專利名稱：：一種抗腫瘤中藥提取物及其制備方法及其用途的制作方法一種抗腫瘤中藥提取物及其制備方法及其用途
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的抗腫瘤中藥提取物以及其制備方法，及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤己經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，全球每年因腫瘤而死亡的人數(shù)已達700萬人；而國內(nèi)每年新增腫瘤病人200萬，其危害性僅次于心血管疾病，成為導(dǎo)致國內(nèi)人口死亡的第二大原因。目前，化學(xué)藥物治療是臨床腫瘤治療的重要手段之一。自一十世紀四十年代氮芥用于治療惡性淋巴瘤后，幾十年來藥物治療取得很大進展，已由單一的藥物治療進入了聯(lián)合化療和綜合化療的階段。但現(xiàn)有的抗腫瘤藥物依然存在毒副反應(yīng)太大，缺乏選擇性的缺點，加之腫瘤多重耐藥性日益嚴重，因此，如何增強現(xiàn)有抗腫瘤藥物的治療效果，減少毒性，是抗腫瘤藥物研究的一個重要領(lǐng)域。中藥在減輕和改善化療藥物的副作用及增加化療效果方面一直發(fā)揮著獨特的作用。圓錐鐵線蓮Chffiatistei7"'/7ciraDC.系毛茛科鐵線蓮屬植物，又名錐花鐵線蓮，銅威靈，蟹沬眼草，小葉力剛，具有祛風(fēng)除濕、解毒消腫、涼血止血的功能，用于治療風(fēng)濕痹痛、疔瘡腫毒、惡腫瘡瘺、喉痹、蛇犬咬傷及吐血、咳血、崩漏下血等癥。主產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽等地。目前，尚沒有成熟的提取圓錐鐵線蓮用丁抗腫瘤藥物的方法。并且，目前的抗腫瘤藥物在體外對白血病Molt-4細胞株、白血病細胞HL60、腦癌U251細胞株、食道癌細胞Eca-109細胞株、肝癌BEL-7402細胞株的生長的抑制作用不大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提出一種抗腫瘤中藥提取物及其制備方法及其用途，該提取物能夠在體外對白血病Molt-4細胞株、白血病細胞HL60、腦癌U251細胞株、食道癌細胞Eca-109細胞株、肝癌BEL-7402細胞株的生長具有良好的抑制作用，能夠用于制備治療腫瘤尤其是消化系統(tǒng)惡性腫瘤等疾病的藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種抗腫瘤中藥提取物的制備方法，將圓錐鐵線蓮粉碎或直接用圓錐鐵線蓮飲片，加水或乙醇后加熱回流提取2-5次，再過濾并合并提取液，過濾或離心后通過大孔樹脂，然后先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去，再用體積百分比為30-95%的含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至稠膏，稠膏再減壓或噴霧干燥即得到圓錐鐵線蓮提取物。作為優(yōu)選，所述大孔樹脂的徑高比為1:3-1:9。作為優(yōu)選，所述干的大孔樹脂的用量為提取液中黃酮含量的5-10倍。作為優(yōu)選，所述提取液的上柱流速為卜4BV/h。作為優(yōu)選，所述水洗滌樹脂的流量為脂3-8BV，流速為2-4BV/h。作為優(yōu)選，所述乙醇洗脫的流速為2-4BV/h。作為優(yōu)選，所述加水或乙醇后加熱回流提取步驟中加水量為圓錐鐵線蓮的6-15倍。作為優(yōu)選，所述加水量為圓錐鐵線蓮的8倍，加熱回流提取的次數(shù)為2次，每次1-3小時。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提出了一種采用上述制備方法所得到的抗腫瘤中藥提取物，所述提取物為圓錐鐵線蓮提取物，其中按重量百分比算，含有不低于20%的黃酮，不低于O.1%的蘆丁。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提出了一種上述抗腫瘤中藥提取物的用途，該圓錐鐵線蓮提取物用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的提取物在體外對白血病Molt-4細胞株、白血病細胞HL60、腦癌U251細胞株、食道癌細胞Eca-109細胞株、肝癌BEL-7402細胞株的增殖均表現(xiàn)出良好的抑制作用；對荷H22肝癌小鼠、荷S180肉瘤小鼠、荷胃癌SGC7901裸鼠具有明顯的治療作用。可用于制備治療腫瘤尤其是消化系統(tǒng)惡性腫瘤等疾病的藥物。本發(fā)明的特征及優(yōu)點將通過實施例進行詳細說明。