專利名稱：：建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的建立方法，用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究及防治藥物篩選及評(píng)價(jià)；用于肺瘤發(fā)生的免疫機(jī)制研究及免疫治療靶點(diǎn)的篩選。用于輻射誘導(dǎo)免疫功能紊亂機(jī)制或輻射調(diào)節(jié)免疫功能的研究。
背景技術(shù)：
：白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚病，臨床表現(xiàn)為局部皮膚白斑，一旦發(fā)病，治愈率低且易遷延進(jìn)展，給患者造成很大的身心壓力。白癜風(fēng)的病理改變主要是產(chǎn)生皮膚黑色素的黑色素細(xì)胞受到損傷。導(dǎo)致白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞破壞的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未闡明。病因非常復(fù)雜，與生化改變、神經(jīng)因素、自由基防護(hù)平衡機(jī)制紊亂以及黑色素細(xì)胞不明營(yíng)養(yǎng)物缺乏；黑色素細(xì)胞黏附缺陷以及遺傳因素等有密切的關(guān)系。目前得到業(yè)界人士普遍認(rèn)同的是免疫機(jī)制。臨床觀察發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)有時(shí)常伴有其他自身免疫性疾病，提示了白癜風(fēng)的免疫病理機(jī)制。有些研究提示白癜風(fēng)患者血清中可檢測(cè)到抗黑色素細(xì)胞及其黑色素提蛋白的自身抗體，但更多的研究提示白癜風(fēng)系細(xì)胞免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病。自身抗原的處理及呈遞的過程還不是很清楚。在多項(xiàng)研究中被證實(shí)，黑色素細(xì)胞許多與合成黑色素有關(guān)的蛋白，如酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1和-2(TRP-1及TRP-2)及黑色素體結(jié)構(gòu)蛋白MARTl/Melan-A,Pmel17/gp100andgp75等，屬細(xì)胞內(nèi)蛋白，由I型MHC在細(xì)胞表面表達(dá)，極有可能被抗原特異性008+T細(xì)胞識(shí)別。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)可能介導(dǎo)黑色素細(xì)胞死亡。另外調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)平衡紊亂，白癜風(fēng)患者出現(xiàn)CD4+CD25+細(xì)胞升高，提示免疫耐受失調(diào)可能是白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制之一。生化異常變化最終也是與誘導(dǎo)免疫改變有關(guān)。白癜風(fēng)生化異常主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面(l)血尿中兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物升高；(2)抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，表皮內(nèi)高水平的過氧化氫。高水平的過氧化氫使酪氨酸及其他單酚類發(fā)生羥化反應(yīng)生成相應(yīng)的兒茶酚類，進(jìn)一步氧化成為苯醌。苯醌的長(zhǎng)時(shí)間堆積后可作用于酪氨酸酶使后者形成半抗原，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。由于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制不清，在臨床上易于診斷但治療比較困難。建立簡(jiǎn)便、可靠的發(fā)病模型對(duì)于研究白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理及治療靶點(diǎn)具有重要的理論意義和實(shí)際意義。目前與白癜風(fēng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有(1)Smythline(SL)雞SL雞是人類自身免疫性白癜風(fēng)的動(dòng)物模型，由美國(guó)麻薩諸塞州大學(xué)Smyth教授在20世紀(jì)70年代創(chuàng)立。這一模型在疾病病理的許多方面特別是在免疫學(xué)方面與人類的白癜風(fēng)極為相似。(2)C57BL/6JLer-vit/vitC57BL小鼠毛色為黑色。其亞系有C57BL/6,C57BL/6J,C57BL/IO等。較易誘發(fā)免疫耐受性，小鼠B16黑素瘤細(xì)胞系起源于C57BL/6小鼠。