專利名稱：報(bào)告基因小鼠t細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及藥物篩選方法的建立的制作方法
報(bào)告基因小鼠T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及藥物篩選方法的
建立技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)中T細(xì)胞培養(yǎng)分化和藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域，更具體 地，本發(fā)明涉及熒光報(bào)告基因小鼠T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及其藥物篩選平臺(tái)的建立方 法，以及利用該方法篩選治療哮喘病的藥物。背景技術(shù)：
初始CD4+T細(xì)胞在不同的因子誘導(dǎo)下，分化成為功能及表型不同 的效應(yīng)性Th細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，并表達(dá)特定的細(xì)胞因子執(zhí)行其功能在IL-12 和anti-IL4作用下向Thl分化，產(chǎn)生IFN-Y等，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；在IL-4和 anti-IFN-y作用下向Th2分化，產(chǎn)生IL-4等，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；在IL-6和TGF-旦 作用下向Thl7分化，產(chǎn)生IL-17等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；在TGF-0作用下向Treg分化，產(chǎn)生 IL-10等，實(shí)行免疫抑制。T細(xì)胞亞群含量和比例及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子與各種疾病的發(fā)生密 切相關(guān)，過(guò)高或過(guò)低都有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。報(bào)告細(xì)胞因子的熒光報(bào)告基因小鼠是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，是在T細(xì)胞分化后產(chǎn)生 的特定細(xì)胞因子(例如Th2分化中IL-4)基因下游連接熒光蛋白編碼序列，使細(xì)胞因子的 產(chǎn)生可以被熒光蛋白報(bào)告，并能被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到的一種技術(shù)。傳統(tǒng)T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化途徑如下(1)脾細(xì)胞的分離與計(jì)數(shù)；(2)細(xì)胞的激活培養(yǎng)；(3)再刺激與抑制蛋白分泌；(4)表面染色與胞內(nèi)染色檢測(cè)分化；T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的形態(tài)學(xué)特征如附圖1所示。傳統(tǒng)T細(xì)胞培養(yǎng)分化一般需要4-5天，經(jīng)激活培養(yǎng)、再刺激、抑制蛋白分泌、胞內(nèi)染 色(此時(shí)產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子)等步驟檢測(cè)是否分化為T(mén)h細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，其 中再刺激、抑制蛋白分泌、胞內(nèi)染色等技術(shù)是鑒定初始CD4+T細(xì)胞是否分化以及分化成為何 種Th或Treg細(xì)胞的必要手段。要用到包被好Anti-mouse_CD3和Anti-mouse_CD28的培 養(yǎng)板，以及Golgi-plug、甲醛、Saponin來(lái)對(duì)細(xì)胞行固定打孔，還要使用熒光標(biāo)記的胞內(nèi)細(xì) 胞因子抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色。而此過(guò)程不僅使篩選藥物變得繁瑣耗時(shí)、增加成本費(fèi)用，也無(wú)法 實(shí)現(xiàn)高通量篩選。基本步驟如下1、超凈臺(tái)內(nèi)取哺乳動(dòng)物脾臟、淋巴結(jié)，用注射器針芯碾碎過(guò)200目金屬濾網(wǎng)，溶解 紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；2、96 孑L 包被板 Anti-mouse-CD3 (10 u g/ml)禾口 / 或 Anti-mouse_CD28 (1 u g/ml) 中，以2X106個(gè)細(xì)胞/mL密度、200iU每孔培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基內(nèi)，并加入抗體與細(xì)胞因子 刺激初始CD4+T細(xì)胞分化；3. 