專利名稱：：一種脂質(zhì)體流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物預(yù)防醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種包裹生物藥物的用于流感防治的脂質(zhì)體疫苗。
背景技術(shù)：
：普通的流感疫苗只能激發(fā)機體的體液免疫，而無法激發(fā)機體的細(xì)胞免疫。目前用于臨床的流感疫苗中有效抗原的含量較高，限制了流感疫苗的生產(chǎn)能力。有專家預(yù)測，新一輪流感大流行即將到來，對流感疫苗的潛在需求量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前人類的生產(chǎn)能力，因此如何使流感疫苗可在減少抗原使用量的情況下，提高流感疫苗的免疫水平，特別是加強流感疫苗刺激機體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫能力，更加提高了集體對流感病毒的抵抗力。因此，加快流感疫苗佐劑的研究具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明提出一種新型的免疫性脂質(zhì)體，它包含流感疫苗所含病毒的主要抗原組分(蛋白或糖蛋白)，也可以包括或不包括免疫調(diào)節(jié)組分，它既能在減少免疫劑量的條件下達(dá)到明顯的免疫效果，又能延長疫苗的免疫保護(hù)時間。本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體流感疫苗，所述脂質(zhì)體的膜帶有電荷，所述流感疫苗的抗原組分包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或鑲嵌于脂質(zhì)體膜中或由于電荷而吸附與膜上。本發(fā)明中的流感疫苗包括全病毒滅活流感疫苗，流感裂解型疫苗和流感亞單位疫苗，流感疫苗抗原組分包括流感病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。所述血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)包括H1N1、H3N2和/或B。其中，脂質(zhì)體流感疫苗單位劑量中含流感疫苗HA/NA組分的量是5ug—100ug;優(yōu)選量是10ug—50ug。本發(fā)明流感疫苗還包含免疫調(diào)節(jié)劑或附加劑。免疫調(diào)節(jié)劑為細(xì)胞因子類蛋白，包括干擾素(IFN—a、IFN—e、IFN—Y)，白介素(IL-1、IL—2、IL-4、IL14、IL16)、胸腺肽al、免疫核糖核酸。附加劑為抗氧化劑，如維生素E等，并可加入正或負(fù)電荷磷脂，防止脂質(zhì)體凝聚、融合，改變劑型，制備凍干劑，避免滲漏，延長脂質(zhì)體保存時間。4本發(fā)明脂質(zhì)體為小單層和大多層脂質(zhì)體共存的脂質(zhì)體。其中，脂質(zhì)體球徑為505000nm，本發(fā)明較優(yōu)選的脂質(zhì)體粒徑范圍是為1001500nm，平均粒徑在300800nm之間。脂質(zhì)體為一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質(zhì)雙層疏水區(qū)的脂肪鏈通過疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成，在其形成過程中可包裹水溶性成分獲得顆粒形態(tài)，被包裹的內(nèi)容物可以受到脂質(zhì)體膜的保護(hù)。水溶性抗原包被于脂質(zhì)體中可借助脂質(zhì)體的傳遞被直接送達(dá)抗原提呈細(xì)胞的胞質(zhì)中，脂質(zhì)體膜基質(zhì)及附加的修飾成分還可以直接活化免疫細(xì)胞的信號傳遞系統(tǒng)。在脂質(zhì)體膜的保護(hù)下，抗原分子可以不受體液成分的破壞，脂質(zhì)體類疫苗可用于多種黏膜途徑的免疫接種。通過選擇脂質(zhì)體膜基質(zhì)組分及對脂質(zhì)體膜加以修飾，還可以選擇所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的類型。淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞都能夠吞噬脂質(zhì)體，在這些細(xì)胞內(nèi)抗原經(jīng)過加I表達(dá)于I型主要組織相容性分子(MHC功，激發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫。脂質(zhì)體是用作疫苗的傳遞載體和免疫佐劑的很好選擇。本發(fā)明所涉及的脂質(zhì)體是由磷脂、非磷脂、固醇類及它們的衍生物和膜材組成。