專(zhuān)利名稱(chēng)：：卵巢癌的檢測(cè)方法及抑制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以通過(guò)觀(guān)察卵巢癌的基因型對(duì)卵巢癌進(jìn)行初期診斷為目的，通過(guò)檢測(cè)特定染色體區(qū)域中存在的基因的變化來(lái)檢測(cè)癌癥的方法。
背景技術(shù)：
：卵巢癌(ovariancancer(OC))多發(fā)于50歲-70歲的女性，在婦科癌癥中為排名第2位的多發(fā)性癌癥，已知由卵巢癌引起的死亡人數(shù)多于其它的婦科癌癥。卵巢癌有多種類(lèi)型，分別是由卵巢中不同類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生的，但是約80%以上的卵巢癌為在卵巢的表面上發(fā)生的上皮癌。近年，盡管用于卵巢癌的診斷和治療的方法一直在發(fā)展，但是到目前為止仍然難以作到早期診斷。為此，強(qiáng)烈期望找到卵巢癌的致病基因并闡明其功能，從而建立起一種用于探索有效的治療和診斷標(biāo)記、進(jìn)行化學(xué)預(yù)防的新型戰(zhàn)略性見(jiàn)解。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問(wèn)題如果能夠闡明來(lái)源于卵巢、主要是來(lái)源于卵巢上皮的細(xì)胞發(fā)生癌化時(shí)在基因水平上的機(jī)制，就能夠在基因水平上發(fā)現(xiàn)來(lái)源于卵巢的細(xì)胞發(fā)生癌化、對(duì)卵巢癌的惡性程度進(jìn)行診斷以及對(duì)卵巢癌的發(fā)展進(jìn)行控制，進(jìn)一步，就應(yīng)該能夠根據(jù)該機(jī)制來(lái)篩選、開(kāi)發(fā)藥物或確立治療的方法。具體來(lái)說(shuō)，可以認(rèn)為，通過(guò)鑒定出在卵巢癌中顯示特征性行為的基因，并以該基因?yàn)橹行倪M(jìn)行技術(shù)上的研究，從而可以解決上述課題。即，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是鑒定出在卵巢癌等癌癥中顯示特征性行為的基因，從而提供一種癌癥的檢測(cè)方法及細(xì)胞增殖抑制劑。解決問(wèn)題的手段比較基因組雜交技術(shù)(ComparativeGenomicHybridization(CGH))是一種可用于解析伴隨基因組中多個(gè)基因的擴(kuò)增或缺失、或者基因失活所致的基因異常的簡(jiǎn)便、迅速、最佳方法。因此，為了解析與癌化和癌癥惡化等有關(guān)的基因組上的基因異常，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)在CGH陣列上載有的800種BAC/PACDNA進(jìn)行了CGH陣列分析(MCGCancerArray-800;TakadaH.,etal"CancerSci.96,100-105,2005)，成功地鑒定出了與促進(jìn)源自卵巢的細(xì)胞癌化有關(guān)的癌基因，即，成功地鑒定了結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connectivetissuegrowthfactor(CTGF))基因。然后，又成功地發(fā)現(xiàn)，CTGF基因的缺失或者失活，即CTGF蛋白質(zhì)的減少會(huì)顯著地促進(jìn)卵巢癌的增殖，而且，如果使CTGF基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)增加，卵巢癌的增殖會(huì)顯著地降低，由此完成了本發(fā)明。艮P，根據(jù)本發(fā)明，提供一種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)檢測(cè)存在于樣本的染色體區(qū)域2ql4.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、llql3.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15ql2、15ql5.1、17pl2、17pl3.1、17pl3.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20ql3.13、20ql3.2、20ql3.31、20ql3.33、Xpll.23、Xpl3.1、Xpl3.3、Xp26.2、Xp26.3、或Xp28中的基因發(fā)生的至少一種變化，來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。優(yōu)選的是，所述基因?yàn)镚LI2、CCND1、FGF3、TGFBR2、CDKN2A、MTAP、SMAD4、EVIl、MUC4、PTPN1、ZNF217、BCAS1、TFAP2C、BIRC7、TNFRSF6B、VEGFC、KLF12、FGF14、EFNB2、GABRB3、RAD51、RH68621、PMP22、RCV1、HSXIAPAF1、ABR、HIC1、MADH4(SMAD4)、DCC、MALT1、GRP、SERPINB5、FVT1、BCL2、SERPINB3、BCL2、CTDP1、SHGC-145820、SSX1、AR、MLLT7、ABCB7、GPC3、FGF13、MAGEA2、KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、禾卩CTGF中的至少一個(gè)。優(yōu)選的是，所述基因的變化為基因擴(kuò)增、缺失和失活中的至少一種。優(yōu)選的是，所述基因的變化是由CpG島的甲基化而引起的失活。優(yōu)選的是，在樣本中，通過(guò)檢測(cè)由權(quán)利要求2所述的基因所翻譯的蛋白質(zhì)的量來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)其惡性程度。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫組化方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的量。優(yōu)選的是，通過(guò)檢測(cè)CTGF基因的缺失或失活來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)其惡性程度。優(yōu)選的是，所述樣本為源自卵巢的組織。優(yōu)選的是，所述癌癥為卵巢癌。優(yōu)選的是，采用DNA芯片法、Southern印跡法、Northern印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法、CGH法、或陣列CGH法、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、COBRA法對(duì)所述基因的變化進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因、或者將作為該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，在體外導(dǎo)入到細(xì)胞中。本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種細(xì)胞增殖抑制劑，其含有KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因、或作為該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種細(xì)胞增殖激活劑，其含有KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因。本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種物質(zhì)的篩選方法，其為針對(duì)由于其中的KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的CpG島被甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的卵巢癌，使該卵巢癌與待測(cè)物質(zhì)接觸以檢測(cè)所述基因的表達(dá)，當(dāng)與未接觸待測(cè)物7質(zhì)的體系相比較，發(fā)現(xiàn)所述基因的表達(dá)增加時(shí)，可將該待測(cè)物質(zhì)篩選為可以通過(guò)將所述基因的CpG島脫甲基化而使該基因活化的抗腫瘤物質(zhì)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以切實(shí)地把握來(lái)源于卵巢的細(xì)胞樣本是否發(fā)生癌化及其惡性程度。而且，在卵巢癌中，通過(guò)導(dǎo)入基因表達(dá)失活的CTGF基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而可以抑制卵巢癌的增殖。而且，可以對(duì)作為由于CTGF基因表達(dá)失活而引發(fā)的卵巢癌的治療劑進(jìn)行篩選。在圖1中，圖1A表示24種卵巢癌細(xì)胞株中拷貝數(shù)的擴(kuò)增與缺失在全部基因組中的頻率。克隆基于UCSC作圖位置(http:〃genome.ucsc.edu/[versionMay,2004])按照1-22、X、Y染色體的順序進(jìn)行排列。星號(hào)表示確認(rèn)有高水平擴(kuò)增(log2比值X).4)、或有純合缺失(log2比值《0.4)的區(qū)域(表1)。圖1B表示在卵巢癌細(xì)胞株中的6q23.2染色體區(qū)域中確認(rèn)有擴(kuò)增。圖1B的上部為RMUG-S細(xì)胞株的代表性擴(kuò)增的陣列CGH圖像，6q23.2染色體區(qū)的BAC克隆的純合缺失可以由明顯的信號(hào)得到確認(rèn)(箭頭)。圖1B的下部為顯示RMUG-S細(xì)胞株的6q23.1-23.2的純合缺失區(qū)域的圖譜。用水平線(xiàn)表示的BAC(RP11-69I8)在陣列CGH解析中為純合缺失。RMUG-S細(xì)胞株中純合缺失的區(qū)域經(jīng)基因組PCR確定，用白色雙箭頭表示。RMUG-S細(xì)胞株中經(jīng)基因組PCR確定的位于純合缺失區(qū)域周?chē)?0個(gè)基因、純合缺失(8個(gè)基因)或殘留基因(2個(gè)基因)用箭頭表示。圖1C表示卵巢癌細(xì)胞株中位于6q23純合缺失區(qū)域周?chē)幕虻幕蚪MPCR和RT-PCR分析結(jié)果。圖1C的上部為通過(guò)基因組PCR在一個(gè)卵巢癌細(xì)胞株中確認(rèn)有CTGF、ENPP1、ENPP3、CRSP3、ARG1、AKAP7、EPB41L2、KIAA1913的純合缺失。1:HT、2:HTOA、3:HUOA、4:KF28、5:MH、6:OVKATE、7:OVSAHO、8:KFrl3、9:HMKOA、10:MCAS、ll:RMUG-L、12:RMUG-S、13:KK、14:OVISE、15:OVMANA、16:OVTOKO、17:RMG-I、18:RMG-II、19:ES-2、20:W3UF、21:HI0Anu、22:HMOA、23:HNOA、24:HTBOA。圖1C的下部為由RT-PCR確認(rèn)卵巢癌細(xì)胞株、源自正常卵巢和源自正常卵巢上皮細(xì)胞的細(xì)胞株(OSE-2a)中CTGF、ENPP1、ENPP3、CRSP3、AKAP7、EPB41L2、KIAA1913基因的mRNA表達(dá)。箭頭表示經(jīng)基因組PCR分析顯示出純合缺失的細(xì)胞株。在多數(shù)的卵巢癌細(xì)胞株中，CRSP3、AKAP7、EPB41L2的mRNA顯示出或多或少的減少。而且，ENPP1、ENPP3、CTGF的mRNA的表達(dá)高頻率地消失。在23個(gè)細(xì)胞株中，因純合缺失以外的原因而使CTGF基因表達(dá)減少的為12種(50%)。圖1D為用5-aza-dCyd(5pM)處理5天/或用TSA(100ng/ml)處理12小時(shí)(經(jīng)處理的為+、未經(jīng)處理的為-)后的卵巢癌細(xì)胞株(HNOA和RMG-I)中CTGF基因的RT-PCR的分析結(jié)果。圖2表示的是在卵巢癌細(xì)胞株和卵巢癌臨床樣本中CTGF的富含CpG區(qū)的甲基化狀態(tài)。圖2A為包括CTGF基因外顯子1周?chē)腃pG島(白色箭頭)在內(nèi)的富含CpG區(qū)的概略圖以及亞硫酸氫鹽測(cè)序的代表性結(jié)果。CpG部位用豎線(xiàn)表示。外顯子l用空白窗口表示，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)記為+1。啟動(dòng)子分析中所使用的片段用粗黑線(xiàn)表示。COBRA和亞硫酸氫鹽測(cè)序所確定的區(qū)域用灰線(xiàn)表示。