具體實施方式抗腫瘤中藥提取物的制備方法是圓錐鐵線蓮藥材粉碎或直接用圓錐鐵線蓮飲片，加6-15倍量水或10%-95%的乙醇，加熱回流提取2-5次，每次l-3h，過濾，合并提取液，濃縮至0.25-2.0g生藥/mL;過濾或離心(4000-16000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過大孔樹脂，藥液按總黃酮含量計與干樹脂的比例為1:5-10，上柱流速1-4BV/h，樹脂徑高比為1:3-1:9;用水洗滌樹脂3-8BV，洗脫流速為2-4BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比為30-95%含水乙醇洗脫，流速為2-4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.1-1.3(5(TC熱測)的稠膏，該稠膏減壓或噴霧干燥，得圓錐鐵線蓮提取物。實施例一圓錐鐵線蓮藥材粗粉5kg，加8倍量水，加熱回流提取2次，每次lh，過濾，合并提取液，濃縮至1.0g生藥/ml;離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過AB-8型大孔樹脂，藥液按圓錐鐵線蓮總黃酮含量計與干樹脂的比例為1:5，上柱流速2BV/h，樹脂徑高比為1:5;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含70X水乙醇洗脫3BV，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.1(5(TC熱測)，減壓干燥，得圓錐鐵線蓮提取物。測得該提取物總黃酮含量為27%(UV法；重量百分比)，蘆丁的含量為0.45%(HPLC法，重量百分比)。實施例二圓錐鐵線蓮藥材飲片5kg，加10倍量30%乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并提取液，濃縮至0.5g生藥/ml;過濾后通過D201型大孔樹脂，藥液按總黃酮含量計與干樹脂的比例為1:9，上柱流速3BV/h，樹脂徑高比為1:7;用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含30%水乙醇洗脫IOBV，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.25(50°C熱測)，噴霧干燥，得圓錐鐵線蓮提取物。測得該提取物總黃酮含量為35%(UV法，重量百分比)，蘆丁的含量為l.1%(HPLC法，重量百分比)。實施例三圓錐鐵線蓮藥材飲片5kg，加15倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次lh，過濾，合并提取液，濃縮至0.25g生藥/ml;離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過HPD101型大孔樹脂，藥液按總黃酮含量計與干樹脂的比例為1:6，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1:9;用水洗滌樹脂2BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用含70X水乙醇洗脫5BV，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.2(5(TC熱測)，噴霧干燥，得圓錐鐵線蓮提取物。測得圓錐鐵線蓮總黃酮含量為70%(UV法，以圓錐鐵線蓮皂苷D計，重量百分比)，蘆丁的含量為2.2%(HPLC法，重量百分比)。圓錐鐵線蓮提取物的藥理作用如下一圓錐鐵線蓮提取物在體外對多種腫瘤細胞株生長的影響1方法采用計活細胞數(shù)法檢測定圓錐鐵線蓮提取物對白血病Molt-4、白血病細胞HL60、腦癌U251、食道癌細胞Eca-109、肝癌BEL-7402等腫瘤細胞株的體外生長抑制率。2試驗步驟2.1將對數(shù)生長期的腫瘤細胞以每毫升4X10'個接種于96孔板，重復(fù)3孑L。2.2根據(jù)實驗組分的溶解性，用乙醇(99.9%)、DMS0溶解配成母液，再用1640培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，溶劑對照也配成相應(yīng)濃度，使細胞培養(yǎng)孔中的終濃度為劑量的設(shè)置值。2.3細胞培養(yǎng)兩小時后，加入實驗藥物組、溶劑對照組、培養(yǎng)液對照組，等體積。2.4不同時間點下，顯微鏡觀察細胞生長情況，抑制率=1-(實驗活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù))X100%。3試驗結(jié)果見表1。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4結(jié)論圓錐鐵線蓮提取物在體外對白血病Molt-4、白血病細胞HL60、腦癌U251、食道癌細胞Eca-109、肝癌BEL-7402等腫瘤細胞株的生長具有明顯的抑制作用。二圓錐鐵線蓮提取物對荷人SGC7901胃癌裸鼠的實驗治療作用l.