48h換液，視細(xì)胞密度轉(zhuǎn)孔，加入新鮮的IL-2 (2ng/mL)刺激1天；4. 72h轉(zhuǎn)到另外包被好的96孔板再刺激。37°C，2_4h ；5.加 Golgi-plug，37°C 2h ；6.收細(xì)胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-mouse-CD4或PE-Anti-mouse-CD4，200倍稀釋(即終濃度1 P g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；7. PBS洗去未結(jié)合的抗體，離心、棄上清；8.每管加2%甲醛(in PBS溶液)2mL，室溫固定30min ；9. PBS洗去甲醛，離心、棄上清；10.加入2mL配制好的0. 5% Saponin溶液，輕輕混勻，遮光室溫打孔30min ；11.離心、棄上清，加Saponin buffer 100 y L，胞內(nèi)染色遮光冰浴30min ；12. Saponin buffer 洗 2 遍，PBS 洗 1 遍；13.每管樣品重懸在0.5mL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)(表達(dá)某種細(xì)胞因子的 Tcell)/CD4+T cell 百分率。該種T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化方法存在的缺點(diǎn)是步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，難以應(yīng)用 于藥物高通量篩選。需要的成本較高，Anti-mouse-CD3, Anti-mouse_CD28，Golgi-plug, Saponin—般實(shí)驗(yàn)室難以獲得、且價(jià)格昂貴，并非所有實(shí)驗(yàn)室都有這個(gè)條件，繁瑣的步驟使 得每組數(shù)據(jù)的平行性很難控制，并且容易受制于胞內(nèi)染色技術(shù)不成熟，常常得不到好的結(jié)^ o
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，通過(guò)熒光報(bào)告基因小 鼠T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及篩選平臺(tái)的建立，提供一種省時(shí)高效、高通量完成與機(jī)體免 疫系統(tǒng)各種細(xì)胞因子相關(guān)的藥物的篩選方法。本發(fā)明提供的T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及藥物篩選方法，包括如下步驟第一、超凈臺(tái)內(nèi)取熒光報(bào)告基因哺乳動(dòng)物脾臟、淋巴結(jié)，浸于1640培養(yǎng)液中，用注 射器針芯碾碎過(guò)200目金屬濾網(wǎng)，溶解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；第二、96孔板中，以1 X 106—107個(gè)細(xì)胞/mL密度、200iU每孔培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基 內(nèi)；第三、將第二步的96孔板分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并與第四步同時(shí)刻或早于第四步 向?qū)嶒?yàn)組加入待篩選藥物，向?qū)φ战M加入待篩選藥物中使用的溶劑DMS0或H20 ；第四、向第二步的96孔板中加入抗體與細(xì)胞因子刺激初始CD4+T細(xì)胞分化；第五、48h收取96孔板中細(xì)胞，行CD4表面染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光報(bào)告基 因EGFP T cell/⑶4+T cell百分率，即分化出的T細(xì)胞占總體⑶4+T細(xì)胞的比例；第六、與對(duì)照組相比，能夠使EGFP T cell/⑶4+T cell百分率有顯著增高或者降 低的藥物為候選藥物，并用藥物劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證。第一步所述的哺乳動(dòng)物可以是熒光報(bào)告基因小鼠或大鼠。第二步所述的細(xì)胞接種密度為2X 106/mL。第三步所述的加入藥物時(shí)刻為_(kāi)lh或Oh。第四步所述的抗體為包被或可溶的Anti-mouse-⑶3 (5 u g/ml)和/或 Anti-mouse-CD28(1u g/ml)。第四步所述的抗體還可以為刀豆蛋白ConA(2. 5ng/ml)。第四步所述的細(xì)胞因子為IL-2(2ng/ml)，以及根據(jù)要求T細(xì)胞分化的方向需要 加入的細(xì)胞因子，包括，向Thl分化加入IL-12(5ng/ml)和/或Anti-IL-4 (10ug/ml)；向 Th2 分化加入 IL-4(20ng/ml)和 / 或 Anti-mouse-IFN-Y (10 u g/ml)；向 Treg 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)；向 Thl7 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)、IL-6 (20ng/ml)、IL-21 (50ng/
