專利名稱：鹽酸洛哌丁胺作為抗腫瘤藥物組分及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹽酸洛哌丁胺的應(yīng)用，特別是作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤包括癌和肉瘤，是危害人類健康的常見而難治之癥。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 人們已經(jīng)開發(fā)出了多種化療和生物治療藥物。目前可以單用或與化療相結(jié)合的生物治療藥 物包括細(xì)胞因子、造血生長因子、過繼免疫治療、體細(xì)胞治療、表皮生長因子酪氨酸激酶 抑制劑、血管生長抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)劑、反義治療、法 尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多靶點(diǎn)抗葉酸藥、腫瘤壞死因子相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體、生長抑素、單 克隆抗體靶向治療、瘤苗治療、基因治療等種類。為進(jìn)一步提高療效，還開發(fā)了生物治療 /化療的同時療法、序貫療法等聯(lián)合治療策略[李衛(wèi)東，李金翰.惡性腫瘤生物化療及其臨 床應(yīng)用類別.癌癥進(jìn)展雜志，2003,1(4): 202-205.]。
化療對于腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移或不能用手術(shù)切除的患者是最主要的治療方法和手段。但是傳 統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，還作用于正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的毒副作用，而 且腫瘤細(xì)胞在存活壓力下還很容易產(chǎn)生耐藥性。而近年來發(fā)展迅速的分子靶向藥物雖然耙 點(diǎn)明確特異，但也有一系列脫靶效應(yīng)(off target effect)的報道，而且單一用藥使人 體產(chǎn)生耐藥性的機(jī)率較大。因而，發(fā)展具有新型作用機(jī)理的療效好、毒性低的抗腫瘤新藥 具有重要的意義。
鹽酸洛哌丁胺(Loperamide hydrochloride)又名易蒙停，化學(xué)名為N， N-二甲基-a， a -二苯基-4-(對-氯苯基)-4-羥基-1-哌啶丁酰胺鹽酸鹽，是由比利時Janssen公司開發(fā)的
一種無嗎啡樣中樞作用的止瀉藥，用于急性腹瀉和各種原因引起的慢性腹瀉，對不明原因 的腹瀉和腸易激綜合征等也有較好療效。同時，該藥不良反應(yīng)發(fā)生率低，偶見過敏反應(yīng)(包
括皮疹)、胃腸不適、惡心、嘔吐、腹痛、頭痛、口干、頭暈、便秘、腸梗阻等，其變態(tài) 反應(yīng)，特別是伴有中樞癥狀的變態(tài)反應(yīng)較為少見。由于其安全性較好，被作為非處方藥銷 售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供鹽酸洛哌丁胺的一種新用途，即鹽酸洛哌丁胺作為制 備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的改進(jìn)鹽酸洛哌丁胺通過口服吸收、皮下注射或靜脈注射，產(chǎn)生
抗腫瘤作用。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)亡。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)
的Tie2受體發(fā)揮作用。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)
腫瘤生長停滯。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn) 揮作用。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn) 進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。
作為本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)
腎癌、胰腺癌或黑色素瘤。
因此，鹽酸洛哌丁胺能用于抑制腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的具體用法可選擇如下方式
將鹽酸洛哌丁胺先溶于二甲基亞砜(DMSO)或甲醇等助劑中形成母液。然后以適宜 的溶液(例如生理鹽水)將母液進(jìn)一步稀釋成為藥液，使最終的藥液中二甲基亞砜(DMSO) 或甲醇等助劑的體積比不超過千分之一，以消除助劑對使用結(jié)果的影響。 一般可按照1.8 2.2mg鹽酸洛哌丁胺/kg體重的劑量以注射的形式給藥。
本發(fā)明所用的鹽酸洛哌丁胺藥液對肝癌細(xì)胞SMMC7721、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肺腺癌 細(xì)胞SPC-A1、卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3-DDP等多種細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。本發(fā) 明所用的鹽酸洛哌丁胺藥液可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1是不同濃度鹽酸洛哌丁胺作用24h誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞SPC-A1凋亡的情況(PI單染)
:鹽酸洛哌丁胺能夠促進(jìn)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋
:鹽酸洛哌丁胺通過結(jié)合腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面