用于制備脂質(zhì)體的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、膽固醇、腦磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇乙酰、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、二棕櫚酰-DL-a磷脂酰膽堿、磷脂酰絲胺酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六垸基醚和四氧乙烯十二烷基醚等。本發(fā)明所涉及的脂質(zhì)體膜材包括但不限于膽固醇、十八胺、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等。膽固醇可以調(diào)節(jié)雙分子層流動性、通透性等，十八胺、磷脂酸等可以改變脂質(zhì)體表面電荷性質(zhì)。脂質(zhì)體制備的基本原理都是將油性材料與水性材料經(jīng)過適當(dāng)處理后形成油包水的制劑，常規(guī)的脂質(zhì)體制備方法，包括薄膜法、逆相蒸發(fā)法、加壓擠出法、熔融法及凍干水化法。本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗的優(yōu)選的制備工藝是逆相蒸發(fā)法、凍干水化法。本發(fā)明最優(yōu)選的脂質(zhì)體的制備工藝是凍干水化法。本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，凍干水化法，包括如下步驟1、將脂質(zhì)體、膜材及附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比(5~10):(15):(廣3)溶于溶媒中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，除去有機溶媒，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成磷脂膜；2、加入緩沖液，406(TC，超聲1020分鐘，形成脂質(zhì)體懸液；3、將脂質(zhì)體懸液與流感疫苗抗原溶液混合，脂質(zhì)體粉碎均勻，加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥；4、滅菌，得到凍干粉劑；加無菌水、震蕩、再水化融合；得到脂質(zhì)體流感疫苗。本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，逆相蒸發(fā)法，包括如下步驟1、將脂質(zhì)體、膜材和附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比(5-10):(15):(12)溶于溶媒中，加入流感疫苗抗原溶液，3560°C，超聲處理1(T20分鐘，得到穩(wěn)定的油包水乳液；2、在4(T6(TC下減壓蒸發(fā)，得到膠態(tài)物質(zhì)；3、加入緩沖液，4(T6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)1020分鐘，除去微量有機溶媒，得到脂質(zhì)體水性混懸液，放置2040分鐘，透析，除去游離的未包入脂質(zhì)體的流感抗原；4、滅菌；得到脂質(zhì)體流感疫苗。在脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法中，步驟l)中的溶媒為；步驟2)中的緩沖液為pH值為5.4—7.8范圍內(nèi)的磷酸緩沖液，Tri-HC1緩沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗可以在注射部位形成抗原儲庫，使抗原緩慢釋放，引起注射部位的炎性反應(yīng)，增加細(xì)胞的穿透能力，提高了注射部位的抗原遞呈細(xì)胞濃度，使抗原易被抗原遞呈細(xì)胞吞噬，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-2,IL-4，IL-12，IL-6，TNF-a，IFN-a，IL-IO和IFN等，更重要的是脂質(zhì)體作為佐劑，能同時激活機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫(B、T細(xì)胞免疫，主要為T細(xì)胞免疫)和體液免疫，通過誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同刺激因子，增加主要組織相容性抗原的表達(dá)，使抗原遞呈細(xì)胞成熟，增強抗原的遞呈作用。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明的脂質(zhì)體膜是使用了帶有電荷的脂質(zhì)體膜，使脂質(zhì)體包封抗原的包封率增大，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性更好，在4°放置下，其粒徑穩(wěn)定期限可以長達(dá)8個月，而普通的脂質(zhì)體不超過1個月；本發(fā)明的脂質(zhì)體可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)，主要刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的血清IgG抗體和粘膜IgA抗體，特別適用于作疫苗佐劑或者免疫復(fù)合物；本發(fā)明的脂質(zhì)體體系是小單層脂質(zhì)體與多層脂質(zhì)體共存的一種脂質(zhì)體溶液體系，脂質(zhì)體的平均粒徑分布在50raTl000nm，為粒徑呈正態(tài)分布的球形或橢球形脂質(zhì)體；本發(fā)明的脂質(zhì)體疫苗同時可包裹流感疫苗的三種抗原，即H1N1、H3N2、B，使得該疫苗的保護(hù)范圍更廣；不僅能同時增強機體對三種抗原的免疫應(yīng)答，而且能快速的提升機體內(nèi)抗體水平，并能持久的對機體產(chǎn)生保護(hù)作用。