4ml)、IL-23(10ng/ml)或 IL-27(20ng/ml)。第五步所述的EGFP T cell為任一熒光標(biāo)示的Tcell，例如RFP、cy5標(biāo)示的T cell寸。此外，第一步所述的單細(xì)胞懸液系全脾與淋巴結(jié)細(xì)胞混合，在得到候選藥物后可 以將全脾與淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液行CD44、CD62L表面染色，分選出純度高的初始CD4+T細(xì)胞 (⑶44L°wCD62LHight)繼續(xù)第二步至第六步驗(yàn)證。此方法可以通過(guò)熒光報(bào)告基因檢測(cè)熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞因子的產(chǎn)生，篩選影響初始 T細(xì)胞分化和細(xì)胞因子分泌的小分子藥物。本發(fā)明提供的4get小鼠(EGFP可報(bào)告Th2分化中IL-4的產(chǎn)生)T細(xì)胞體外培養(yǎng) 分化模型及藥物篩選方法的具體步驟如下(1)超凈臺(tái)內(nèi)取4get小鼠脾臟、淋巴結(jié)浸于RPMI1640培養(yǎng)液中，以注射器針芯碾 碎過(guò)200目金屬濾網(wǎng)，溶解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；(2)96孔板中(無(wú)需包被)，以2X 106個(gè)細(xì)胞/mL密度、200 yl每孔培養(yǎng) 于 RPMI 培養(yǎng)基內(nèi)，并加入 conA(2. 5ii g/ml)、IL-2 (2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和或 Anti-mouse-IFN- y (10 u g/ml)刺激初始 CD4+T 細(xì)胞向 Th2 分化；(3)同時(shí)刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時(shí)加藥)實(shí)驗(yàn)組加入待篩選藥物， 設(shè)立對(duì)照組加入待篩選藥物溶解過(guò)程使用的溶劑DMS0或H20 ；(4) 48h收每孔細(xì)胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-mouse-CD4(0. 2mg/ml)表面染 色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結(jié)合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。此方法可以通過(guò)檢測(cè)EGFP標(biāo)記的IL-4，篩選影響初始T細(xì)胞向Th2分化和調(diào)節(jié) IL-4分泌的小分子藥物，由于該模型產(chǎn)生的IL-4是介導(dǎo)哮喘疾病發(fā)生的主要細(xì)胞因子，與 人類的哮喘病發(fā)病機(jī)理相似，故可應(yīng)用于篩選治療哮喘病藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明與傳統(tǒng)T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的方法比較具有如下優(yōu)點(diǎn)1、極大地節(jié)省了時(shí)間、工作量。48h既能完成上百種藥物的篩選，縮短了時(shí)間；該 方法應(yīng)用簡(jiǎn)單，并且不需要復(fù)雜的包板再刺激與胞內(nèi)染色，大大節(jié)省了勞動(dòng)量。2、降低成本。由于應(yīng)用熒光報(bào)告基因小鼠及可溶性抗體(無(wú)需包板)，省略了包 板、再刺激、胞內(nèi)染色等繁瑣步驟，節(jié)省了昂貴的包板抗體與胞內(nèi)熒光染色抗體。3、確保高通量篩選平臺(tái)的建立。由于應(yīng)用了可溶性抗體(ConA)以及不需要人工 的包板、轉(zhuǎn)孔、換液等步驟，可以達(dá)到計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)化水平，現(xiàn)有的多種類熒光報(bào)告基 因小鼠可以確保高通量藥物篩選平臺(tái)的建立。4、結(jié)果準(zhǔn)確。采用熒光報(bào)告基因小鼠，化合物的藥效結(jié)果可以通過(guò)光學(xué)強(qiáng)度的改 變表現(xiàn)出來(lái)，避免了因胞內(nèi)染色技術(shù)不成熟導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定或失敗，是國(guó)際前沿的 高通量篩選體系。5、應(yīng)用廣泛。機(jī)體免疫功能的改變直接與體系的熒光強(qiáng)度相連，這些重要的免疫 過(guò)程與很多重大疾病相關(guān)，包括各種癌癥，糖尿病，病毒感染，自身免疫疾病紅斑狼瘡，類風(fēng)
5濕性關(guān)節(jié)炎等。我們的篩選模型可以用于廣泛疾病的新藥篩選。
