蟾酥提取物制備方法及其在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)，特別涉及一種蟾酥提取物制備方法及其在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膠質(zhì)瘤是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的一種最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35%?61%，其侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，是病死率和致殘率都較高的惡性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤在發(fā)病之初，通常沒有典型的癥狀，并且膠質(zhì)瘤位于重要功能區(qū)及深部的侵襲性生長(zhǎng)特征，使其難以全切，對(duì)放化療也不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)。而化學(xué)藥物和一般的抗腫瘤中藥，因很難同時(shí)具有殺傷腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和透過血腦屏障兩方面作用，療效也不理想，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。因此，研發(fā)相對(duì)高效低毒的新型抗腦膠質(zhì)瘤化療藥物成為臨床上亟待解決的問題，同時(shí)也是當(dāng)前世界研究的前沿課題和熱點(diǎn)領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種蟾酥提取物制備方法，該方法能夠提尚提取物中的有效成分瞻毒靈(B)、華瞻醉毒基(C)和脂瞻毒配基(R)的綜合純度，以便提高其相應(yīng)制劑應(yīng)用效果。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種蟾酥提取物的普通溶液劑及其制備方案，蟾酥提取物的普通溶液劑用于抗腦膠質(zhì)瘤藥物。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0006]技術(shù)方案一:
[0007]本發(fā)明的一種蟾酥提取物制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](I)將蟾酥藥材粉碎成粗粉，加入體積濃度90 % -95 %的乙醇中依次溶解、抽濾，蒸發(fā)濾液的乙醇，干燥，得到粗提物；
[0009](2)將粗提物加入蒸餾水，超聲懸浮，得懸浮液;再加入乙酸乙酯萃取，得萃取液；蒸發(fā)萃取液中的乙酸乙酯，并真空干燥，得到萃取物；
[0010](3)將萃取物溶于體積比為1:1的氯仿和甲醇混合液中，濾去不溶物，得澄清液;將澄清液邊加邊攪拌于硅膠中拌樣，放置待完全干燥，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，硅膠柱色譜分離時(shí)，洗脫劑依次選用環(huán)己烷-丙酮混合液、丙酮和甲醇洗脫，得到混合洗脫液；
[0011](4)將混合洗脫液進(jìn)行減壓蒸餾，蒸發(fā)洗脫劑，并對(duì)餾分進(jìn)行濃縮，干燥，即得蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基綜合含量大于95 %的蟾酥提取物。
[0012]上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)和特點(diǎn)在于:
[0013]步驟(2)中，所述蒸餾水的質(zhì)量為所述步驟(I)中粗提物的質(zhì)量的10倍；乙酸乙酯的質(zhì)量為所述懸浮液的質(zhì)量的1倍。
[0014]步驟(3)中，所述氯仿和甲醇混合液的質(zhì)量為所述萃取物的質(zhì)量的1.5倍，硅膠的質(zhì)量為所述澄清液的質(zhì)量的5倍；
[0015]步驟(3)中硅膠柱色譜分離時(shí)，先用體積比為10:1的環(huán)己烷-丙酮混合液洗脫，再用體積比為5:1的環(huán)己烷-丙酮混合液洗脫，然后用丙酮洗脫，最后用甲醇洗脫。
[0016]蟾酥抗癌有效成分主要是脂溶性的蟾毒配基類化合物，其中蟾毒靈(Bufalin)、華蟾酥毒基(Cinobufagin)和脂蟾毒配基(Resibufogenin)是蟾毒配基中含量較高、活性較強(qiáng)的三個(gè)成分，均為白色或近似白色粉狀物。
[0017]本發(fā)明制備的蟾酥提取物，經(jīng)薄層色譜法(TLC)鑒定，其中蟾毒靈(Bufalin)含量約20%、華蟾醉毒基(Cinobufagin)含量約為30%和脂蟾毒配基(Resibufogenin)含量約為46%，三者的綜合含量在95%以上。
