專利名稱：：預(yù)防和治療腦卒中的藥物復(fù)合制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于腦卒中的預(yù)防和治療的藥物復(fù)合制劑，特別涉及包含由山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧組成的藥物組合物作為有效成分和藥用輔料的藥物復(fù)合制劑，及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腦血管疾病是一大類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中的急性缺血性腦卒中(IschemicStroke)最為常見，具有高發(fā)病率、高患病率和高致殘率的特點(diǎn)。腦卒中是全球第二位致死原因，每年共554萬人死于腦卒中，而其中三分之二來自發(fā)展中國家。我國腦卒中的患病率為620/10萬，其中絕大部分為缺血性卒中。此外，作為首位致殘?jiān)颍X卒中每年造成的疾病傷殘?jiān)?003年約4900萬。預(yù)計(jì)到2015年，全球因卒中損失的健康生命年將逾5000萬，其中卯％來自中低收入國家。在我國，血管性疾病致死病處首位，比腫瘤及慢性呼吸系統(tǒng)疾病還高。值得注意的是，有別于發(fā)達(dá)國家心血管疾病高于腦卒中的趨勢，我國死于腦血管病的人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過心血管疾病，是后者的三倍。我國目前用腦卒中發(fā)病率和死亡率來估算該數(shù)目亦相當(dāng)驚人，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。這勢必影響中國的和諧社會和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)性發(fā)展，己經(jīng)并將進(jìn)一步成為中國乃至世界人口與健康領(lǐng)域中的重大問題。發(fā)達(dá)國家在近二十年內(nèi)，花了巨大的投資，對缺血性腦卒中的研究提供了幫助。然而，許多實(shí)驗(yàn)室的陽性結(jié)果在臨床試驗(yàn)時(shí)卻大多失敗了。迄今為止，雖有一些治療手段，但僅在缺血后3小時(shí)內(nèi)有效，且有毒性等問題。至今為止，在現(xiàn)有技術(shù)中還未發(fā)現(xiàn)由山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧組成的藥物組合物用于預(yù)防和治療腦卒中的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容3求一種新的藥物或藥物組合物用于預(yù)防和治療腦卒中。為此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物復(fù)合制劑。本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問題是提供制備上述藥物復(fù)合制劑的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下。本發(fā)明提供用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物復(fù)合制劑，其中，所述藥物復(fù)合制劑包含由山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧(主要成分是黃酮類)組成的藥物組合物作為有效成分，和藥用輔料。本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的特征在于，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為09重量份，銀杏黃酮的含量為1~7重量份，并且知母寧的含量為0~3重量份。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的特征在于，在IO重量份的所述藥物組合物中，優(yōu)選山楂黃酮的含量為4重量份，銀杏黃酮的含量為3重量份，并且知母寧的含量為3重量份。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的特征在于，在10重量份的所述藥物組合物中，也優(yōu)選山楂黃酮的含量為5重量份，銀杏黃酮的含量為3重量份，并且知母寧的含量為2重量份。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的特征在于，在10重量份的所述藥物組合物中，也優(yōu)選山楂黃酮的含量為8重量份，銀杏黃酮的含量為1重量份，并且知母寧的含量為1重量份。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的特征在于，在IO重量份的所述藥物組合物中，也優(yōu)選山楂黃酮的含量為9重量份，并且銀杏黃酮的含量為1重量份，可以不含知母寧。在本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑中，所述藥用輔料是葛根粉、淀粉、或水溶液。在本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑中，所述藥物復(fù)合制劑為膠囊、片劑或口服液。當(dāng)本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑為膠囊時(shí)，其中藥用輔料優(yōu)選是葛根粉。當(dāng)本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑為片劑時(shí)，其中藥用輔料優(yōu)選是淀粉。