中的血紅蛋白仍然有結(jié)合氧氣的能力，并且 可以與一氧化碳循環(huán)。如附圖3所示，上述CO-Hb在光照下通入氧氣， 其紫外光譜中吸收峰從419nm移到405nm，再通入一氧化碳，則發(fā)生 相反的光譜變化，證明包裹血紅蛋白的囊泡可以作為攜氧單元使用。


圖l:載有血紅蛋白的兩嵌段共聚肽囊泡的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2:血紅蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3:攜氧能力測試的紫外光譜圖。圖中，在包裹有CO-Hb的囊泡溶
液中光照下通入氧氣，紫外光譜吸收峰從419nm移到405nm。 圖4:聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物的核磁氫譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:端氨基聚(N-芐氧羰基賴氨酸)(PZLL)的合成 將2.0g的N-節(jié)氧羰基賴氨酸NCA放入用火焰烘烤過的安瓶內(nèi)，用氮 氣換氣三次，密封后用注射器加入20mlDMF，溶解之后，按比例加入正己
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胺的DMF溶液，攪拌下在30°C油浴中反應(yīng)72h。反應(yīng)物用過量的乙醚沉 降后，得到透明粘性的PZLL，將此粘性物質(zhì)重新溶解在氯仿中，用過量 的乙醚沉降，得白色固體。40。C下真空干燥24小時(shí)即得到純的末端氨基的 PZIX。
實(shí)施例2:聚(Z-賴氨酸)-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合成 將末端氨基的聚(Z-賴氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤 過的安瓶內(nèi)，用氮?dú)鈸Q氣三次，密封后用注射器加入DMF (2wt%)，攪拌 下在30°C油浴中反應(yīng)24h，之后處理過程如實(shí)施例1所示。 實(shí)施例3: PZLL-b-PPA的脫保護(hù)
PZLL如PPA的脫保護(hù)是用溴化氫來實(shí)現(xiàn)的。PZLL-b-PPA溶于三氟乙 酸(0.04g/ml)中，再通入溴化氫氣體，鼓泡反應(yīng)30分鐘，繼續(xù)冰浴攪拌 反應(yīng)12小時(shí)，用過量乙醚沉降，得到脫保護(hù)后的產(chǎn)物。40°C下真空干燥 24小時(shí)即得到聚賴氨酸-聚苯丙氨酸(PLL-b-PPA)，其核磁氫譜見附圖4。
實(shí)施例4:載有CO保護(hù)的血紅蛋白的囊泡的制備方法，步驟如下
(1) 500mg血紅蛋白溶于250mlPBS緩沖溶液中，取100ml置于三 口瓶中，加入250 的L-Asc抗壞血酸溶液(0.1 mo1/1的PBS溶液)，緩慢 攪拌下在液面上方通過一氧化碳?xì)饬?，持續(xù)大約2h左右，至紫外檢測550 nm左右的峰不再變化為止，得到鮮紅色的CO保護(hù)血紅蛋白溶液(CO-Hb)。
(2) 先取CO-Hb溶液(2mg/mlPBS， pH5.8) 1 ml，加入2.5mg的 聚合物，攪拌12h。整個(gè)過程中體系需用氮?dú)獗Ｗo(hù)。結(jié)束后將此混合溶液以 10000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，并用PBS溶液洗滌數(shù)次，每次洗滌后取上層清 液用紫外光譜掃描，至洗出液在400 600nm無吸收峰為止。將離心下來的 囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例5:端氨基聚(N-芐氧羰基賴氨酸)(PZLL)的合成 將2.0g的N-節(jié)氧羰基賴氨酸NCA放入用火焰烘烤過的安瓶內(nèi)，用氮 氣換氣三次，密封后用注射器加入60ml二氯甲烷，溶解之后，按比例加入正己胺的二氯甲垸溶液，攪拌下在40。C油浴中反應(yīng)120h。反應(yīng)物用過量的 乙醚沉降后，得到透明粘性的PZLL，將此粘性物質(zhì)重新溶解在氯仿中， 用過量的乙醚沉降，得白色固體。40。C下真空干燥24小時(shí)即得到純的末端 氨基的PZLL。
實(shí)施例6:聚(Z-賴氨酸)-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合成 將末端氨基的聚(Z-賴氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤 過的安瓶內(nèi)，用氮?dú)鈸Q氣三次，密封后用注射器加入二氯甲烷(10wt%)， 攪拌下在40°C油浴中反應(yīng)72h。反應(yīng)物用過量的乙醚沉降后，得到 PZLL-b-PPA，將此粘性物質(zhì)重新溶解在氯仿中，用過量的乙醚沉降，得白 色固體。40°C下真空干燥24小時(shí)即得到純的末端氨基的PZLL-b-PPA。 實(shí)施例7: PZLL-b-PPA的脫保護(hù)