方法取荷人胃癌SGC7901裸鼠1只(購于中科院上海藥物研究所動物中心)，待腫瘤長到約500誦'i時，無菌條件下剖殺小說，取出瘤塊切割成約1.5mm3,用套管針接種到45周齡雄性裸小鼠右前肢腋皮下，共21只。待瘤塊長到100150匪3時將裸小鼠隨機分成4組，分別為(1)陰性對照組6只，灌胃給予滅菌蒸餾水0.4mL/只;(2)陽性對照組3只，羥基喜樹堿(HCPT)20mg/kg，im;(3)圓錐鐵線蓮提取物實驗組6只，灌胃給予圓錐鐵線蓮提取物3.0g/kg;(4)圓錐鐵線蓮提取物實驗組6只，灌胃給予圓錐鐵線蓮提取物4.0g/kg。各組連續(xù)給藥15天，每2天稱量裸鼠重量，并測定瘤塊的長和寬，按一下公式計算瘤塊的體積V=1/2*a*b2(a為瘤塊的長；b為瘤塊的寬)實驗結(jié)束后，剖殺裸小鼠，取瘤塊稱重。按照以下公式計算相對瘤體積(Relativetumorvolume,RTV)和相對腫瘤增殖率T/C(%)。RTV=Vt/V(1(V。為分籠時腫瘤體積；Vt為每次測量時腫瘤體積)T/C(%)=~^"KTV木100%TKTV:治療組RTV;:C,陰性對照組RTV2實驗結(jié)果見表2。表2:陰性對照620.2±0.921.5±0.8]51.0士化.63。6.2±179.4i.化士O.33—HCPT10mg/kg320.8±1.916.3±3.〔)308.5±961486±639.1()37±0.21科68.6鐵線蓮^19.5±1.620.7±2.0160.8±50.71243.0±462.0，A。Anrv?！?。A,,61.08±0.208.53.Og/kg鐵線蓮，.20.8±1.621.0±1.7131.7±40.5713.6±206.8n，。Ann，AA仏A60.72±().25承40.040g/kg_3實驗結(jié)論圓錐鐵線蓮提取物對荷人SGC7901胃癌裸鼠有明顯的治療作用。二二圓錐鐵線蓮提取物對荷H22肝癌小鼠和荷S180肉瘤小鼠的實驗治療作開好體重(g)結(jié)束開始瘤體積(mm3)會吉^瘤重(g)抑瘤(%)動物數(shù)且經(jīng)1.方法ICR小鼠分別腋下接種2X1C)5個H22肝癌及S180肉瘤細胞，連續(xù)灌胃鐵線蓮6天，剖殺后取瘤塊稱重，計算腫瘤抑制百分率。2.實驗材料2.l試驗試劑圓錐鐵線蓮提取物2.2實驗動物小鼠ICR品系，雄性，58只，實驗一體重20士2g，實驗二體重21土lg。由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。合格證SCXK(浙)2003-0001。發(fā)證單位浙江省實驗動物管理委員會。3.實驗步驟3.1接種癌細胞將預(yù)先接種H22和S180腹水瘤的小鼠處死，從腹腔中抽取1mL腹水瘤，用生理鹽水稀釋成1X1(f個細胞/mL，按0.2mL/只注射于小鼠腋下，24小時后，隨機分組，并開始給藥。3.2分組及給藥58只接種H22肝癌小鼠隨機分成5組，(1)陰性對照組18只，(2)陽性對照順鉑組10只，(3)圓錐鐵線蓮提取物3.0g/kg組10只，(4)圓錐鐵線蓮提取物6.0g/kg組10只，(5)圓錐鐵線蓮提取物12.0g/kg組10只。陰性對照組每天灌胃生理鹽水0.3mL/10g，陽性對照(順鉑)組每天腹腔注射1.Omg/kg，每天一次，圓錐鐵線蓮提取物3.0、6.0、12.0g/kg組每天灌胃0.05、0.10、0.20g/mL濃度圓錐鐵線蓮提取物，給藥容量0.3mL/10g，一天兩次，連續(xù)給藥6天后，停藥，稱小鼠體重，并解剖取瘤塊稱重量，計算腫瘤抑制百分率，做統(tǒng)計學(xué)分析。另58只接種S180肉瘤小鼠隨機分成5組，同上分組、給藥。4.實驗結(jié)果4.1H22肝癌連續(xù)給藥6天后，陽性對照，圓錐鐵線蓮提取物3.0g/kg，6.0g/kg禾口12.0g/kg組的H22肝癌平均瘤重分別為0.18g、0.14g、0.04g、0.Olg，與陰性對照組0.77g比較，均有不同程度的下降，抑瘤率分別為76%、81%、95%和98%。見表3。表3:_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.2S180肉瘤連續(xù)給藥6天后，陽性對照，圓錐鐵線蓮提取物3.0g/kg，6.0g/kg和12.Og/kg組的S180肉瘤平均瘤重分別為0.llg、0.46g、0.37g、0.02g，與陰性對照組0.71g比較，均有不同程度的下降，抑瘤率分別為85%、36%、48%和98%。見表4。表4:組別給藥方動物數(shù)(只)式開始體重(g)開始結(jié)束開始結(jié)束瘤重(g)抑瘤率(%)陰性對照0.3(蒸餾mlZlOg水)順鉑1.0mg/kg低劑量3.0g/kg中劑量6.0g/kg高劑量12.Og/kgi.g.181819.7±1.228.2±2.60.71±0.4019.8±.526.8±2.50.11±0.0685林19.7±1.619.5土1.丄0.46±0.丄736*19.9±1.617.肚0.70.37±0.2248林]9.2±1.