當(dāng)本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑為口服液時(shí)，其中藥用輔料優(yōu)選是10%的檸檬酸水溶液。本發(fā)明提供所述藥物復(fù)合制劑的制備方法，該方法包含將有效量的所述藥物組合物與所述藥用輔料以適當(dāng)比例混合，優(yōu)選將80重量％的藥物組合物與20重量％的藥用輔料混合，以制備臨床中所需的劑型。本發(fā)明還提供所述藥物復(fù)合制劑在制備用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，上述重量比例組成是本發(fā)明的各組分之間優(yōu)選的比例，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)方法適當(dāng)調(diào)整和改變所述藥物組合物各組分之間的比例也可以達(dá)到本發(fā)明的目的，而不背離本發(fā)明的范圍和精神，因此意欲將此調(diào)整和改變也包括在本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。上述涉及的藥物復(fù)合制劑的各組分是市場上可以采購到的藥用級產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的上述的預(yù)防和治療腦卒中藥物復(fù)合制劑，在具體實(shí)施方式中經(jīng)過細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)(缺血再灌手術(shù)模擬腦卒中)，探明了作用機(jī)理，所述藥物復(fù)合制劑具有以下功能特征和有益效果本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對羥基、超氧陰離子自由基有明顯清除作用，對過氧亞硝基和脂類自由基有明顯清除作用，對沙鼠腦卒中腦組織中產(chǎn)生一氧化氮有明顯調(diào)節(jié)作用，對沙鼠腦卒中腦組織中產(chǎn)生活性氧有清除作用，對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)成活大錐體神經(jīng)元的數(shù)量有明顯保護(hù)作用，對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DNA損傷有明顯保護(hù)作用，對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中iNOS的mRNA水平及NF招p65和TNF-a的蛋白質(zhì)水平有明顯抑制作用。從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對羥基和超氧陰離子自由基的清除作用的圖。圖2是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對過氧亞硝基和脂類自由基的清除作用的圖。圖3是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中腦組織中產(chǎn)生一氧化氮的調(diào)節(jié)作用的圖。圖3A顯示用ESR法檢測了缺血再灌注過程中在腦中產(chǎn)生的一氧化氮自由基的量。圖3B顯示缺血再灌過程中在腦中產(chǎn)生的亞硝酸鹽產(chǎn)量。1:對照；2:缺血再灌注；3:低劑量；4:高劑量。圖4是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中腦組織中產(chǎn)生活性氧的清除作用的圖。1:對照；2:缺血再灌注；3:低劑量；4:高劑量。圖5是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中腦組織中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化的抑制作用的圖。圖6是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)成活大錐體神經(jīng)元的數(shù)量的保護(hù)作用的圖。A:對照；B:缺血再灌注；C:低劑量；D:高劑量。圖7是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DNA損傷的保護(hù)作用的圖。A:對照；B:缺血再灌注；C:低劑量；D:高劑量。圖8是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的防護(hù)作用的圖。A:對照；B:缺血再灌注；C:低劑量；D:高劑量。圖9是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中iNOS的mRNA水平的抑制作用的圖。圖10是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中NF&Bp65的蛋白質(zhì)水平的抑制作用的圖，其中l(wèi):對照；2:缺血再灌注；3:低劑量；4:高劑量。圖11是表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中TNF-OC的蛋白質(zhì)水平的抑制作用的圖，其中l(wèi):對照；2:缺血再灌注；3:低劑量；4:高劑量。在圖l至ll中，""表示與正常對照相比有顯著差異(P0.05)，表示與損傷對照相比有顯著差異(P<0.05)。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的制備方法。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實(shí)施例1.本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的制備——膠囊的制備每粒300毫克，有效成分為80重量％，其它添加葛根粉(級別食物級；購自四川富貴人生物工程有限公司)。