PZLL-b-PPA溶于二氧六環(huán)(0.2g/ml)中，再通入溴化氫氣體，鼓泡反 應(yīng)10分鐘，繼續(xù)冰浴攪拌反應(yīng)l小時(shí)，用過量乙醚沉降，得到脫保護(hù)后的 產(chǎn)物。40。C下真空干燥24小時(shí)即得到聚賴氨酸-聚苯丙氨酸(PLL-b-PPA)。
實(shí)施例8:載有CO保護(hù)的血紅蛋白的囊泡的制備方法，步驟如下
(1) 500mg血紅蛋白溶于100mlPBS緩沖溶液中，取100ml置于三 口瓶中，加入250 ^的L-Asc抗壞血酸溶液(0.5 mo1/1的PBS溶液)，緩慢 攪拌下在液面上方通過一氧化碳?xì)饬?，持續(xù)大約4h左右，至紫外檢測550 nm左右的峰不再變化為止，得到鮮紅色的CO保護(hù)血紅蛋白溶液(CO-Hb)。
(2) 先取CO-Hb溶液(5mg/mlPBS， pH6.8) 1 ml，加入2.0mg的 聚合物，攪拌24h。整個(gè)過程中體系需用氮?dú)獗Ｗo(hù)。結(jié)束后將此混合溶液以 12000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，并用PBS溶液洗滌數(shù)次，每次洗滌后取上層清 液用紫外光譜掃描，至洗出液在400 600nm無吸收峰為止。將離心下來的 囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例9:端氨基聚(N-芐氧羰基賴氨酸)(PZLL)的合成
將2.0g的N-芐氧羰基賴氨酸NCA放入用火焰烘烤過的安瓶內(nèi)，用氮?dú)鈸Q氣三次，密封后用注射器加入40ml 二氧六環(huán)，溶解之后，按比例加入 正己胺的二氧六環(huán)溶液，攪拌下在25°C油浴中反應(yīng)24h。反應(yīng)物用過量的 乙醚沉降后，得到PZLL，將此粘性物質(zhì)重新溶解在氯仿中，用過量的乙 醚沉降，得白色固體。40°C下真空干燥24小時(shí)即得到純的末端氨基的 PZIX。
實(shí)施例10:聚(Z-賴氨酸)-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合
成
將末端氨基的聚(Z-賴氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤 過的安瓶內(nèi)，用氮?dú)鈸Q氣三次，密封后用注射器加入二氧六環(huán)(5wt%)，攪 拌下在25°C油浴中反應(yīng)12h。反應(yīng)物用過量的乙醚沉降后，得到 PZLL-b-PPA，將此粘性物質(zhì)重新溶解在氯仿中，用過量的乙醚沉降，得白 色固體。40°C下真空干燥24小時(shí)即得到純的末端氨基的PZLL-b-PPA。
實(shí)施例ll: PZLL-b-PPA的脫保護(hù)
PZLL-b-PPA溶于三氟乙酸(0.02g/ml)中，再通入溴化氫氣體，鼓泡 反應(yīng)20分鐘，繼續(xù)冰浴攪拌反應(yīng)6小時(shí)，用過量乙醚沉降，得到脫保護(hù)后 的產(chǎn)物。40°C下真空干燥24小時(shí)即得到聚賴氨酸-聚苯丙氨酸 (PLL-b-PPA)。
實(shí)施例12:載有CO保護(hù)的血紅蛋白的囊泡的制備方法，步驟如下
(1) 500mg血紅蛋白溶于500mlPBS緩沖溶液中，取100ml置于三 口瓶中，加入250 的L-Asc抗壞血酸溶液(0.05 mol/1的PBS溶液)，向 液體底部通入一氧化碳?xì)饬鳎呐莘磻?yīng)2h左右，至紫外檢測550 nm左右 的峰不再變化為止，得到鮮紅色的CO保護(hù)血紅蛋白溶液(CO-Hb)。
(2) 先取CO-Hb溶液(2mg/mlPBS， pH5.8) 1 ml，加入lmg的聚 合物，攪拌18h。整個(gè)過程中體系用氮?dú)獗Ｗo(hù)。結(jié)束后將此混合溶液以 10000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，并用PBS溶液洗滌數(shù)次，每次洗滌后取上層清 液用紫外光譜掃描，至洗出液在400 600nm無吸收峰為止。將離心下來的囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例13:反應(yīng)條件同實(shí)施例1、 2、 3和4,但實(shí)施例1、 2中所用的
溶劑改為二甲亞砜。
實(shí)施例14:反應(yīng)過程同實(shí)施例1、 2、 3和4,但實(shí)施例4中溶解血紅蛋 白所用的磷酸緩沖液的pH值為3.8。
權(quán)利要求
1、載有血紅蛋白的聚肽囊泡，其特征在于，其為一種載有血紅蛋白的可生物降解的兩親性嵌段共聚肽囊泡；該囊泡的內(nèi)部水相中含有CO保護(hù)的血紅蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚賴氨酸-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽構(gòu)成；其中聚賴氨酸段的分子量在5000～10000范圍，聚苯丙氨酸段的分子量在800～2000范圍，囊泡的直徑大小在0.5～10μm范圍，血紅蛋白在囊泡中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10～50％。