圖1是初始T細(xì)胞培養(yǎng)向Th2分化示意圖，圖1 (a) Oh初始T細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞相對(duì) 圓而?。粓Dl(b)24h T細(xì)胞培養(yǎng)及向Th2分化情況，細(xì)胞出現(xiàn)變形；圖l(c)48h T細(xì)胞培養(yǎng) 及向Th2分化情況，更多細(xì)胞發(fā)生變形，并有明顯集落形成；放大倍數(shù)40X10 ；黑色箭頭 激活的T細(xì)胞形成的集落。圖l(d)T細(xì)胞體外培養(yǎng)48h向Th2分化流式散點(diǎn)圖，經(jīng)流式細(xì) 胞儀檢測(cè)對(duì)照組(不加藥物)EGFP T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞百分率為59%。圖2、圖3、圖4是實(shí)施例1示意圖，從1-8號(hào)藥物中初步篩選出4號(hào)藥物可抑制 初始T細(xì)胞向Th2分化。圖2 1-8號(hào)藥物結(jié)構(gòu)式；圖3 初篩(a)加入藥物溶劑DMS0對(duì)照 組，(b)-(i)加入1-8號(hào)藥物組；(j)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入4號(hào)藥物組EGFP T細(xì) 胞/CD4+T細(xì)胞百分率為22% ；圖4-1藥物劑量效應(yīng)關(guān)系(a)-(l)0h施加不同濃度4號(hào)藥 物，48h后初始T細(xì)胞向Th2分化情況；每排為一個(gè)濃度梯度的三次重復(fù)，濃度如圖中標(biāo)出； 圖4-2(m)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，誤差線為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差；與DMSO control比較，g/ml 濃度下4號(hào)藥物具有顯著的抑制Th2分化作用，EGFP T細(xì)胞/⑶4+T細(xì)胞百分率為22. 37% (以 control 為 100% )p < 0. 01 ；圖5、圖6是實(shí)施例2示意圖，從1-81種天然提取物中初步篩選出27、29號(hào)小分子 化合物可抑制初始T細(xì)胞向Th2分化過(guò)程中IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生。圖5 初篩(a)Rl畫(huà)門(mén) 在淋巴細(xì)胞；(b)R2畫(huà)門(mén)在CD4+T細(xì)胞；(c)加入藥物溶劑DMS0對(duì)照組，(d)-(g)加入26-29 號(hào)藥物組(散點(diǎn)圖顯示為R1&R2門(mén))；(h)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入27，29號(hào)藥物組 EGFP T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞百分率分別為38%、13% (以control為100% )；圖6_1藥物劑 量效應(yīng)關(guān)系(a)-(n)號(hào)，圖6-2藥物劑量效應(yīng)關(guān)系(o)-(w)號(hào)及結(jié)果統(tǒng)計(jì)(X)，其中，(a)Rl 畫(huà)門(mén)在淋巴細(xì)胞；(b)R2畫(huà)門(mén)在CD4+T細(xì)胞；(c)-(e)加入藥物溶劑DMS0對(duì)照組，(f)-(w)0h 施加不同濃度27、29號(hào)藥物，48h后初始T細(xì)胞向Th2分化情況；每排為一個(gè)濃度梯度的三 次重復(fù)，藥物及濃度如圖左所示；圖(x)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，誤差線為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差； 與DMSO control比較，10nmol/ml濃度下29號(hào)藥物具有顯著的抑制Th2分化作用，EGFP T 細(xì)胞 /CD4+T 細(xì)胞百分率為 21. 64% (以 control 為 100% ), p < 0. 01 ；。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1 應(yīng)用4get小鼠從1-8號(hào)藥物中初步篩選出4號(hào)藥物可抑制初始T細(xì)胞向Th2分 化過(guò)程中IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生(1)超凈臺(tái)內(nèi)取4get小鼠脾臟、淋巴結(jié)浸于1640培養(yǎng)液中，以注射器針芯碾碎過(guò) 200目金屬濾網(wǎng)，溶解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；(2)96孔板中(無(wú)需包被)，以2\106個(gè)細(xì)胞/1^密度、200111每孔培養(yǎng)于1 ^1 培養(yǎng)基內(nèi)，并加入 conA(2. 