:鹽酸洛哌丁胺能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂，使
:鹽酸洛哌丁胺能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
:鹽酸洛哌丁胺通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的Tie2受體發(fā)
:鹽酸洛哌丁胺通過阻斷腫瘤細(xì)胞膜上的鈣離子通道
:所述腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、腸癌、乳腺癌、圖2是鹽酸洛哌丁胺37. 5 uM對肺腺癌細(xì)胞SPC-Al的凋亡誘導(dǎo)作用(FITC-Annexin V/PI雙染)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、鹽酸洛哌丁胺對細(xì)胞增殖的抑制作用
將鹽酸洛哌丁胺溶于二甲基亞砜(DMS0)或甲醇，配成鹽酸洛哌丁胺的濃度為50mM 的母液備用。
將對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞SMMC7721稀釋成2X10S個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 加入O. 1 ml，置37 'C， 5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁后，小心吸 棄上清。用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋母液，從而使鹽酸洛哌丁胺至不同的終濃度(100uM、 50uM、 25uM、 12. 5uM、 6. 25uM)，每濃度平行5孔，每孔加入0. 1 ml，空白對照組加等量 同樣稀釋的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h (培養(yǎng)條件同上)；實(shí)驗終止前4小時每孔加入5 mg/mlMTT 10 ul。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄上清，每孔加入150 ul 二甲基亞砜(DMSO)， 振蕩10 min。待MTT還原產(chǎn)物完全溶解后，用酶標(biāo)儀，以550 nm為檢測波長，655 nm為 參照波長測定其吸光度。計算細(xì)胞的存活率，并以藥物的不同濃度對細(xì)胞的存活率作圖，
從而確定藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
細(xì)胞蹄率:Hl^lllx腿 對照組的OD平均值
半數(shù)抑制濃度(IC5o):引起半數(shù)細(xì)胞死亡的藥物濃度。
實(shí)驗結(jié)果為鹽酸洛哌丁胺藥液對肝癌細(xì)胞SMMC7721的半數(shù)抑制濃度(IC5o)為 24. 2uM。
以乳腺癌細(xì)胞MCF-7替代肝癌細(xì)胞SMMC7721，其余測試方法同上，實(shí)驗結(jié)果為 鹽酸洛哌丁胺藥液對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)為23. 6uM。
以肺腺癌細(xì)胞SPC-A1替代肝癌細(xì)胞SMMC7721，其余測試方法同上，實(shí)驗結(jié)果為 鹽酸洛哌丁胺藥液對肺腺癌細(xì)胞SPC-A1的半數(shù)抑制濃度(IC5o)為25.9uM。
以卵巢癌耐藥細(xì)胞SK0V3-DDP替代肝癌細(xì)胞SMMC7721，其余測試方法同上，實(shí) 驗結(jié)果為鹽酸洛哌丁胺藥液對卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3-DDP的半數(shù)抑制濃度(IC5o)為 27. luM。
實(shí)施例2、 PI單染測定鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
取對數(shù)生長期的肺腺癌細(xì)胞SPC-A1，以2X105個/ml的密度接種于底面積25cm2的 培養(yǎng)瓶中，置37'C， 5%(202及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁后，用1640培養(yǎng) 基稀釋實(shí)施例1中的鹽酸洛哌丁胺母液(50mM)，從而使培養(yǎng)瓶中鹽酸洛哌丁胺的終濃度 分別為0、 12. 5uM、 25uM、 50uM，繼續(xù)培養(yǎng)24h (培養(yǎng)條件同上)。加入0. 25%胰酶200ul 消化細(xì)胞，1000rpm 6min離心，收集培養(yǎng)上清中和貼壁消化下來的細(xì)胞，以PBS洗2次， 離心去上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，在4。C下固定細(xì)胞3h以上或過夜。離心，去固定液， 用PBS緩沖液洗細(xì)胞一次，加入終濃度為50 ug/tnl的碘化丙錠(Propidium iodide， PI) 染色，室溫作用30min。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，CELLQUEST軟件分析數(shù)據(jù)并 作圖，亞二倍體峰被定量，作為測定凋亡的標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果表明，隨鹽酸洛哌丁胺濃度的增加，凋亡峰的比例逐漸增加(圖1)，說明鹽酸 洛哌丁胺可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
實(shí)施例3、 FITC-Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞早期凋亡