()16.2±1.20.02±0.0298***i.p.1010i.g-1010i.g.109i,g-107〈0.001。5.實驗結(jié)論圓錐鐵線蓮提取物對j、鼠H22肝癌和S180肉瘤均有顯著的實驗治療作用。陰性對0.3〖餾ml/10g鉑1.Omg/kg遣3.0g/kg還6.0g/kg遣12.Og/kgg-181819,4±1.327.3±1.90.77±0.66p-101019.6±丄.424.7±2.10.18±0.1676g.101019.9±1.321.0±1.50.14±0.1781g-10919.3±1.320.4±0.90.04±0.0495g.10720.4±0.817.0±1.30.Ol土O.0198秦；齊，界布{水順低中高該中藥提取物可與臨床常用腫瘤化療藥物環(huán)磷酰胺、5-Fii、紫杉醇、順鉬等合用，以增強療效。上述實施例是對本發(fā)明的說明，不是對本發(fā)明的限定，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上簡單變換后的方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1.抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于將圓錐鐵線蓮粉碎或直接用圓錐鐵線蓮飲片，加水或乙醇后加熱回流提取2-5次，再過濾并合并提取液，過濾或離心后通過大孔樹脂，然后先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去，再用體積百分比為30-95％的含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至稠膏，稠膏再減壓或噴霧干燥即得到圓錐鐵線蓮提取物。2.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂的徑高比為1.'3-l:9。3.如權(quán)利要求2所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述干的大孔樹脂的用量為提取液中黃酮含量的5-10倍。4.如權(quán)利要求3所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述提取液的上柱流速為1-4BV/h。5.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述水洗滌樹脂的流量為脂3-8BV，流速為2-4BV/h。6.如權(quán)利要求5所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述乙醇洗脫的流速為2-4BV/h。7.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述加水或乙醇后加熱回流提取步驟中加水量為圓錐鐵線蓮的6-15倍。8.如權(quán)利要求7所述的抗腫瘤中藥提取物的制備方法，其特征在于所述加水量為圓錐鐵線蓮的8倍，加熱回流提取的次數(shù)為2次，每次l-3小時。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項的制備方法所得到的抗腫瘤中藥提取物，其特征在于所述提取物為圓錐鐵線蓮提取物，其中按重量百分比算，含有不低于20%的黃酮，不低于O.1%的蘆丁。10.權(quán)利要求9中所述的抗腫瘤中藥提取物的用途，其特征在于該圓錐鐵線蓮提取物用于制備抗腫瘤藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗腫瘤中藥提取物及其制備方法及其用途，將圓錐鐵線蓮粉碎或直接用圓錐鐵線蓮飲片，加水或乙醇后加熱回流提取2-5次，再過濾并合并提取液，過濾或離心后通過大孔樹脂，然后先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去，再用體積百分比為30-95％的含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至稠膏，稠膏再減壓或噴霧干燥即得到黃酮含量不低于20％、蘆丁含量不低于0.1％的圓錐鐵線蓮提取物。本發(fā)明的提取物在體外對白血病Molt-4細胞株、白血病細胞HL60、腦癌U251細胞株、食道癌細胞Eca-109細胞株、肝癌BEL-7402細胞株的增殖均表現(xiàn)出良好的抑制作用?？捎糜谥苽渲委熌[瘤尤其是消化系統(tǒng)惡性腫瘤等疾病的藥物。文檔編號A61P35/00GK101352490SQ20081012100公開日2009年1月28日申請日期2008年9月12日優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日發(fā)明者吳淑英,琳張,彭曉國,田景奎申請人:浙江大東吳藥業(yè)有限公司