山楂黃酮(購自山西金甲藥物有限公司)銀杏黃酮(購自江蘇健佳藥業(yè)有限公司)知母寧(購自山東富而美生物科技有限公司)的重量比例和各自的重量分別見表1。表1.在膠囊劑型的藥物復(fù)合制劑中，各成分的比例及重量。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在GMP車間，將山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧及添加劑葛根粉按要求的比例在攪拌器(CH-IO小型混合機(jī)，中南制藥機(jī)械廠)中充分?jǐn)嚢杌旌?小時(shí)，在膠囊機(jī)(半自動膠囊充填機(jī)，山東省青州市精誠機(jī)械制造有限公司)上裝膠囊(A型腸溶膠囊，潮州市強(qiáng)基制藥廠)，采用好樂股份公司的紫外技術(shù)bluepoint4經(jīng)濟(jì)型紫外消毒器消毒，包裝(YLE-500+YLH-500L包裝機(jī)，裕隆包裝設(shè)備有限公司)。實(shí)施例2.本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的制備——口服液的制備每瓶10毫升，藥物復(fù)合制劑共300mg，有效成分為80重量％，將組合藥物溶解在蒸餾水中，其它添加檸檬酸(食用級，購自山東濟(jì)南云翔化工有限責(zé)任公司)，其中山楂黃酮(購自山西金甲藥物有限公司)銀杏黃酮(購自江蘇健佳藥業(yè)有限公司)知母寧(購自山東富而美生物科技有限公司)的重量比例和各自的重量分別見表2。表2.在口服液劑型的藥物復(fù)合制劑中，各成分的比例及重量。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在GMP車間，將山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧及添加劑檸檬酸按要求的比例在攪拌器(RW20DZM.n頂置式機(jī)械攪拌器，上海麗度電子科技發(fā)展有限公司)中充分?jǐn)嚢杌旌?，在罐裝機(jī)(DGDG系列臺式液體灌裝機(jī)，中南制藥機(jī)械廠)上裝瓶，采用好樂股份公司的紫外技術(shù)bluepoint4經(jīng)濟(jì)型紫外消毒器消毒，包裝(YLE-500+YLH-500L包裝機(jī)，裕隆包裝設(shè)備有限公司)。實(shí)施例3.本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑的制備——片劑的制備每片300毫克，有效成分為80重量％，其它添加劑為淀粉(級別食物級；天津森眾商貿(mào)公司)。山楂黃酮銀杏黃酮知母寧的重量比例和各自的重量分別見表3。表3.在片劑劑型的藥物復(fù)合制劑中，各成分的比例及重量。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在GMP車間，將山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧及添加劑淀粉按要求的比例在攪拌器(RW20DZM.n頂置式機(jī)械攪拌器，上海麗度電子科技發(fā)展有限公司)中充分?jǐn)嚢杌旌?，在制片機(jī)(TDP-1.5單沖壓片機(jī)，中南制藥機(jī)械廠)上裝制片，采用好樂股份公司的紫外技術(shù)bluepoint4經(jīng)濟(jì)型紫外消毒器消毒，包裝(YLE-500+YLH-500L包裝機(jī)，裕隆包裝設(shè)備有限公司)。試驗(yàn)例以下通過具體的試驗(yàn)例進(jìn)一步闡明本發(fā)明組合藥物復(fù)合制劑的有益效果。但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述實(shí)驗(yàn)例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。腦卒中動物模型用缺血再灌手術(shù)的沙鼠(來自北京動物中心)模擬。試驗(yàn)例l.藥物復(fù)合制劑對自由基的清除作用本試驗(yàn)例采用膠囊劑型的藥物復(fù)合制劑，表1中的9號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=4:3:3。進(jìn)行體外試驗(yàn)檢測所述藥物復(fù)合物制劑對自由基的清除作用。自由基，特別是活性氧自由基，如羥基、超氧陰離子自由基，是引起腦卒中損傷的重要因素。采用電子自旋共振技術(shù)(ESR)測試，條件如下在BruckerER200D-SRC型ESR波譜儀(德國Brucker公司)上進(jìn)行測定時(shí)，X波段，微波功率10mW，調(diào)制頻率100kHz，調(diào)幅1G，中心磁場3385G,掃寬200G，室溫下檢測(參見，Zhao，B-L，Li，X-J,He,R-G,Cheng,S-J,Xin,\V-J:Scavengingeffectofextractsofgreenteaandnaturalantioxidantsonactiveoxygenradicals.CellBiophys.l4:175.1989)。測試結(jié)果表明本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對羥基、超氧陰離子自由基有明顯清除作用。由圖l可以看出，本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑對羥基和超氧陰離子自由基的清除作用的IC5o分別大約為IC5Q(羥基自由基)=0.05mg/ml和IC5Q(超氧陰離子自由基)=0.10mg/ml。復(fù)合制劑對羥基的清除作用比對超氧陰離子自由基的清除作用略強(qiáng)(參見圖1)。NO和超氧陰離子自由基具有非常高的反應(yīng)速率常數(shù)(6.4X10Vol/I/V1)，反應(yīng)形成過氧亞硝基(ONOCT)。