C57BL/6JLer-vit/vit小鼠是C57BL/6J的同源突變系，是白癜風(fēng)的鼠模型。由美國(guó)耶魯大學(xué)的Lerner教授建立。C57BL小鼠的應(yīng)用范圍較廣，與白癜風(fēng)相關(guān)的研究主要有毛囊黑素細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)與白癜風(fēng)復(fù)色的研究，抗腫瘤免疫和抗腫瘤生物治療與黑素瘤相關(guān)性白癜風(fēng)的研究以及鼠白癜風(fēng)的遺傳等。(3)豚鼠遠(yuǎn)交群豚鼠，按其毛色分可有白色、黃褐色、黑色等。其中黃褐色豚鼠表皮中有適量的對(duì)UVB和PUVA敏感的功能性黑素細(xì)胞，經(jīng)紫外線照射后的皮膚可產(chǎn)生清晰可見的色素沉著過度，表皮中多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)量較未照射部位增加3~4倍，黑素細(xì)胞樹突增加。這一現(xiàn)象和過程類似于人類紫外線誘導(dǎo)的色素沉著，特別是黃種人的曬黑現(xiàn)象。因此，這一模型常用于研究紫外線誘導(dǎo)的色素沉著和白癜風(fēng)治療中的補(bǔ)骨脂素光化學(xué)療法以及用于酪氨酸酶抑制劑和防曬劑的藥效學(xué)研究；(4)化學(xué)脫色模型國(guó)內(nèi)安徽中醫(yī)學(xué)院龍子江教授利用氫醌或過氧化氫等化學(xué)物進(jìn)行局部脫色制備了豚鼠白癜風(fēng)模型。IRM-2小鼠是用ICR/JCL小鼠、615小鼠進(jìn)行雜交，按修飾單線培育出的近交系小鼠。IRM-2小鼠對(duì)電離輻射具有較強(qiáng)的耐受性，自發(fā)腫瘤發(fā)生率低。但是對(duì)多種小鼠接種腫瘤細(xì)胞易感，如肺腺癌T795、Lewis肺癌、乳腺癌TA2、肝癌HepA、白血病L1210、宮頸癌U14、肉瘤S180、LM淋巴癌、B16黑色素瘤、H22肝癌。在進(jìn)行輻射敏感性實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)輻射暴露后的1詣-2小鼠易出現(xiàn)毛發(fā)脫色。本發(fā)明人通過深入的研究和大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IRM-2小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4/CD8比值降低，與臨床白癜風(fēng)患者改變類似。為此，為探討白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)理研究及藥物開發(fā)建立合適的白癜風(fēng)動(dòng)物模型，本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)室開展了多方面的試驗(yàn)，觀察IRM-2小鼠輻射暴露誘導(dǎo)白癜風(fēng)的發(fā)生及其機(jī)制。目前關(guān)于IRM-2小鼠輻射暴露誘導(dǎo)白癜風(fēng)動(dòng)物模型的建立方法，迄今尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)同類文獻(xiàn)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是利用我單位培育的純系IRM-2小鼠，建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)的小鼠模型，用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究及防治藥物篩選及評(píng)價(jià)；用于腫瘤發(fā)生的免疫機(jī)制研究及免疫治療靶點(diǎn)的篩選。用于輻射誘導(dǎo)免疫功能紊亂機(jī)制或輻射調(diào)節(jié)免疫功能的研究。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法，包括以下步驟一種建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法，包括以下步驟(1)選擇純系IRM-2小鼠分組，使其在全身Y射線照射下出現(xiàn)毛發(fā)色素脫失。(2)單次全身照射后觀察10周，優(yōu)選記錄不同照射劑量下毛發(fā)脫色的發(fā)生率、發(fā)生時(shí)間、發(fā)病的嚴(yán)重程度。(3)建立以輻射誘導(dǎo)IRM-2小鼠毛發(fā)脫色為特征的小鼠模型。本發(fā)明所述的輻射包括電離輻射和非電離輻射。其中的電離輻射指的是oc粒子、P粒子、質(zhì)子、中子以及X射線、Y射線；非電離輻射指的是可見光、紅外線、紫外線、電磁輻射等。本發(fā)明優(yōu)選指的是137CsY射線照射，照射劑量為l-6格瑞(gray，Gy),單次全身照射。本發(fā)明所述的選擇純系irm-2小鼠分組是指將irm-2小鼠分為七組，雌雄兼有，每組7-9只，分為0(對(duì)照組)，1，2，3，4，5,6Gy組。