專利名稱：半巢式-RT-Realtime PCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種病毒的檢測方法，具體地說是半巢式-RT-Realtime PCR檢測馬鈴 薯X病毒的試劑盒，屬于植物病毒檢測領域。
背景技術：
馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)是馬鈴薯上最為重要的病害之一，嚴重感 病的馬鈴薯能減產80%以上。馬鈴薯X病毒粒子為彎曲狀，長470-580nm，直徑13nm，螺旋 對稱結構，為單鏈RNA病毒。馬鈴薯X病毒通常具有中等致病性，引起許多單子葉植物和雙 子葉植物的系統(tǒng)花葉和環(huán)斑癥狀。在自然條件通過機械接觸傳播，無已知介體，該病毒容易 通過人工接種傳播。單一病毒的寄主范圍較窄，馬鈴薯X病毒僅限于浸染茄科植物。雖然 是馬鈴薯X病毒單一浸染時癥狀比較輕微或在溫度過高、過低或高肥水條件下極易隱癥， 但是當該病毒與其它能協(xié)生的病毒復合感染抗耐病差的馬鈴薯品種時，常導致嚴重減產現(xiàn) 象，甚至達80%以上。因此，馬鈴薯X病毒是造成馬鈴薯病毒性退化的主要病毒之一。目前，檢測馬鈴薯X病毒的方法主要有鑒別寄主接種法、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、RT-PCR技術等。電鏡技術設備昂貴，檢測靈敏度低；ELISA技術操作步驟繁瑣、檢 測周期長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性；PCR凝膠電泳技術較ELISA在多個方面有所提高，但易 于造成污染；未見采用實時熒光PCR檢測PVX的研究所道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，針對上述問題，提出根據(jù)PVX外殼蛋白(CP)基因的保守序列， 設計并合成了三條巢式PCR弓I物和一條TaqMan熒光探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR 檢測PVX的新方法。該方法有機了結合了實時熒光PCR和巢式PCR技術在實時熒光PCR 引物的外側按照巢式PCR的設計原理增設了一條正鏈引物；反鏈引物分別與兩條正鏈引物 配對形成兩套獨立的PCR反應，并共用一條TaqMan探針。實時熒光PCR技術采用TaqMan 熒光探針信號放大的功能有效提高了檢測的靈敏度；三條引物形成的兩套PCR體系進行相 互驗證，極大地提高了檢測的準確性；全封閉的操作系統(tǒng)減少了污染，PCR結果的實時觀察 極大縮短了檢測周期。該方法檢測的準確性、靈敏度等比巢式PCR、Real-time PCR及其它 方法高。本發(fā)明的技術方案為半巢式-RT-Realtime PCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，包括以下步驟制備而成(I)TaqMAN探針與引物的設計合成，根據(jù)核酸數(shù)據(jù)庫中PVX全基因組中CP基因序 列保守區(qū)，設計三條引物和一條TaqMan探針；(2)總RNA提取及質量控制，從植物葉片中提取總RNA，測定其OD值；(3)反轉錄合成cDNA，將提取的植物總RNA進行反轉錄合成cDNA ；(4)實時熒光PCR檢測，包括特異性檢測和靈敏度檢測；所述的特異性檢測方法為從感染PVX病毒及其它的對照植物葉片中提取總RNA，將提取的植物總RNA分別進行反轉錄合成特異性模板cDNA，將合成的cDNA進行引物探針特 異實時熒光PCR試驗；所述的靈敏度檢測方法為將上述步驟O)中提取的感染馬鈴薯X病毒的植物葉 片總RNA梯度稀釋，并分別進行反轉錄合成cDNA，然后進行實時熒光PCR檢驗。所述的三條引物和一條TaqMan探針序列分別為一條上游引物序列為 5，-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3，；另一條上游引物序列為5，-GGCCAGGGCACAATCCA-3，；下游引 物序列為5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探針序列為5，(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGA TGCAG-3， (TAMRA)。所述的反轉錄合成cDNA的方法為在反應體系中加入緩沖液、反轉錄酶及其緩沖 液、隨機引物、和植物總RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反應條件為37°C、15分鐘，85°C、5 秒，合成cDNA。所述的緩沖液為5 PrimeScript Buffer,緩沖液中含有四種dNTP混合物和Mg2+ ； 所述的反轉錄酶及其緩沖液為I^rimeScript RT Enzyme Mix I，所述的隨機引物為Oligo dT Primer 禾口 Random 6 mers。所述的特異性檢測，反應體系為分別加入PCR SuperMix-UDG、熒光染料、上游 引物、下游引物、探針和cDNA，補充DEPC水定容；循環(huán)條件依次為45-55 V、l-3min ； 90-100°C、l-3min ；90_100°C、10_20s ；55_65°C、25_35s。