用于COBRA法的限制酶部位BstUI用黑色箭頭表示。還顯示出了表達(dá)CTGF的卵巢癌細(xì)胞株(+)和未表達(dá)CTGF的卵巢癌細(xì)胞株(-)中所檢測(cè)的富含CpG區(qū)的亞硫酸氫鹽測(cè)序的代表性結(jié)果。各白色和黑色的方塊分別表示非甲基化和甲基化的CpG部位。每列來(lái)自一種克隆。用于MSP的PCR引物用箭頭表示。圖2B表示的是BstUI消化后的卵巢癌細(xì)胞株中CTGFCpG島的COBRA法檢測(cè)的代表性結(jié)果。箭頭表示甲基化CpG部位被特異性消化后的片段。箭頭表示未被消化的片段中非甲基化的CpG。圖2C表示的是CTGF富含CpG區(qū)的啟動(dòng)子活性。構(gòu)建了pGL3空載體(mock)和包含CpG島區(qū)域片段1-3不同序列的報(bào)告基因質(zhì)粒。將這些構(gòu)建體與內(nèi)部對(duì)照載體(pRL-hTK)同時(shí)轉(zhuǎn)化到RMUG-S細(xì)胞、KK細(xì)胞、KF28細(xì)胞中。相對(duì)于對(duì)照物，將熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示的是3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值士SD。圖2D中，上部左側(cè)表示的是卵巢癌臨床樣本中CTGF啟動(dòng)子區(qū)域的MSP分析的代表性結(jié)果。同時(shí)采用對(duì)于非甲基化(U)DNA或甲基化(M)DNA具有特異性的引物進(jìn)行研究。圖2D中，下部表示的是通過(guò)對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行亞硫酸氫鹽測(cè)序確定了CTGF啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。圖2D中，上部的右側(cè)表示的是除了粘液型腫瘤以外的43種卵巢癌臨床樣本中，由MSP所確定的CTGF的甲基化狀態(tài)和由RT-PCR所確定的mRNA表達(dá)狀態(tài)之間的相關(guān)關(guān)系。圖3表示的是卵巢癌臨床樣本中CTGF表達(dá)的免疫組化分析。其中圖3A表示的是正常人卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌臨床樣本中代表性的CTGF免疫化學(xué)染色。在圖3A中，左側(cè)表示的是在正常卵巢上皮細(xì)胞中可見(jiàn)到CTGF的高表達(dá)，中間和右側(cè)表示的是在卵巢癌臨床樣本的癌細(xì)胞中可見(jiàn)到CTGF表達(dá)較高(中間)、或者幾乎沒(méi)有表達(dá)(右)的結(jié)果。在正常上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中，CTGF清楚地局部分布在細(xì)胞質(zhì)的頂點(diǎn)。倍率為x200。圖3B表示的是相對(duì)于卵巢癌患者的全體的存活率的卡普蘭邁耶曲線(xiàn)。在圖3B中，左側(cè)表示的是在各期的腫瘤中，由免疫組化法確定為CTGF表達(dá)低的患者比CTGF表達(dá)高的患者顯示出更好的存活率(P=0.128、Log-rank檢驗(yàn))，中間表示的是在.I期和II期的腫瘤中，由于CTGF表達(dá)高的患者組沒(méi)有出現(xiàn)死亡，所以無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但是，CTGF表達(dá)低的患者比CTGF表達(dá)高的患者還是顯示出存活率縮短的傾向，右側(cè)表示的是在III期和IV期的腫瘤中，CTGF表達(dá)高的患者比CTGF表達(dá)低的患者顯示出更短的存活率(P=0.189、Log-rank檢驗(yàn))。圖3C表示的是相對(duì)于60歲以下的處于III期和IV期的卵巢癌患者的全體存活率的卡普蘭*邁耶曲線(xiàn)。當(dāng)僅限于60歲以下的、與轉(zhuǎn)移現(xiàn)象相關(guān)的III期和IV期的卵巢癌患者時(shí)，盡管分析中所包含的患者只有少數(shù)的病例，但CTGF表達(dá)高的患者比CTGF表達(dá)低的患者還是明顯地顯示出存活率更短(P=0.033、Log-rank檢驗(yàn))。圖4表示的是CTGF基因表達(dá)對(duì)卵巢癌增殖的效果(A、B)。將pCMV-3Tag4-CTGF或pCMV-3Tag4-mock轉(zhuǎn)化到CTGF基因缺失的細(xì)胞株(HNOA、HMOA)中。圖4A表示的是用從轉(zhuǎn)化后48小時(shí)的細(xì)胞中所提取的蛋白質(zhì)10|ig，采用抗Myc抗體進(jìn)行Western印跡分析。B表示的是對(duì)不表達(dá)CTGF基因的細(xì)胞株(HNOA、HMOA)進(jìn)行菌落形成分析。向這些細(xì)胞中瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化包含CTGF基因的Myc標(biāo)簽載體(pCMV-3Tag4-CTGF)或者空載體(pCMV-3Tag4-niock)。在G418的存在下進(jìn)行藥物篩選2周。在圖4B中，上部表示的是轉(zhuǎn)化2周后形成耐藥性菌落的結(jié)果。轉(zhuǎn)化有CTGF基因的細(xì)胞所形成的菌落比轉(zhuǎn)化有空載體的細(xì)胞要少；下部表示的是對(duì)菌落形成的定量分析，計(jì)數(shù)〉2mm的菌落個(gè)數(shù)，其結(jié)果用三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值土SD來(lái)表示。具體實(shí)施例方式下面進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。(1)癌癥的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的癌癥檢測(cè)方法的特征在于，通過(guò)存在于檢測(cè)樣本的染色體區(qū)域2ql4.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、Ilql3.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15ql2、15ql5丄17pl2、17pl3.1、17pl3.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20ql3.13、20ql3.2、20ql3.31、20ql3.33、Xpll.23、Xpl3.1、Xpl3.3、Xp26.2、Xp26.3、或Xp28中的基因發(fā)生的至少一種變化，來(lái)檢測(cè)樣本的包括惡性程度的癌化。更具體來(lái)說(shuō)，上述基因可以是選自GLI2、CCND1、FGF3、TGFBR2、CDKN2A、MTAP、SMAD4、EVIl、MUC4、PTPN1、ZNF217、BCAS1、TFAP2C、BIRC7、TNFRSF6B、VEGFC、KLF12、FGF14、EFNB2、GABRB3、RAD51、R腦621、PMP22、RCV1、HSXIAPAF1、ABR、HIC1、MADH4(SMAD4)、DCC、MALT1、GRP、SERPINB5、FVT1、BCL2、SERPINB3、BCL2、CTDP1、SHGC-145820、SSX1、AR、MLLT7、ABCB7、GPC3、FGF13、MAGEA2、KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、和CTGF中的至少一個(gè)。特別優(yōu)選的是，通過(guò)檢測(cè)來(lái)源于卵巢的細(xì)胞中的CTGF基因的缺失或失活，可以檢測(cè)出樣本的包括惡性程度的癌化。根據(jù)人基因組計(jì)劃的成果，CTGF基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是已知的，該基因?yàn)榇嬖谟?q23染色體區(qū)域中的一個(gè)基因。已經(jīng)知道的是，CTGF基因的編碼蛋白屬于CCN(CTGF、CYR61、NOV)家族，與血管的形成、骨骼的形成、腎臟疾病、皮膚疾病等的生化學(xué)及病理學(xué)過(guò)程廣泛相關(guān)。但其詳細(xì)的功能尚不明。還未發(fā)現(xiàn)該CTGF基因是一種重要的與卵巢癌的發(fā)病或惡性程度相關(guān)的癌相關(guān)基因。如上所述，本發(fā)明檢測(cè)方法的特征在于，對(duì)來(lái)源于卵巢的細(xì)胞或卵巢癌中的CTGF基因的缺失或失活進(jìn)行檢測(cè)。作為檢測(cè)CTGF基因的缺失或失活的對(duì)象的來(lái)源于卵巢的細(xì)胞或卵巢癌，最好是樣本提供者的活檢組織細(xì)胞。該樣本組織細(xì)胞無(wú)論是來(lái)源于健康人卵巢的細(xì)胞還是卵巢癌患者的癌組織，實(shí)際上，主要的受檢對(duì)象都是這樣的組織根據(jù)檢査等的結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢中存在有疑似癌化的病變部位時(shí)的病變組織；或者為已經(jīng)確診為卵巢癌，但需要判定其惡性程度和進(jìn)展程度的卵巢癌的組織等。根據(jù)本檢測(cè)方法，在"根據(jù)檢査等的結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢中存在有疑似癌化的病變部位時(shí)的病變組織"中確認(rèn)CTGF存在基因缺失或失活的情況下，如果判定該病變組織正在進(jìn)行癌化，或者已經(jīng)處于癌化狀態(tài)、并且惡性程度在持續(xù)增加，提示需要及早地進(jìn)行正式治療(通過(guò)手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。另外，在"已經(jīng)確診為卵巢癌，但需要判定其惡性程度和進(jìn)展程度的卵巢癌的組織"中確認(rèn)存在CTGF基因的缺失或失活的情況下，如果判定癌組織的惡性程度在持續(xù)增加，也提示需要及早地進(jìn)行正式治療(通過(guò)手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。作為樣本而采集的卵巢癌組織經(jīng)過(guò)必要的處理(例如，由所采集的細(xì)胞來(lái)制備DNA或RNA)后可以用作進(jìn)行本檢測(cè)方法的對(duì)象。(2)CTGF基因缺失的檢測(cè)作為可直接進(jìn)行CTGF基因缺失檢測(cè)的代表性方法，可以列舉CGH(比較基因組雜交，comparativeGenomicHybridization)法、FISH(熒光原位雜交，F(xiàn)luorescenceInSituHybridization)法。該實(shí)施方案中的本檢測(cè)方法為這樣的方法對(duì)具有CTGF基因的BAC(細(xì)菌人工染色體，BacterialArtificialChromosome)DNA、YAC(酵母人工染色體，YeastArtificialChromosome)DNA、PAC(PI衍生的人工染色體，PI-derivedArtificialChromosome)DNA(下面也稱(chēng)為BACDNA等)進(jìn)行標(biāo)記后，進(jìn)行FISH檢測(cè)，即可以檢測(cè)出是否存在CTGF基因(即，CTGF基因是否缺失)。具體來(lái)說(shuō)，作為含有CTGF基因的BACDNA，可以列舉RP11-69I8等。采用固定有基因組DNA的基質(zhì)來(lái)進(jìn)行上述實(shí)施方案中的方法是合適的，而且在現(xiàn)實(shí)中也是這樣進(jìn)行的。通過(guò)制造多個(gè)基因組DNA的固定基質(zhì)來(lái)實(shí)用化時(shí)，由于通常所得到的BACDNA的量很少，所以就需要將該DNA作為基因擴(kuò)增產(chǎn)物而獲得(該基因擴(kuò)增過(guò)程也稱(chēng)為"無(wú)窮化")。在該無(wú)窮化過(guò)程中，首先將BACDNA等用識(shí)別4堿基的酶(例如Rsal、Dpnl、HaeIII)等消化以后，加入連接物進(jìn)行連接。連接物為由10-30個(gè)堿基、合適的是由15-25個(gè)堿基組成的寡核苷酸，具有2條互補(bǔ)序列的鏈，退火以后，形成平滑末端一側(cè)的3'末端的寡核苷酸需要磷酸化。接下來(lái)，采用與連接物一方的寡核苷酸具有相同序列的引物，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReaction)法進(jìn)行擴(kuò)增，即可以實(shí)現(xiàn)無(wú)窮化。另一方面，可以將各BACDNA等中的特征性的50-70個(gè)堿基的氨基化寡核苷酸作為檢測(cè)用探針。