劑量分組將照射同一劑量的兩種小鼠一同進(jìn)行全身137Csy射線照射4-8周，照射后分組飼養(yǎng)并長(zhǎng)期觀察；定時(shí)觀察皮膚脫色情況，做積分紀(jì)錄。本發(fā)明所述的輻射誘導(dǎo)irm-2小鼠白癜風(fēng)模型是采用前述公開的方法獲得。本發(fā)明更進(jìn)一步公開了輻射誘導(dǎo)irm-2小鼠白癜風(fēng)模型的應(yīng)用。包括輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究及防治藥物篩選及評(píng)價(jià)；用于腫瘤發(fā)生的免疫機(jī)制研究及免疫治療乾點(diǎn)的篩選；用于輻射誘導(dǎo)免疫功能紊亂機(jī)制或輻射調(diào)節(jié)免疫功能的研究；用于輻射誘導(dǎo)其他自身免疫性疾病模型的參考；用于其他化學(xué)藥物誘導(dǎo)皮膚脫色模型。本發(fā)明輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型與現(xiàn)有的各種白癜風(fēng)模型相比所具有的積極效果在于(1)本發(fā)明選用的irm-2,具有在全身照射下易于出現(xiàn)毛發(fā)色素脫失的特性；輻射誘導(dǎo)的IRM-2小鼠白癜風(fēng)出現(xiàn)早，照射劑量低，更符合擬人體一般機(jī)能狀態(tài)；只需單次y射線全身照射即可成模型，方法筒便。也可擴(kuò)展不同的方案建立模型；并且可以根據(jù)試驗(yàn)的需要選擇不同照射劑量。(2)本發(fā)明選用的irm-2小鼠繁殖率高，生長(zhǎng)快，抵抗力強(qiáng)，作為輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)的動(dòng)物模型具有造價(jià)低廉，易于在研究和應(yīng)用中推廣使用的特點(diǎn)。(3)本發(fā)明建立的irm-2小鼠白癜風(fēng)模型為研究輻射損傷免疫細(xì)胞機(jī)制及白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)理提供了線索，也為治療白瘢風(fēng)藥物的開發(fā)和評(píng)價(jià)提供了客觀標(biāo)準(zhǔn)。(4)本發(fā)明的模型具有制備簡(jiǎn)單、病變出現(xiàn)時(shí)間早，發(fā)生率高，輻射劑量低等特點(diǎn)，同時(shí)也為開發(fā)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，篩選新藥奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所建立的I脂-2小鼠白癜風(fēng)模型屬于易感模型。因此，對(duì)于化學(xué)毒物或某些免疫抑制病毒誘導(dǎo)引起免疫細(xì)胞損傷，皮膚色素脫失的白癜風(fēng)同樣具有指導(dǎo)意義。同時(shí)采用本發(fā)明所建立的IRM-2小鼠白癜風(fēng)模型也可以進(jìn)行化學(xué)毒物或某些免疫抑制病毒誘導(dǎo)引起免疫細(xì)胞損傷白癜風(fēng)藥物的藥理研究及白癜風(fēng)新藥的篩選。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明動(dòng)物模型構(gòu)建方法及作為模型進(jìn)行機(jī)制探討的描述加以進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)?zāi)康母鶕?jù)以往實(shí)驗(yàn)觀察，探討輻射暴露誘導(dǎo)IRM-2小鼠建立白癜風(fēng)小鼠模型。實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，購(gòu)自維通利華，批準(zhǔn)號(hào)SCXK(京)2007-0001;IRM-2小鼠來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院放射醫(yī)學(xué)研究所，批準(zhǔn)號(hào)SCXK(津)2005-00019。I詣-2小鼠是用ICR/JCL小鼠、615小鼠進(jìn)行雜交，按修飾單線培育出的近交系小鼠，對(duì)外有銷售。其中的ICR/JCL小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，615小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。2.試劑K3EDTA購(gòu)自Sigma;CD4、CD8、CD25、B220、NK1.1購(gòu)自eBioscience公司。CDllc及LysingBuffer購(gòu)自BDPharmingen公司。celltiter-Gl(^試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；曱基纖維素培養(yǎng)基(MethoCult⑧GFM3534)，StemCellTechnologies,超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。