所述的PCR SuperMix-UDG 為 2XPlatinum 定量 PCR SuperMix-UDG，主要包括 Platinun^iTaq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgC12、400yM dGTP、400yM dATP、400yM dCTP、800 μ M dUTP、尿嘧啶DNA轉葡糖基酶以及穩(wěn)定劑。所述的循環(huán)條件最佳依次為:50°C、2分鐘；95°C、2分鐘；95°C、15秒，60°C、30秒， 45個循環(huán)。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明有機了結合了實時熒光PCR和巢式PCR技術在實 時熒光PCR引物的外側按照巢式PCR的設計原理增設了一條正鏈引物；反鏈引物分別與兩 條正鏈引物配對形成兩套獨立的PCR反應，并共用一條TaqMan探針。本發(fā)明中設計的三條 引物極高的擴增效率保證了檢測的高靈敏度，同時采用實時熒光PCR技術中TaqMan熒光 探針信號放大功能也有效提高了檢測的靈敏度；三條引物形成的兩套PCR體系進行相互驗 證，極大地提高了檢測的準確性；能實時觀察PCR的擴增過程和結果，無需進行后續(xù)大量而 繁瑣的工作，簡化了操作并縮短了檢測周期；全封閉的操作系統(tǒng)減少了污染。與已報道的其 它方法相比較，該方法更簡便、快速、準確和靈敏。試驗結果表明，本發(fā)明方法的檢測靈敏度 可達0. 071fg/ μ 1植物總RNA。


圖1為套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探針特異性試驗PCR擴增結果；
圖2為套2 (PVXF2/PVXR/PVXP)引物探針特異性試驗PCR擴增結果；圖3為套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探針靈敏度試驗PCR擴增結果；圖4為套2 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探針靈敏度試驗PCR擴增結果；圖 5 為套 1 組合(PVXF1/PV)(R/PVXP)和套 2 組合(PVXF2/PV)(R/PVXP)引物探針擴 增效率對比結果；
圖1中縱軸為Afo1(熒光信息增加值，下同)，橫軸為Cycle number(循環(huán)數(shù)，下 同)；A 為 PVX，B、C、D、E、F 依次為為 ArMV、PVYn、PBRSV、健康葉(CKl)和 DEPC 水對照(CK2)；圖 2 中縱軸為 Δ Rn,橫軸為 Cycle number ；A 為 PVX, B、C、D、Ε、F 依次為為 ArMV、 PVYn、PBRSV、健康葉(CKl)和 DEPC 水對照(CK2)；圖3 中縱軸為 ΔΙ η，橫軸為 Cycle number ；A、B、C、D、Ε、F、G、H、I、J、K 所對應 的 RNA 濃度依次為 7. lng/μ l、710pg/y l、71pg/y 1、7. lpg/μ l、710fg/μ l、71fg/μ 1、 7. lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、0· 0071fg/y 1、DEPC 水；圖4 中縱軸為 Δ Rn，橫軸為 Cycle number ；A、B、C、D、Ε、F、G、H、I、J、K 所對應 的 RNA 濃度依次為 7. lng/μ l、710pg/y l、71pg/y 1、7. lpg/μ l、710fg/μ l、71fg/μ 1、 7. lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、0· 0071fg/y 1、DEPC 水；圖 5 中縱軸為 Δ Rn，橫軸為 Cycle number ；A 為套 1 組合(PVXF1/PVXR/PVXP)，B 為為套 2 組合(PVXF2/PV)(R/PVXP)。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。1原料及來源1. 1 材料馬鈴薯X病毒(PVX)、南芥菜花葉病毒(ArMV)、馬鈴薯黑環(huán)斑病毒(PBRSV)、馬鈴薯 Y病毒脈壞死株系(PVYn)毒源由中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所提供。1.2主要的儀器及試劑1. 2. 1主要儀器1. 2. 1. 1實時熒光PCR基因擴增儀為ABI Prism 7000 (美國ABI公司)；1. 2. 1. 2核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國印pendorf公司)。1.2.2主要試劑1. 2. 2. 1植物總RNA提取試劑盒(商品名Ε. Ζ. N. A ，美國Omega公司產品，貨號 R2867-01)購自北京雙贏生物公司，其成分及操作步驟參照試劑盒自帶說明書。1. 2. 2. 