這樣，通過(guò)將無(wú)窮化的BACDNA等固定于基質(zhì)上、特別合適的是固定于固體基質(zhì)上，即可以制備出所希望的DNA固定化基質(zhì)。所述固體基質(zhì)優(yōu)選為玻璃板。玻璃等固體基質(zhì)更優(yōu)選通過(guò)聚-L-賴(lài)氨酸、氨基硅烷、金，鋁等的沉積將該基質(zhì)進(jìn)行包被。點(diǎn)接于基質(zhì)上的上述無(wú)窮化的DNA的濃度優(yōu)選為10pg*l5貼小1，更優(yōu)選為lng/W200ng/|al。點(diǎn)接量?jī)?yōu)選為lnll|il，更優(yōu)選為10nl100nl。另外，對(duì)固定于基質(zhì)上的各個(gè)點(diǎn)的大小和形狀不特別限定，例如，大小可以為直徑0.01mmlmm，從上面看的形狀可以為圓形至橢圓形。對(duì)干燥點(diǎn)的厚度也不特別限定，為1pm至100pm。進(jìn)一步，點(diǎn)的個(gè)數(shù)不特別限定，每個(gè)使用的基質(zhì)上為10個(gè)50,000個(gè)點(diǎn)，更優(yōu)選為100個(gè)5,00Q個(gè)點(diǎn)。雖然各個(gè)DNA的點(diǎn)接次數(shù)在一次至四次的范圍內(nèi)，但優(yōu)選兩次重復(fù)或三次重復(fù)點(diǎn)接。干燥點(diǎn)的制備(例如)可以通過(guò)采用點(diǎn)樣儀將無(wú)窮化的BACDNA等滴接于基質(zhì)上，形成多個(gè)點(diǎn)以后，將點(diǎn)干燥而制得。點(diǎn)樣儀可以使用噴墨式打印機(jī)、針式陣列打印機(jī)、雙噴射式(注冊(cè)商標(biāo))打印機(jī)，優(yōu)選使用噴墨式打印機(jī)。例如，可以使用GENESHOT(日本名古屋市的力'<^株式會(huì)社生產(chǎn))等。這樣，通過(guò)將無(wú)窮化的BACDNA等固定于基質(zhì)上，特別合適的是固定于固體基質(zhì)上，即可以制備出所希望的DNA固定化基質(zhì)。另外，作為直接檢測(cè)該CTGF基因缺失的手段之一，可以列舉Southern印跡法。Southern印跡法是將從樣本得到的基因組DNA分離并固定，通過(guò)檢測(cè)該基因組DNA與CTGF基因的雜交來(lái)檢測(cè)樣本中該基因存在的方法。而且，也可以通過(guò)Northern印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法進(jìn)行CTGF基因的缺失檢測(cè)。Northern印跡是一種將由樣本中獲得的mRNA分離、固定，通過(guò)檢測(cè)該mRNA與CTGF基因的雜交、從而檢測(cè)該樣本中該基因的mRNA存在的一種方法。實(shí)時(shí)RT-PCR法是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增、并實(shí)時(shí)進(jìn)行測(cè)定的一種方法，根據(jù)擴(kuò)增倍率即可以對(duì)作為模板的mRNA進(jìn)行定量。該定量可以采用熒光色素來(lái)進(jìn)行，有兩種方法。即采用在雙鏈DNA中特異性插入(intercalate)發(fā)出熒光的色素(例如，SYBR綠)的方法，以及采用使熒光色素結(jié)合在擴(kuò)增的DNA序列中的特異性寡核苷酸上的探針的方法。(3)CTGF基因失活的檢測(cè)已有報(bào)道，當(dāng)富含CpG的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域發(fā)生密集甲基化時(shí)就會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活(BirdA.P.,etal.,Cell,99,451-454，1999)。在癌細(xì)胞中，與其它區(qū)域相比，CpG島存在高頻率的且密集的甲基化，啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化(hypermethylation)與癌癥中的癌抑制基因的失活緊密相關(guān)(EhrlichM.,etal.,Oncogene,21,6694-6702,2002)。如后所述，實(shí)際上，CTGF基因的外顯子中存在的CpG島具有啟動(dòng)子活性，而且，該CpG島甲基化的程度與一部分卵巢癌中的CTGF基因的表達(dá)抑制強(qiáng)烈相關(guān)。而且，通過(guò)在作為脫甲基化試劑的5-氮脫氧胞嘧啶(5-aza-dCyd)的存在下培養(yǎng)卵巢癌，可以使CpG島脫甲基化，其結(jié)果是，可以使CTGF基因的表達(dá)恢復(fù)。根據(jù)這些結(jié)果可以判斷，CpG島的高頻率甲基化(hypermethylation)是高頻率地引發(fā)卵巢癌中的癌抑制基因表達(dá)抑制的原因之一。通過(guò)上述檢測(cè)方法，對(duì)于被判斷為CTGF基因表達(dá)量減少的樣本細(xì)胞(來(lái)源于癌組織的原發(fā)癌細(xì)胞)，使該細(xì)胞與脫甲基化試劑(5-氮脫氧胞嘧啶)發(fā)生作用，從而使基因的表達(dá)量恢復(fù)。即，在使脫甲基化試劑與樣本細(xì)胞發(fā)生作用、從而使基因的表達(dá)量恢復(fù)的情況中，樣本細(xì)胞中的基因受到抑制的主要原因?yàn)镃pG島的甲基化，所以通過(guò)對(duì)樣本提供者給予具有脫甲基化作用的藥物，預(yù)期可獲得相應(yīng)的抗腫瘤效果。(4)細(xì)胞增殖的抑制方法以及細(xì)胞增殖抑制劑本發(fā)明進(jìn)一步提供一種抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因、或?qū)⒆鳛樵摶虻谋磉_(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，在體外導(dǎo)入細(xì)胞中。并且，本發(fā)明還提供一種含有上述基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞增殖抑制劑。在處理KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因時(shí)，其可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員采用公知的技術(shù)從培養(yǎng)細(xì)胞等中獲得的cDNA,也可以是采用PCR法等通過(guò)酶學(xué)方法而合成的DNA。在采用PCR法獲得DNA時(shí)，使用人染色體DNA或cDNA庫(kù)作為模板，使用經(jīng)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以使得目標(biāo)堿基序列可以得到擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增得到的DNA片斷可以被克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，其中該載體在大腸桿菌等宿主中能夠增殖。KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的檢測(cè)探針或引物的制備、以及目標(biāo)基因的克隆等操作對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)均是已知的，例如，可以參照1989年冷泉港實(shí)驗(yàn)室(冷泉港，紐約)編著的"MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版)"，或JohnWiley&Sons(19871997)年出版的"CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement138，，等記載的方法進(jìn)行制備。KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因可以重組入載體中以重組載體的形式使用。載體為病毒載體或動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體，優(yōu)選使用病毒載體。作為病毒載體，可以列舉逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、桿狀病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體等。其中，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在感染細(xì)胞以后病毒基因組整合進(jìn)入宿主染色體內(nèi)，從而可以使整合進(jìn)入載體內(nèi)的外源基因能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地表達(dá)，所以特別優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體例如可以采用pCXN2(Gene,1991年第108巻第193-200頁(yè))、PAGE207(日本特開(kāi)平6-46841號(hào)公報(bào))或其變體等。將上述重組載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦羞M(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)即可以進(jìn)行生產(chǎn)。當(dāng)重組載體為病毒載體時(shí)，.導(dǎo)入該載體的宿主可以采用具有產(chǎn)生病毒能力的細(xì)胞，例如，COS-7細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BALB/3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的宿主可以使用甲CRE、甲CRIP、MLV等；腺病毒載體及腺相關(guān)病毒載體的宿主可以是來(lái)源于人胎兒腎臟的293細(xì)胞等?？梢圆捎昧姿徕}法等將病毒載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。而重組載體為動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體時(shí)，導(dǎo)入該載體的宿主可以使用大腸桿菌K12菌株、HB101菌株、DH5a菌株等，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所得到的轉(zhuǎn)化體分別在合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。例如，大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用含有生長(zhǎng)發(fā)育所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)物以及其它物質(zhì)的pH58左右的液體培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。通常在1543'C下培養(yǎng)約824小時(shí)左右。此時(shí)，在培養(yǎng)結(jié)束以后，目的重組載體可以通過(guò)通常的DNA分離純化方法制得。此外，動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)例如可以使用含有約5~20%胎牛血清的199培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約68。通常在3040。C下培養(yǎng)約18~60小時(shí)。此時(shí)，由于含有該載體的病毒粒子釋放于培養(yǎng)上清中，所以可以通過(guò)氯化銫離心法、聚乙二醇沉淀法、過(guò)濾濃縮法等對(duì)病毒粒子進(jìn)行濃縮和純化而獲得目的重組載體。本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑可以通過(guò)將作為有效成分的上述基因與基因治療劑中通常使用的基劑一起配合而制得。而且，當(dāng)將上述基因重組整合進(jìn)入病毒載體中時(shí)，制備含有重組載體的病毒粒子，將其與基因治療劑中通常使用的基劑一起配合。為了配制作為有效成分的上述基因或蛋白質(zhì)，所使用的基劑可以使用通常注射液中使用的基劑，例如，蒸餾水、氯化鈉或氯化鈉與無(wú)機(jī)鹽的混合物等的鹽溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液、有機(jī)酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液的混合溶液等?