圖1是樣品組3與對照組免疫效果比較圖；圖2是樣品組4與對照組免疫效果比較圖；圖3是樣品組5與對照組免疫效果比較圖；圖4是樣品組6與對照組免疫效果比較圖；圖5是樣品組7與對照組免疫效果比較圖；圖6是樣品組8與對照組免疫效果比較圖7是6組樣品與對照組免疫效果一時間圖。具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，下面結(jié)合具體的實驗及實驗結(jié)果對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。通過實驗觀察幾種制備工藝對抗原物質(zhì)活性的影響，尤其是監(jiān)測其免疫誘導(dǎo)活性。實驗結(jié)果證明應(yīng)選擇制備過程相對柔和、無劇烈的理化條件改變的方法。以小鼠注射疫苗后血清中抗體的濃度判斷免疫反應(yīng)強度的指標(biāo)，抗體濃度用血凝抑制法進(jìn)行檢測(以滴度大于1:40者判為陽性)，陽性對照抗體為不含脂質(zhì)體的疫苗免疫一周后再用相同劑量進(jìn)行加強免疫。陰性對照抗血清為免疫前從SPFBalb/c小鼠直接抽取血清。樣品組小鼠只進(jìn)行一次性免疫。實驗結(jié)果見表l。表1制備工藝對脂質(zhì)體流感疫苗免疫小鼠后抗體產(chǎn)生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>我們在實驗中采用幾種不同的流感疫苗，給小鼠注射不同的疫苗后，用目前藥典規(guī)定的血凝抑制方法檢測免疫后小鼠(SPFBalb/c小鼠)血清中抗體的滴度，作為判斷免疫反應(yīng)強度的指標(biāo)(以大過1:40作為陽性)，用不含脂質(zhì)體的疫苗，免疫小鼠一周后再用相同劑量進(jìn)行加強免疫，一周后采血作為陽性對照組血清。免疫前從小鼠直接采血清作為陰性對照組血清。而對于各樣品組，只給小鼠分別進(jìn)行一次性免疫，在免疫后各隔兩周采血，一直到第io周。各樣品組所含的抗原量都一樣，最后用血凝抑制實驗測定抗體滴度，并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計，實施例1按照文獻(xiàn)的方法制備脂質(zhì)體流感疫苗按照文獻(xiàn)IlanBabai等(1999)的方法，并用其最優(yōu)的實施例方法制備脂質(zhì)體，取卵磷脂4g，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入40ml的雙蒸水中，在40-45°溶解后，用勻漿機均質(zhì)到50nm的粒徑，然后加入的HlNl抗原含血凝素為7.5IU/ml，混合。作為樣品1。實施例2本發(fā)明方法制備脂質(zhì)體流感疫苗取卵磷脂、膽固醇、硬脂胺按照摩爾比(7:1:1)，溶于二氯甲烷溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(pH7.4)水化脂質(zhì)體膜，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，均質(zhì)形成脂質(zhì)體混懸液，過0.45um的濾膜；即為脂質(zhì)體流感疫苗，標(biāo)志為樣品組2,其中加入的H1N1抗原含血凝素為7.5IU/ml。對照組樣品為流感亞單位疫苗，含7.5IU/ml的血凝素，不加任何輔助成分。將上述三個樣品，分別免疫16-18g的SPFBalb/c小鼠，雌雄各半，每隔2周采血。每個樣品每次采取10個小鼠血清，然后進(jìn)行HI測定抗體的滴度。結(jié)果見表2。表2、文獻(xiàn)方法制備的和本發(fā)明的脂質(zhì)體作為佐劑的免疫后抗體滴度比較(n-lO)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與對照組比較t=5.569P<0.0001林與對照組比較t=4.714P<0.0001**與樣品1比較t=5.482P<0.0001將上述兩種脂質(zhì)體樣品分別測定包封率測定分別為17.3%、32.4%，同時，進(jìn)行電鏡檢測和觀測脂質(zhì)體的粒徑穩(wěn)定性，樣品1的平均粒徑為47.83rnn，跨距為1.87，樣品2的平均粒徑為482.24nrn，跨距為2.91。