本發(fā)明涉及絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥診斷、預測預后領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測numb異常為手段的絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥診斷、預測預后方法。

背景技術：

骨質疏松癥(osteoporosis，op)是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病(who)。2001年美國國立衛(wèi)生研究院(nih)提出骨質疏松癥是以骨強度下降、骨折風險性增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病，骨強度反映了骨骼的兩個主要方面，即骨礦密度和骨質量。

該病可發(fā)生于不同性別和任何年齡，但多見于絕經(jīng)后婦女和老年男性。骨質疏松癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性骨質疏松癥又分為絕經(jīng)后骨質疏松癥(i型)、老年性骨質疏松癥(ii型)和特發(fā)性骨質疏松(包括青少年型)3種。絕經(jīng)后骨質疏松癥一般發(fā)生在婦女絕經(jīng)后5-10年內，因絕經(jīng)后卵巢合成雌激素減少所致，為骨量減少和骨組織微結構破壞，以致骨骼脆性增高從而易發(fā)生骨骼的一種全身性疾病。女性絕經(jīng)后骨密度(bonemineraldensity，bmd)丟失速度很快，年丟失率為1.5％-2.5％，從而導致骨密度急劇下降，使得絕經(jīng)后女性成為骨質疏松癥的高發(fā)人群。

具有以下高危因素者易患絕經(jīng)后骨質疏松癥：

雌激素缺乏：雌激素缺乏，被認為是引起絕經(jīng)后骨質疏松癥的主要因素，絕經(jīng)后卵巢功能減退，分泌雌激素水平降低，同時伴有維生素d、鈣的攝入不足，造成繼發(fā)性骨丟失。

遺傳因素：骨質疏松癥多見于白種人，其次是黃種人，而黑種人最少。骨密度為診斷骨質疏松癥的主要指標，骨密度值主要決定于遺傳因素，其次是受環(huán)境因素的影響。

營養(yǎng)因素：鈣缺乏，已發(fā)現(xiàn)青幼年時鈣的攝入量與成年人的骨量峰直接有關。低鈣飲食(<10mg·kg^-1·d^-1)者有3/4患有骨質疏松，而高鈣飲食(10mg·kg^-1·d^-1)者有1/4患有骨質疏松；長期蛋白質營養(yǎng)缺乏，造成血漿蛋白降低，骨基質合成不足，新骨生成落后，如同是伴有鈣的缺乏，骨質疏松會加快出現(xiàn)；維生素c缺乏，是骨基質羥脯氨酸合成不可缺少的，如缺乏可使骨基質合成減少。

廢用因素：肌肉對骨組織是一種機械力的影響，肌肉發(fā)達則骨骼粗壯，骨密度高。老年人活動減少，肌肉強度減弱，機械刺激減少，骨量減少。同時肌肉強度的減弱和協(xié)調障礙是老年人較容易摔倒，伴骨量減少時，則已發(fā)生骨折。

其他因素：酗酒、嗜煙、過多咖啡和咖啡因的攝入、肝素使用均是本病的危險因素。酒精中毒可影響鈣的吸收，酒精也直接作用于成骨細胞，抑制骨的形成?？Х纫驍z入過多是尿鈣和內源性糞鈣丟失：肝素可引起骨質疏松，一般研究表明每天接受1500u以上的肝素治療患者中60％的發(fā)展成為骨質疏松癥。

此外，年齡增長、服用皮質類固醇和抗驚厥藥物、具有骨質疏松癥家族史或具有影響骨量的特殊基因、早絕經(jīng)或絕經(jīng)前行雙側卵巢切除術也是絕經(jīng)后骨質疏松癥的高危因素。

絕經(jīng)后骨質疏松癥早期可以沒有任何癥狀，骨質在不知不覺中流失，直到發(fā)生骨折后才被意識到，亦被稱之為“無聲殺手”，由于早期沒有典型的臨床癥狀，所以常常不能引起醫(yī)患足夠的重視，以致許多患者只能無奈的面對從病痛到恢復的漫漫長路。

診斷骨質疏松癥，首先必須進行骨密度的測定。骨密度實際上就是表示骨的健康程度，或是反過來說表示骨的老化程度。常用的檢測手段：

x線攝片法：使用歷史最早，但由于有放射性，其測驗結果不能量化，已逐漸被取代。

單光子測定儀：費用低、方便、輻射量小而安全。但因不能測軀干骨以及不能區(qū)別皮質骨、松質骨、軟組織等而受限制，已逐漸被取代。

定量超聲法：低廉、方便、又無放射性損傷。適合各年齡段人群的骨狀態(tài)普查工作。不僅能檢測骨密度，還能了解骨的質量即可反應骨的微結構及彈性。但目前只用于跟骨、脛骨和指骨，不能進行全身骨骼的檢測。

