專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療肝衰竭的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的藥物及其制備方法，特別是涉及一種治療肝衰竭的 藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，也是功能最復(fù)雜的器官之一，它擔(dān)負(fù)著許多非常重 要的生理功能，如各種物質(zhì)代謝的中樞、分泌膽汁、合成蛋白和凝血因子、以及解毒 等，對(duì)維持生命和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到重要作用。目前，終未期肝病，如急性肝衰竭、 肝硬化和肝癌等均危及生命，且死亡率極高， 一直是醫(yī)學(xué)界難以解決的問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，
全世界約有3億多肝病患者，其中三分之一在我國(guó)，我國(guó)是肝病大國(guó)，是世界上終末 期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)之一，每年因肝病而死亡者人數(shù)眾多。原位肝移植是肝功能 衰竭及先天性肝代謝疾病唯一成熟的治療方法。據(jù)美國(guó)UNOS報(bào)道，在過(guò)去十年里， 全世界共實(shí)施26040例肝移植;據(jù)中華器官移植學(xué)會(huì)及全國(guó)肝移植協(xié)作組的統(tǒng)計(jì)，1976 年至2004年，我國(guó)內(nèi)地共完成各種類(lèi)型肝移植5000余例。此外，供肝缺乏是世界各 國(guó)面臨的主要問(wèn)題。盡管近年來(lái)發(fā)展了背馱式、劈離式和活體劈離式等多種肝移植術(shù) 式，以求最大程度地利用供肝，但仍不能解決等待肝移植患者與供肝者之間的巨大差 額，且因其具有操作復(fù)雜、患者常需終生免疫抑制和花費(fèi)巨大等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受到 極大的限制。
隨著20世紀(jì)90年代生物人工肝概念的提出和不斷發(fā)展，體外生物型人工肝為肝 衰竭的治療開(kāi)辟了一條新途徑。雖然近年來(lái)幾種以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝 已進(jìn)行了 I-ni期臨床試驗(yàn)，且取得了令人鼓舞的療效，但這些系統(tǒng)要真正得到臨床 推廣應(yīng)用，還必須獲得足夠數(shù)量，且具有高度活性及良好功能的肝細(xì)胞，這也成為限 制其發(fā)展的最主要因素。目前，研究的焦點(diǎn)主要集中在利用肝細(xì)胞來(lái)替代肝功能，但
免疫排斥是其發(fā)展的瓶頸。近幾年發(fā)展起來(lái)的微囊技術(shù)具有有效的免疫隔離屏障，隨 著該技術(shù)的發(fā)展，擴(kuò)大了供肝細(xì)胞來(lái)源，解決了供體缺乏這一難題。微囊化肝細(xì)胞移 植在治療各種肝病中的研究正受到越來(lái)越多的關(guān)注，其臨床效果也更加值得期待。
微囊(Microcapsules)技術(shù)是一種利用天然的或合成的高分子成膜材料(囊材) 把液體或固體藥物(囊心物)包嵌形成直徑1-5000 um (通常為5-250 um)微小膠囊 的技術(shù)。囊膜具有透膜或半透膜性質(zhì)，囊心物可藉壓力、pH值、溫度或提取等方法釋出。根據(jù)包囊技術(shù)和囊心物、囊材的性質(zhì)不同，微囊的囊粒可以是囊心物外包囊材的 膜殼型或囊心物與囊材鑲嵌在一起的鑲嵌型。囊粒可以是球形、葡萄串形、表面平滑 或折疊而不規(guī)則等各種形狀。目前制藥工業(yè)中常采用各種藥物的微囊制成各種劑型， 如散劑、膠囊劑、注射劑、混懸劑、咀嚼片、含片、洗劑、埋植片、軟膏劑、涂劑、 栓劑、膜劑、敷料等。
制備微囊的過(guò)程稱(chēng)為微型包囊術(shù)(Microencapsulation)，簡(jiǎn)稱(chēng)微囊化。藥物微 囊化后具有許多優(yōu)越性
1. 能減少?gòu)?fù)方制劑中藥物之間的配伍禁忌，隔絕藥物組分間的反應(yīng)。
2. 遮蔽藥物的苦味或異味，如磺胺類(lèi)藥物。
3. 控制藥物的釋放。
(1) 控釋或緩釋藥物，可采用惰性薄膜、可生物降解的材料等來(lái)達(dá)到控釋或 緩釋的作用。
(2) 使藥物在特定的部位釋放，對(duì)于治療指數(shù)比較低的藥物可制成靶向制劑， 提高藥物的療效。
4. 降低藥物的毒性。
5. 用微囊制備的藥物制劑具有以下優(yōu)越性
(1) 控釋或緩釋藥物。用微囊配制散劑，流動(dòng)性好，齊U量比較準(zhǔn)確?？筛纳?藥物的易吸濕引濕性，粉末不易結(jié)塊。
(2) 用微囊灌注空心膠囊，流動(dòng)性好，裝量準(zhǔn)確。
(3) 可直接用微囊壓制片劑，可壓性良好。制得的顆粒流動(dòng)性好，填入沖模 的量準(zhǔn)確，片重差異較??；也可以減小壓片時(shí)粉末飛揚(yáng)。
6. 保護(hù)藥物，如易氧化、對(duì)水氣敏感等藥物；使液態(tài)或揮發(fā)性藥物成為穩(wěn)定的粉末。
7. 更利于藥物的貯存。
8. 可將活細(xì)胞或生物活性物質(zhì)包裹，如酶、胰島素血紅蛋白等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種安全、療效確切的治療肝衰竭的藥物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案 一種治療肝衰竭的藥物，它的有效 成分為采用微囊技術(shù)混合包裹的肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子
(rhbFGF)的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
所述肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比 例可為10-1: 1，優(yōu)選為7: 1。所述肝細(xì)胞的來(lái)源是廣泛的，如可工業(yè)獲取的大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動(dòng)物的 肝細(xì)胞，或經(jīng)不同干細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞，優(yōu)選為來(lái)自大鼠的肝細(xì)胞。
可采用生物技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法誘導(dǎo)干細(xì)胞成為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞。
所述表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞為轉(zhuǎn)染重組人堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的轉(zhuǎn)基因人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
可按照常規(guī)方法將重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染人胎肝基質(zhì)細(xì)胞，如 通過(guò)含有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá)載體將重組人堿性成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因?qū)肴颂ジ位|(zhì)細(xì)胞。
用于構(gòu)建含有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá)載體的出發(fā)
載體可為pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0-U6 (Ambion， Austin, TX， USA) 、 pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (購(gòu)于Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5等。