實施例3制備小單層免疫性脂質(zhì)體流感疫苗取卵磷脂及膽固醇、硬脂酸按照摩爾比(7:1:1)，溶于二氯甲烷溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(pH7.0)，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，形成小單層脂質(zhì)體混懸液；即為脂質(zhì)體流感疫苗。標(biāo)志為樣品組3，加入的H1N1抗原含血凝素為7.5IU/ml,同時加入20萬IU/ml的IFN—alpha;對照組樣品為流感亞單位疫苗，不加任何輔助成分。實施例4制備大多層免疫性脂質(zhì)體流感疫苗取磷脂酰絲氨酸及膽固醇、硬脂酸胺摩爾比(7:5:3)，溶于氯仿溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(0.1M，PH7.4)，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，形成大多層脂質(zhì)體混懸液，即為免疫勝脂質(zhì)體流感疫苗。流感抗原含H1N1、B兩種組分，加入5萬IU/ml的IL一14，標(biāo)志為樣品組4;對照組樣品為流感亞單位疫苗，兩種型別的抗原分別含血凝素為10IU/ml，不加任何輔助成分。實施例5凍干水化法制備制備大多層免疫性脂質(zhì)體流感疫苗取二肉豆蔻卵磷脂及膽固醇、硬脂酰胺按照摩爾比(7:1:1)，溶于氯仿溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量Tris—HCl緩沖液(0.1M,W15.4)，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，形成大多層脂質(zhì)體混懸液；再加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥；再加入無菌水，用震蕩器震蕩5分鐘，重新水化形成大單層或多層脂質(zhì)體混懸液，即為免疫性脂質(zhì)體流感疫苗。樣品的免疫組分為H1N1，H3N2，B三種型別的抗原，標(biāo)志為樣品組5;對照組樣品為流感亞單位疫苗，含血凝素為15IU/ml，不加任何輔助成分。實施例6凍干水化法制備免疫性脂質(zhì)體流感疫苗取卵磷脂及膽固醇、硬脂酸按照設(shè)定的摩爾比，溶于氯仿溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(0.1M,PH8.0)，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，形成大多層脂質(zhì)體混懸液；再加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥；再加入含有50萬IU的干擾素a2b的無菌水，用震蕩器震蕩5分鐘，重新水化形成大單層或多層脂質(zhì)體混懸液，即為免疫勝脂質(zhì)體流感疫苗。樣品組的免疫原組分含H1N1,H3N2,B分別含血凝素為15IU/ml，標(biāo)志為樣品組6，對照組樣品為流感亞單位疫苗，不加任何輔助成分。實施例7凍干水化法制備免疫性脂質(zhì)體流感疫苗取卵磷脂及膽固醇、硬脂酸按照設(shè)定的摩爾比，溶于氯仿溶液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(0.1M，PH7.4)，將脂質(zhì)體混懸液與流感抗原溶液混合，形成大多層脂質(zhì)體混懸液；再加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥；再加入含有50萬IU的白介素一2的無菌水若千，用震蕩器震蕩5分鐘，重新水化形成大單層或多層脂質(zhì)體混懸液，即為免疫性脂質(zhì)體流感疫苗。樣品組的抗原為H1N1(含血凝素為15IU/ml)，同時含有40萬IU/ml的IL-2，標(biāo)志為樣品組7，對照組樣品為流感亞單位疫苗，不加任何輔助成分。實施例8核酸復(fù)合物佐劑流感疫苗用免疫核糖核酸復(fù)合物(含200-500bp的iRNA)在的0.5—100ug/ml范圍內(nèi)，和流感疫苗抗原組分進(jìn)行充分混合，標(biāo)志為樣品組8，對照組樣品為流感亞單位疫苗，含血凝素為15IU/ml，不加任何輔助成分。表3:不同疫苗組不同時間的抗體滴度結(jié)果(實施例3-8結(jié)果，n=10)組別第14天第28天第42天第56天第70天樣品3d300±13840±16800±34600±42243±23樣品4A260±251160±35680±25457土26370±35樣品5V537±27880±20960±31640±31340±24樣品6°34±2280±22450±43420±28310±33樣品7°50±4320±30430±26270±24120±22樣品8*40±6340±18280±16230±3195±17對照組38±5210±20320±20160±17100±20根據(jù)實施例3-8所述的方法制備的脂質(zhì)體流感疫苗免疫效果一時間圖如下:P〈0.001，與樣品8組比較，P<0.001P<0.001，與樣品8組比較，P<0.001P〈0.001,與樣品8組比較，P<0.001P〈0.01，與樣品8組比較，P<0.001P〈0.05