雙能x線吸收法：是目前最理想的測定法，是診斷骨質疏松癥的金標準，國內外通用，可測全身各部位骨骼，也能測軟組織厚度，但該設備數(shù)量較少且價格昂貴，因此對于骨質疏松癥患者的診斷來說經(jīng)濟負擔大。為此尋找一種敏感性高、準確度高且價格合理的診斷骨質疏松癥的方法是亟待解決的問題。

近年來，遺傳因素已經(jīng)成為了骨生物學中最活躍的研究領域之一，很多基因已經(jīng)被確定為調節(jié)古骨密度的候選基因。這些候選基因大多數(shù)都是影響骨代謝的基因。如維生素d受體(vdr)、脂蛋白受體相關基因5(lrp5)、i型膠原蛋白(colia1)、雌激素受體α、轉化生長因子tgfβ1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmps)、runx2、osterix(osx)、sclerostin、tcirg1、igf-1、il-1(骨質疏松癥，張弛，中國骨質疏松雜志，2010年10月，802-813)。此外，已經(jīng)有相當數(shù)量的專利申請涉及骨質疏松癥的基因診斷，如申請?zhí)枮椋?01610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的專利?？梢娎没騺碓\斷骨質疏松癥成為了今后骨質疏松癥早期診斷的發(fā)展趨勢。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測numb基因或蛋白表達差異來診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測numb基因或蛋白表達差異來預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

本發(fā)明提供了檢測numb基因或numb蛋白的產品在制備絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥診斷工具中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測numb基因或numb蛋白的產品在制備預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后工具中的用途。

進一步，所述檢測numb基因或numb蛋白的產品包括檢測numb基因或numb蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合numb基因的核酸或者能夠結合numb蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測numb基因的表達水平；所述物質能夠檢測numb蛋白的表達水平。

本發(fā)明的檢測numb基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。

上面所述的核酸包括擴增numb基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通過化學合成來制備。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為qpcr實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的檢測numb蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的檢測numb蛋白的產品包括特異性結合numb蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的檢測numb蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的numb蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對numb蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記的抗體或其片段。

預測預后是指預測患者狀況的過程或結果，并不意味著能以100％的準確度預測患者狀況的過程或結果。預測預后是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中numb基因或numb蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。

進一步，所述檢測numb基因或numb蛋白的產品可以是檢測numb基因或numb蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

利用前面所述的檢測產品檢測絕經(jīng)女性受試者樣本中的numb基因或numb蛋白的表達水平，與正常絕經(jīng)女性相比，絕經(jīng)女性受試者樣本中的numb基因或numb蛋白的表達水平降低，則診斷該受試者為絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者或該受試者的預后差。

作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自絕經(jīng)女性受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的工具，所述工具能夠檢測絕經(jīng)女性受試者樣本中numb基因或numb蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合numb基因的核酸或者能夠結合numb蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測numb基因的表達水平；所述物質能夠檢測numb蛋白的表達水平。

進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。

進一步，所述診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知numb基因的異常與絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥相關也屬于numb基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明還提供了一種預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后的工具，所述工具能夠檢測受試者樣本中numb基因或numb蛋白的表達水平，所述預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后工具包括能夠結合numb基因的核酸或者能夠結合numb蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測numb基因的mrna水平；所述物質能夠檢測numb蛋白的表達水平。

進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。

進一步，所述預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷骨質疏松癥的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知numb基因的異常與絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥相關也屬于numb基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗numb抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結合numb即可。當抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能夠識別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制numb功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數(shù)目是至少一個，更優(yōu)選至少三個?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。

本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗numb抗體的其他性質同前面所述。

進一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥或預測絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥預后的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取絕經(jīng)女性受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中numb基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的numb基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。

(4)與正常絕經(jīng)女性相比，numb基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被診斷為絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥，或判斷患有絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的受試者預后差。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥”既包括判斷絕經(jīng)女性受試者是否已經(jīng)患有絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥、也包括判斷絕經(jīng)女性受試者是否存在患有絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥的風險。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥以及判預測患有預后的分子標志物，使用該分子標志物可以在絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。另外，通過預測患者的預后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr檢測numb基因在絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者和正常絕經(jīng)女性中的表達差異。