3.實(shí)驗(yàn)儀器137Csv射線照射源加拿大原子能有限公司，USD型，Autocell140，劑量率0.79Gy/min。倒置顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠；CoulterAltra流式細(xì)胞儀美國(guó)Beckman;GloMax^^發(fā)光檢測(cè)儀美國(guó)Promega。實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)分組及照射本實(shí)驗(yàn)將小鼠分為七組，雌雄兼有，每組7-9只。分為對(duì)照組，1，2，3,4，5，6Gy組。按照劑量分組將照射同一劑量的兩種小鼠一同進(jìn)行全身照射，照射后分組飼養(yǎng)并長(zhǎng)期觀察皮膚脫色情況及進(jìn)行積分紀(jì)錄。2.皮膚脫色觀察及積分紀(jì)錄方法照射后定時(shí)觀察皮膚脫色情況。出現(xiàn)脫色后，每周觀察皮膚脫色情況，并由兩人分別進(jìn)行積分記錄。小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分毛發(fā)無脫色；l分毛發(fā)有脫色；2分毛發(fā)脫色面積>10%;3分毛發(fā)脫色面積>25%;4分毛發(fā)脫色面積>50%;5分毛發(fā)脫色面積>75%。3.病理取材及固定方法照射后觀察10w取材。小鼠處死后，對(duì)皮膚病損照相。3.l.皮膚固定用8。/。Na2S小鼠脫毛，在脫色與未脫色交界處，切取寬度約1.5cm的長(zhǎng)方形皮膚。取下皮膚后將皮膚展開貼在濾紙上，中性福爾馬林固定。3.2.剝離小鼠腎臟與脾臟，稱重后，中性福爾馬林固定。4.免疫學(xué)測(cè)定方法4.1取材小鼠摘取眼球取血，K3EDTA抗凝。4.2.染色取50ul抗凝血加入到lml血細(xì)胞裂解液中，震蕩混勻后，避光放置15min。用含1%血清的PBS溶液洗涂?jī)纱魏髼壢ド锨澹尤?00ulPBS懸起細(xì)胞，加入相應(yīng)的抗體，混勻后，避光孵育15min，中間混勻一次。最后加入400ul的PBS，混勻過濾，進(jìn)4亍流式細(xì)胞檢測(cè)。使用EXP032軟件進(jìn)行檢測(cè)與用配套的EXP032Analysis軟件進(jìn)行分析。4.3.結(jié)果處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理5.氧化損傷指標(biāo)測(cè)定小鼠摘取眼球取血，制備血清，按廠家提供方法測(cè)定小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定。6.股骨有核細(xì)胞計(jì)數(shù)無菌取小鼠股骨，沖洗骨髓細(xì)胞，混勻后過濾，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)數(shù)結(jié)果以每根股骨有核細(xì)胞數(shù)表示。7.集落形成(克隆)能力測(cè)定分裝曱基纖維素培養(yǎng)基，-201C保存。用前置于2-8'C冰箱內(nèi)或室溫下解凍；分離小鼠骨髓細(xì)胞，胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度加入M3534，振蕩器充分混勻，靜置待氣泡消失，用3ml注射器連接16#平頭注射器針頭，加入24孔板放入濕盒，置入37X:,5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。集落形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)。從培養(yǎng)第5天開始在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)>30為陽性集落，集落形成率以每105個(gè)細(xì)胞形成的集落數(shù)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論(1)輻射誘導(dǎo)IRM-2小鼠毛發(fā)脫色發(fā)生率在照射4周后，IRM-2雄性小鼠照射6Gy組全部出現(xiàn)皮膚色素脫失性病變，IRM-2雌性小鼠與C57雄性小鼠均未出現(xiàn)。照射8周后，IRM-2雄性小鼠照射3-6Gy均出現(xiàn)白癜風(fēng)皮膚色素脫失，3Gy組發(fā)病率為25%,4Gy組發(fā)病率為75%，5-6Gy組均為100%。IRM-2雌性小鼠照射4-6Gy出現(xiàn)了白癜風(fēng)，發(fā)病率均與IRM-2雄性同劑量照射組一致。而C57雄性小鼠僅在照射5Gy和6Gy出現(xiàn)白癜風(fēng)，5Gy組發(fā)病率為33%,6Gy組發(fā)病率為100%。照射10周后小鼠的毛發(fā)脫色發(fā)生率與8周相似。以上結(jié)果顯示IRM-2小鼠接受照射可以出現(xiàn)皮膚脫色病變，與對(duì)照組C57BL/6小鼠比較，照射誘導(dǎo)毛發(fā)脫色的劑量低，發(fā)生率呈劑量依賴性。