專利名稱：：¹³¹I標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種放射性抗腫瘤抗體，特別涉及一種用mI標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，放射免疫治療(RIT)是除手術(shù)、放化療外的又一腫瘤治療手段。RIT是將放射性核素標(biāo)記抗腫瘤抗體注射入體內(nèi)，單克隆抗體及標(biāo)記核素特異性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合(定向制導(dǎo))，將放射性核素?cái)y帶到腫瘤部位，放射性核素衰變過程中發(fā)出的射線對腫瘤細(xì)胞DNA造成損傷，最終造成腫瘤細(xì)胞生長抑制和壞死。放射免疫治療是繼腫瘤化療和放射治療后又一全新的治療方法，它結(jié)合了單克隆抗體的靶向作用與放射性核素內(nèi)照射的強(qiáng)殺傷作用，具有療效好、副作用低的特點(diǎn)。國內(nèi)外已有學(xué)者利用核素對膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、腹膜癌、肺癌、骨與軟組織腫瘤以及前列腺癌骨轉(zhuǎn)移等進(jìn)行診斷及治療。目前市場上所用單克隆抗體多為鼠源性的抗體，這些抗體因?yàn)槿丝故竺庖叻磻?yīng)而不適合于臨床運(yùn)用。針對肺癌的放射免疫治療(RIT)有人用釔-90標(biāo)記抗肺癌單克隆抗體LC-1采用局部治療的給藥方式，抑瘤率較低；唯一上市的新藥131I-chTNT其作用機(jī)制是晚期實(shí)體腫瘤的典型特征是存在大量的變性壞死細(xì)胞，在細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死的過程中，細(xì)胞膜會出現(xiàn)許多裂隙，胞漿內(nèi)大量成分流失到胞外，細(xì)胞內(nèi)的染色體的三維結(jié)構(gòu)遭到破壞，產(chǎn)生大量變性DNA單鏈復(fù)合體，這種單鏈復(fù)合體就是131I-chTNT作用于實(shí)體腫瘤的靶點(diǎn)，故該藥物僅適用于放、化療失敗的晚期肺癌患者。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種腫瘤靶向性好的、抑瘤率較高的、適用于各期非小細(xì)胞肺癌的1311標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2。采用的技術(shù)方案如下以濃度是200pg/ml的人源化1E2抗體、放射性比活度大于2.5GBq/ml的Na1311、濃度是lpg/pl的氯氨T為原料，三者體積比是1:2:1進(jìn)行取樣，使用常規(guī)氯胺T法制得；人源化1E2抗體為本發(fā)明人制備保存，使用前用pH7.5、濃度為0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為200i_ig/ml;其余所有的原材料制劑均可購買得到。人源化1E2抗體的制備方法如下手術(shù)中切取病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌患者的癌旁淋巴結(jié)，抽提淋巴結(jié)組織內(nèi)的總RNA，利用噬菌體抗體庫構(gòu)建技術(shù)得到含1E2抗體的噬菌體抗體庫，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌體抗體1E2，經(jīng)洗滌、篩選、擴(kuò)增得到對CPS1特異的人源化抗體1E2，最后進(jìn)行鑒定和抗體活力分析。單克隆抗體的選擇在放射免疫治療中是非常重要一方面。本發(fā)明經(jīng)過大量的篩選用人源化1E2作為標(biāo)記抗體。1E2是抑制肺癌細(xì)胞生長的單克隆抗體，其與腫瘤細(xì)胞膜結(jié)合，抑制癌細(xì)胞增殖，以單克隆抗體與放射性核素聯(lián)合進(jìn)行導(dǎo)向治療，在制備方法上使用常規(guī)氯胺T法標(biāo)記131I-1E2簡單有效，標(biāo)記率為77.73%,放化純度為95.63%，放射性比活度為432MBq/嗎。在治療效果上其優(yōu)點(diǎn)是將放射性核素的優(yōu)點(diǎn)和人源化單克隆抗體集于一體，一方面，核素的放射性殺傷作用范圍可達(dá)數(shù)十個(gè)細(xì)胞直徑，在一定程度上克服了腫瘤抗原的表達(dá)異質(zhì)性所造成的盲區(qū)，而且核素對瘤細(xì)胞能直接殺傷，不需免疫毒素或免疫藥物的內(nèi)在化過程。核素的殺傷作用不依賴于DNA的合成(對靜止期腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用)。另一方面，有抗體導(dǎo)向的治療優(yōu)點(diǎn)，提高了藥物對腫瘤細(xì)胞的耙向性，從而提高療效，從其作用機(jī)制來看，適用于各期非小細(xì)胞肺癌的治療。由于使用了人源化單克隆抗體，具有高效、低毒、病人不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，大大減少了人抗鼠免疫反應(yīng)，從而減少副作用，更適合臨床應(yīng)用。