專利名稱：預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法。
背景技術(shù)：
樹(shù)莓(Raspberry)也稱木莓，為薔薇科懸鉤子屬(Rubussp.)植物，鮮果 中含大量的維生素C、維生素E、 SOD(超氧化物歧化酶一含量居水果之首)、Y-氨基丁酸等抗衰老物質(zhì)和抗癌物質(zhì)一鞣化酸(Ellagicacid),其中維生素E和鞣 化酸含量為所有水果之最。美國(guó)稱紅樹(shù)莓是癌癥的克星，被譽(yù)為"紅寶石"。樹(shù) 莓是當(dāng)今風(fēng)靡歐美、深受人們歡迎的高營(yíng)養(yǎng)新興水果。鞣化酸對(duì)結(jié)腸、宮頸、 乳腺、和胰腺癌細(xì)胞有特殊療效。樹(shù)莓及其加工產(chǎn)品能有效地保持鞣化酸的活 性成分，并能被人體吸收。樹(shù)莓是當(dāng)今發(fā)現(xiàn)的天然鞣化酸含量最高的食物，鞣 化酸是一種帶苯環(huán)的酚類化合物，低含量的鞣化酸還可以減慢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)， 高含量則可殺死癌細(xì)胞。
目前國(guó)內(nèi)已有科研組研究樹(shù)莓，但不論是從研究的目的及研究的方向上都 有很大差異，在提取工藝上也有很大的差異。
沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院對(duì)樹(shù)莓進(jìn)行提取的工藝是采用了 SephadexG-100柱 層析的方法進(jìn)行的，這種方法具有很多缺點(diǎn)首先，層析運(yùn)用正負(fù)電荷相吸原 理進(jìn)行，這種方法容易丟失中性基團(tuán)基及弱電荷基團(tuán)，眾所周知，很多有機(jī)物 都是中性的；其次，由于植物化學(xué)物質(zhì)之間是有配伍功效的，層析方法不能充 分提取樹(shù)莓中有效成分，所以導(dǎo)致配伍的失衡，植物化學(xué)物質(zhì)的功效不能充分 發(fā)揮；再次，層析需要溶液的流動(dòng)性好，致使提取物的濃度很低，不利于研究 高濃度組的效果。
東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)化系研究了熱水法提取樹(shù)莓多糖的工藝，這種方法 也有比較明顯的劣勢(shì)首先，樹(shù)莓中抗氧化成份是有機(jī)物，水不能夠?qū)⑵涑浞?萃??；其次，樹(shù)莓中抗氧化成份在熱水中若沒(méi)有有效措施會(huì)被氧化，從而失去 了抗氧化的能力，也就沒(méi)有了樹(shù)莓提取物的抗腫瘤的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，能夠充分地提 取樹(shù)莓中的有效成分并保證其抗氧化及抗腫瘤的能力。 上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，其組成包括在成熟季節(jié)摘取新鮮樹(shù)莓 并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹(shù)莓充分?jǐn)嚢韬蠓湃霟胁⒅糜诒鶋K上,
在100g樹(shù)莓中加入80%的丙酮200ml在預(yù)冷的混合器內(nèi)混合3分鐘，然后使 用勻漿器繼續(xù)勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過(guò)瓶中，濾過(guò) 瓶上放置有濾過(guò)紙(Whatmaii2W，收集濾過(guò)物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中并在50。C條 件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45分鐘，用去離子水調(diào)節(jié)到終體積為50ml，置于零下2(TC-零下 8(TC凍存。
本發(fā)明的有益效果
1. 本發(fā)明利用80%丙酮200ml做為溶劑與100g樹(shù)莓混合，此種比例為最 佳配比，能充分提取樹(shù)莓中有效成分，使植物化學(xué)物質(zhì)的功效充分發(fā)揮，并且 提取物的濃度高，能最大限度的保證樹(shù)莓中抗氧化成份抗氧化的能力，從而保 證了樹(shù)莓提取物的抗腫瘤的能力。用Whatman2弁濾紙可以濾過(guò)更多雜質(zhì)，使提 取物更純。
2. 本發(fā)明將打碎去渣后的新鮮樹(shù)莓放入燒杯后置于冰塊上，可以減少由于 氧化反應(yīng)而引起的顏色變褐植物化學(xué)物質(zhì)失活。
3. 通過(guò)利用TOSC方法檢測(cè)樹(shù)莓提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)濃 度組樹(shù)莓提取物都具有抗氧化活性，隨著濃度的升高，抗氧化活性上升；樹(shù)莓 提取物能夠從抑制多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)預(yù)防和治療腫瘤；樹(shù)莓提取物中 的植物化學(xué)物質(zhì)具有的抗氧化特性，可以清除體內(nèi)的氧自由基(ROS)，預(yù)防細(xì) 胞DNA的損傷，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生；總的鞣化酸(Ellagic acid)可以影響 腫瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)活性如增殖，癌基因表達(dá)，凋亡的發(fā)生等；植物化學(xué)物 質(zhì)能夠抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，影響野生型p53的表達(dá)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的 凋亡可能是樹(shù)莓提取物預(yù)防和治療惡性腫瘤的主要機(jī)制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明樹(shù)莓提 取物能夠有效的發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤的活性，其效果非常明顯。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:
預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，其組成包括在成熟季節(jié)摘取新鮮樹(shù)莓 并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹(shù)莓充分?jǐn)嚢韬蠓湃霟胁⒅糜诒鶋K上， 在100g樹(shù)莓中加入80%的丙酮200ml在預(yù)冷的混合器內(nèi)混合3分鐘，然后使 用勻漿器繼續(xù)勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過(guò)瓶中，濾過(guò) 瓶上放置有Whatmaii2^濾過(guò)紙，收集濾過(guò)物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中并在50'C條件下 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45分鐘，用去離子水調(diào)節(jié)到終體積為50ml，置于零下20'C-零下80 'C凍存。
TOSC實(shí)驗(yàn)是利用氣相色譜分析方法檢測(cè)純化溶液或生物樣品的抗氧化 性。在氧存在的條件下，ABAP可以在高溫條件下產(chǎn)生過(guò)氧化物自由基，這些 自由基進(jìn)一步氧化KMBA產(chǎn)生乙烯，乙烯的產(chǎn)量可以通過(guò)氣相色譜分析來(lái)檢 測(cè)。TOSC實(shí)驗(yàn)的理論基礎(chǔ)為外加的抗氧化劑與KMBA競(jìng)爭(zhēng)過(guò)氧化物自由基， 從而部分地抑制乙烯的生成。在我們的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)中，不同濃度的樹(shù)莓提取 物(200ng/ml、400照/ml、800ng/ml、1000照/ml)加入4ml帶膠蓋的Teflon/Silicone 小瓶中，小瓶中含有0.2 1]\110\18八，20mMABAP和lOOmM磷酸鹽緩沖液各 O.lml，最后用去離子水調(diào)節(jié)終體積為lml。整個(gè)反應(yīng)在加入100|al， 200mM ABAP 后被啟動(dòng)。在37'C， 160 r/min條件下的搖床內(nèi)反應(yīng)15、 30、 45、 60分鐘，對(duì) 照組含有除樹(shù)莓提取物外的其它所有試劑。在不同時(shí)段透過(guò)小瓶瓶塞抽取0.5 ml 反應(yīng)液上方的氣體，注入氣相色譜反應(yīng)系統(tǒng)中。氦氣作為運(yùn)送氣體，流速為 25ml/min。
通過(guò)利用TOSC方法檢測(cè)樹(shù)莓提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)濃度 組樹(shù)莓提取物都具有抗氧化活性，隨著濃度的升高，抗氧化活性上升，目前已
經(jīng)發(fā)現(xiàn)的清除自由基的機(jī)理有兩種 一種是增強(qiáng)抗氧化酶活性，迅速消滅自由
基，比如超氧化物岐化酶和過(guò)氧化氫酶就是存在于人體正常組織當(dāng)中的清除氧
自由基的重要酶系統(tǒng)；另外一種方法是直接攝入抗氧化劑。據(jù)報(bào)道蔬菜及水 果中的主要的抗氧化物質(zhì)是多酚類及黃酮類化合物，來(lái)源于蘋(píng)果中的維生素C 的抗氧化性僅占總的抗氧化能力的0.4%。樹(shù)莓植物化學(xué)物質(zhì)中鞣化酸(Ellagic acid)的抗氧化活性是Vc的600-800倍，說(shuō)明樹(shù)莓具有的較強(qiáng)的抗氧化活性主
5要來(lái)源于其它植物化學(xué)成分，他們是其預(yù)防腫瘤發(fā)生的主要原因之一。癌癥的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，不僅涉及多種癌基因、抑癌基因的變化，而且 一些細(xì)胞因子在癌癥發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中也起到一定的作用。盡管這些基因、 細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的作用方式不同，作用途徑和作用部位有別，但最終結(jié)果都將 導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。因此，遏制細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤治療的基礎(chǔ)。我們的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樹(shù)莓提取物隨濃度升高，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而預(yù) 防腫瘤的發(fā)生。在人類腫瘤中，抑癌基因p53的突變是較常見(jiàn)的原因之一，尤以大腸癌中 表現(xiàn)更為明顯。p53基因有野生型和突變型兩種，前者為腫瘤抑制基因，后者 為致癌基因，前者的突變、缺失或后者的過(guò)表達(dá)均可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。我們實(shí) 驗(yàn)檢出的野生型p53蛋白，其陽(yáng)性表達(dá)具有抑癌作用，實(shí)驗(yàn)表明，樹(shù)莓提取物 中的植物化學(xué)物質(zhì)能夠增強(qiáng)野生型p53的表達(dá)。眾多研究表明，VEGF在幾乎所有惡性腫瘤組織中都有髙度表達(dá)，較高的 VEGF表達(dá)率反映了高水平的細(xì)胞增殖狀態(tài)。研究結(jié)果表明樹(shù)莓提取物具有明 顯的抑制VEGF表達(dá)的活性，使腫瘤細(xì)胞處于較低的增殖狀態(tài)，而抑制腫瘤的 發(fā)生和發(fā)展。