；蛘撸鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常用方法，也可以在這些基劑中使用滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、植物油、表面活性劑等佐劑，以溶液、懸濁液、分散液的形式配制為注射劑。這些注射劑可以通過(guò)粉末化、凍干等操作制備為用時(shí)溶解的制劑。本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑的給藥形式可以是通常的靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)等的全身給藥方式，或者也可以是局部注射或經(jīng)口給藥等局部給藥方式。此外，當(dāng)細(xì)胞增殖抑制劑在給藥時(shí)，也可以采用與插管技術(shù)、基因?qū)爰夹g(shù)、或者外科手術(shù)等的組合給藥形式。本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑的給藥量因患者年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型等而異，但一般來(lái)說(shuō)，成年人每日攝入的重組基因的重量在1(ig/kg體重至1000mg/kg體重左右的范圍內(nèi)，優(yōu)選為從10嗎/kg體重至100mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。給藥次數(shù)不作特別限定。(5)細(xì)胞增殖的激活方法及細(xì)胞增殖激活劑根據(jù)本發(fā)明，提供一種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。而且提供一種含有上述siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因的細(xì)胞增殖激活劑。siRNA為約20個(gè)堿基(例如為約2123個(gè)堿基)或者不足20個(gè)堿基長(zhǎng)度的雙鏈RNA。通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)這種siRNA，即可以抑制作為該siRNA的靶標(biāo)的基因(在本發(fā)明中為KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF)的表達(dá)。只要能夠引發(fā)RNAi，本發(fā)明中所使用的siRNA可以是任何形式。這里，所謂"siRNA，，是"短干擾RNA(shortinterferingRNA)"的簡(jiǎn)稱(chēng)，或者是人工化學(xué)合成的，或者是生物化學(xué)方法合成的，或者是在生物體內(nèi)合成的，或者是約40個(gè)堿基以上的雙鏈RNA在體內(nèi)分解為10個(gè)堿基對(duì)以上的短雙鏈RNA。通常，其具有5'-磷酸、3'-OH的結(jié)構(gòu)，3'末端有約2個(gè)突出的堿基。該siRNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，RNA-induced-silencing-complex)。該復(fù)合物能夠識(shí)別與該siRNA具有相同序列的mRNA并與之結(jié)合，通過(guò)RNaseIII樣的酶活性，在siRNA的中部將mRNA切斷。優(yōu)選的是，siRNA的序列與作為切斷靶標(biāo)的mRNA的序列100%一致，但是，在siRNA的中間斷掉的位置上的堿基不一致的情形下，多數(shù)情況下RNAi的切斷活性還會(huì)部分殘留，所以也可不必100%—致。優(yōu)選的是，siRNA的堿基序列與表達(dá)應(yīng)該被抑制的KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的堿基序列之間具有同源性的區(qū)域不包含該基因的翻譯起始區(qū)。原因在于由于預(yù)想到在翻譯起始區(qū)中siRNA會(huì)與各種轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子結(jié)合，從而在效果上就會(huì)不能與mRNA結(jié)合，可以預(yù)測(cè)其效果會(huì)降低。因此，具有同源性的序列，優(yōu)選為距離該基因翻譯起始區(qū)20個(gè)堿基，更優(yōu)選為距離該基因翻譯起始區(qū)70個(gè)堿基。具有同源性的序列例如可以是該基因3'末端附近的序列。根據(jù)本發(fā)明的另外一種實(shí)施形式，作為通過(guò)RNAi抑制目標(biāo)基因表達(dá)的因子，其還可以使用3'末端具有突出部的短的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)的shRNA(shorthairpinRNA)。所謂"shRNA"是指通過(guò)在單鏈RNA中包含部分回文結(jié)構(gòu)的堿基序列、從而在分子內(nèi)形成雙鏈結(jié)構(gòu)、形成類(lèi)似于發(fā)卡一樣的結(jié)構(gòu)的約20個(gè)堿基對(duì)以上的分子。這樣的shRNA被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)以后，在細(xì)胞內(nèi)被分解為約20個(gè)堿基(代表性地為例如21個(gè)堿基、22個(gè)堿基、23個(gè)堿基)的長(zhǎng)度，與siRNA—樣可以引發(fā)RNAi。如上所述，shRNA由于可以與siRNA—樣引發(fā)RNAi，在本發(fā)明中也可以有效地加以應(yīng)用。shRNA優(yōu)選具有3'突出末端。雖然雙鏈部分的長(zhǎng)度并不做特別限定，但優(yōu)選為約IO個(gè)核苷酸以上，更優(yōu)選為約20個(gè)核苷酸以上。這里，3'突出末端優(yōu)選為DNA，更優(yōu)選為至少2個(gè)核苷酸以上的DNA，進(jìn)一步更優(yōu)選為24個(gè)核苷酸的DNA。如上所述，在本發(fā)明中，作為可以通過(guò)RNAi來(lái)抑制KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的表達(dá)的因子，可以使用siRNA或者shRNA。siRNA的優(yōu)點(diǎn)在于O)即便是導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部，RNA本身也不會(huì)重組入正常細(xì)胞的染色體中，所以其不是一種能夠引起遺傳給后代的變異的治療方法，安全性高；以及，(2)短雙鏈RNA的化學(xué)合成比較容易，形成雙鏈形式更穩(wěn)定，等等。而shRNA的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)進(jìn)行治療時(shí)，可以制作在細(xì)胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄shRNA的載體，然后將其導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部。通過(guò)本發(fā)明中所使用的RNAi來(lái)抑制KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因表達(dá)的siRNA或者shRNA可以是人工化學(xué)合成，也可以將由正義鏈和反義鏈的DNA序列反向連接形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA通過(guò)T7RNA聚合酶在體外合成RNA而制備。體外合成時(shí)，使用T7RNA聚合酶和T7啟動(dòng)子，由模板DNA可以合成反義和正義的RNA。將它們?cè)隗w外退火以后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，即可以引發(fā)RNAi，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。這里，可以采用例如磷酸鈣法、或者各種轉(zhuǎn)染試劑(例如oligofectamine、lipofectamine禾口lipofection)將那些RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。上述siRNA或者shRNA可以作為細(xì)胞增殖激活劑使用。本發(fā)明的細(xì)胞增殖激活劑的給藥方法可以是經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥(例如靜脈給藥、肌肉給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、粘膜給藥、直腸給藥、陰道給藥、患病部位的局部給藥、皮膚給藥等等)、患部直接給藥等。本發(fā)明的制劑作為藥物組合物使用時(shí)，必要時(shí)可以添加藥學(xué)上許可的添加劑。藥學(xué)上許可的添加劑的具體例子可以列舉抗氧化劑、保存劑、著色劑、調(diào)味劑、以及稀釋劑、乳化劑、懸濁劑、溶劑、填料、增量劑、緩沖劑、傳輸介質(zhì)、稀釋劑、載體、賦形劑和/或藥學(xué)佐劑等。但并不僅限于這些。本發(fā)明的藥劑的制劑形式不作特別限定。例如可以列舉口服液劑、注射劑、緩釋劑等等。將本發(fā)明的藥劑作為上述制劑而用于處方時(shí)的溶劑可以是水性溶劑也可以是非水性溶劑。進(jìn)一步，本發(fā)明的細(xì)胞增殖激活劑的有效成分siRNA或者shRNA可以以非病毒載體或病毒載體的形式給藥。當(dāng)為非病毒載體的形式時(shí)，可以使用脂質(zhì)體導(dǎo)入核酸分子的方法(脂質(zhì)體法、HVJ-脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、Lipofectamine法等)、顯微注射法、用基因槍(GeneGun)與載體(金屬顆粒)一起將核酸分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的方法等。而當(dāng)將siRNA或者shRNA以病毒載體形式給藥于生物體時(shí)，可以使用重組腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體。在無(wú)毒化的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbisvims)、仙臺(tái)病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中導(dǎo)入能夠表達(dá)siRNA或者shRNA的DNA，使細(xì)胞或組織被該重組病毒感染，即可以將基因?qū)爰?xì)胞或組織中。根據(jù)使用目的、疾病的嚴(yán)重程度、患者年齡、體重、性別、既往史、或者作為有效成分的siRNA或者shRNA的種類(lèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定本發(fā)明的細(xì)胞增殖激活劑的給藥量。雖然siRNA或者shRNA的給藥量不作特別限定，例如可為約0.1ng/kg/日約100mg/kg/日，優(yōu)選為約lng/kg/日約10mg/kg/日。一般是給藥后l3日可見(jiàn)RNAi的效果。因此，優(yōu)選以1日3日一次的頻率給藥。使用表達(dá)載體時(shí)，可以按一周左右給藥一次。本發(fā)明中，也可以將反義寡核苷酸作為細(xì)胞增殖激活劑使用。本發(fā)明中所使用的反義寡核苷酸為與KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的DNA序列中的連續(xù)5100個(gè)堿基序列互補(bǔ)的、或雜交的核苷酸，也可以是DNA或RNA任意一個(gè)，或者，只要在功能上沒(méi)有損害，也可以是它們的修飾物。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂"反義寡核苷酸"，不僅指與構(gòu)成DNA或mRNA的預(yù)定區(qū)域的核苷酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸完全互補(bǔ)的核苷酸，只要DNA或mRNA與寡核苷酸能夠穩(wěn)定雜交，也可以存在一些錯(cuò)配。另外，反義寡核苷酸也可以進(jìn)行修飾。通過(guò)適當(dāng)?shù)男揎?，該反義寡核苷酸在生物體內(nèi)很難分解，更加穩(wěn)定，從而可以阻礙ITIIa。這種修飾后的寡核苷酸可以列舉為S-oligo型(硫代磷酸酯型)、C-5噻唑型、D-oligo型(磷酸二酯型)、M-oligo型(甲基磷酸酯型)、肽核酸型、磷酸二酯鍵型、C-5丙烯基嘧啶型、2-0-丙基核糖、2'-甲氧基乙氧基核糖型等修飾型的反義寡核苷酸。而且，反義寡核苷酸也可以是通過(guò)將構(gòu)成磷酸基團(tuán)的氧原子的至少一部分為硫原子取代而被修飾。