同時(shí)又克服了鼠單抗半衰期短、反復(fù)應(yīng)用會引進(jìn)病人的HAMA等缺點(diǎn)，人源性單抗已成為繼手術(shù)切除、放療及化療后又一治療腫瘤的藥物。為了證明1311標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2對非小細(xì)胞肺癌的治療效果，做了下述試驗(yàn)先建立Lewis肺癌荷瘤鼠模型，40只荷瘤小鼠成瘤后隨機(jī)分為四組生理鹽水對照組(NS0.1ml);單純1E2抗體組(注射1E23嗎)；1311標(biāo)記IgG組(注射131I-IgG18.5MBq);1311標(biāo)記1E2抗體組(注射131I-1E218.5MBq),l次/2天，共10次，注射標(biāo)記抗體前2日，小鼠飲用0.1。/。KI溶液以封閉甲狀腺。采用游標(biāo)卡尺每3天測量一次腫瘤最大直徑(a)和最大垂直直徑(b)。21天后處死小鼠，剝離瘤體、測量腫瘤組織重量。對腫瘤體積大小和重量進(jìn)行單因素方差分析。腫瘤體積計(jì)算公式為V(mm3)=1/2xabH十算，長度單位mm;腫瘤體積抑瘤率抑瘤率氣Vo—Vn)/Vo><100%(Vo為對照組體積，Vn為治療組體積)。觀察病理學(xué)改變，21天后處死小鼠，取治療組和對照組腫瘤組織10%福爾馬林固定，石臘包埋切片后HE染色，鏡下觀察病理學(xué)改變。結(jié)果顯示1、^I-1E2在小鼠體內(nèi)的分布荷瘤小鼠注射標(biāo)記抗體后36h腫瘤的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)最高為11.61，此時(shí)瘤/血比值=4.73,瘤/肝比值=7.44，瘤/脾比值=7.07，24小時(shí)后mi-lE2在腫瘤組織內(nèi)濃度較其他各部位高(尸<0.05)，證明mi-lE2抗體在腫瘤組織中濃聚(表l)。表1."I-1E2瘤內(nèi)注射后不同時(shí)間小鼠體內(nèi)的分布情況(王土S)單位％ID/g<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、各組小鼠腫瘤重量、體積、抑瘤率比較21天后測量腫瘤體積和重量(表2)，SNK-q檢驗(yàn)表明1311標(biāo)記1E2抗體組與其他三組有差異，而其他三組間比較無明顯差異，說明131I-1E2明顯抑制腫瘤生長，抑瘤率高達(dá)78.3%。表2各組腫瘤重量與體積比較及抑瘤率(5士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與對照組比較，尸<0.053、鏡下可見^I標(biāo)記1E2抗體組大片腫瘤細(xì)胞壞死，核濃縮、核碎裂，呈玻璃樣變。而其它三組病理切片細(xì)胞核分裂相多見，明顯異型性，未見大片組織壞死。由此可知注射131I-1E2后腫瘤生長速度明顯低于對照組，131I-IgG組雖然也局部注射了高劑量1311，腫瘤生長速度明顯快于^I-1E2組，單用單抗組雖對腫瘤生長有一定的抑制作用，但效果不明顯，由此可見只有將單抗與放射性核素相結(jié)合，才能起到良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，使抑瘤率得到大大提高。本發(fā)明無明顯的臨床毒副作用，可對腫瘤進(jìn)行局部注射治療也可以靜脈注射治療，但局部注射效果優(yōu)于靜脈注射，適用于各期非小細(xì)胞肺癌的治療。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明用mI標(biāo)記抗肺癌人源化單克隆抗體1E2，將放射性核素的優(yōu)點(diǎn)和人源化單克隆抗體集于一體，兩者協(xié)同作用，提高對腫瘤的耙向性，對腫瘤生長有明顯的抑制作用，大大提高了抑瘤率。同時(shí)本發(fā)明采用的是人源化單克隆抗體，大大減少了免疫反應(yīng)，適用范圍更加廣泛，對各期非小細(xì)胞肺癌都有效。具體實(shí)施例(共5例)實(shí)施例l制備人源化抗肺癌單克隆抗體1E2(1)噬菌體抗體庫的構(gòu)建①總RNA的提取手術(shù)切取肺癌患者癌旁淋巴結(jié)(病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌)10g，無菌紗布包好后迅速放入液氮中凍存，在盛有液氮碾缽中迅速把淋巴組織碾成粉末，然后再利用RNA抽提試劑盒進(jìn)行提取，得到總RNA。②VH和VL基因片斷的擴(kuò)增以01igodT-Adaptorprimer作為引物合成cDNA，PCR條件為50°C30min，99。C5min，5。C5min，一個(gè)循環(huán)。然后以cDNA為模板，以上下游引物配對分別擴(kuò)增輕鏈基因片斷和重鏈基因片斷，PCR條件為94°C2min，一個(gè)循環(huán)，94。C30sec，55。C30sec，72°C90sec，三十個(gè)循環(huán)。最后利用Linker引物分別擴(kuò)增VH—Linker基因片斷和VL—Linker基因片斷，PCR條件為94。C2min，一個(gè)循環(huán)，94°C30sec，60。C30sec，72。