所述攜帶有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá)載體可通過(guò)脂 質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等常規(guī)的生物學(xué)方法 轉(zhuǎn)化人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備上述治療肝衰竭的藥物的方法。
本發(fā)明所提供的制備方法，可包括以下步驟
1) 將肝細(xì)胞懸液與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合 形成混合物；
2) 將步驟1)獲得的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì) 細(xì)胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。
在上述藥物的制備方法中，步驟l)中的混合物中肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例可為10-1: 1，優(yōu)選為7: 1。
以上方法中，所述肝細(xì)胞的來(lái)源是廣泛的，如可工業(yè)獲取的大鼠、小鼠、豬或人 等哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞，或經(jīng)不同干細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞，優(yōu)選為來(lái)自大 鼠的肝細(xì)胞。
以上方法中，所述表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞為轉(zhuǎn)染 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的轉(zhuǎn)基因人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
以上方法中，可按照常規(guī)方法將重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)化人胎肝 基質(zhì)細(xì)胞，如通過(guò)含有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá)載體將重 組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因?qū)肴颂ジ位|(zhì)細(xì)胞。
以上方法中，用于構(gòu)建含有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá) 載體的出發(fā)載體可為pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0—U6 (Ambion， Austin, TX， USA)、
6pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (購(gòu)于Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5 等。
以上方法中，所述攜帶有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組真核表達(dá)載 體可通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等常規(guī)的 生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
以上方法中，可用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen P0. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)制 備肝細(xì)胞懸液將肝細(xì)胞重懸于含8-12%小牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)液中，然后 測(cè)定細(xì)胞存活率，若存活率大于90%，得到肝細(xì)胞懸液。
以上方法中，步驟2)中將肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎 肝基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化的方法可為對(duì)步驟l)獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，棄上清 液，將細(xì)胞沉淀重懸于質(zhì)量/體積(W/V)百分濃度為1.0-2. 0%的藻酸鈉溶液中，然后 將細(xì)胞懸液置于氣流式微囊形成儀中，調(diào)整氣流量為2-6 L/min(氧氣)，用3-6號(hào)針 尖打出，滴入質(zhì)量/體積(W/V)百分濃度為1.0_2.0%的氯化鈣溶液中，靜置20-30min 后，形成聚集，洗滌；然后，將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0.05-0. 15%的 多聚賴氨酸溶液中靜置4-8min，洗滌；再將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為 0. 1-0.2%的藻酸鈉溶液中，靜置2-6min，洗滌；最后，將混合細(xì)胞加入質(zhì)量/體積 百分濃度為1.0-2.0%的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3-7min，洗滌，得到微囊化的肝細(xì) 胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物，即本發(fā)明治療肝 衰竭的藥物。
在上述將肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合 物微囊化過(guò)程中所用的洗滌液均為生理鹽水。
此外，本發(fā)明治療肝衰竭的藥物可制成多種劑型，如注射液或冷凍注射劑等。上 述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載 體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑等。
上述肝衰竭的藥物的用量一般為10-100mL/kg體重/day (請(qǐng)?zhí)峁┏Ｒ?guī)劑量)，療 程一般為10-20天，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。
為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑等進(jìn)行組合治療。
本發(fā)明提供了一種治療肝衰竭的藥物及其制備方法。該藥物的有效成分為采用微 囊技術(shù)混合包裹的肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的藥物對(duì)大鼠肝細(xì)胞壽命和功能發(fā)揮起到支持作用，將其植入急性肝衰竭小鼠模型腹腔內(nèi)，可見(jiàn)該藥物對(duì)肝衰竭小鼠的肝功恢復(fù)起到促進(jìn)作用，移植后 的小鼠存活率得到顯著提高，且肝組織壞死程度明顯減輕。本發(fā)明為肝細(xì)胞移植及生 物人工肝等提供了一條新的途徑，在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域，尤其是提高肝功能和遏制 肝衰竭藥物的制備領(lǐng)域具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1A為體外單獨(dú)培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖IB為體外混合培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖1C體外混合培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎
肝基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖ID為熒光顯微鏡下的體外混合培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)
胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞
圖IE為體外單獨(dú)培養(yǎng)的微囊化大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖IF為體外混合培養(yǎng)的微囊化大鼠肝細(xì)胞與人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖1G為體外混合培養(yǎng)的微囊化大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人
胎肝基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)
圖1H為體外混合培養(yǎng)的微囊化大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人 胎肝基質(zhì)細(xì)胞的熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果
圖2A為I、 II、 III、 IV、 V組白蛋白含量檢測(cè)結(jié)果
圖2B為I、 II、 III、 IV、 V組谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量檢測(cè)結(jié)果
圖2C為I、 II、 m、 IV、 V組肝細(xì)胞色素酶P450-CYP3A4的活性檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)
結(jié)果
圖3A為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果 圖3B和圖3C為IK III、 IV、 V組移植小鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及白蛋白 (ALB)含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果
圖4為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠肝組織的病理學(xué)觀察結(jié)果 圖5A至圖5E為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠肝組織PCNA表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)
果
圖6為H、 III、 IV、 V組移植小鼠的微囊回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)以下文獻(xiàn): 組織工程基礎(chǔ)與應(yīng)用筏義人科學(xué)出版社，2007，
8組織工程原理(美)R. P.蘭扎，R.蘭格，J.瓦康提主編化學(xué)工業(yè)出版社2006， 組織工程方法(美)A.阿塔拉，R. P.蘭扎主編化學(xué)工業(yè)出版社2006， 細(xì)胞培養(yǎng)司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正世界圖書(shū)出版公司2007。
所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V) 百分比濃度。
實(shí)施例1、制備治療肝衰竭的藥物
用本發(fā)明的方法制備治療肝衰竭的藥物，具體過(guò)程包括以下步驟
1) 大鼠肝細(xì)胞懸液的制備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)，用改良 的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Pr印aration of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)制備肝細(xì)胞懸液將大鼠肝細(xì)胞按5X105 個(gè)/mL的濃度重懸于含10X(8-12X均可)小牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibcol) 中，然后用臺(tái)盼藍(lán)拒染法(細(xì)胞培養(yǎng)司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正世界圖書(shū)出版公司2007) 測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝細(xì)胞懸液。
需要說(shuō)明的是，上述以大鼠為例說(shuō)明了獲得肝細(xì)胞懸液的其中一種途徑，是實(shí)驗(yàn) 室獲取肝細(xì)胞的一種方式，但并非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明肝細(xì)胞來(lái)源的限制。工業(yè)應(yīng)用中，所 述肝細(xì)胞的來(lái)源應(yīng)該是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的肝細(xì)胞都可以 作為本發(fā)明的原料，如來(lái)源于大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動(dòng)物的離體肝細(xì)胞，也包括 從細(xì)胞庫(kù)中取得、或商業(yè)購(gòu)買(mǎi)獲得的肝細(xì)胞，還包括經(jīng)可以商業(yè)獲取的不同干細(xì)胞用 已知方法誘導(dǎo)而來(lái)的肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞，目前可以誘導(dǎo)為肝細(xì)胞的干細(xì)胞包括骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和肝干細(xì)胞等。
2) 表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的獲得
參考文獻(xiàn)(《慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)bFGF的胎兒肝臟基質(zhì)細(xì)胞株的建立》，生 物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2007, 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達(dá)重組人堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF)的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
同樣，人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的獲取過(guò)程中的任何生物材料并不限于參考文獻(xiàn)介紹的來(lái) 源，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可作為其來(lái)源，其目標(biāo)在于從 具有可應(yīng)用來(lái)源的生物材料中按照參考文獻(xiàn)記載的方法獲得表達(dá)重組人堿性成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF)的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
3) 將步驟l)提示得到的大鼠肝細(xì)胞懸液與步驟2)提示獲得的表達(dá)重組人堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合，大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例為7 : 1，即使混合液中大鼠肝細(xì)胞的濃度為 5X105個(gè)/mL，表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的濃度為7X101 個(gè)/mL。
在具體實(shí)施中，大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì) 細(xì)胞的混合比例可以在(10-1) : l均可，在此恕不一一羅列。