表1照射8周后小鼠的發(fā)病率照射劑量IRM-2雄性IRM-2雌性C57雄性3Gy25004Gy757505Gy100100336Gy100100100(2)不同劑量輻射誘導(dǎo)小鼠照射后毛發(fā)脫色出現(xiàn)時(shí)間觀察不同照射劑量小鼠出現(xiàn)病變的最早時(shí)間，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，IRM-2小鼠病變出現(xiàn)早。并且照射劑量越高，毛發(fā)脫色出現(xiàn)的時(shí)間越早。表2不同劑量輻射誘導(dǎo)小鼠毛發(fā)脫色出現(xiàn)時(shí)間照射劑量IRM-2雄性IRM-2雌性C57雄性3Gy57614Gy35355Gy3535576Gy283542(3)不同劑量輻射誘導(dǎo)小鼠照射后毛發(fā)脫色面積照射4周后僅有I詣-2雄性6Gy照射組脫色，脫色面積得分為1.00±0.00。照射8周后，各種小鼠脫色面積得分均呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見表2。I詣-2小鼠與C57小鼠比較差異有顯著性。表3照射8周后不同小鼠平均脫色面積照射劑量IRM-2雄性IRM-2雌性C57雄性3Gy0.25±0.500.000.004Gy1.50士1.000.75土0.500.005Gy2.25±0.962.25±0.960.33±0,586Gy4.75士0.504.50±0.582,67±0.58照射IO周后不同小鼠平均脫色面積增加，積分呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見表4。表4照射IO周后不同小鼠平均脫色面積照射劑量IRM-2雄性IRM-2雌性C57雄性3Gy0.25±0.500.50±0.580.004Gy1.00±0.820.75±0.500.005Gy3.00±0.823.00±1.411.33±2.316Gy5.00±0.004.50±0.583.67±0.58以上結(jié)果表明，IRM-2小鼠輻射暴露后易于出現(xiàn)皮膚脫色性病變，與C57比較誘發(fā)病損出現(xiàn)率高，病損出現(xiàn)早，并且病變程度呈劑量反應(yīng)關(guān)系，由此獲得類似于人皮膚色素脫失(白癜風(fēng))的模型。因此，可利用輻射誘導(dǎo)IRM-2小鼠毛發(fā)脫色的特征作為誘導(dǎo)性白癜風(fēng)模型，用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的探討以及防治藥物的開發(fā)。并提供作為探討其他自身免疫性疾病模型的可能性。實(shí)施例2輻射誘發(fā)白癜風(fēng)小鼠免疫學(xué)機(jī)制探討，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同上。1.健康小鼠外周血免疫細(xì)胞分型采集小鼠外周血進(jìn)行免疫細(xì)胞分型流式細(xì)胞分析，結(jié)果見表4。通過檢測(cè)CD4、CD8、CD25、Dllb、NKl.l，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRM-2小鼠與C57小鼠比較，CD4以及CD4/CD8有一定的差別，表現(xiàn)為IRM-2小鼠的CD4/CD8低于C57小鼠。而CDllb則是IRM-2小鼠高于C57小鼠。CD25及NK1.1兩種小鼠未見明顯區(qū)別。兩種小鼠免疫細(xì)胞分型的差異意義有待于進(jìn)一步探討。表5鍵<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.輻射暴露小鼠外周血免疫細(xì)胞分型進(jìn)行輻射暴露后IO周采血進(jìn)行小鼠T淋巴細(xì)胞亞群觀察，發(fā)現(xiàn)IRM-2CD4、CD8隨照射劑量升高，有下降趨勢(shì)，CD4/CD8有升高趨勢(shì)，提示CD4和CD8在輻射照射后損傷及恢復(fù)的程度不同。表6輻射暴露后小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞型照射劑量<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>018.7±3.1616.l土l.1320.8±1.5014.1±1.140.卯±0.801.17±0.02113.8土3.3214-3土0-9121.6土0.787.75±1.480.74土0.101.89±0.43217.8±0.5717.2±1.7016.9±0.9913.03土2,371.03±0.081.37±0.20415.4土1.6914.2土0.1513.7±5.898.93土2.481.58土0.522-53±1.16613.5±3.0312.8±0.4911.1±3.9612.97±0.671.27±0.340.90±0.13檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射引起暴露小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD25/CD4升并呈劑量依賴趨勢(shì)。兩組小鼠未見明顯差異。結(jié)果見表7。