具體的實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者和正常絕經(jīng)女性中差異表達的基因

1、研究對象：

選擇絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者3例，年齡分別為81歲、68歲、79歲；正常絕經(jīng)女性2例，年齡分別為67歲、68歲。

絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者的納入標準：絕經(jīng)超過12個月的漢族絕經(jīng)后婦女，患者均知情同意；

絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者的排除標準包括①既往接受過抗骨吸收藥物(包括降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素等)或促骨形成藥物(如甲狀旁腺素等)治療者(單純使用鈣劑和/或維生素d者除外)；②長期服用糖皮質激素者；③合并有惡性腫瘤、骨轉移腫瘤和其他內分泌、骨代謝病史(如類風濕性關節(jié)炎、甲亢、腎上腺疾病等)者；④脊柱或髖部等部位新鮮骨折或髖關節(jié)手術置換者；⑤嚴重肝腎疾病、長期臥床≧3個月者；⑥精神障礙、認知障礙。

2、血液總rna提取

使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。

基本步驟：

(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；

(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；

(3)異丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、rna樣品的質量分析

利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5μg，濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

5、片段化rna

illumina平臺是針對短序列片段進行測序，mrna平均長度可能達幾kb，因此需要對其進行隨機打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機斷裂成200bp左右的小片段。

6、反轉合成cdna

在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mrna為模板反轉合成一鏈cdna，進行二鏈合成時，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中堿基包含a/u/c/g。

7、連接adaptor

雙鏈的cdna結構為粘性末端，加入endrepairmix將其補成平末端，隨后在3’末端加上一個a堿基，用于連接y字形的接頭。

8、ung酶消化cdna二鏈

在pcr擴增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cdna第一鏈。

9、illuminax-ten上機測序

illuminax-ten測序平臺，進行2*150bp測序。

10、生物信息學分析

測序數(shù)據(jù)獲得以后的rawdata分析過程如下所示：

(1)用cutadapt對reads的5’和3’段進行trim，trim掉質量<20的堿基，并且刪掉n大于10％的reads；

(2)tophat比對到參考基因組上。所用的參考基因組版本為grch38.p7，fasta和gff文件下載自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表達量并標準化輸出；

(4)在r環(huán)境下用degseq包比較對照組跟疾病組mrna的表達差異。顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05。

11、結果

用以上標準篩選得到差異表達基因3296個，其中表達上調的基因1428個，表達下調的基因有1868個。

實施例2qpcr實驗驗證絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者和正常絕經(jīng)女性中差異表達的基因

選擇實施例1篩選出的numb基因進行大樣本驗證。

1、研究對象：

選擇絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者30例，正常絕經(jīng)女性30例，年齡在65-82歲之間。

絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者的納入標準：絕經(jīng)超過12個月的漢族絕經(jīng)后婦女，患者均知情同意；

絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者的排除標準包括①既往接受過抗骨吸收藥物(包括降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素等)或促骨形成藥物(如甲狀旁腺素等)治療者(單純使用鈣劑和/或維生素d者除外)；②長期服用糖皮質激素者；③合并有惡性腫瘤、骨轉移腫瘤和其他內分泌、骨代謝病史(如類風濕性關節(jié)炎、甲亢、腎上腺疾病等)者；④脊柱或髖部等部位新鮮骨折或髖關節(jié)手術置換者；⑤嚴重肝腎疾病、長期臥床≧3個月者；⑥精神障礙、認知障礙。

2、血液總rna提取

使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。

基本步驟：

(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；

(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；

(3)異丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、逆轉錄

用逆轉錄緩沖液對lμg總rna進行逆轉錄合成cdna。采用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

4、qpcr

采用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。

配制以下反應體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。

引物序列如下：

擴增numb基因的正向引物序列為5’-acaacagccactgaacaa-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-atgaaccaacgactatcttatct-3’(seqidno.2)；

擴增gapdh基因的正向引物序列為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

擴增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*40個循環(huán)。以sybr

green作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、結果

結果如圖1所示，與正常絕經(jīng)女性相比，絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥患者血液中numb基因的mrna水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，結果同rna-seq實驗。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。

sequencelisting

<110>首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院

<120>numb在絕經(jīng)后婦女原發(fā)性骨質疏松癥診斷或預后中的用途

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acaacagccactgaacaa18

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

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atgaaccaacgactatcttatct23

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<212>dna

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<400>4

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