2反轉錄試劑盒(貨號DRR037A)購自大連寶生物公司(TaKaRa)，其成份 包括(l)5XPrimerScript Buffer (主要包括 4 種 dNTP(G、Α、Τ、C)混合物和 Mg2+) ； (2) PrimerScript Enzyme Mix I (主要包括反轉錄酶及其緩沖液)；(3) Oligo dT Primer ( — 種隨機反轉錄引物)；(4) Random 6 mers (—種隨機反轉錄引物)。1. 2. 2. 3 實時熒光 PCR 試劑盒(Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG,貨號 C11730-025)購自美國hvitrogen公司，其成份包括(1) 2xPlatinum 定量PCR SuperMix-UDG(主要包括 Platinun^iTaq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgCl2、400yM dGTP、400yMdATP、400yM dCTP、800yM dUTP、尿嘧啶 DNA 轉葡糖基酶以及穩(wěn)定劑)；(2) ROX (熒光染料)。2.檢測方法2. II1aqMan探針與引物的設計合成根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中PVX全基因組中CP基因序列保守區(qū)，設計三條引物和一條TaqMan探針，引物和探針由上海生工合成。本研究中共設計三條引物O條上游引物、1條下游引物)和1條TaqMan探 針，上游引物用PVXF表示，其中上游引物PVXF1序列為5 ’ -TGCCCAAACTGCTGCCTT-3 ’， PVXF2序列為5-GGCCAGGGCACAATCCA-3，下游引物用PVXR表示，序列為5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探針用 PVXP 表示，序列為5，(FAM) -CGACTTTGCCAGCCTAGAT GCAG-3，(TAMRA) ；PCR 產物長度 PVXF1/PVXR 為 98bp、PVXFl/PVXR 為 65bp ；三條引物及探針 可以組成兩套不同的反應組合，套1為PVXF1/PVXR/PVXP，套2為PVXF2/PVXR/PVXP。2. 2總RNA提取及質量控制用植物總RNA提取試劑盒Ε. Ζ. N. A 從病葉片及健康馬鈴薯葉片中提取總RNA，植 物總RNA提取步驟參照試劑盒自帶說明書；用核酸蛋白分析儀BioWiotometer測定其OD 值，得出其濃度與純度值，并以此控制核酸質量。2. 3反轉錄合成cDNA將提取的植物總RNA用反轉錄試劑盒DRR037A進行反轉錄操作，以合成 cDNA。反應體系如下在25 μ 1反應體系中加入SXI^rimei^criptTMBufferj μ 1， PrimerScript Enzyme Mix IU. 25 μ 1, Oligo dT Primer (50 μ Μ) >1. 25 μ 1, Random 6 mers(100yM)U. 25 μ 1，適量總RNA (10 μ 1反應體系可最大可使用為500ng)，加DEPC水至 25 μ 1。反應條件為:37°C、15分鐘，85°C、5秒，合成cDNA。2. 4實時熒光PCR試驗2. 4.1特異性試驗2. 4. 1. 1 植物總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒Ε. Ζ. N. A ,參照“1. 4”中所述方法，從分別感染PVX、 ArMV、PBRSV、PVYM種病毒的葉片及健康馬鈴薯葉片(CKl)中提取總RNA。2. 4. 1. 2cDNA 合成將“ 1. 6. 1. 1”提取的5個植物總RNA及DEPC水對照(CK2)用反轉錄試劑盒 DRR037A分別進行反轉錄合成cDNA。反應體系和條件參照“ 1. 5”所述。2. 4. 1. 3 特異性 PCR 試驗將“1. 6. 1. 2”合成的6個cDNA，進行引物探針特異實時熒光PCR試驗⑴反應體 系在 25 μ L 體系中分別加入 2xPlatinum 定量 PCR SuperMix-UDG、12. 5 μ 1，R0X、0. 5 μ 1， 上游引物 PVXFl (或 PVXF2) (15 μ Μ)、1 μ 1，下游引物(PVXR) (15 μ Μ)、1 μ 1，探針(PVXP) (10μΜ)、1μ 1，cDNA、2. Ομ 1，補充DEPC水至25μ 1，每個cDNA至少設置2個重復；(3)在 ABI Prism 7000儀器的96孔板中進行反應；(4)循環(huán)條件為50°C、2分鐘；95°C、2分鐘； 95°C、15 秒，60°C、30 秒，45 個循環(huán)。2. 4. 2靈敏度試驗將“ 1. 6. 1. 1，，中提取的感染馬鈴薯X病毒(PVX)的植物葉片總RNA，用DEPC水稀 釋為KT1 10_1(1、DEPC水11個梯度，并分別進行反轉錄合成CDNA，然后進行實時熒光PCR 試驗。反轉錄與實時熒光PCR操作參照“1.5”和“1.6. 1. 1”。2. 4. 3兩套引物探針的擴增效率對比試驗 用同一個PVX病毒cDNA為模板，分別用套1組合(PVXF1/PVXR/PVXP)和套2組合 (PVXF1/PVXR/PVXP)進行實時熒光PCR試驗，以比較這兩套引物探針的擴增效率。實時熒光PCR 參照 “1. 6. 1. 1”。3結果與分析3. 1特異性試驗PCR擴增結果套1 (PVXF1/PV)(R/PVXP)結果見圖 1、套 2 (PVXF2/PV)(R/PVXP)結果見圖 2。圖 1、2 的結果顯示，套1引物探針與套2引物探針只有在PVX的CDNA為模板的反應中出現(xiàn)擴增曲 線，其余5種cDNA未出現(xiàn)擴增信號，表明套1、套2引物探針的特異性很好，結果與預計相 符。3. 2靈敏度試驗PCR擴增結果從帶PVX的葉片中提取植物總RNA，用DEPC處理水稀釋為10—1 10_1CI、DEPC水 11個梯度。本試驗中所提取RNA濃度與純度值為71.2(約71ng/l·! 1)，0D260/280 =