表7輻射暴露后小鼠外周血CD25測(cè)定照射劑量CD4CD25CD25/CD4(Gy)IRM曙2C57IRM-2C57mM-2C57018.7±3.1616.10±1.131.IO士O.561.40±0.720.90土0.801.87±1.46113.8±3.3214.33土0.910.87±0.250,87土0,151.40±0.360.77±0.31217.8±0.5717.23±1.701.卯±0.142.13±0,813.15±0.071.97±1.29415.4±1.6914.17±0.152.58±1,241,60±0.565.20土1.472.53土1.16613.5±3.0312.77±0.496.68±2.904.50土2.093.94土0.535.50±0.57檢測(cè)小鼠外周血B細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)照射后小鼠B220比對(duì)照組升高，提示可能是T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)降低。反映DC及NK細(xì)胞表型未見明顯差異。結(jié)果見表8。表8輻射暴露后小鼠外周血免疫細(xì)胞表型變化照射劑量B220CDllc(Gy)IRM-2C57IRM曙2C57IRM陽2C57038.03±12.7751.63土2.901.20±0.101.27±0.310.87土0.151,17±0.15140,55土2.1952.77±9.500.70±0.530.90±0.780.57±0.060.67±0.32245.50土5.6662.07±3,051.IO土O.710.87±0.12l.OO土O.281.67±0.61453.97±4.4368.03±1.501.35土0.610.53±0.510.70土0.180.67±0.32648.53±12.8353.93±1,403,22土1,501.97±0.763.12±1.682.卯±0.833.輻射暴露小鼠造血免疫細(xì)胞從表8可以看出，輻射暴露10周后的小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，與對(duì)照組未見明顯差異(見表9)。但骨髓細(xì)胞增殖功能受到抑制，并且呈劑量依賴性。IRM-2小鼠骨髓細(xì)胞增殖活力高于對(duì)照C57小鼠(P〈0.05~0.01)，輻射對(duì)骨髓增殖活性抑制程度低于C57小鼠(結(jié)果見表10)。表9輻射暴露后小鼠造血免疫細(xì)胞<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>重要臟器如胸腺、脾臟、肺和腎臟重量照射組小鼠與對(duì)照組小鼠未見明顯差異。結(jié)果見表11及表12。表ll輻射暴露后小鼠免疫臟器指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>42.70±0.402.38±0.100.87±0.361.37±0.10G2.85±0.362.03±0.050.71±0.301.20±0.19表12輻射暴露后小鼠臟器指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)選擇了亞致死劑量l~6Gy照射，測(cè)定時(shí)間為受照后10周。從臟器重量及骨髓、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果來看，兩組小鼠及照射組與對(duì)照組沒有顯著差異，但骨髓細(xì)胞增殖功能仍受到不同程度的抑制，IRM-1骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)高，照射后抑制率低，與其輻射抗性特性一致。外周血淋巴細(xì)胞分型結(jié)杲發(fā)現(xiàn)，與C57小鼠比較，IRM-2小鼠CD/CD8比值較高，差異有顯著性。CD25/CD4也略高。全身照射后IRM-2的CD4/CD8比值呈升高趨勢(shì)，這種差異可能與IRM-2某些生物學(xué)特性有關(guān)。CD25/CD4雙陽性細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一種。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells,Treg細(xì)胞)通過"主動(dòng)"的方式抑制免疫系統(tǒng)對(duì)自身和外來抗原的應(yīng)答，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有非常重要的作用。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨照射劑量增加l~6Gy，CD25/CD4細(xì)胞比例升高，但兩種小鼠未見明顯區(qū)別。這些結(jié)果提示本項(xiàng)研究選擇的不同劑量照射后，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)，雖然臟器未見明顯損傷但免疫細(xì)胞之間的平衡出現(xiàn)了變化，可能與導(dǎo)致某些自身免疫性樣疾病發(fā)生有關(guān)。