[0018]技術(shù)方案二:
[0019]本發(fā)明的一種蟾醉提取物的普通溶液劑(bufadienolides solut1n,BU-S)，用于抗腦膠質(zhì)瘤藥物，其特征在于，其5mL標(biāo)準(zhǔn)劑量組分為:2.5mg蟾酥提取物，2.5mL第一溶劑丙二醇，其余為第二溶劑注射水。
[0020]上述蟾酥提取物的普通溶液劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:稱定蟾酥提取物2.5mg置5mL量瓶中，加入丙二醇2.5mL，超聲溶解，加注射用水稀釋定容5mL，搖勻，用
0.22μπι濾膜濾過，即得。
[0021]其中，所述蟾酥提取物中蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基綜合含量大于95%。
[0022]本發(fā)明在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用，通過BU-S處理過的膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞MTT檢測(cè)，證明對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用;通過BU-S對(duì)裸鼠原位移植腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行作用，與常規(guī)臨床藥物替莫唑胺注射液(TemozolomideJMZM)以及陰性對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，通過核磁共振掃描技術(shù)和活體動(dòng)物體內(nèi)熒光成像技術(shù)檢測(cè)裸鼠腦膠質(zhì)瘤的體積和腫瘤的信號(hào)強(qiáng)度；通過HE染色(蘇木精-伊紅染色法，hematoxylin-eosin staining ,HE)對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查;免疫組化技術(shù)檢(S-100)和(GFAP)蛋白的表達(dá)；因此證明，BU-S具有體內(nèi)抗腦膠質(zhì)瘤的作用。
[0023]技術(shù)方案三:
[0024]蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基綜合含量大于95%的蟾酥提取物中在制備在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0026]圖1為本發(fā)明蟾酥提取物的普通溶液劑(BU-S)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖抑制作用的示意圖；圖中橫坐標(biāo)是BU-S的藥物濃度，縱坐標(biāo)是U87-MG細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，圖中的三條趨勢(shì)線從下往上依次為不同濃度藥物作用24h、48h和72h后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
[0027]圖2為流式細(xì)胞術(shù)BU-S對(duì)U87-MG細(xì)胞凋亡的影響圖，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，橫坐標(biāo)是Annexin V，縱坐標(biāo)是PI，左下象限是活細(xì)胞，右下象限是凋亡早期細(xì)胞，右上象限是凋亡晚期細(xì)胞。Control是正常對(duì)照組，BU-SP low,BU-SP middle和BU-SP high分別為BU-SP的三個(gè)劑量組(10、30和60yg/ml)
[0028]圖3為本發(fā)明不同給藥組裸鼠治療后的體重變化比較圖，圖中橫坐標(biāo)為不同給藥組，從左到右依次為空白對(duì)照組，BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM(2.5mg/ml)組，每組均包括造模前裸鼠的體重，造模后14天裸鼠的體重及給藥后12天裸鼠的體重；縱坐標(biāo)表示不同組別裸鼠的體重變化。
[0029]圖4為本發(fā)明不同給藥組裸鼠的帶瘤生存期比較圖，圖中橫坐標(biāo)為不同給藥組，從左到右依次為空白對(duì)照組，BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM(2.5mg/ml)組，縱坐標(biāo)表示不同組別裸鼠帶瘤的生存時(shí)間。