4)將步驟3)獲得的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝 基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化，方法為對(duì)步驟3)獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心(500rpm， 5min), 棄上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于質(zhì)量/體積百分濃度為1.5% (1.0_2.0%均可)的藻酸 鈉溶液中，然后將細(xì)胞懸液置于氣流式微囊形成儀中，調(diào)整氣流量為4 L/min (2-6 L./min均可)(氧氣)，用4.5號(hào)(3-6號(hào)均可)針尖打出，滴入質(zhì)量/體積百分濃度為 1.5% (1.0-2. 0%均可)的氯化鈣溶液中，靜置25min(20-30min均可)后，用生理鹽 水洗滌2遍，每遍5min;然后，將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 1 %
(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置6min (4-8min均可)，用生理鹽水洗 滌2遍，每遍5min;再將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 15% (0. 1-0.2%均 可)的藻酸鈉溶液中，靜置4min (2-6min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min; 最后，將混合細(xì)胞加入質(zhì)量/體積百分濃度為1.5% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉 溶液中，靜置5min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化 的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物，即本發(fā)明 治療肝衰竭的藥物。
將本發(fā)明治療肝衰竭的藥物置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco' s modified Eagle's medium,購(gòu)自Gibcol公司，配制方法將10g低糖DMEM粉末溶 于1L三蒸水中，再每升加入4g HEPES、 3. 7g Na2HCO:,及0. 3g谷胺酰銨，調(diào)pH值至 7.0-7.4，加入青霉素、鏈霉素至終濃度為100U/mL，用0.22Mm的微孔濾膜超濾除菌， 最后，每90mL加入10mL胎牛血清(fetal bovine serum, FCS))， 4'C保存，備用。
實(shí)施例2、微囊化混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)觀察及其體外功能測(cè)定
一、微囊化混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人 胎肝基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)和細(xì)胞形態(tài)觀察
觀察體外單獨(dú)培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞(I組)、體外混合培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞和人胎肝
基質(zhì)細(xì)胞(n組)或表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞(m組)
(混合比例均為7:1)的細(xì)胞形態(tài)，方法為將大鼠肝細(xì)胞重懸于含10%小牛血清 的DMEM培養(yǎng)液中，制成濃度為2. 5X 1()S個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后將其接種于六孔板中，
10再按7: 1的比例接種人胎肝基質(zhì)細(xì)胞或表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎 肝基質(zhì)細(xì)胞(細(xì)胞濃度均為7X104個(gè)/mL，每種接種2孔)，以未接種的為對(duì)照，然 后將此六孔板置于37'C、 5% C02孵養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并 記錄各組細(xì)胞形態(tài)的變化。同時(shí)，用相同方法觀察體外單獨(dú)培養(yǎng)的微囊化大鼠肝細(xì)胞 (IV組)、體外混合培養(yǎng)的微囊化的大鼠肝細(xì)胞(V組)和人胎肝基質(zhì)細(xì)胞或表達(dá)重 組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞(VI組)(混合比例均為7 : 1，混合 及微囊化方法與實(shí)施例1相同)的細(xì)胞形態(tài)。
觀察結(jié)果體外平面單獨(dú)培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞24小時(shí)后，可見(jiàn)30-50%的細(xì)胞粘附于 平皿表面，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，大鼠肝細(xì)胞的粘附率達(dá)70%，肝細(xì)胞開(kāi)始鋪展，變 得扁平，在細(xì)胞中央可見(jiàn)細(xì)胞核透明易識(shí)別，但無(wú)聚集生長(zhǎng)傾向；體外培養(yǎng)48小時(shí) 后，大鼠肝細(xì)胞變得更加扁平， 一小部分鄰近的細(xì)胞因鋪展而開(kāi)始融合，形成索狀細(xì) 胞團(tuán)(見(jiàn)圖1A);培養(yǎng)至2周時(shí)，已有細(xì)胞開(kāi)始逐漸死亡。混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞， 接種即時(shí)就和人胎肝基質(zhì)細(xì)胞或表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì) 細(xì)胞己有相互粘附聚集傾，培養(yǎng)24小時(shí)后，大部分大鼠肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞呈片狀相連。培養(yǎng)48小時(shí)后，混合培養(yǎng)的大鼠 肝細(xì)胞與人胎肝基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步聚集成不規(guī)則的小片狀，細(xì)胞連接緊密，外周松散(見(jiàn) 圖1B)，并保持此形態(tài)約l周，l周后細(xì)胞狀態(tài)下降，開(kāi)始出現(xiàn)死亡細(xì)胞。而混合培 養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞與前者相 比，不但聚集而成的不規(guī)則片狀區(qū)域更大，滿布視野，而且外周保持緊密，見(jiàn)圖1D 和圖1H，其中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞(如圖中箭頭所指)為表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞，并保持此形態(tài)直至終止培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后，細(xì)胞才逐漸死 亡。
體外單獨(dú)培養(yǎng)微囊化大鼠肝細(xì)胞48小時(shí)后，在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)微囊呈 圓球形，表面光滑，肝細(xì)胞呈圓形，均勻地分布于微囊內(nèi)(見(jiàn)圖1E);微囊化混合共 培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與人胎肝基質(zhì)細(xì)胞在微囊內(nèi)均呈圓形，并有聚集趨勢(shì)，相互接觸呈 小團(tuán)塊狀，但小團(tuán)塊間未見(jiàn)接觸(見(jiàn)圖1F);在微囊化混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與表 達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞在微囊內(nèi)，表達(dá)重組人堿性成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞圍繞肝細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，聚集趨勢(shì)非常明顯，相互接 觸形成類(lèi)肝組織樣較大的團(tuán)塊，并懸浮于微囊內(nèi)呈三維生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1G)。在熒光顯微 鏡下清晰可見(jiàn)表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞在與大鼠肝細(xì) 胞形成的團(tuán)塊中所發(fā)出的綠色熒光，見(jiàn)圖1H，其中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞(如圖中箭頭所 指)為表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