2、 如權(quán)利要求l所述的載有血紅蛋白的聚肽囊泡的制備方法，其步驟 和條件如下1) 合成端氨基的聚(N-芐氧羰基賴氨酸)以正己胺為引發(fā)劑，引發(fā)N-芐氧羰基賴氨酸N-羰基羧酸酐開環(huán)聚合得 到聚(N-芐氧羰基賴氨酸)，所用的聚合溶劑為甲苯、氯仿、二氯甲烷、四 氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)，其用量是N-芐氧羰基 賴氨酸N-羰基羧酸酐單體質(zhì)量的5 30倍，反應(yīng)24 120小時(shí)，聚合溫度為 25~40。C;2) 合成聚(N-節(jié)氧羰基賴氨酸)和聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物 以端氨基的聚(N-芐氧羰基賴氨酸)為引發(fā)劑，引發(fā)苯丙氨酸N-羰基羧酸酐開環(huán)聚合得到目標(biāo)物；所用聚合溶劑為甲苯、氯仿、二氯甲烷、四 氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)，其用量是聚(N-芐氧 羰基賴氨酸)和苯丙氨酸N-羰基羧酸酐單體總質(zhì)量的10 50倍，反應(yīng)12 72 小時(shí)，聚合溫度為25 40。C;3) 將側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽脫保護(hù)得到聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩 嵌段共聚物將含側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽溶于四氫呋喃、二氧六環(huán)、三氟乙酸、 硝基甲烷、苯、二氧化硫或它們的混合溶劑中，側(cè)基保護(hù)的兩嵌段共聚肽的質(zhì)量濃度為2 20%，通入溴化氫氣體，鼓泡反應(yīng)10~30分鐘，繼續(xù)冰浴 攪拌反應(yīng)1 12小時(shí)，然后用乙醚沉降，過濾，真空干燥，得到聚賴氨酸和 聚苯丙氨酸的兩嵌段共聚物；4)在緩沖溶液中用得到的聚賴氨酸和聚苯丙氨酸的兩嵌段兩嵌段共聚 肽形成的囊泡包裹CO保護(hù)的血紅蛋白，形成載有血紅蛋白的囊泡，其具體 步驟是① 將血紅蛋白溶于pH值為6.8~4.0的PBS緩沖溶液中，濃度1~5 mg/ml;② 取上述血紅蛋白溶液，置于三口容器中，加入摩爾濃度為0.05 0.5 mol/1的抗壞血酸(L-Asc)/PBS溶液，使抗壞血酸與血紅蛋白的摩爾比為 4~20;③ 在攪拌條件下，在液面上方通過一氧化碳?xì)饬鳎蛘咧苯釉谌芤褐?通CO氣體鼓泡，持續(xù)1 4小時(shí)，待紫外檢測550nm左右的峰不再變化為 止，得到鮮紅色的CO保護(hù)血紅蛋白(CO-Hb)溶液； 取CO-Hb溶液，濃度為l 5mg/ml，將pH值調(diào)到6.8~4.0，再加入 所述的兩嵌段共聚肽，該兩嵌段共聚肽的質(zhì)量為溶液中CO-Hb質(zhì)量的0.5~2 倍，攪拌12-24小時(shí)，整個(gè)過程中體系用氮?dú)獗Ｗo(hù)；⑤將步驟④的得到的溶液離心分離，離心轉(zhuǎn)速5000~10000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間 5~30分鐘，并用PBS溶液洗滌，洗滌后取上層清液用紫外光譜掃描，至洗 出液在400~600 nm無吸收峰為止，將離心下來的膠束仍分散于PBS溶液中 避光保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供一種載有血紅蛋白的聚肽囊泡及其制備方法。該囊泡中包裹有血紅蛋白，囊泡的壁由聚賴氨酸-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽構(gòu)成。首先以正己胺為引發(fā)劑，進(jìn)行N-芐氧羰基(Z)賴氨酸N-羰基羧酸酐的開環(huán)聚合得到聚(Z-賴氨酸)，接著用聚(Z-賴氨酸)的端氨基引發(fā)苯丙氨酸N-羰基羧酸酐開環(huán)聚合得到聚(Z-賴氨酸)-聚苯丙氨酸，將其脫保護(hù)后，在水溶液中進(jìn)行自組裝形成囊泡并包裹血紅蛋白，得到載有血紅蛋白的囊泡。由于該囊泡是由兩親性嵌段共聚肽在水溶液中直接組裝形成的，不需要使用有機(jī)溶劑，較好地保持了血紅蛋白的生物活性。
文檔編號A61K47/42GK101433718SQ20081005161
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者靜 孫, 景遐斌, 全 石, 陳學(xué)思, 黃宇彬 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所