取對數(shù)生長期的肺腺癌細(xì)胞SPC-A1，以2X105個/ml的密度接種于底面積250112的 培養(yǎng)瓶中，置37'C， 5%<:02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁后，用1640培養(yǎng) 基稀釋實(shí)施例1中的鹽酸洛哌丁胺母液(50mM)，從而使培養(yǎng)瓶中鹽酸洛哌丁胺的終濃度 為37.5uM，繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，分別于作用Oh、 6h、 12h、 24h后，加入0.25% 胰酶200ul消化細(xì)胞，1000rpm6min離心，收集培養(yǎng)上清中和貼壁消化下來的細(xì)胞，以PBS 洗2次，離心去上清。按FITC-A腿xin V/PI雙染試劑盒說明，加入FITC-A匿xin V和 PI進(jìn)行染色。同時，取正常培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞SPC-Al，不加任何染料，作為陰性對照。 另外，還需制備FITC-Amiexin V陽性對照和PI陽性對照，即將正常培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞 SPC-A1煮沸3min，冷卻后，按試劑盒中用量，分別加入FITC-Annexin V和PI中的一禾中 即可。使用FACSArray Bioanalyzer流式細(xì)胞儀檢測。
結(jié)果表明，鹽酸洛哌丁胺作用6h即可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的早期凋亡，隨作用時間延長， 凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加(圖2)，說明鹽酸洛哌丁胺可以誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例4、鹽酸洛哌丁胺的體內(nèi)抗腫瘤活性
取對數(shù)生長期的肺腺癌細(xì)胞SPC-Al，在每個底面積252的培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰
酶200ul消化，將消化下來的細(xì)胞加入到15 ml塑料離心管中，1000 rpm離心10 min， 小心倒掉離心管中的培養(yǎng)液，加入PBS，吹打均勻，再IOOO rpm離心10 min，小心倒掉 離心管中的PBS，加入新的PBS，將細(xì)胞吹打均勻后調(diào)至lxl(^個/ml，用于接種。
購買四周齡SPF級BALB/c裸鼠，在接種前先馴養(yǎng)5天，并自由飲水和進(jìn)食。接種時， 在每只裸鼠的前肢皮下注射肺腺癌細(xì)胞SPOAl懸液(lxl(^個/ml) 0.2ml。接種后10天 左右，可見接種處形成瘤塊。將裸鼠稱重、標(biāo)記并隨機(jī)分為3組，每組10只。分別是
陰性對照組注射生理鹽水，0.2ml/次；
陽性對照組注射阿霉素(Adriamycin， ADM)溶液(以生理鹽水稀釋配制)，劑量 2 mg阿霉素/kg體重；
試驗組注射鹽酸洛哌丁胺藥液(以生理鹽水稀釋配制)，劑量2 mg鹽酸洛哌丁胺/kg 體重-，
采用腹腔注射形式(i. P.)給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥7天。每隔一天測量瘤 塊的體積，并觀察、記錄裸鼠的行為和死亡情況。連續(xù)觀察30天，對各組裸鼠的瘤塊體 積及死亡情況進(jìn)行對比，作為藥物療效的評價指標(biāo)。
結(jié)果表明，陰性對照組裸鼠在30天內(nèi)死光；陽性對照組在30天內(nèi)死亡3只，存活率70%， 瘤塊平均體積l. 73cm3;鹽酸洛哌丁胺組30天內(nèi)死亡1只，存活率90%,瘤塊平均體積l. 33cm3。 這說明鹽酸洛哌丁胺可以抑制裸鼠實(shí)體腫瘤的生長，并顯著提高裸鼠的存活率。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛 哌丁胺通過口服吸收、皮下注射或靜脈注射，產(chǎn)生抗腫瘤作用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸 洛哌丁胺能夠促迸腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛哌丁胺通過結(jié)合腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的Tie2受體發(fā)揮作用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛哌丁胺能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂，使腫瘤生長停滯。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛哌丁胺能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛哌丁胺通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的Tie2受體發(fā)揮作用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是鹽酸洛哌丁胺通過阻斷腫瘤細(xì)胞膜上的鈣離子通道進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征是所述腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、腸癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌或黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽酸洛哌丁胺的一種新用途作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。鹽酸洛哌丁胺對腫瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，鹽酸洛哌丁胺可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。
文檔編號A61P35/00GK101390858SQ20081012180
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者宮興文, 徐宇虹 申請人:浙江大學(xué)