C90sec，三十五個(gè)循環(huán)。得到VH—Linker基因片斷和VL—Linker基因片斷。③Scfv基因片段的連接及PCR擴(kuò)增將膠回收純化的VH—Linker基因片斷和VL—Linker基因片斷進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為94°C5min，一個(gè)循環(huán)，94°Clmin,60°Clmin，72°C90sec，五個(gè)循環(huán)。從而將VH基因片斷和VL基因片斷連接形成scfv基因片斷。然后再向反應(yīng)體系中加入scfv擴(kuò)增的引物(帶有酶切位點(diǎn))，反應(yīng)條件為94°C30sec，60°C60sec，72°C90sec，五個(gè)循環(huán)。形成兩端分別帶有酶切位點(diǎn)的scfv基因片斷。④重組質(zhì)粒的構(gòu)建用T4DNA連接酶連接經(jīng)sfiI限制性內(nèi)切酶和NotI限制性內(nèi)切酶雙酶切ScFv基因片斷和PCANTAB-5E載體，用電穿孔法轉(zhuǎn)化TG感受態(tài)細(xì)胞，鋪于氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜，計(jì)算克隆數(shù)。隨機(jī)挑取24個(gè)轉(zhuǎn)化后TG1菌落，分別加入到2-YT培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用PCR檢查DNA中有無ScFv基因插入。⑤抗體庫的構(gòu)建將陽性細(xì)菌克隆鋪于S0BAG平板上37。C培養(yǎng)過夜，再加入10ml2-YT培養(yǎng)液收聚菌液。用2-YT培養(yǎng)液稀釋至A600二0.3。加入氨芐青霉素，終濃度為IOOug/ml，葡萄糖的終濃度為2%。37°C150rpm振蕩培養(yǎng)lh，再加入5.lX101Qpfu的M13K07至終濃度為4X109，37°C250rpm振蕩培養(yǎng)lh。4000g離心20min，棄上清。沉淀重懸于100m1-YTAK培養(yǎng)液，30°C250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。10000g離心10min沉淀細(xì)菌，取上清加入1/5的PEG/NaCl，冰浴60min。10000g4。C離心20min，棄上清。沉淀重懸于lml2-YT培養(yǎng)液，10000g再次離心10min，上清中加入終濃度為O.02%的疊氮鈉。4'C保存。(2)噬菌體抗體庫的親和篩選用lmlscFv噬菌體抗體庫溶液，加入濃度為300ug/ml氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)抗原lml，靜止30分鐘。②PBS洗滌去除非特異性結(jié)合物，收集與抗原CPS1結(jié)合的噬菌體抗體1E2;③感染大腸桿菌，使特異的噬菌體抗體1E2擴(kuò)增富集，便可得到對CPS1特異的人源化抗體1E2。(3)陽性噬菌體單克隆PCR鑒定挑取第三輪篩選出的單克隆，提取單克隆質(zhì)粒進(jìn)行抗體基因克隆.隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆，加入3mL含lOOmg/L氨芐青霉素的2-YT培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，常規(guī)提取質(zhì)粒.以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后以IOg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否擴(kuò)增出目的基因。(4)陽性噬菌體單克隆酶切鑒定隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆質(zhì)粒以NheI及BssHII雙酶切，以IOg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否含有目的基因.(5)陽性單克隆抗體活性分析挑取陽性單克隆，以不含目的基因的載體為對照.按前述方法進(jìn)行噬菌體表面呈現(xiàn)，收集上清即為噬菌體抗體.將單克隆抗體及對照上清加入接種有人成纖維細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的96孔板過夜，再加入HRP-羊抗M1337°C溫育lh，加入TMB顯色I(xiàn)Omin，加入2mol/L硫酸終止反應(yīng).酶標(biāo)儀讀板，以P/N〉2.l為陽性.