這種反義寡核苷酸的核酸酶耐受性、水溶性、對(duì)RNA的親和性特別優(yōu)異。將構(gòu)成磷酸基團(tuán)的氧原子的至少一部分為硫原子取代而被修飾的反義寡核苷酸例如可以是S-01igo型等的寡核苷酸。反義寡核苷酸的堿基數(shù)優(yōu)選為小于或等于50個(gè)，更優(yōu)選為小于或等于25個(gè)。堿基數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致寡核苷酸的合成的工夫與成本大大增加，收率也會(huì)降低。而反義寡核苷酸的堿基數(shù)為大于等于5個(gè)，優(yōu)選為大于等于9個(gè)。堿基數(shù)小于等于4個(gè)時(shí)，對(duì)目標(biāo)基因的特異性降低，所以是不優(yōu)選的。反義寡核苷酸(或其衍生物)可以通過(guò)通常的方法合成，例如，通過(guò)市售的DNA合成裝置(例如AppliedBiosystems公司制造的等等)即可以很容易地合成。作為合成法，采用Phosphoroamidite的固相合成法、采用氫膦酸酯的固相合成法等等均可以獲得。在本發(fā)明中，當(dāng)反義寡核苷酸用作細(xì)胞增殖激活劑時(shí)，一般是以包含反義寡核苷酸和制劑用添加物(載體、賦形劑等)的藥物組合物的形式提供的。可以對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物以藥物形式給予反義21寡核苷酸。對(duì)反義寡核苷酸的給藥途徑不作特別限定，經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥(例如肌肉給藥、靜脈給藥、皮下給藥、腹腔給藥、鼻腔等粘膜給藥、或者吸入給藥等)中的任意一種均可。對(duì)反義寡核苷酸的制劑形式不作特別限定。經(jīng)口給藥的制劑例如可以列舉片劑、膠囊劑、細(xì)粒劑、粉末劑、顆粒劑、口服液劑、糖漿劑等；非經(jīng)口給藥的制劑例如可以列舉注射劑、滴劑、栓劑、吸入劑、黏膜吸收劑、皮膚吸收劑、滴鼻劑、滴耳劑等等。包含反義寡核苷酸的藥劑的形式、可使用的制劑用添加物、制劑的制造方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員均可適當(dāng)?shù)剡x擇。反義寡核苷酸的給藥量可以綜合考慮患者的性別、年齡、體重、疾病的嚴(yán)重程度、給藥目的為預(yù)防還是治療、或者其它合并癥狀的有無(wú)等等而適當(dāng)?shù)剡x擇，但一般給藥量為約0.1pg/kg體重/日100mg/kg體重/日，優(yōu)選為約0.1pg/kg體重/日10mg/kg體重/日。本發(fā)明中，也可以將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的功能缺陷型基因作為細(xì)胞增殖激活劑使用。所謂"功能缺陷型基因"是指在該基因中導(dǎo)入變異以使其功能缺失的基因。具體來(lái)說(shuō)，與此相對(duì)應(yīng)的基因?yàn)榉g一般被稱(chēng)為突變蛋白質(zhì)的基因，突變蛋白質(zhì)是指由該基因形成的氨基酸序列中至少一個(gè)組成氨基酸缺失、至少一個(gè)組成氨基酸被別的氨基酸取代、至少一個(gè)氨基酸被附加等原本的功能缺失的蛋白質(zhì)。當(dāng)功能缺失型基因作為細(xì)胞增殖激活劑使用時(shí)，可以通過(guò)將作為有效成分的上述基因與基因治療劑中通常使用的基劑共同配合而制備。而且，當(dāng)將上述基因重組入病毒載體時(shí)，制備含有該重組載體的病毒粒子，將其與基因治療劑中通常使用的基劑共同配合。上述基劑可以使用通常注射液中使用的基劑，例如，蒸餾水、氯化鈉或氯化鈉與無(wú)機(jī)鹽的混合物等的鹽溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有機(jī)酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液的混合溶液等?；蛘撸鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常用方法，也可以在這些基劑中使用滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、植物油、表面活性劑等佐劑，以溶液、懸濁液、分散液的形式配制成注射劑。這些注射劑可以通過(guò)粉末化、凍干等操作制備成用時(shí)溶解的制劑。功能缺失型基因的給藥形式可以是通常的靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)等全身給藥，或者也可以是局部注射或經(jīng)口給藥等局部給藥方式。給藥時(shí)，也可以采用與插管技術(shù)、基因?qū)爰夹g(shù)、或者外科手術(shù)等的組合給藥形式。功能缺失型基因的給藥量因患者年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型等等而異，但一般成年人每日攝入的重組基因的重量在l貼/kg體重至1000mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。優(yōu)選為從10pg/kg體重至100mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。給藥次數(shù)不作特別限定。另外，上述本發(fā)明的各種基因治療劑也可以在按常法制備的脂質(zhì)體懸濁液中添加基因、通過(guò)冷凍后融解而制得。調(diào)制脂質(zhì)體的方法有薄膜震蕩法、超聲波法、逆相蒸發(fā)法、表面活性劑去除法等。優(yōu)選的是，在超聲波處理脂質(zhì)體懸浮液以后，添加基因可以提高基因的包封率。包封有基因的脂質(zhì)體可以直接或與水、生理鹽水等混懸后靜脈給藥。(6)抗腫瘤物質(zhì)的篩選方法如上所述，對(duì)于卵巢癌，KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF基因的失活是主要的原因，因此，可以認(rèn)為，使這些基因的作用正?；乃幬锟捎米髀殉舶┑目鼓[瘤制劑。特別是，在該失活的主要原因是由于CTGF基因的CpG島發(fā)生甲基化的情況中，使這些主要原因得以解除、緩和的藥劑即可以用作抗腫瘤制劑。作為進(jìn)行這種篩選方法的前提，需要確保在樣本中存在CTGF基因的表達(dá)量被抑制的卵巢癌細(xì)胞。即，本發(fā)明的篩選方法中，需要的是"由于CTGF基因的CpG島發(fā)生甲基化而引起的CTGF基因表達(dá)被抑制的卵巢癌細(xì)胞"。在基于如上所述見(jiàn)解的基礎(chǔ)上，采用常法就可以建立這些細(xì)胞株。例如，從至少已經(jīng)被確認(rèn)為CTGF基因失活的細(xì)胞中，選擇使該細(xì)胞與已知的脫甲基化試劑(如5-氮脫氧胞嘧啶)進(jìn)行作用后CTGF基因水平得以恢復(fù)的細(xì)胞，將該細(xì)胞繼代培養(yǎng)，即可以建立"由于CTGF基因的CpG島發(fā)生甲基化而引起的CTGF基因表達(dá)被抑制的卵巢癌細(xì)胞"(以下也稱(chēng)為甲基化癌細(xì)胞株)。本發(fā)明的篩選方法中，需要將上述甲基化癌細(xì)胞株與待測(cè)物質(zhì)相接觸。對(duì)該接觸的方式不作特別限定，可以將待測(cè)物質(zhì)以適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)進(jìn)行稀釋后添加到甲基化細(xì)胞株的培養(yǎng)基中，接著進(jìn)行培養(yǎng)，從而使它們接觸。然后，定量測(cè)定添加待測(cè)物質(zhì)前甲基化癌細(xì)胞株中的CTGF基因的表達(dá)量，以及適當(dāng)?shù)亻g隔一定的時(shí)間定量測(cè)定添加待測(cè)物質(zhì)后的CTGF基因的表達(dá)量，將添加待測(cè)物質(zhì)前、后所測(cè)定的CTGF基因的表達(dá)量之差，與不添加待測(cè)物質(zhì)而在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)后的對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行比較，當(dāng)與對(duì)照培養(yǎng)物相比，如果添加待測(cè)物質(zhì)后的培養(yǎng)基中的CTGF基因表達(dá)量增加時(shí)，則將該待測(cè)物質(zhì)篩選作為在使用甲基化癌細(xì)胞株的試劑中的"通過(guò)使CTGF基因的CpG島脫甲基化而可以使CTGF基因得以活化的抗腫瘤物質(zhì)"。.另外，進(jìn)行本篩選方法時(shí)，也可以將篩選出來(lái)的有希望成為卵巢癌的抗腫瘤成分的物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)篩選，例如，適宜的是，以卵巢癌的增殖抑制效果和裸鼠的生存率得以提高為指標(biāo)，在植入有上述甲基化癌細(xì)胞株的裸鼠體內(nèi)進(jìn)行篩選，將范圍縮小到最終的候選物質(zhì)。下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因這些實(shí)施例而受到特定限制。實(shí)施例實(shí)施例l:卵巢癌中基因的變化為了檢測(cè)出卵巢癌中的新型基因變化，采用由24種卵巢癌細(xì)胞株(HT、HTOA、HUOA、KF28、MH、OVTOKO、OVSAHO、KFrl3、HMKOA、MCAS、RMUG國(guó)L、RMUG-S、KK、OVISE、OVMANA、OVTOKO、RMG-I、RMG-II、ES-2、W3UF、HIOAnu、HMOA、HNOA、HTBOA)制備的基因組DNA，采用MCGCancerArray-800來(lái)進(jìn)行CGH陣列分析(圖lA)。以來(lái)源于正常的卵巢上皮的細(xì)胞株(OSE-2a)所提取的基因組DNA為對(duì)照用Cy5進(jìn)行標(biāo)記；以由卵巢癌細(xì)胞株所制備的基因組DNA為被檢DNA采用Cy3進(jìn)行標(biāo)記。具體來(lái)說(shuō)，將DpnII消化的基因組DNA(0.5pg)、分別在0.6mMdATP、0.6mMdTTP、0.6mMdGTP、0.3mMdCTP、0.3mMCy3-dCTP(卵巢癌細(xì)胞)或者0.3mMCy5-dCTP(正常細(xì)胞)的存在下，用BioPrimeArrayCGHGenomicLabelingSystem(Invitrogen公司生產(chǎn))進(jìn)行豐示記。Cy3禾口Cy5標(biāo)記的dCTP購(gòu)自GEHealthcare公司。在Cot-1DNA(Invitrogen公司生產(chǎn))的存在下將兩種標(biāo)記的基因組DNA加入乙醇中使其沉淀，然后溶解于120"1的雜交混合液(50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖(Dextransulfate)、2XSSC(1XSSG150mMNaCl/15mM檸檬酸鈉)、4%十二烷基硫酸鈉、pH7.0)中，在37"C孵育30分鐘以后，將所得物加入在雜交儀(GeneTAC;八一"'一卜"、'<才廿<工>^公司)上設(shè)置的CGH陣列上，孵育4872小時(shí)。然后，將CGH陣列在50%甲酰胺/2XSSC溶液(pH7.0)中在5(TC下清洗15分鐘，接下來(lái)在2XSSC/0.1%SDS中于50'C下清洗15分鐘。風(fēng)干以后，將CGH陣列用GenePix4000B掃描儀(美國(guó)加利福尼亞州AxonInstruments公司制造)監(jiān)測(cè)來(lái)源于Cy3和Cy5的熒光。得到的結(jié)果用GenePixPro6.0成像軟件(美國(guó)加利福尼亞州AxonInstruments公司制造)進(jìn)行分析。將來(lái)源于Cy3的熒光強(qiáng)度的平均值和來(lái)源于Cy5的熒光強(qiáng)度的平均值調(diào)整為相同值，求得Cy3/Cy5的比值。當(dāng)在基因組中沒(méi)有異常時(shí)，Cy3/Cy5的比值為1(log2比值=0)，而該比值為1.32以上(log2比值為0.4以上)時(shí)判定為存在基因組擴(kuò)增，該比值為4以上(1og2比值為2以上)時(shí)判定為顯著擴(kuò)增。當(dāng)比值為0.75以下(log2比值為-0.4以下)時(shí)可判斷基因組有可能發(fā)生雜合子缺失，當(dāng)比值為0.25以下(1og2比值為-2以下)時(shí)可判定發(fā)生純合子缺失的可能性極大。其結(jié)果如表1和表2所示。在24種卵巢癌中，發(fā)生高水平的基因擴(kuò)增的為2種，可以確認(rèn)2個(gè)基因座。而在24種卵巢癌中，發(fā)生基因缺失的為3種，可以確認(rèn)4個(gè)基因座。表1使用MCGCancerit!CGHM測(cè)分析所濺定的在24.