5ii g/ml)與 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 細(xì)胞 向Th2分化；(3)同時(shí)刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時(shí)加藥)實(shí)驗(yàn)組加入待篩選1-8號(hào) 藥物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2 (1-8)，終濃度1 y g/ml，對(duì)照組加入待篩選藥物溶劑DMS0 ；(4)48h收每孔細(xì)胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-m0uSe-CD4(終濃度1 y g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結(jié)合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP T cell/⑶4+T cell百分 率。結(jié)果如圖3(a)-(i)，4號(hào)藥物可顯著降低EGFP T cell/⑶4+T cell百分率如圖3 (j)。(7)為進(jìn)一步驗(yàn)證4號(hào)藥物的抑制作用，于T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化0小時(shí)加入不同濃 度的4號(hào)藥物實(shí)驗(yàn)組加入4號(hào)藥物濃度分別為0. 1 u g/mlUu g/ml、5ii g/ml，每濃度設(shè)三 個(gè)重復(fù)，對(duì)照組加入待篩選藥物溶劑DMS0 ；48h檢測(cè)EGFP T cell/⑶4+Tcell百分率，4號(hào)藥 物濃度在5 u g/ml時(shí)可顯著抑制IL-4產(chǎn)生見(jiàn)圖4(m)。實(shí)施例2應(yīng)用4get小鼠從1-81種天然提取物中初步篩選出27、29號(hào)小分子化合物可抑制 初始T細(xì)胞向Th2分化過(guò)程中IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生(1)超凈臺(tái)內(nèi)取4get小鼠脾臟、淋巴結(jié)浸于1640培養(yǎng)液中，以注射器針芯碾碎過(guò) 200目金屬濾網(wǎng)，溶解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；(2)96孔板中(無(wú)需包被)，以2\106個(gè)細(xì)胞/1^密度、200111每孔培養(yǎng)于1 ^1 培養(yǎng)基內(nèi)，并加入 conA(2. 5ii g/ml)與 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 細(xì)胞 向Th2分化；(3)同時(shí)刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時(shí)加藥)實(shí)驗(yàn)組加入待篩選1-81種 天然提取物(終濃度lOnmol/ml)，對(duì)照組加入待篩選藥物溶劑DMS0或H20 ；(4)48h收每孔細(xì)胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-m0uSe-CD4(終濃度1 y g/ml)表 面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結(jié)合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。其中加入27、29號(hào)小分子化合物組EGFP T cell/CD4+T cell百分率分別為38%、 13% (以control為100% )見(jiàn)圖5(h)，僅附1_81種天然提取物中四種化合物的檢測(cè)結(jié)果。(7)藥物劑量效應(yīng)關(guān)系為進(jìn)一步驗(yàn)證初篩結(jié)果(即27、29號(hào)小分子化合物的抑 制作用)，于T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化Oh加入不同濃度的27、29號(hào)小分子化合物三個(gè)濃度梯 度分別為0. lnmol/ml、lnmol/ml、lOnmol/ml，每濃度設(shè)三個(gè)重復(fù)，對(duì)照組加入待篩選藥物溶 劑DMS0 ;48h檢測(cè)EGFP T cell/CD4+T cell百分率，29號(hào)小分子化合物濃度在lOnmol/ml 時(shí)可顯著抑制IL-4產(chǎn)生見(jiàn)圖6 (x)。
權(quán)利要求
一種報(bào)告基因小鼠T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及藥物篩選的方法，其特征在于該方法包括如下步驟第一、超凈臺(tái)內(nèi)取熒光報(bào)告基因哺乳動(dòng)物脾臟、淋巴結(jié)，浸入1640培養(yǎng)基，用注射器針芯碾碎過(guò)200目金屬濾網(wǎng)，溶解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液；第二、96孔板中，以1×106--107個(gè)細(xì)胞/mL密度、200μl每孔培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基內(nèi)；第三、將第二步的96孔板分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并與第四步同時(shí)刻或早于第四步向?qū)嶒?yàn)組加入待篩選藥物，向?qū)φ战M加入待篩選藥物中使用的溶劑DMSO或H2O；第四、向第二步的96孔板中加入抗體與細(xì)胞因子刺激初始CD4+T細(xì)胞分化；第五、48h收取96孔板中細(xì)胞，行CD4表面染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分化出的T細(xì)胞占總體CD4+T細(xì)胞的比例，即EGFPT