VEGF高表達(dá)與野生p53蛋白的過(guò)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示癌腫的發(fā) 生發(fā)展與多種腫瘤相關(guān)基因協(xié)同作用有關(guān)，而樹(shù)莓提取物能夠從抑制多種腫瘤 相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)預(yù)防和治療腫瘤?？傊?，樹(shù)莓提取物中的植物化學(xué)物質(zhì)具有的抗氧化特性，可以清除體內(nèi)的 氧自由基(ROS)，預(yù)防細(xì)胞DNA的損傷，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生；總的鞣化酸(Ellagic acid)可以影響腫瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)活性如增殖，癌基因表達(dá)， 凋亡的發(fā)生等；植物化學(xué)物質(zhì)能夠抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，影響野生型p53 的表達(dá)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡可能是樹(shù)莓提取物預(yù)防和治療惡性腫瘤的主要機(jī) 制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明樹(shù)莓提取物能夠有效的發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤的活性，其效果非常 明顯。目前惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，但治療手段主要是以手術(shù)為主， 化療、放療為輔，療效欠佳，死亡率高居各類疾病之首。因此，有關(guān)惡性腫瘤 的預(yù)防、治療問(wèn)題是當(dāng)代醫(yī)務(wù)工作者面臨的首要問(wèn)題。就藥物治療而言，目前臨床上應(yīng)用的絕大多數(shù)抗癌藥主要為化學(xué)合成藥，其作用機(jī)制主要以抑制和殺 滅腫瘤細(xì)胞為主，而且往往導(dǎo)致正常組織細(xì)胞的損傷，因此毒、副作用較大。 另外，惡性腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸藥物后容易產(chǎn)生耐藥性，大大地影響了治療效果。 天然植物提取物，其各種成份為天然配伍，幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性及副作用，可以 作為長(zhǎng)期預(yù)防及治療用藥。樹(shù)莓提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性；具有明顯的抗 肝癌細(xì)胞系HepG-2增殖的活性；樹(shù)莓提取物能夠抑制肝癌細(xì)胞系HepG-2 VEGF的表達(dá)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；樹(shù)莓提取物能夠影響肝癌細(xì)胞系 H印G-2野生p53的表達(dá)；樹(shù)莓提取物抑制VEGF及影響野生p53的表達(dá)與誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤機(jī)理的三個(gè)主要方面；樹(shù)莓提取物在體內(nèi)能夠明顯 抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，其組成包括在成熟季節(jié)摘取新鮮樹(shù)莓并打碎去渣，其特征是將所述的打碎去渣后的樹(shù)莓充分?jǐn)嚢韬蠓湃霟胁⒅糜诒鶋K上，在100g樹(shù)莓中加入80％的丙酮200ml在預(yù)冷的混合器內(nèi)混合3分鐘，然后使用勻漿器繼續(xù)勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過(guò)瓶中，濾過(guò)瓶上放置有濾過(guò)紙，收集濾過(guò)物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中并在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45分鐘，用去離子水調(diào)節(jié)到終體積為50ml，置于零下20℃-零下80℃凍存。
全文摘要
預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，已有的提取方法具有很多缺點(diǎn)。預(yù)防原發(fā)性肝癌的樹(shù)莓提取方法，其組成包括在成熟季節(jié)摘取新鮮樹(shù)莓并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹(shù)莓充分?jǐn)嚢韬蠓湃霟胁⒅糜诒鶋K上，在100g樹(shù)莓中加入80％的丙酮200ml在預(yù)冷的混合器內(nèi)混合3分鐘，然后使用勻漿器繼續(xù)勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過(guò)瓶中，濾過(guò)瓶上放置有濾過(guò)紙，收集濾過(guò)物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中并在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45分鐘，用去離子水調(diào)節(jié)到終體積為50ml，置于零下20℃-零下80℃凍存。本發(fā)明作為一種提取樹(shù)莓的方法。
文檔編號(hào)A61K36/73GK101658563SQ20081013700
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者明 劉, 宋文婷, 張春鵬, 林羅強(qiáng), 趙金璐 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)