，與樣品8組比較，P〈0.05P〉0.05，與對照組比較，與對照組比較，與對照組比較，與對照組比較，'與對照組比較，「與對照組比較，10實施例10本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗的凍干水化法制備工藝包括如下步驟1、將脂質(zhì)體、膜材及附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比7:(r5):(13)溶于溶媒中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，除去有機溶媒，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成磷脂膜；2、加入磷酸緩沖液，4(T6(TC，超聲1(T20分鐘，形成脂質(zhì)體懸液；3、將脂質(zhì)體懸液與各疫苗抗原溶液混合，脂質(zhì)體粉碎均勻達(dá)到所需要的粒徑，加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥；4、采用濕熱法或鉆照射等方法滅菌，得到凍干粉劑；加無菌水、震蕩、再水化融合；得到脂質(zhì)體疫苗。實施例11本發(fā)明脂質(zhì)體流感亞單位疫苗的逆相蒸發(fā)法制備工藝包括如下步驟1、將脂質(zhì)體、膜材和附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比7:(15):(廣2)溶于溶媒中，加入流感抗原溶液，35~60°C，超聲處理1020分鐘，得到穩(wěn)定的油包水乳液；2、在4(T6(TC下減壓蒸發(fā)，得到膠態(tài)物質(zhì)；3、加入磷酸緩沖液，406(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)1(T20分鐘，除去微量有機溶媒，得到脂質(zhì)體水性混懸液，放置2(T40分鐘，透析2(T30小時，除去游離的未包入脂質(zhì)體的流感抗原；4、采用濕熱法或鈷照射等方法滅菌；5、得到免疫性脂質(zhì)體流感亞單位疫苗。本發(fā)明制備的免疫性脂質(zhì)體流感亞單位可以采用肌肉注射或皮下給藥。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明的脂質(zhì)體流感亞單位，它既能對Influenzavirus起到良好的預(yù)防作用，這種疫苗既能激發(fā)機體體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)性抗體，清除血循環(huán)中的病毒，又能激發(fā)T與B細(xì)胞免疫反應(yīng)，消滅病毒，從而達(dá)到徹底清除病毒。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體的膜帶有電荷，所述流感疫苗的抗原組分包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或鑲嵌于脂質(zhì)體膜中或由于電荷而吸附于膜上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述流感疫苗包括全病毒滅活流感疫苗，流感裂解型疫苗和流感亞單位疫苗。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述流感疫苗抗原組分包括流感病毒的血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)。4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)包括h1n1、h3n2和/或b。5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體流感疫苗單位劑量中含流感疫苗HA/NA組分的量是5ug—100ug。6.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述流感疫苗還包含免疫調(diào)節(jié)劑或附加劑。7.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑為細(xì)胞因子類蛋白，包括干擾素(ifn—a、IFN—p、IFN—y)，白介素(il-1、il一2、il-4、il14、il16)、胸腺肽al、免疫核糖核酸。8.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體為小單層和大多層脂質(zhì)體共存的脂質(zhì)體。9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述所述脂質(zhì)體球徑為505000nm。