[0030]圖5為本發(fā)明熒光成像檢測(cè)不同給藥組裸鼠體內(nèi)腫瘤信號(hào)強(qiáng)度圖，圖中橫坐標(biāo)為不同給藥組，從左到右依次為空白對(duì)照組，BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM( 2.5mg/ml)對(duì)照組，縱坐標(biāo)表示不同組別裸鼠體內(nèi)腫瘤信號(hào)強(qiáng)度。
[0031]圖6為本發(fā)明不同給藥組裸鼠腦膠質(zhì)瘤的體積變化圖，圖中橫坐標(biāo)為不同給藥組，從左到右依次為空白對(duì)照組，BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM (2.5mg/ml)對(duì)照組，縱坐標(biāo)表示不同組別裸鼠腦內(nèi)腫瘤的體積。
[0032]圖7為不同給藥組裸鼠的抑瘤率圖，圖中橫坐標(biāo)為不同給藥組，從左到右依次為空白對(duì)照組，BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM( 2.5mg/ml)對(duì)照組，縱坐標(biāo)表示不同組別裸鼠的抑瘤率。
[0033]圖8為不同給藥組腦膠質(zhì)瘤的病理學(xué)檢查(HE染色，X200)圖，圖中從左到右依次為正常對(duì)照組、模型組、BU-S(0.lmg/ml)組和陽(yáng)性藥TMZM( 2.5mg/ml)對(duì)照組。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下給出具體的實(shí)驗(yàn)例以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明不限于這些實(shí)驗(yàn)例。
[0035]實(shí)驗(yàn)例1:
[0036]本發(fā)明的蟾酥提取物制備方法，包括以下步驟:
[0037](I)將蟾酥藥材粉碎成粗粉，過于60目篩，加入體積濃度80%的乙醇中溶解，其中，乙醇的質(zhì)量為粗粉質(zhì)量的10倍，溶解為水浴加熱溶解，水浴加熱溫度為800C，加熱時(shí)間為Ih;然后抽濾，蒸發(fā)濾液的乙醇，干燥，得到粗提物。
[0038](2)將粗提物加入蒸餾水，其中蒸餾水的質(zhì)量為粗提物的質(zhì)量的10倍，超聲懸浮，得懸浮液;再加入乙酸乙酯萃取，其中乙酸乙酯的質(zhì)量懸浮液的質(zhì)量的10倍，得萃取液;蒸發(fā)萃取液中的乙酸乙酯，并真空干燥，得到萃取物。
[0039](3)將萃取物溶于體積比為1:1的氯仿和甲醇混合液中，其中氯仿和甲醇混合液的質(zhì)量為萃取物的質(zhì)量的1.5倍，濾去不溶物，得澄清液;將澄清液邊加邊攪拌于硅膠中拌樣，其中硅膠的質(zhì)量為澄清液的質(zhì)量的5倍，放置待完全干燥，進(jìn)行硅膠柱色譜分離。
[0040]硅膠柱色譜分離時(shí)，先用體積比為10:1的環(huán)己烷-丙酮混合液洗脫3次，再用體積比為5:1的環(huán)己烷-丙酮混合液洗脫5次，然后用丙酮洗脫I次，最后用甲醇洗脫I次，得到混合洗脫液。
[0041](4)將混合洗脫液進(jìn)行減壓蒸餾，蒸發(fā)洗脫劑，并對(duì)餾分進(jìn)行濃縮，干燥，即得蟾酥提取物。
[0042]采用薄層色譜法(TLC)，測(cè)定蟾酥提取物中蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量，計(jì)算蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的純度。本實(shí)施例的蟾酥提取物中，蟾毒靈(Bufal in)含量20%、華蟾酥毒基(Cinobufagin)含量為30%和脂蟾毒配基(Resibufogenin)含量為46%，三者的含量96%。
[0043]蟾酥抗癌有效成分主要是脂溶性的蟾毒配基類化合物，其中蟾毒靈(Bufalin)、華蟾酥毒基(Cinobufagin)和脂蟾毒配基(Resibufogenin)是蟾毒配基中含量較高、活性較強(qiáng)的三個(gè)成分，均為白色或近似白色粉狀物。
[0044]實(shí)驗(yàn)例2:
[0045]上述蟾醉提取物的普通溶液劑(bufadienolides solut1n，BU_S)，用于抗腦膠質(zhì)瘤藥物，其5mL標(biāo)準(zhǔn)劑量組分為:2.5mg蟾酥提取物，2.5mL第一溶劑丙二醇，其余為第二溶劑注射水。其中，所述蟾酥提取物中蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基綜合含量大于95%。本實(shí)驗(yàn)例2采用實(shí)驗(yàn)例I制備的蟾酥提取物。
[0046]上述蟾酥提取物的普通溶液劑的制備方法，包括以下步驟:稱定蟾酥提取物2.5mg置5mL量瓶中，加入