實(shí)施例2用氯氨T法制備1311標(biāo)記1E2抗體方法如下1、碘化反應(yīng)取實(shí)施例1制備的人源化1E2抗體10昭，用pH7.5、濃度為0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為200pg/ml，精確量取50pl備用；取放射性比活度5.5GBq/ml的Na1311100再取濃度是lpg/|il的氯氨T50pl，將三者混勻，加入放有磁力攪拌子的玻璃試管中，置于磁力攪拌器上充分搖勻，在室溫下反應(yīng)60s;2、終止碘化反應(yīng)60s后立即加入偏重亞硫酸鈉(Na2S205))100|ig,體積100pl，終止碘化反應(yīng)；3、分離純化(1)、將標(biāo)記反應(yīng)液注入lcmxl5cm規(guī)格的SephadexG50層析柱，PBS溶液(pH=7.4)洗脫，流速為10滴/min，用試管分段收集，10滴/管，收集100管；(2)、在r-計(jì)數(shù)儀上測定每管的每分鐘放射性計(jì)數(shù)(countsperminute,cpm)，繪制純化曲線，對兩次純化曲線進(jìn)行比較，確定Na^I放射峰的位置。收集第一次純化的第一個(gè)放射峰的反應(yīng)液，得到純化的1311標(biāo)記的1E2抗體。實(shí)施例3對實(shí)施例2所制備的純化1311標(biāo)記的1E2抗體進(jìn)行標(biāo)記率和放化純度的鑒定三氯乙酸為展開劑，以新華1號濾紙為支持物，對分離純化前后的反應(yīng)液作紙層析檢測標(biāo)記率和放化純度，公式1311標(biāo)記1E2抗體峰的放射性強(qiáng)度(cpm)標(biāo)記率(％)=-xl00%卞總放射性強(qiáng)度(cpm)=77.73%層析后1311標(biāo)記1E2抗體峰的放射性強(qiáng)度(cpm)放化純度(％)=xinn<)/層析后總放射性強(qiáng)度(cpm)1U"/e=432MBq/jxg實(shí)施例4131I標(biāo)記1E2抗體濃度測定-將1E2抗體倍比稀釋成20pl、10pg/100pl、5ng/100pl、2.5(ig/100pil、1.25pl、0.625ng/100(il、0.3125ng/100^作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，和待測的131I標(biāo)記1E2抗體各100pi分別裝入5ml試管中，加入考馬斯亮藍(lán)lOOpl混勻；30分鐘后用分光光度計(jì)在波長595測定每個(gè)試管的吸光度(OD595);用以上相同方法測量兩次；根據(jù)吸光度建立回歸方程夕=a+6x計(jì)算出被標(biāo)記物的濃度為18.65pg/100pl。實(shí)施例51311標(biāo)記1E2抗體的比活度的計(jì)算測量標(biāo)記物的放射性，然后求出放射性比活度，公式始fr+W"^沐存n/m/、標(biāo)記抗體的放射性活度(MBq)O《"o/放射性比活度(MBq///g)=-m^^-s,~100%=95.63%標(biāo)記抗體的質(zhì)量(//g)權(quán)利要求1、一種131I標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2，其特征是以濃度是200μg/ml的人源化1E2抗體、放射性比活度大于2.5GBq/ml的Na131I、濃度是1μg/μl的氯氨T為原料，三者體積比是1∶2∶1進(jìn)行取樣，使用常規(guī)氯胺T法制得；所述人源化1E2抗體的制備方法如下手術(shù)中切取病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌患者的癌旁淋巴結(jié)，抽提淋巴結(jié)組織內(nèi)的總RNA，利用噬菌體抗體庫構(gòu)建技術(shù)得到含1E2抗體的噬菌體抗體庫，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌體抗體1E2，經(jīng)洗滌、篩選、擴(kuò)增得到對CPS1特異的人源化抗體1E2，最后進(jìn)行鑒定和抗體活力分析。2、如權(quán)利要求1所述的1311標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種用¹³¹I標(biāo)記的抗肺癌人源化單克隆抗體1E2。以人源化1E2抗體、Na¹³¹I、氯氨T為原料，使用氯胺T法標(biāo)記制得純化的¹³¹I標(biāo)記1E2抗體。其中人源化1E2抗體是取非小細(xì)胞肺癌患者的癌旁淋巴結(jié)，抽提淋巴結(jié)組織內(nèi)的總RNA，利用噬菌體抗體庫構(gòu)建技術(shù)得到含1E2抗體的噬菌體抗體庫，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌體抗體1E2，經(jīng)洗滌、篩選、擴(kuò)增得到對氨甲酰磷酸合成酶特異的人源化抗體1E2。本發(fā)明應(yīng)用了放射免疫治療技術(shù)，將放射性核素的優(yōu)點(diǎn)和抗腫瘤細(xì)胞人源化單克隆抗體集于一體，提高了藥物對腫瘤細(xì)胞的靶向性和療效，減少了副作用和不良免疫反應(yīng)，適用范圍更加廣泛，適用于各期非小細(xì)胞肺癌的治療。文檔編號A61K101/02GK101407545SQ200810233139公開日2009年4月15日申請日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者吳永忠,平季,尹曉玲,華龐,濤張,彭志平,明文,李少林,林海波,東段,陳曉品申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)