這是一種氧化性極強(qiáng)的物質(zhì)，可氧化細(xì)胞膜脂和蛋白質(zhì)的硫氫基，導(dǎo)致腦卒中細(xì)胞損傷，因而對過氧亞硝基的研究非常引人關(guān)注。復(fù)合制劑對過氧亞硝基的清除作用的IC50=40|ag/ml(參見圖2)。試驗(yàn)例2.藥物復(fù)合制劑對缺血再灌注過程中一氧化氮的調(diào)節(jié)作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，為表2中的10號，其中活性成分重量比例為山楂黃酮銀杏黃酮知母寧=5:3:2。采用缺血再灌注沙鼠模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件(23土1。C，每日8:00-20:00光照)下飼養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)(在附圖中簡稱"缺血再灌注")，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)動物手術(shù)前12小時(shí)禁食，但可以自由飲水，腹腔注射1300mg/Kg.wt氨基甲酸乙酯(EthylCarbamate)麻醉動物。仰位固定于手術(shù)臺上，用手術(shù)刀在頸部劃開一個(gè)11.5cm小口，鈍性分離肌肉，暴露與迷走神經(jīng)伴行的頸總動脈，用動脈夾閉塞雙側(cè)頸總動脈5分鐘，夾閉后或打開后檢查血管，以保證血管閉塞或暢通按實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行，該操作可以可重復(fù)性造成沙鼠大腦海馬CA1區(qū)大錐體神經(jīng)元的死亡(Kirino，Delayedneuronaldeathinthegerbilhippocampusfollowingischemia.BrainRes.239，57-69，1982)，在手術(shù)過程中和手術(shù)后5小時(shí)內(nèi)，動物的體溫用肛溫計(jì)和紅外燈控制于37士0.5。C;陰性對照組(在附圖中簡稱"對照")，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組(在附圖中簡稱"低劑量")，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組(在附圖中簡稱"高劑量")，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的復(fù)合制劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。用ESR法檢測了缺血再灌注過程中產(chǎn)生的一氧化氮自由基。與缺血再灌注過程中ROS升高相比，一氧化氮的產(chǎn)量在缺血再灌組與陰性對照組相比降低了約19%，復(fù)合制劑預(yù)處理15天顯著升高了缺血再灌后腦中的一氧化氮的產(chǎn)量，低劑量和高劑量組一氧化氮的產(chǎn)量與缺血再灌組相比分別升高了約44%和77%(見圖3A)。而亞硝酸鹽的產(chǎn)量在缺血再灌組與陰性對照組相比升高了約150%，復(fù)合制劑預(yù)處理15天顯著降低了缺血再灌后腦中的亞硝酸鹽的產(chǎn)量，低劑量和高劑量組亞硝酸鹽的產(chǎn)量與缺血再灌組相比分別降低了約30%和40%，試驗(yàn)結(jié)果見圖3B。試驗(yàn)例3.藥物復(fù)合制劑對缺血再灌注腦組織中活性氧(ROS)升高的抑制作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的3號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=8:1:1。雄性蒙古沙鼠(北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件(見試驗(yàn)例2)下飼養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/m復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。缺血再灌注腦損傷手術(shù)一小時(shí)后，部分動物麻醉后殺死，快速分離腦組織，冰浴生理鹽水沖洗，沿中線分離兩側(cè)大腦。左側(cè)大腦半球用于檢測缺血再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧(CapaniF.，LoidlC.F.，AguirreF.,PiehlL.，F(xiàn)acorroG.,HagerA.，PaoliT.D,，F(xiàn)arachH.andPecci陽SaavedraJ.Changesinreactiveoxygenspecies(ROS)productioninratbrainduringglobalperinatalasphyxia:anESRstudy.BrainRes.914,204-207，2001.)。組織稱重后加入lml冰浴的自旋捕集劑溶液(在冰冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)中的IOOmMN-叔丁基-a-苯基硝酸靈(PBN)，2mM二亞乙基三胺五乙酸(DETAPAC))，勻漿。然后加入500jil乙酸乙酯，渦旋振蕩l分鐘，10000g離心5分鐘。小心分離上層的乙酸乙酯，避光4。C保存，24小時(shí)內(nèi)室溫ESR檢、、缺血再灌后，按上述檢測方法分別測量缺血再灌過程中產(chǎn)生的ROS，腦勻漿的脂質(zhì)過氧化水平，腦勻漿的抗氧化能力(或腦勻漿中的抗氧化劑手術(shù)1小時(shí)后，ESR試驗(yàn)表明，與陰性對照組相比，缺血再灌組中的ROS升高了約62%。與缺血再灌組相比，復(fù)合制劑預(yù)處理15天，低劑量組和高劑量組中，ROS分別顯著降低了約23X和約50X。