11對(duì)于微囊化混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的 人胎肝基質(zhì)細(xì)胞在10-1: 1范圍內(nèi)混合形成的其它系列藥物進(jìn)行同樣的體外培養(yǎng)和細(xì) 胞形態(tài)觀察，得到與圖1G類(lèi)似的結(jié)果。
上述細(xì)胞形態(tài)觀測(cè)結(jié)果表明囊內(nèi)轉(zhuǎn)rhbFGF人胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠肝細(xì)胞維持壽 命和功能發(fā)揮有明顯的支持作用。
二、微囊化混合共培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人 胎肝基質(zhì)細(xì)胞的體外功能測(cè)定
用與步驟一相同的方法體外培養(yǎng)上述六組細(xì)胞(I組、II組、III組、IV組、V組、 VI組)，隔天換液時(shí)取細(xì)胞培養(yǎng)上清，培養(yǎng)4周后，用OLYMPUS AU2600全自動(dòng)生化 儀分別檢測(cè)六組細(xì)胞培養(yǎng)上清中微量白蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量，同時(shí)檢測(cè)肝細(xì)胞色 素酶P450-CYP3A4的活性，檢測(cè)方法為各組隔天換液后，將細(xì)胞用PBS洗滌3次， 加入睪酮(Testosterone)工作液(CYP3A4典型底物，Sigma 500nM， PBS稀釋)，在 37"C下與細(xì)胞共孵育2小時(shí)，分別取孵育0、 2小時(shí)點(diǎn)，加入等體積含5% (W/V)內(nèi) 標(biāo)非那西汀的乙腈終止反應(yīng)，然后14000rpm離心5min，取上清液通過(guò)質(zhì)譜儀(型號(hào) 為Agilent7600，購(gòu)自Agilent Co.)進(jìn)樣檢測(cè)細(xì)胞上清中睪酮的剩余量，以此來(lái)評(píng) 價(jià)肝細(xì)胞色素酶P450-CYP3A4的活性(空白對(duì)照孔平行操作，復(fù)孔)。
微量白蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量檢測(cè)結(jié)果用OLYMPUS AU2600全自動(dòng)生化儀檢 測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清后，發(fā)現(xiàn)各組肝細(xì)胞均產(chǎn)生一定量的白蛋白。在整個(gè)培養(yǎng)期間，III組 所產(chǎn)生的白蛋白量高于I、 II組，VI組所產(chǎn)生的白蛋白量高于IV、 V組，特別是VI組 所產(chǎn)生的白蛋白量明顯高于其它各組(尸<0.05，說(shuō)明差異顯著)。培養(yǎng)至14天時(shí)， I、 II、 III、 IV、 V組白蛋白含量開(kāi)始下降，并低于第O天水平，但VI組白蛋白含量 仍然高于初始水平，并且維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(見(jiàn)圖2A，圖中，從左至右的柱依次對(duì)應(yīng)I 組、II組、III組、IV組、V組、VI組，圖2B至2C同)。此外，各組肝細(xì)胞均釋放一 定量的谷丙轉(zhuǎn)氨酶，第2天時(shí)，VI組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量比第O天下降 約3倍。但培養(yǎng)至第14天時(shí)，各組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶量無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖2B)。上述 檢測(cè)結(jié)果表明微囊內(nèi)轉(zhuǎn)rhbFGF胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠肝細(xì)胞維持壽命和功能發(fā)揮有明 顯的支持作用。
肝細(xì)胞色素酶P450-CYP3A4的活性檢測(cè)結(jié)果各組肝細(xì)胞均不同程度的代謝了部 分睪酮。第2天，VI組細(xì)胞培養(yǎng)上清中睪酮剩余量已開(kāi)始明顯低于其它各組(尸<0. 05， 說(shuō)明差異顯著)，而其它各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第21天，I、 II、 III、 IV、 V 組培養(yǎng)上清中睪酮剩余量已明顯接近孵育前的初始濃度500nM，而VI組睪酮剩余量仍 明顯低于其它各組和初始濃度(尸<0.05，說(shuō)明差異顯著)(見(jiàn)圖2C)。上述檢測(cè)結(jié)果表明微囊內(nèi)轉(zhuǎn)rhbFGF人胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠肝細(xì)胞維持P450-CYP3A4酶的活性有明顯的促進(jìn)作用。
對(duì)于大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞在
10-1: l范圍內(nèi)混合形成的其它系列藥物(如6: 1、 8: 1等)進(jìn)行相同的功能檢測(cè)，
結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，在此不再一一羅列。
實(shí)施例3、本發(fā)明治療肝衰竭藥物的藥效檢測(cè)
用小鼠急性肝衰竭模型檢測(cè)本發(fā)明藥物的療效，檢測(cè)方法如下
一、 小鼠急性肝衰竭模型的建立
實(shí)驗(yàn)前將100只BALB/c系小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)飼養(yǎng)一周，然后將部分小鼠用乙醚麻醉、消毒后，行上腹正中橫行切口，暴露肝臟，依次結(jié)扎并切
除大鼠肝左葉和中葉(約占全肝的70%)，僅保留右葉，方葉和尾狀葉；術(shù)后給飲IO
%葡萄糖水，標(biāo)準(zhǔn)鼠食飼養(yǎng)，不同時(shí)間監(jiān)測(cè)動(dòng)物的存活情況和血生化指標(biāo)。
二、 體內(nèi)移植方法和步驟
將步驟一獲得的急性肝衰竭模型小鼠于肝臟切除術(shù)后立即進(jìn)行腹腔移植，將急性肝衰竭模型小鼠分成五組(每組i5只，i組為空白對(duì)照，n組、in組、iv組為對(duì)照，
V組為實(shí)驗(yàn)組)，在位于腹腔正中3腿處，用12號(hào)針頭，分別注入lmL空囊(II組)、微囊化大鼠肝細(xì)胞(III組)、微囊化大鼠肝細(xì)胞與人胎肝基質(zhì)細(xì)胞(IV組)，以及微囊化大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞(V組，實(shí)施例一中7: l混合藥物)(m組、IV組、V組均含有大鼠肝細(xì)胞5X1()5個(gè)，IV組、V組中均含有7X104個(gè)人胎肝基質(zhì)細(xì)胞或表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞)，術(shù)后常規(guī)肌注青霉素10萬(wàn)單位，每日1次，連續(xù)注射3天。
三、 微囊化混合肝細(xì)胞移植對(duì)肝衰竭小鼠生存狀態(tài)及肝功能的影響步驟二中的I、 II、 III、 IV組移植小鼠在72小時(shí)均出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能衰竭狀態(tài)，