種卵巢澆細(xì)胞株中的為'水平擴(kuò)(l鄰2比値>2.0)IB純ff缺火《tog2比鎮(zhèn)<-2.0)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>11報(bào)據(jù)UCSCGtm(加eBrowser(2加4年5月版)i'位干BAC周醜的可能的致癌SM或腫瘤'抑制蓰因表:2補(bǔ)充袞S2在使用MCGCweerA0鵬CGH陣,分折中發(fā)埂的頻舉溢處的瑜益靡缺失的究g<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>分別裉據(jù)kg2比值的閾誼0.4和-0,4來(lái)定義變化類(lèi)型為拷貝數(shù)據(jù)益或缺失..在該表中,拷貝數(shù)纖益的爽隆*缺失翁鬼a按照染色偉的位a來(lái)徘列，這fi克隆在超過(guò)40%的細(xì)胞株,表現(xiàn)出拷li數(shù)的傰差，實(shí)施例2:卵巢癌中6q23(6q23.1-23.2)染色體缺失區(qū)域中所含有的基因的分離為了詳細(xì)確定在卵巢癌細(xì)胞株中(RMUG-S)中新檢測(cè)出的6q23(6q23.1-23.2)染色體純合缺失區(qū)域中所包含的基因，首先，以從RMUG-S細(xì)胞中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行基因組PCR，由此確定純合缺失區(qū)域的范圍?；蚪MPCR中所使用的引物序列如表3所示。表3補(bǔ)充:農(nóng)Si本研究中所用的引物序列方法靶港H正向引物反向引物SH組PCRCOBRA和亞k酸^鹽溯序GTGFK域'K域K域^嵌套式!x:域"茲K域^"嵌套式5'-AGGAGCACTAATTTATTC丁3ATAAAAG■5'-A66GAACOCTCiGASGTAAAG.5'-eiT::3CASOSTa;Ti3TTTAAGW^GCGC了《3TCTC秘3TGAT5'-CA(3-4丁CA了G'SCATGGAACAA5'-TC站SA丁SAC丁OT3GAA丁CACT5'-TTQA'i5Ai3C，A'3AT泌TTAaTG5義TCGTGAGAGA'COGAeTGC改-TeGGCCATTCTTUTTTCATC'^"ACCTTTCCCAA4GGTT3C丁S^CACQAACAACCACAACATC5'《^CTAACTATCTCGTCTCAA^5:'-TC:CATAGTACACPAAAAGATAC4ACC由CGH陣列的結(jié)果及人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃genome.ucsc.edu/)可以確認(rèn)缺失區(qū)域中存在的基因(圖1B、圖1C)。結(jié)果顯示，該缺失區(qū)域存在有10種基因(圖1B)。其中，在RMUG-S細(xì)胞(1/24，4.2%;圖1C)中，可以確認(rèn)CTGF基因、ENPP1基因、ENPP3基因、CRSP3基因、ARG基因、AKAP7基因、EPB4L2基因、KIAA1913基因發(fā)生純合缺失。實(shí)施例3:卵巢癌細(xì)胞株中CTGF基因表達(dá)的消失以及DNA脫甲基化后的恢復(fù)為了了解上述7個(gè)基因(CTGF基因、ENPP1基因、ENPP3基因、CRSP3基因、ARG基因、AKAP7基因、EPB41L2基因、KIAA1913基因)的表達(dá)水平，對(duì)24種卵巢癌細(xì)胞株、正常卵巢細(xì)胞、來(lái)自正常卵巢上皮細(xì)胞的不死化細(xì)胞株(OSE-2a)進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄PCT(RT-PCR)。具體來(lái)說(shuō)，從培養(yǎng)的細(xì)胞株中提取RNA，采用SuperscriptFirst-strandSynthesisSystem(Invitrogen公司)，合成單鏈cDNA，采用表3所示的引物序列進(jìn)行PCR。另外，采用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH基因)作為對(duì)照物。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管CTGF基因、ENPP1基因、KIAA1913基因在6q23.1-23.2染色體區(qū)域中并不存在純合缺失，但與正常卵巢和OSE-2a細(xì)胞相比，其顯示出表達(dá)量減少(圖ID)?？梢哉J(rèn)為，這種現(xiàn)象是由于卵巢癌細(xì)胞株中除基因組缺失以外的機(jī)制(例如后生遺傳現(xiàn)象)所致。另外，在上述試驗(yàn)中，根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(ncbi.nlm.nih.gov禾nhttp:〃www.lsbm.org/database/index.html)的分析結(jié)果，ARG1基因在卵巢中并不表達(dá)，所以其不在研究之列。為了研究CTGF基因的表達(dá)抑制是否是由于DNA甲基化的原因所致，采用CTGF基因不表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株(HNOA、RMG-II)，用5|liM的脫甲基化試劑5-aza-dCyd處理5天，或者用100ng/ml的脫乙?；种苿㏕SA處理12小時(shí)。從這些細(xì)胞中提取RNA，用RT-PCR檢測(cè)CTGF基因的表達(dá)(圖1D)。其結(jié)果是，5-aza-dCyd處理以后，CTGF基因的基因表達(dá)得以恢復(fù)。由該結(jié)果可以明顯地推定，CTGF基因的表達(dá)抑制與DNA甲基化相關(guān)。而且，TSA處理后，并未見(jiàn)到CTGF基因的表達(dá)存在差異，由此明顯可以看出，CTGF基因的表達(dá)調(diào)節(jié)受組蛋白脫乙?；挠绊懶　?shí)施例4:卵巢癌細(xì)胞株中CTGF基因的CpG島的甲基化CpG島的甲基化是抑制基因表達(dá)的機(jī)制之一。采用CpGPLOT程序(http:〃www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot)分析了CTGF基因的CpG島，結(jié)果顯示，在CTGF基因的外顯子1、2的周?chē)嬖谟蠧pG島(圖2A)。為了確認(rèn)卵巢癌細(xì)胞株中CTGF基因表達(dá)的有無(wú)所導(dǎo)致的CTGF基因的CpG島的甲基化狀態(tài)，對(duì)三個(gè)區(qū)域(區(qū)域l、區(qū)域2、區(qū)域3)進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測(cè)序分析。具體來(lái)說(shuō)，使用EZDNA甲基化試劑盒(美國(guó)加利福尼亞州的ZymoRESEARCH生產(chǎn))，將源自卵巢癌細(xì)胞株的基因組DNA(2叫)在亞硫酸氫鈉中于5(TC下處理過(guò)夜，采用經(jīng)設(shè)計(jì)的引物(表3)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。將這些序列亞克隆入TOPOTA克隆載體(Invitrogen公司)中，確定其堿基序列。其結(jié)果是，在CTGF基因表達(dá)減少的細(xì)胞株(HTOA、HUOA、RMUG-L、RMG-I、HNOA、KF28)中，區(qū)域2和區(qū)域3被極度地甲基化(圖2A)。另外，在CTGF基因表達(dá)的細(xì)胞株(KK、OVISE)中，區(qū)域2的3'部分、區(qū)域2B和區(qū)域3也被甲基化。為了進(jìn)一步確定卵巢癌細(xì)胞株中CTGF基因的表達(dá)狀態(tài)與甲基化狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性，采用COBRA法進(jìn)行了解析。具體來(lái)說(shuō)，將上述得到的PCR產(chǎn)物用BstUI限制性?xún)?nèi)切酶(NewEnglandBioLabs)進(jìn)行消化，然后電泳檢測(cè)。利用BstUI不消化未被甲基化的但被亞硫酸氫鈉修飾的序列，而可消化發(fā)生甲基化的但未被亞硫酸氫鈉修飾的序列的性質(zhì)，檢測(cè)甲基化的程度。將PCR片段進(jìn)行電泳以后，采用MultiGauge2.0(富士7<A厶株式會(huì)社)根據(jù)密度測(cè)定法來(lái)測(cè)定甲基化片段的帶和未被甲基化片段的帶的濃度比，甲基化區(qū)域的甲基化程度用百分比表示(圖2A、圖2B)。其結(jié)果是，不論CTGF基因的表達(dá)狀態(tài)如何，幾乎所有的卵巢癌細(xì)胞株在區(qū)域1中均不存在甲基化的等位基因(圖2B)。另一方面，在CTGF基因表達(dá)缺失的卵巢癌細(xì)胞中，除了OVMANA細(xì)胞、OVTOKO細(xì)胞以外，在區(qū)域2中均可以確認(rèn)存在甲基化的等位基因(圖2B)。實(shí)施例5:CTGF基因的CpG島周邊序列的啟動(dòng)子活性為了研究該CpG島的啟動(dòng)子活性，將含有該CpG島周?chē)膮^(qū)域分為3個(gè)片段(片段1、片段2、片段3)，將這些片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-Basic載體，Promega公司生產(chǎn))中，并轉(zhuǎn)到卵巢癌細(xì)胞株(RMUG-S、KK、KF28)中(圖2C)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因陣列檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司生產(chǎn))，按照其操作指南測(cè)定熒光素酶的活性，測(cè)定含有各片段的pGL3載體所產(chǎn)生的熒光素酶活性(圖2C)。其結(jié)果顯示，含有區(qū)域2A的片段1和3的熒光素酶活性較高(圖3b)。由上述啟動(dòng)子分析的結(jié)果可以看出，區(qū)域2A的甲基化對(duì)CTGF基因表達(dá)的抑制發(fā)揮重要的作用。實(shí)施例6:卵巢癌臨床樣本中的CTGF啟動(dòng)子區(qū)的甲基化為了探明卵巢癌臨床樣本中的CTGF基因的甲基化，在66種卵巢癌臨床樣本中，采用以區(qū)域2A周?chē)募谆课粸槟繕?biāo)的引物組，進(jìn)行甲基化特異性PCR(Methylation-specificPCR(MSP))。結(jié)果如圖2D所示。亞硫酸氫鹽測(cè)序與COBRA的結(jié)果一致，可以確認(rèn)CTGF表達(dá)缺失的細(xì)胞株(RMUG-L)被甲基化，而表達(dá)CTGF的細(xì)胞株(0SE-2a)則未被甲基化(圖2D)。由結(jié)果可以確認(rèn)，在66種卵巢癌臨床樣本中有39種的CTGF高頻率地發(fā)生甲基化(59%,圖2D)。并且，通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在MSP分析中未被甲基化的腫瘤顯示出低頻率的甲基化模式；而在MSP分析中被甲基化的腫瘤則顯示出高頻率的甲基化模式(圖2D)。為了研究CTGF甲基化與卵巢癌臨床樣本中的基因沉默的關(guān)聯(lián)性，使用由43例卵巢癌臨床樣本制備的cDNA，用實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)確認(rèn)CTGF的mRNA的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果顯示，在進(jìn)行MSP分析時(shí)顯示出CTGF的區(qū)域2A被甲基化的情形中，與未顯示出甲基化的情形相比，基因的表達(dá)要低得多(P=0.041、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，圖2D)。從該結(jié)果可以看出，CTGF的區(qū)域2A的甲基化與基因沉默相關(guān)。另外，關(guān)于66例卵巢癌病例中CTGF的CpG島的甲基化與臨床病理診斷之間的相關(guān)性的調(diào)查結(jié)果如表4所示。表4充教S3跌床背楚匈CT(3Fg;域2的甲旌化之問(wèn)的爽累總數(shù)(，TGf的化*n(%)665t316382632817.54933029.71144313&駒27闊22(S8)17夠則S6》S《S》'H《S5)4網(wǎng)31《57》2(67》19〖S3〗悠《S2)2《29》6(55》27,fi胡0.0770.8!8。.S7SCL739a極轉(zhuǎn)和方法中部分銜述的針對(duì)區(qū)域WMW來(lái)裂!