cell/CD4+T cell百分率；第六、與對(duì)照組相比，能夠使EGFP T cell/CD4+T cell百分率有顯著增高或者降低的藥物為候選藥物，并用藥物劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的哺乳動(dòng)物是熒光報(bào)告基因小鼠 或大鼠。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第二步所述的細(xì)胞接種密度為2X106/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第三步所述的加入藥物時(shí)刻為-Ih或Oh。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗體為包被或可溶的濃度為 5 μ g/ml 的 Anti-mouse-CD3 禾口 / 或濃度為 1 μ g/ml 的 Anti-mouse_CD28。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗體為刀豆蛋白濃度為2.5ng/ ml 的 ConA0
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的細(xì)胞因子為2ng/mlIL-2， 以及根據(jù)要求T細(xì)胞分化的方向需要加入的細(xì)胞因子，包括，向Thl分化加入5ng/ ml IL-12 禾口 / 或 10ug/ml Anti-IL-4 ；向 Th2 分化力口 入 20ng/ml IL-4 禾口 / 或 10 μ g/ ml Anti-mouse-IFN-y ；向 Treg 分化力口入 5ng/ml TGF—beta ；向 Thl7 分化力口入 5ng/ml TGF-beta、20ng/ml IL_6、50ng/ml IL-21、10ng/ml IL-23 或 20ng/ml IL-27。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell為任一熒光標(biāo)示 的 T cell。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell為RFP或cy5標(biāo) 示的T cell。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的單細(xì)胞懸液含有全脾與淋巴 結(jié)細(xì)胞混合，在得到候選藥物后可以將全脾與淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液行CD44、CD62L表面染色， 分選出純度高的⑶初始⑶4+T細(xì)胞繼續(xù)第二步至第六步驗(yàn)證。
全文摘要
一種熒光報(bào)告基因小鼠T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化模型及藥物篩選方法，以及利用4get(IL-4/GFP-enhanced transcript)小鼠篩選治療哮喘病藥物的具體方法，包括T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化、同時(shí)刻藥物高通量篩選及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本發(fā)明中的T細(xì)胞體外培養(yǎng)分化與藥物篩選分別涉及免疫學(xué)與化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用特有的熒光報(bào)告基因小鼠在T細(xì)胞分化過(guò)程中可指示特定細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具備高通量篩選小分子藥物及天然產(chǎn)物提取物的能力?；谠撃Ｐ偷乃幬锖Y選平臺(tái)可用于篩選新藥，以及開(kāi)發(fā)一批對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)和對(duì)T細(xì)胞分化、重要細(xì)胞因子分泌具有調(diào)控作用的藥物。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101851657SQ20101013884
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日 公開(kāi)號(hào)201010138847.8
發(fā)明者劉蘭珍, 尹芝南, 張寶童, 溫倜, 王璞玥, 趙立青, 陳曦 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)