表現(xiàn)為活動(dòng)障礙、嗜睡、昏迷，此時(shí)的存活率分別為40%、 40%、 46.70%、 60%;與之相比，植入本發(fā)明藥物(微囊化混合肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞)的V組移植小鼠未出現(xiàn)嚴(yán)重的肝衰竭癥狀，存活率為86.70%。至7天時(shí)，V組小鼠的存活率是其它各組的兩倍。7天后，各組小鼠的存活率分別為20%、 20%、 26.70%、 40%和80%。與其它組相比，V組小鼠的存活率明顯優(yōu)于其它各組(尸< 0.05，說(shuō)明差異顯著)，其它組間無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3A)。
小鼠肝功能受損在切除術(shù)后48小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰，以后逐漸下降；V組移植后24小時(shí)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)較其它各組均有明顯好轉(zhuǎn)(尸<0.05，說(shuō)明差異顯著)，而自移植48小時(shí)起，V組ALT及白蛋白(ALB)含量均較其它組明顯好轉(zhuǎn)，具有顯著性
13差異(尸< 0.05，說(shuō)明差異顯著)；移植后第7天，各組間生化指標(biāo)差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3B和圖3C)。
上述檢測(cè)結(jié)果表明微囊化混合肝細(xì)胞與轉(zhuǎn)rhbFGF人胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)肝衰竭小鼠肝功恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。
四、 腹腔移植后肝組織的病理學(xué)觀察
行肝大部切除術(shù)48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，步驟二中的I、 II、 III、 IV組移植小鼠殘存的肝臟呈黃白色、無(wú)光澤，肝組織腫脹明顯，失去彈性，邊緣圓鈍易碎裂；鏡下肝組織大片壞死(見(jiàn)圖4中的A)，失去正常肝小葉結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖4中的D)，匯管區(qū)紊亂(見(jiàn)圖4中的B)，肝細(xì)胞嚴(yán)重變性，部分細(xì)胞溶解，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞界限不清，肝竇裂隙增大(見(jiàn)圖4中的C)，血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，還可見(jiàn)到大片淡染區(qū)域，有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與之相比，V組肝臟也呈黃白色，略有光澤，肝組織輕度腫脹，但較其它組明顯減輕，中葉和尾葉輕度肥大；在光鏡下觀察肝組織，與其它組相比，V組肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)稍有紊亂，肝索間裂隙不規(guī)則增大，偶爾可見(jiàn)肝細(xì)胞變性壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)肝細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)大量雙核或多核細(xì)胞(見(jiàn)圖4中的E)。上述病理學(xué)觀察結(jié)果表明微囊化混合肝細(xì)胞與轉(zhuǎn)rhbFGF人胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)肝衰竭小鼠肝功恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。
同時(shí)，利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織PCNA (增殖細(xì)胞核抗原)的表達(dá)情況，檢測(cè)方法參見(jiàn)《免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用》倪燦榮，馬大烈，戴益民化學(xué)工業(yè)出版社2006; —抗為小鼠抗大鼠PCNA (購(gòu)自中山)，二抗為山羊抗小鼠IgG (購(gòu)自中山)，以此來(lái)反映肝衰竭小鼠肝組織的增殖狀態(tài)。在光鏡下可見(jiàn)，肝切除術(shù)后24小時(shí)，V組(見(jiàn)圖5中的E)與其它組相比，陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)已開(kāi)始迅速升高，48小時(shí)表達(dá)量最高，其后表達(dá)量逐漸下降；陽(yáng)性細(xì)胞核表達(dá)區(qū)域從匯管區(qū)周?chē)饾u向中央靜脈周?chē)鷧^(qū)推進(jìn)，24小時(shí)集中在匯管區(qū)周?chē)?；?8小時(shí)，陽(yáng)性表達(dá)除小葉中央靜脈周?chē)鷧^(qū)外，其余細(xì)胞核均為陽(yáng)性；至96小時(shí)以后，從匯管區(qū)周?chē)蛑醒腱o脈周?chē)饾u轉(zhuǎn)為陰性。而其它組值(1、 II、 III、 IV組)(見(jiàn)圖5中的A、 B、 C禾nD)至72小時(shí)，陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)才逐漸開(kāi)始表達(dá)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束表達(dá)量一直很低。上述檢測(cè)結(jié)果表明微囊化混合肝細(xì)胞與轉(zhuǎn)rhbFGF人胎肝基質(zhì)細(xì)胞對(duì)肝衰竭小鼠肝臟再生的促進(jìn)作用。
五、 微囊的回收
移植4周后，對(duì)步驟二中的五組小鼠進(jìn)行腹腔灌洗，收集腹腔內(nèi)游離或附著于肝包膜的微囊。在光鏡下觀察回收的微囊后，發(fā)現(xiàn)II組中的空囊大多具有良好的外形，呈圓形，囊壁光滑、完整，囊外無(wú)纖維化現(xiàn)象，回收率達(dá)(89±52) %。 III、 IV組大部分在腹腔內(nèi)呈游離狀態(tài)，腹腔沖洗可取出微囊，小部分微囊粘附于大網(wǎng)膜、腸系膜間，回收率分別為(76±45) %、 (78±67) %，在光鏡下下觀察大部分細(xì)胞胞膜破裂、萎縮，胞漿渾濁不清，提示大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。V組微囊小部分游離于腹腔，多在肝臟斷端周?chē)奂蓤F(tuán)或附著于肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內(nèi)大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞相互接觸成團(tuán)，細(xì)胞膜均完整光滑，胞漿飽滿，表明仍有肝細(xì)胞存活。各組間回收率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸〈0.05，說(shuō)明差異顯著)(見(jiàn)圖6)。上述回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明微囊有較好的回收率。
實(shí)施例4、制備治療肝衰竭的藥物及其療效檢測(cè)
一、制備治療肝衰竭的藥物.
用本發(fā)明的方法制備治療肝衰竭的藥物，具體過(guò)程包括以下步驟
1) 大鼠肝細(xì)胞懸液的制備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g)，用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol1976;13:29)制備肝細(xì)胞懸液將大鼠肝細(xì)胞按4X105個(gè)/mL的濃度重懸于含8X(8-12%均可)小牛血清的1640培養(yǎng)液中，然后用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝細(xì)胞懸液。