2.07，0D260/230 = 2. 21。稀釋后各個梯度所對應的RNA濃度分別為7. Ing/μ l、710pg/ μ l、71pg/y 1、7· lpg/μ U710fg/y U71fg/y 1、7· lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、 0.0071fg/yl、DEPC水。反轉錄分別合成cDNA后，進行實時熒光PCR擴增。套1結果見圖
3、套2結果見圖4。PCR擴增的結果表明，當RNA稀釋至10,(即0.0071fg/yl)時，檢測 不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達10_9，即0. 071fg/yl植物總RNA。3. 3兩套引物探針的擴增效率對比試驗結果套1組合(PVXF1/PVXR/PVXP)和套2組合(PVXF2/PVXR/PVXP)引物探針的擴增效 率對比試驗結果見圖5。圖5的結果表明，這兩套引物探針的擴增效率幾乎一樣。4結論與討論馬鈴薯X病毒是一種非常重要的馬鈴薯病害，嚴重感病的馬鈴薯能減產80%以 上。對于該病害的防治措施最主要的是早發(fā)現(xiàn)、早防治，為了保護我國馬鈴薯及相關產業(yè)的 健康發(fā)展，開發(fā)出快速、靈敏檢測該病毒的先進的技術，具有較重大現(xiàn)實意義。不同的方法，其檢測靈敏度差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法，檢測的靈敏 度相差100倍以上，PCR凝膠電泳與實時熒光PCR技術靈敏度相關也在100倍以上。本試 驗室還進行過大量的試驗室證明，采用不同引物探針的實時熒光PCR技術，由于引物的擴 增效率不一樣，靈敏度差異也可達到1000倍以上。在實際檢測鑒定工作中，為了提高結果 的準確性，經常需要對一個結果進行兩個以上的確認試驗，不同方法檢測靈敏度不一樣，很 難保證兩個試驗的結果完全一樣，這就為結果的判斷增加了難度，特別是在檢測目標含量 極少的情況下，這種難度就會進一步加大。若兩套方法檢測靈敏度一樣或非常接近，這個難 題就迎刃而解。實時熒光PCR檢測技術是國際最近幾年發(fā)展起來的高新檢測技術，該技術有機結 合了熒光檢測系統(tǒng)PCR擴增系統(tǒng)。與目前已報道的其它檢測技術相比，該技術具有巨大的 優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在(1)通過熒光信號，能實時觀察PCR過程中待檢測樣品模板DNA(或 cDNA)擴增情況，無需進行染色、電泳和紫外檢測，大大簡化了檢測程序并縮短檢測時間； (2)采用熒光信號放大功能，其檢測的靈敏度得到了大大提高；(3)全封閉的操作系統(tǒng)，減 少了 PCR產物對試驗室環(huán)境的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結果。 實時熒光PCR技術，是目前最準確、最靈敏的技術，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的 應用前景。本研究建立了 “半巢式-RT-Realtime PCR"檢測馬鈴薯X病毒(PVX)的方法。該方法既利用了實時熒光PCR方法所固有的簡便、快速和高靈敏度特性，同時巧妙地將巢式 PCR的原理，運用到實時熒光PCR技術中。設計上僅僅在一般Realtime PCR的基礎上增設 了一條引物，就形成了兩套完全獨立的檢測體系，兩套引物探針相互驗證，又進一步提高了 準確性。這兩套引物探針的擴增效率極高且?guī)缀跻粯樱瑥亩ＷC了兩套系統(tǒng)檢測結果的一 致性。試驗結果表明，它們檢測的靈敏度均可達0. 071fg/yl植物總RNA。
最后應說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內。
權利要求
1.半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其特征在于包括以下步驟制 備而成根據(jù)馬鈴薯X病毒全基因組中外殼蛋白基因序列保守區(qū)，設計三條引物和一條TaqMan 探針；(1)從植物葉片中提取總RNA并測定其OD值；(2)將提取的植物總RNA反轉錄合成cDNA；(3)實時熒光PCR檢測，包括引物探針的特異性檢測和靈敏度檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其特 征在于所述的特異性檢測方法為從感染PVX病毒的植物葉片以及其它相應的對照植物葉 片中提取總RNA，將提取的植物總RNA進行反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行引物探針 特異性實時熒光PCR試驗；