定甲Sfc狄態(tài)4爐斜fiW或F勵(lì)sr櫞確檢酸法，錄i當(dāng):p幼必《雙劍)It)l統(tǒng)計(jì)學(xué)jS奢實(shí)施例7:卵巢癌臨床樣本中CTGF的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特性之間的關(guān)系為了明確卵巢癌中CTGF基因的臨床意義，采用CTGF特異性抗體，通過(guò)免疫組化染色來(lái)評(píng)價(jià)卵巢癌臨床樣本中CTGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。具體方法是將用石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定，然后將位于涂敷有硅垸的載玻片上的切片進(jìn)行脫石蠟化并用乙醇逐步進(jìn)行脫水。將抗原在高pH緩沖液(DakoCytomation株式會(huì)社生產(chǎn)的TargetRetrievalSolutionHighpH)中于95°C下進(jìn)行10分鐘的高壓鍋滅菌預(yù)處理后取出。用5%的過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用2%的標(biāo)準(zhǔn)豬血清抑制非特異性染色。將該載玻片與抗人CTGF羊多克隆抗體(L-20，1:100稀釋?zhuān)籗antaCruzBiotechnology株式會(huì)社生產(chǎn))在4t:下孵育過(guò)夜。然后，使該載玻片與HistofineSimpleStainMAXPO(G)(Nichrei株式會(huì)社)在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)采用0.2%的二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽和過(guò)氧化氫可以看到抗原抗體的反應(yīng)，然后將載玻片采用Mayer蘇木精進(jìn)行對(duì)比染色。免疫組織染色的結(jié)果分為水平0(沒(méi)有被染色)、水平1(1-10%的腫瘤細(xì)胞被染色)、水平2(10-50%的腫瘤細(xì)胞被染色)、水平3(50%以上的腫瘤細(xì)胞被染色)。在正常卵巢上皮中，可以確認(rèn)有CTGF的高水平免疫反應(yīng)(圖3A左)。還可以明確的是，CTGF蛋白質(zhì)主要局部存在于正常細(xì)胞或腫瘤上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中。-雖然在數(shù)個(gè)卵巢癌樣本中檢出了CTGF的高表達(dá)(圖3A中部)，但是CTGF表達(dá)較弱(水平l)、或者無(wú)表達(dá)(水平0)的卵巢癌樣本是高頻率出現(xiàn)的(圖3A右)。在卵巢癌樣本中，CTGF低表達(dá)水平(水平0和1)占81%(57個(gè)病例中的46個(gè)病例)，高表達(dá)水平(水平2和3)占19%(57個(gè)病例中的11個(gè)病例)。CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)性總結(jié)于表5中。由該結(jié)果可以看出，CTGF蛋白質(zhì)的表達(dá)與腫瘤的階段性相關(guān)。CTGF表達(dá)缺失的腫瘤處于較早期(I期和II期)的傾向性高，而顯示出CTGF表達(dá)的腫瘤處于較晚期(III期和IV期)的傾向性高。農(nóng)5表2貌床鋝戰(zhàn)與CTOT斑白旗乾達(dá)之S^關(guān)系總數(shù)CTGF的喪達(dá)aP館b備注統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的ffl以潔體農(nóng)示，^報(bào)據(jù)材料和方法部分中所述的兔疫組化分析來(lái)評(píng)針CTGF級(jí)白煩游表達(dá)bP但得SX2flER油er粒確檢驗(yàn)法，并且Sp〈0鄰(雙ffiD時(shí)為統(tǒng)il'學(xué)顯Se報(bào)據(jù)材料額:Mfe部分中所述的針'對(duì)S域2A的MSP來(lái)測(cè)您甲JKfeR邀在總體生存率方面，與CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)高的卵巢癌患者相比，CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)低的卵巢癌患者顯示出更高的生存率(P=0.128，Log-rank檢驗(yàn)；圖3B左)。在處于I期和II期的病例中，如果CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)低，則生存率變低(圖3B中間)。另外，在處于III期和IV期的病例中，如果CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)高，則生存率變低(P=0.189，Log-rank檢驗(yàn)；圖3B右)。如果限于60歲以下的、與轉(zhuǎn)移現(xiàn)象相關(guān)的III期和IV期的病例的話(huà)，這種傾向更加明顯(P=0.033，Log-rank檢驗(yàn)；圖3C)。由此可以看出，CTGF的失活對(duì)腫瘤形成的作用在卵巢癌的不同階段574215372.Q23S分4732443322(3，a，'鵬0一靴0.3S總數(shù)年齡<60歲160歲FKK)輪殷〗*H組織類(lèi)型瓶漿粘液透明細(xì)跑子宮.內(nèi)麟i￡if'術(shù)來(lái)知鼸藤鲴,學(xué)檢:激11《19!,4)柳7《均柳脾.卿K"〗1闊,〗■訓(xùn)陽(yáng)鵬來(lái)基陽(yáng)閣未甲乃.是不同的。實(shí)施例8:通過(guò)CTGF基因的活化來(lái)抑制卵巢癌的增殖根據(jù)前述結(jié)果，研究了CTGF基因表達(dá)活化是否可以抑制卵巢癌的增殖。首先，構(gòu)建了能夠表達(dá)CTGF基因的并具有Myc標(biāo)簽的質(zhì)粒(pCMV-3Tag4-CTGF)。該質(zhì)粒可以用于檢測(cè)全長(zhǎng)的CTGF基因的作用。該質(zhì)粒是這樣制備的將通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到的CTGF基因的cDNA插入到pCMV-3Tag4載體(Stratagene公司)中，使得Myc標(biāo)簽與翻譯框匹配連接。采用沒(méi)有插入CTGF基因的空載體(pCMV-3Tag4-mock)作為對(duì)照。將這些表達(dá)質(zhì)粒與作為轉(zhuǎn)化試劑的FuGENE6(RochDiagnostics)混合，轉(zhuǎn)至HNOA細(xì)胞或HMOA細(xì)胞中。48小時(shí)后回收細(xì)胞。采用抗Myc抗體(CellSignalingTechnology公司)經(jīng)Western印跡確認(rèn)有CTGF蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖4A)。另外，在轉(zhuǎn)化2周后，在作為新霉素類(lèi)藥物的G418的存在下使細(xì)胞增殖，用70%乙醇將增殖后的細(xì)胞固定，用結(jié)晶紫進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。其結(jié)果顯示v與用空載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞相比，用pCMV-3Tag4-CTGF轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的菌落數(shù)顯著減少(圖4B)。該結(jié)果明確顯示，CTGF基因的表達(dá)活化具有作為可抑制卵巢癌增殖的癌抑制劑的功能。序列表<110>富士膠片株式會(huì)社國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)<120〉卵巢癌的檢測(cè)方法及抑制方法〈130〉F卜080773-59:56<150>JPNo.2007-143川A<151>2007-05-30<160〉48<170>PatentInversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>1ttccagagcagctgcaagta20<210〉2<211>20〈212>■〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述合成DNA<400>2aaggaaggaaaggcacacaa20<210〉3<211〉19<212>隱<213>人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成DNA〈400〉3gcatggaacaaggcagttg19<210>4〈211〉27<212〉隱<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成DNA〈400>4aggagcactaatttattctgataaaac27<210>5〈211>20<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成DNA〈400〉5agggaacgctccaggtaaag20<210>6<211>23<212>陽(yáng)<213>人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成DNA<400>6ttccctcttggtgtaaaattcaa23〈210>7<211>20<212〉隨〈213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>7cttgcagcgtgctgtttaag20〈210〉8<211>2036<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成DNA<400〉8tC3cacaggtttgaggatgc20<210〉9〈211>20〈212〉DNA〈213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉9atgaaacgtttttgcccttg20<210〉10<21D20<212〉DNA<213〉人工序列〈220><223;>人工序列的描述合成DNA<400〉10agagcgctgtctcaggtcat20<210〉11<211〉20<212>隨<213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA<400〉11ttccagagcagctgcaagta20〈210〉12<211〉20<212>,<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400>12cagatcatggcatggaacaa20〈210〉13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400〉13gc3gctaccaggacaatgga20〈210〉14〈211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400〉14ggcaaacttccacactggtt20<210〉15〈211〉22<212>隱<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA<400>15tcaggatgactgtggaatcact22<210>16<211〉24<212〉瞧<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA頁(yè)〈400〉16ggggaagattaagtaagaaagtca24〈210〉17<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成DNA<400>17cagctggtgtgtgctagaagag22<210>18<211>19〈212〉DNA〈213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述合成DNA〈400>18gtaggaaggtggggaggaa19<210>19<211〉30<212〉隱〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉19ggaatgttgagtgttaaggggttaggatta30<210>20<211>20〈212〉隨<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉20ttgagaggagatagttagtg20<210>21<211〉18〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成DNA〈400>21ggttgttagggaggg3tt18〈210〉22<211〉24〈212〉陽(yáng)<213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉22gtataagggtttattttgttattt24<210>23〈211