2) 表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的獲得
參考文獻(xiàn)(《慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)bFGF的胎兒肝臟基質(zhì)細(xì)胞株的建立》，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2007， 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
3) 將步驟l)制備的大鼠肝細(xì)胞懸液與步驟2)獲得的表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合，大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例為8 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝細(xì)胞的濃度為4X105個(gè)/mL，表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的濃度為5X104個(gè)/mL。
4) 將步驟3)獲得的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化，方法為對(duì)步驟3)獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心(600rpm， 3min)，棄上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于質(zhì)量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸鈉溶液中，然后將細(xì)胞懸液置于氣流式微囊形成儀中，調(diào)整氣流量為6 L/min (2-6L/min均可)(氧氣)，用5號(hào)(3-6號(hào)均可)針尖打出，滴入質(zhì)量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的氯化鈣溶液中，靜置30min(20-30min均可)后，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;然后，將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 05%
15(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置8min (4-8min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5niin;再將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 2% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸鈉溶液中，靜置2min (2-6min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;最后，將混合細(xì)胞加入質(zhì)量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉溶液中，靜置7min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物，即本發(fā)明治療肝衰竭的藥物。將本發(fā)明治療肝衰竭的藥物置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
二、本發(fā)明治療肝衰竭藥物的療效檢測(cè)
用與實(shí)施例三相同的方法檢測(cè)本發(fā)明藥物的療效，結(jié)果較其它組，移植有本發(fā)明藥物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到顯著提高，肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)稍有紊亂，肝索間裂隙不規(guī)則增大，偶爾可見(jiàn)肝細(xì)胞變性壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)肝細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)大量雙核或多核細(xì)胞；肝組織PCNA
(增殖細(xì)胞核抗原)的表達(dá)情況良好；此外，微囊小部分游離于腹腔，多在肝臟斷端周?chē)奂蓤F(tuán)或附著于肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內(nèi)大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞相互接觸成團(tuán)，細(xì)胞膜均完整光滑，胞漿飽滿，表明仍有肝細(xì)胞存活。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的藥物對(duì)肝衰竭具有較好的療效，可用于肝衰竭的治療，以及進(jìn)一步用于肝細(xì)胞移植及生物人工肝的制備等。
實(shí)施例5、制備治療肝衰竭的藥物及其療效檢測(cè)
一、制備治療肝衰竭的藥物
用本發(fā)明的方法制備治療肝衰竭的藥物，具體過(guò)程包括以下步驟
1) 大鼠肝細(xì)胞懸液的制備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g)，用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol
1976:13:29)制備肝細(xì)胞懸液將大鼠肝細(xì)胞按6X 105個(gè)/1^的濃度重懸于含12%(8-12%均可)小牛血清的1640培養(yǎng)液中，然后用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞存活率，
結(jié)果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝細(xì)胞懸液。
2) 表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的獲得
參考文獻(xiàn)(《慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)bFGF的胎兒肝臟基質(zhì)細(xì)胞株的建立》，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2007， 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。3) 將步驟l)制備的大鼠肝細(xì)胞懸液與步驟2)獲得的表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合，大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例為6 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝細(xì)胞的濃度為6Xl05個(gè)/mL，表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的濃度為1Xl。5個(gè)/mL。
4) 將步驟3)獲得的大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化，方法為對(duì)步驟3)獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心(500rpra， 5min)，棄上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于質(zhì)量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸鈉溶液中，然后將細(xì)胞懸液置于氣流式微囊形成儀中，調(diào)整氣流量為2 L/min (2-6L/min均可)(氧氣)，用3號(hào)(3-6號(hào)均可)針尖打出，滴入質(zhì)量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2. 0%均可)的氯化l丐溶液中，靜置20min(20-30rain均可)后，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;然后，將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 15%