10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的脂質(zhì)體流感疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體的膜材包括卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、膽固醇、腦磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇乙酰、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、二棕櫚酰-dl-a磷脂酰膽堿、磷脂酰絲胺酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二垸基醚、膽固醇、十八胺、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸。11.根據(jù)上述1-1I中任^^一個權(quán)利要求所述的脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，其特征在于采用凍干水化法，包括如下步驟1)將脂質(zhì)體膜材及附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比(510):(1~7):(1~5)溶于溶媒中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，除去有機溶媒，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成磷脂膜；2)加入緩沖液，40~60°c，超聲1020分鐘，形成脂質(zhì)體懸液；3)將脂質(zhì)體懸液與流感疫苗抗原溶液混合，脂質(zhì)體粉碎均勻，加入冷凍保櫨劑，進(jìn)行冷凍干燥；4)滅菌，得到凍干粉劑；加無菌水、震蕩、再水化融合；得到脂質(zhì)體流感疫苗。12.根據(jù)權(quán)利要求12所述的脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的溶媒為二氯甲烷溶液或氯仿溶液；所述步驟2)中的緩沖液為pH值為5.4~7.8范圍內(nèi)的磷酸緩沖液、Tri-HCl緩沖液、碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。13.根據(jù)上述1-10中任一一個權(quán)利要求所述的脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，其特征在于采用逆相蒸發(fā)法，包括如下步驟1)將脂質(zhì)體膜材和附加劑或免疫調(diào)節(jié)劑以摩爾比(5~10):(1~7):(1~5)溶于溶媒中，加入流感疫苗抗原溶液，35~60°C，超聲處理10-20分鐘，得到穩(wěn)定的油包水乳液；2)在406(TC下減壓蒸發(fā)，得到膠態(tài)物質(zhì)；3)加入緩沖液，406(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓蒸發(fā)1020分鐘，除去微量有機溶媒，得到脂質(zhì)體水性混懸液，放置2040分鐘，透析，除去游離的未包入脂質(zhì)體的流感抗原；4)滅菌；得到脂質(zhì)體流感疫苗。14.根據(jù)權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的溶媒為二氯甲垸溶液或氯仿溶液；所述步驟2)中的緩沖液為pH值為5.4—7.8范圍內(nèi)的磷酸緩沖液、Tri-HCl緩沖液、碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。全文摘要本發(fā)明涉及生物預(yù)防醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種包裹生物藥物的用于流感防治的脂質(zhì)體疫苗。本發(fā)明是一種脂質(zhì)體流感疫苗，所述脂質(zhì)體的膜帶有電荷，所述流感疫苗的抗原組分包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或鑲嵌于脂質(zhì)體膜中或由于電荷而吸附于膜上。本發(fā)明脂質(zhì)體流感疫苗的制備方法，包括凍干水化法和逆相蒸發(fā)法。本發(fā)明的有益效果是使用了帶有電荷的脂質(zhì)體膜，使脂質(zhì)體包封抗原的包封率增大，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性更好；本發(fā)明的脂質(zhì)體疫苗同時可包裹流感疫苗的三種抗原，即H1N1、H3N2、B，使得該疫苗的保護(hù)范圍更廣；不僅能同時增強機體對三種抗原的免疫應(yīng)答，而且能快速的提升機體內(nèi)抗體水平，并能持久的對機體產(chǎn)生保護(hù)作用。文檔編號A61K47/28GK101502649SQ200810067900公開日2009年8月12日申請日期2008年6月23日優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日發(fā)明者張麗君,張根生,妍王,黃志立申請人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院