〉17〈212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉23gggtcgtgtcggtgttc17<210>24〈211>19<212>瞧<213>人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成DNA<400>24gttgtgttggtgtttggat19〈210>25〈211>19〈212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉25ctcgtcacacacccactcc19〈210〉26〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉26tttccaaggggctggagtat20〈210>27<211>20<212>瞧〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400>27gggacatcagagggtctcaa<210>28〈211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列〈220><223>人工序列的描述合成DNA〈400>28gtgttcttcttaacaggttgttcc24<210>29〈211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述合成DNA<400>29cctcttcgaaaatgctctgc20<210>30〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成DNA〈400〉30gggggcttatgtaagtgtgc20<210>31〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成DNA<400>31tgggccattcttctttcatc20<210>32<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>32tagggtcaaaggcaaaggaa20<210>33<211>20<212>隱<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>33acctttcccaaacctttgct20〈210〉34<211>20〈212〉■<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成DNA<400>34aatccttccaaaacggaggt20〈210>35〈211>20〈212〉陽(yáng)<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400>35ccaggcagttggctctaatc20<210>36<211〉20〈212>DNA<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成DNA<400>36gggacatcagagggtctcaa20<210>37<211〉20〈212>DNA<213>人工序列〈220>〈223>人工序列的描述合成DNA<400>37gcaagaagaacaatgcaagc20<210>38〈211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉38atccctggaataaggctgct20〈210〉39<211〉21〈212〉DNA〈213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述合成DNA<400>39tgaaaggaaccatcactgacc21〈210>40<211〉20〈212〉隱<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述合成DNA<400>40aggtttggtgttggc3tttt20<210〉41<211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述合成DNA〈400〉41ccacgaacaaccacaacatc20<210>42<211>21〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成DNA〈400〉42cactaactatctcctctcaac21〈210〉43<211〉30〈212〉隱<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成DNA<400>43atcaaacattaaaacactctcacatccaaa30<210>44〈211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成DNA〈400>44aacaaaataaacccttatac20<210>45〈211>26<212>隨〈213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成DNA〈400>45tCC3t3Ct3C3C33333C3t3C33CC26<210>46<211>24<212>隨<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成DNA<400>46gtataagggtttattttgttattt<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成DNA〈400>47gtccaacacgaaactcacg19〈210>48<211〉20〈212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成DNA<400〉48catccaacacaaaactcaca20權(quán)利要求1.一種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)檢測(cè)存在于樣本的染色體區(qū)域2q14.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、11q13.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15q12、15q15.1、17p12、17p13.1、17p13.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20q13.13、20q13.2、20q13.31、20q13.33、Xp11.23、Xp13.1、Xp13.3、Xp26.2、Xp26.3、或Xp28中的基因發(fā)生的至少一種變化，來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。2.權(quán)利要求1所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述基因?yàn)镚LI2、CCNDl、FGF3、TGFBR2、CDKN2A、MTAP、SMAD4、EVIl、MUC4、PTPN1、ZNF217、BCAS1、TFAP2C、BIRC7、TNFRSF6B、VEGFC、KLF12、FGF14、EFNB2、GABRB3、RAD51、RH68621、PMP22、RCV1、HSXIAPAF1、ABR、HIC1、MADH4(SMAD4)、DCC、MALT1、GRP、SERPINB5、FVT1、BCL2、SERPINB3、BCL2、CTDP1、SHGC-145820、SSX1、AR、MLLT7、ABCB7、GPC3、FGF13、MAGEA2、KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、CTGF中的至少一個(gè)。3.權(quán)利要求1或2所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述基因變化為擴(kuò)增、缺失和失活中的至少一種。4.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述基因的變化是由CpG島的甲基化而引起的失活。5.權(quán)利要求2所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中在樣本中，通過(guò)檢測(cè)由權(quán)利要求2所述的基因所翻譯的蛋白質(zhì)的量來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。6.權(quán)利要求5所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中通過(guò)免疫組化法來(lái)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的量。7.—種癌癥檢測(cè)方法，其通過(guò)檢測(cè)CTGF基因的缺失或失活來(lái)檢測(cè)樣本的癌化，并包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。8.權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述樣本為源自卵巢的組織。9.權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述癌癥為卵巢癌。10.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中采用DNA芯片法、Southern印跡法、Northern印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法、CGH法、或陣列CGH法、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、COBRA法對(duì)所述基因的變化進(jìn)行檢測(cè)。11.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，其包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因、或者將作為該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，在體外導(dǎo)入到細(xì)胞中。12.—種細(xì)胞增殖抑制劑，其含有KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因、或者作為該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。13.—種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。14.一種細(xì)胞增殖激活劑，其含有KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因。15.—種物質(zhì)的篩選方法，其為針對(duì)由于其中的KIAA1913、EPB42L2、AKAP7、CRSP3、ARG1、ENPP3、ENPP1、或CTGF基因的CpG島發(fā)生甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的卵巢癌，使該卵巢癌與待測(cè)物質(zhì)接觸以檢測(cè)所述基因的表達(dá)，當(dāng)與未接觸待測(cè)物質(zhì)的體系相比較，發(fā)現(xiàn)所述基因表達(dá)增加時(shí)，可將該待測(cè)物質(zhì)篩選為可以通過(guò)將所述基因的CpG島脫甲基化而使該基因活化的抗腫瘤物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明通過(guò)以卵巢癌中基因組結(jié)構(gòu)的變化為指標(biāo)來(lái)提供一種檢測(cè)包括惡性程度在內(nèi)的卵巢癌的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以卵巢癌的基因組結(jié)構(gòu)變化為指標(biāo)，可以檢測(cè)包括惡性程度在內(nèi)的卵巢癌。另外本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，通過(guò)使失活的基因恢復(fù)，可以抑制卵巢癌的增殖。文檔編號(hào)A61K48/00GK101314793SQ200810108639公開(kāi)日2008年12月3日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日發(fā)明者井本逸勢(shì),稻澤讓治,菊池良子申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社;國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)