高劑量組中ROS的產(chǎn)量甚至低于陰性對照組，但是差異性不顯著(見圖4)。缺血再灌后脂質(zhì)過氧化水平用TBARS(硫代巴比妥酸反應(yīng)的物質(zhì)(thiobarituricacidreactedsubstance))的含量表示，腦勻漿中的脂質(zhì)過氧化水平以TBARS濃度表示。100^1腦勻漿加入1.9ml反應(yīng)體系中(100pi8.1%SDS，750(al20%冰乙酸,調(diào)pH至3.5,750^10.8%硫代巴比妥酸(thiobarituricacid)，300|il雙蒸水)，混勻后沸水浴1小時(shí)，然后加入0.5ml雙蒸水，2.5ml正丁醇，渦旋混勻后4000g離心10分鐘。上清于532nm分光光度計(jì)檢測。脂質(zhì)過氧化水平TBARS含量以nmol/g/ml組織蛋白表示。結(jié)果表明，缺血再灌注損傷使腦勻漿中的TBARS水平與陰性對照組相比升高了約73%，口服復(fù)合制劑15天，劑量依賴性降低了TBARS水平。與單純?nèi)毖俟嘟M(IR)相比，在低劑量和高劑量處理組，TBARS水平分別降低了約26%和約48%。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。試驗(yàn)例4.藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)成活大錐體神經(jīng)元的數(shù)量的保護(hù)作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的4號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=9:1:0。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(見試驗(yàn)例2)飼養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。缺血再灌注手術(shù)六天后，部分動物用硫代巴比妥鈉(50mg/kgi.p.)深度麻醉，用預(yù)冷的pH7.4磷酸鹽配制的4X多聚甲醛穿心臟灌流(perfiisedtranscardially)15分鐘，等動物頸部僵硬后分離腦組織，在4X多聚甲醛PBS溶液中后固定24小時(shí)，然后在30%蔗糖PBS溶液中浸泡72小時(shí)，保證所有的腦樣本沉入蔗糖的底部，充分防凍保護(hù)(cryoprotection)，在海馬區(qū)切12pm厚的冰凍切片，甲酚紫(CresylViolet)染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，有清楚的細(xì)胞核，胞體著色良好的計(jì)為成活神經(jīng)元，由對試驗(yàn)分組不了解者計(jì)數(shù)CA1區(qū)lmm長度內(nèi)成活大錐體神經(jīng)元的數(shù)量。每只動物的腦片，光鏡下計(jì)數(shù)4片，成活神經(jīng)元按每毫米的成活細(xì)胞數(shù)表示。按上述方法測量復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)成活大錐體神經(jīng)元的數(shù)量的保護(hù)作用，腦中各部分對缺血再灌注損傷的敏感性不同，海馬CA1區(qū)大錐體神經(jīng)元對缺血尤其敏感，5分鐘缺血就可造成CA1區(qū)細(xì)胞的不可逆性損傷。本試驗(yàn)用本領(lǐng)域公知的尼氏染色方法檢測了CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量。圖6所示為缺血再灌損傷6天后海馬CA1區(qū)的冰凍切片圖像。在缺血再灌注組，CA1區(qū)神經(jīng)元幾乎全部消失了，活體神經(jīng)元僅為11士7cel1/mm，與之相比陰性對照組CA1區(qū)活體細(xì)胞數(shù)為280±30cell/mm。與缺血再灌注組相比，用本發(fā)明的復(fù)合藥物制劑預(yù)處理顯著增加了CA1區(qū)成活神經(jīng)元數(shù)量，在低劑量組和高劑量組CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量分別為130±60cell/mm和255±35cell/mm。在高劑量組和陰性對照組之間無顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。試驗(yàn)例5.藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DNA損傷的保護(hù)作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的5號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=5:2:3。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(見試驗(yàn)例2)詞養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。測量方法如下每只動物尼氏染色試驗(yàn)相鄰的切片用于TUNEL試驗(yàn)，檢測缺血再灌注損傷后海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡情況。TUNEL用改進(jìn)的Gavrieli等建立的原位DNA碎片終端標(biāo)記的方法(GavrieliY.,ShermanY.andBen-SassonS.A.IdentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentation.J.CellBiol.119,493—501，1992)，可以特異檢測斷裂的DNA碎片，反映細(xì)胞的凋亡情況。