3.根據(jù)權利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其特 征在于所述的靈敏度檢測方法為將上述步驟O)中提取的感染馬鈴薯X病毒的植物葉片 總RNA進行梯度稀釋，并分別反轉錄合成CDNA，然后進行實時熒光PCR檢驗。
4.根據(jù)權利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試 劑盒，其特征在于所述的三條引物和一條TaqMan探針，其中一條上游引物序列為 5，-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3，；另一條上游引物序列為5，-GGCCAGGGCACAATCCA-3，；下游引 物序列為5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探針序列為5，(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGA TGCAG-3， (TAMRA)。
5.根據(jù)權利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其 特征在于所述的反轉錄合成cDNA的方法為在反應體系中加入緩沖液、反轉錄酶及其緩沖 液、隨機引物、和植物總RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反應條件為37°C、15分鐘，85°C、5 秒，合成cDNA。
6.根據(jù)權利要求5所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其 特征在于所述的緩沖液為5 PrimeScript Buffer，緩沖液中含有四種dNTP混合物和Mg2+ ； 所述的反轉錄酶及其緩沖液為I^rimeScript RT Enzyme Mix I，所述的隨機引物為Oligo dT Primer 禾口 Random 6 mers。
7.根據(jù)權利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其特 征在于所述的特異性檢測，反應體系為分別加入PCR SuperMix-UDG、熒光染料、上游引物、 下游引物、探針和cDNA，補充DEPC水定容；循環(huán)條件依次為45-55°C、l-3min ；90-100°C > l-3min ；90_100°C、10_20s ；55_65°C、25_35s。
8.根據(jù)權利要求7所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒， 其特征在于所述的PCR SuperMix-UDG為2XPlatinum 定量PCR SuperMix-UDG,主要包括 Platinum Taq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgC12、400yM dGTP、400yM dATP、400yM dCTP、800 μ M dUTP、尿嘧啶DNA轉葡糖基酶以及穩(wěn)定劑。
9.根據(jù)權利要求7所述的半巢式-RT-RealtimePCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，其特 征在于所述的循環(huán)條件依次為50°C、2分鐘；95°C、2分鐘；95°C、15秒，60°C、30秒，45個循 環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了半巢式-RT-Realtime PCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，包括TaqMan探針與引物的設計、植物總RNA提取及質量控制、將RNA反轉錄合成cDNA和實時熒光PCR檢測。本方法有機地結合了實時熒光PCR和巢式PCR技術在實時熒光PCR引物的外側按照巢式PCR的設計原理增設了一條正鏈引物，反鏈引物分別與兩條正鏈引物配對形成兩套獨立的PCR反應，并共用一條TaqMan探針。本發(fā)明的優(yōu)點在于引物極高的擴增效率保證了檢測的高靈敏度，有效提高了檢測的靈敏度，三條引物形成的兩套PCR體系進行相互驗證，極大地提高了檢測的準確性，簡化了操作并縮短了檢測周期，全封閉的操作系統(tǒng)減少了污染。
文檔編號G01N21/64GK102080132SQ20101056049
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權日2010年11月16日
發(fā)明者張京萱, 李明福, 楊益娥, 欒晶, 粟智平, 耿金培 申請人:煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心