(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置4min (4-8min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;再將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 1% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸鈉溶液中，靜置6min (2-6rain均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;最后，將混合細(xì)胞加入質(zhì)量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物，即本發(fā)明治療肝衰竭的藥物。將本發(fā)明治療肝衰竭的藥物置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
二、本發(fā)明治療肝衰竭藥物的療效檢測(cè)
用與實(shí)施例三相同的方法檢測(cè)本發(fā)明藥物的療效，結(jié)果較其它組，移植有本發(fā)明藥物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到顯著提高，肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)稍有紊亂，肝索間裂隙不規(guī)則增大，偶爾可見(jiàn)肝細(xì)胞變性壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)肝細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)大量雙核或多核細(xì)胞；肝組織PCNA
(增殖細(xì)胞核抗原)的表達(dá)情況良好；此外，微囊小部分游離于腹腔，多在肝臟斷端周?chē)奂蓤F(tuán)或附著于肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內(nèi)大鼠肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞相互接觸成團(tuán)，細(xì)胞膜均完整光滑，胞槳飽滿，表明仍有肝細(xì)胞存活。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的藥物對(duì)肝衰竭具有較好的療效，可用于肝衰竭的治療，以及進(jìn)一步用于肝細(xì)胞移植及生物人工肝的制備等。
1權(quán)利要求
1、一種治療肝衰竭的藥物，它的有效成分為采用微囊技術(shù)混合包裹的肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的藥物，其特征在于所述肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例為10 1: 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于所述肝細(xì)胞來(lái)源于大鼠、小 鼠、豬或人，或經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞；所述表達(dá)重組人堿性成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞為轉(zhuǎn)染重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組 人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
4、 一種制備權(quán)利要求1所述的治療肝衰竭的藥物的方法，包括以下步驟1 )將肝細(xì)胞制成懸液與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞 混合形成細(xì)胞混合物；2)將步驟l)獲得的細(xì)胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的細(xì)胞混合物中肝 細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞的混合比例為10-1: 1。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的肝細(xì)胞來(lái)源 于大鼠、小鼠、豬或人，或經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞；所述表達(dá)重組人 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞為轉(zhuǎn)染攜帶重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子基因的重組人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟l)中用Seglen膠 原酶/EGTA兩步灌注法制備肝細(xì)胞懸液將肝細(xì)胞重懸于含8-12%小牛血清的1640 培養(yǎng)液中，然后測(cè)定細(xì)胞存活率，若存活率大于90%，得到肝細(xì)胞懸液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中將肝細(xì)胞與表 達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化的方法為對(duì)步驟 1)獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，棄上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于質(zhì)量/體積百分濃度為 1.0-2.0%的藻酸鈉溶液中，然后將細(xì)胞懸液置于氣流式微囊形成儀中，調(diào)整氣流量 為2-6L/min，用3-6號(hào)針尖打出，滴入質(zhì)量/體積百分濃度為1. 0-2. 0%的氯化鈣溶 液中，靜置20-30min后，洗滌;然后，將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為0. 05-0. 15 %的多聚賴氨酸溶液中靜置4-8min，洗滌；再將混合細(xì)胞置入質(zhì)量/體積百分濃度為 0. 1-0.2%的藻酸鈉溶液中，靜置2-6min，洗滌；最后，將混合細(xì)胞加入質(zhì)量/體積 百分濃度為1.0-2. 0%的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3-7min，洗滌，得到微囊化的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述洗滌液均為生理鹽水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療肝衰竭的藥物及其制備方法。該藥物的有效成分為采用微囊技術(shù)混合包裹的肝細(xì)胞和表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞。其制備方法包括以下步驟1)將肝細(xì)胞懸液與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合；2)將步驟1)獲得的肝細(xì)胞與表達(dá)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。本發(fā)明為肝細(xì)胞移植及生物人工肝等提供了一條新的途徑，在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域，尤其是提高肝功能和遏制肝衰竭藥物的制備領(lǐng)域具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K9/50GK101496815SQ20081005754
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日
發(fā)明者雪 南, 偉 師, 越 滕, 王韞芳, 白慈賢, 裴雪濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所