該試驗(yàn)用試劑盒(Insitucellapoptosisdetectionkit,武漢Boster生物技術(shù)公司)檢測，步驟如下切片在TBS(Tris-bufferSolution)緩沖液中浸泡2次每次5分鐘，在0.5%&02甲醇溶液中室溫浸泡10分鐘淬滅內(nèi)源性的過氧化物酶，在雙蒸水中沖洗2次，每次2分鐘。切片用蛋白酶K(2mg/ml)室溫通透60秒，TBS緩沖液中沖洗3次，每次2分鐘。加入20pl標(biāo)記緩沖液后，與含有地高辛標(biāo)記的dUTP(digoxigenin-dUTP)在濕盒(Humidifiedchamber)中37。C孵育2小時(shí)。在TBS中沖洗3次，每次2分鐘，然后用含有牛血清白蛋白的封閉液在濕盒中室溫封閉30分鐘。切片用生物素標(biāo)記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)在濕盒中37。C孵育30分鐘，TBS沖洗3次，每次2分鐘，然后切片用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素濕盒中37。C孵育30分鐘，TBS沖洗4次，每次5分鐘，DAB顯色。在試驗(yàn)中，DNAseI處理的切片和反應(yīng)中不含中端轉(zhuǎn)移酶的切片分別作為陽性對照和陰性對照。復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中細(xì)胞凋亡過程的作用包括，激活細(xì)胞內(nèi)DNA內(nèi)切酶，降解基因組DNA，斷裂DNA。結(jié)果顯示，陰性對照組海馬區(qū)神經(jīng)元沒有特異性染色，缺血再灌后，幾乎所有CA1區(qū)細(xì)胞都被特異性的著色，顯示缺血再灌注引起CA1區(qū)大錐體神經(jīng)元大量斷裂的DNA。在缺血再灌注損傷腦片中，與CA1區(qū)相比，CA2區(qū)神經(jīng)元部分?jǐn)嗔训腄NA，CA3區(qū)凋亡神經(jīng)元只有少部分?jǐn)嗔训腄NA，CA4區(qū)和海馬回幾乎沒有細(xì)胞斷裂的DNA。復(fù)合制劑預(yù)處理劑量依賴性減少了切片中斷裂DNA神經(jīng)元的數(shù)目，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。試驗(yàn)例6.藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的防護(hù)作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的6號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=6:2:2。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(見試驗(yàn)例2)飼養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。電子顯微鏡檢測了缺血再灌手術(shù)三天后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的狀態(tài)。陰性對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞核，細(xì)胞核膜完整，DNA均勻的分布于核中。與陰性對照組相比，多數(shù)缺血再灌注組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核，表現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞的特征，細(xì)胞核皺縮，DNA凝聚在核膜附近。低劑量處理組的CA1區(qū)細(xì)胞核部分表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞特征，部分細(xì)胞核DNA均勻的分布與細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核膜基本完整但是與核膜相連的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹。高劑量處理組CA1區(qū)神經(jīng)元大部分型態(tài)完好，DNA均勻的分布于細(xì)胞核內(nèi)，表現(xiàn)出正常細(xì)胞特征，極少數(shù)神經(jīng)元表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞特征。電子顯微鏡結(jié)果進(jìn)一步表明，復(fù)合制劑預(yù)處理可以保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元免受缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡。試驗(yàn)結(jié)果見圖8。試驗(yàn)例7.藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中iNOS的mRNA水平本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的7號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=7:2:1。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件(見試驗(yàn)例2)下詞養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。用RT-PCR試驗(yàn)檢測沙鼠大腦海馬組織中iNOS的mRNA水平，如圖9所示。在缺血再灌注組iNOS的mRNA大量表達(dá)，復(fù)合制劑處理劑量依賴性降低了iNOS的mRNA表達(dá)水平。