建立IRM-2小鼠白癜風(fēng)4莫型為研究輻射損傷免疫細(xì)胞機(jī)制及白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)理提供了線索，也為治療藥物開發(fā)和評(píng)價(jià)提供了客觀標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3輻射誘導(dǎo)皮膚脫色性病變過氧化損傷機(jī)制的探討IRM-2小鼠與C57小鼠照射后1周，取外周血，制備血清，測(cè)定S0D活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未照射組IRM-2低于C57小鼠；照射后S0D活力下降，2Gy、4GylRM-2小鼠降低10%左右，而C57小鼠分別降低30%、40%。提示照射后IRM-2小鼠S0D活力較高。表13小鼠血清中CuZn-SOD活力(U/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法，包括以下步驟(1)選擇純系IRM-2小鼠，使其全身在γ射線照射下出現(xiàn)毛發(fā)色素脫失；(2)單次全身照射后觀察10周，記錄不同照射劑量下毛發(fā)脫色的發(fā)生率、發(fā)生時(shí)間、發(fā)病的嚴(yán)重程度；(3)建立以輻射誘導(dǎo)IRM-2小鼠毛發(fā)脫色為特征的小鼠模型。2、權(quán)利要求1所述建立輻射誘導(dǎo)白瘋風(fēng)小鼠模型的方法，其中的IRM-2小鼠是用ICR/JCL小鼠、615小鼠進(jìn)行雜交，按修飾單線培育出的近交系小鼠。3、權(quán)利要求1所述建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法，其中所述的輻射包括電離輻射或非電離輻射。4、權(quán)利要求1所述建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法，其中的單次全身照射，指的是l6Gy，137CsY射線單次全身照射。5、一種輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型，其特征在于由權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的建立方法獲得。6、一種權(quán)利要求5所定義的輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型，其特征在于白癜風(fēng)小鼠模型用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究及藥物篩選中的應(yīng)用。7、一種權(quán)利要求5所定義的輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型，其特征在于用于肺瘤發(fā)生的免疫機(jī)制及免疫治療靶點(diǎn)藥物篩選中的應(yīng)用。8、一種權(quán)利要求5所定義的輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型，其特征在于用于輻射誘導(dǎo)免疫功能紊亂機(jī)制或輻射調(diào)節(jié)免疫功能中的應(yīng)用。9、一種權(quán)利要求5所定義的輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型，其特征在于用于輻射誘導(dǎo)其他自身免疫性疾病模型中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種應(yīng)用不同劑量γ射線對(duì)IRM-2小鼠全身照射，建立輻射誘導(dǎo)白癜風(fēng)小鼠模型的方法。輻射誘導(dǎo)的白癜風(fēng)小鼠模型，主要用于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的探討以及防治藥物的開發(fā)；也可用于腫瘤發(fā)生的免疫機(jī)制研究及免疫治療靶點(diǎn)的篩選；還可用于輻射誘導(dǎo)免疫功能紊亂機(jī)制的研究。本發(fā)明的模型具有制備簡(jiǎn)單、病變出現(xiàn)時(shí)間早，發(fā)生率高，輻射劑量低等特點(diǎn)，同時(shí)也為開發(fā)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，篩選新藥奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)A61B19/00GK101288602SQ20081005346公開日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月10日優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日發(fā)明者吳紅英,孟愛民,張俊伶,李德冠,彥王,王月英,褚麗萍,璐路申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所