試驗(yàn)例8.藥物復(fù)合制劑對沙鼠腦卒中大腦海馬組織中NFABp65和TNF-a的蛋白質(zhì)水平作用本試驗(yàn)例采用口服液劑型的藥物復(fù)合制劑，表2中的7號產(chǎn)品，其中活性成分重量比例為楂黃酮銀杏黃酮知母寧=7:2:1。雄性蒙古沙鼠(來自北京動物中心)，體重5070克，每籠一只，在標(biāo)準(zhǔn)條件(見試驗(yàn)例2)下飼養(yǎng)，自由飲食，隨機(jī)分為四組缺血再灌注組(IR)，自來水喂養(yǎng)15天后，實(shí)行缺血再灌注手術(shù)；陰性對照組，處理與IR組相同但是不結(jié)扎頸總動脈；低劑量處理組，用含有0.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同；高劑量保護(hù)組，用含有2.5mg/ml復(fù)合制劑的自來水喂養(yǎng)，其余處理與IR組相同。動物在手術(shù)之后處死前，繼續(xù)用相應(yīng)的自來水或自來水配制的抗氧化劑喂養(yǎng)。每天記錄動物的飲水量，計(jì)算動物實(shí)際的服藥量。缺血再灌注損傷48小時(shí)后海馬區(qū)NFA:B和TNF-a的蛋白質(zhì)水平如圖10和11中所示(所述蛋白質(zhì)水平以考馬斯亮藍(lán)G-250測定并調(diào)整所有的樣品至統(tǒng)一的蛋白濃度)。在陰性對照組中NFAB顯示構(gòu)成型表達(dá)，缺血再灌注損傷顯著性增加了75。％左右的NFAB表達(dá)水平。復(fù)合制劑處理劑量依賴性降低了NFAB的表達(dá)水平，其中高劑量組的表達(dá)水平與缺血再灌注組相比有顯著性差異，與陰性對照組相比差異不顯著(如圖IO所示)。TNF-a的蛋白質(zhì)水平也表現(xiàn)出相似的趨勢。TNF-a在陰性對照組中也有表達(dá)，但表達(dá)量比較低，可能是由于缺血再灌手術(shù)引起的。在缺血再灌注損傷組中，TNF-a的蛋白質(zhì)水平顯著性升高一倍以上。復(fù)合制劑處理劑量依賴性降低了TNF-a的蛋白質(zhì)水平，其中高劑量組與缺血再灌注組相比有顯著性差異(如圖ll所示)。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，而不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物復(fù)合制劑，其中所述藥物復(fù)合制劑包含由山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧組成的藥物組合物作為有效成分，和藥用輔料。2.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合制劑，其中，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為09重量份，銀杏黃酮的含量為1~7重量份，并且知母寧的含量為0~3重量份。3.權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)的藥物復(fù)合制劑，其中，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為4重量份，銀杏黃酮的含量為3重量份，并且知母寧的含量為3重量份。4.權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)的藥物復(fù)合制劑，其中，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為5重量份，銀杏黃酮的含量為3重量份，并且知母寧的含量為2重量份。5.權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)的藥物復(fù)合制劑，其中，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為8重量份，銀杏黃酮的含量為1重量份，并且知母寧的含量為1重量份。6.權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)的藥物復(fù)合制劑，其中，在10重量份的所述藥物組合物中，山楂黃酮的含量為9重量份，并且銀杏黃酮的含量為1重量份。7.權(quán)利要求1的藥物復(fù)合制劑，其中所述藥物復(fù)合制劑為膠囊、片劑或口服液。8.權(quán)利要求7的藥物復(fù)合制劑，其中，當(dāng)所述藥物復(fù)合制劑為膠囊時(shí)，其中藥用輔料是葛根粉；當(dāng)所述藥物復(fù)合制劑為片劑時(shí)，其中藥用輔料是淀粉；當(dāng)所述藥物復(fù)合制劑為口服液時(shí)，其中藥用輔料是檸檬酸水溶液。9.權(quán)利要求1的藥物復(fù)合制劑的制備方法，所述方法包含將有效量的所述藥物組合物與所述藥用輔料混合。10.權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的藥物復(fù)合制劑在制備用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供用于臨床預(yù)防和治療腦卒中的藥物復(fù)合制劑，所述藥物復(fù)合制劑包含由山楂黃酮、銀杏黃酮和知母寧的藥物組合物作為有效成分和藥用輔料，并且提供用于制備所述藥物復(fù)合制劑的方法。本發(fā)明的藥物復(fù)合制劑可有效用于臨床預(yù)防和治療腦卒中。文檔編號A61K36/734GK101618092SQ20081011604公開日2010年1月6日申請日期2008年7月2日優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日發(fā)明者趙保路申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所