專利名稱：瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白抗腫瘤增殖和遷移的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的新用途，特別涉及癥原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白抗肺瘤增 殖和遷移的新用途。
背景技術(shù)：
研究發(fā)現(xiàn)，核因子-kB (NF-kB)是架接炎癥和腫瘤的橋梁。腫瘤培育巨噬 細(xì)胞(tumor-educated macrophage)分泌的腫瘤壞死因子-a ( TNF-a )通過(guò)與腫 瘤細(xì)胞膜表面的TNF-a受體結(jié)合，可活化NF-kB,促進(jìn)腫瘤的存活和增殖。Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR)激動(dòng)劑也可通過(guò)與腫瘤細(xì)胞膜表面的TLR結(jié) 合，活化NF-kB,促進(jìn)胂瘤的存活和增殖。因此，NF-kB抑制劑是治療腫瘤的 重要手段。
環(huán)子孑包子蛋白(circumsporozoite protein, CSP )是^篁蓋于疾原蟲(chóng)子孑包子表面 的主要蛋白，通過(guò)與肝細(xì)胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)特異性結(jié)合，可介導(dǎo)子孢子特異性粘附于肝細(xì)胞膜上， 是子孢子特異入侵肝細(xì)胞的重要蛋白之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，侵入肝細(xì)胞后， 位于納蟲(chóng)空泡的子孢子表面的CSP能借助其pelex功能域從納蟲(chóng)空泡中溢出， 進(jìn)入細(xì)胞漿中，竟?fàn)幮砸种芅F-kB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制NF-kB的活化和局部的 炎癥反應(yīng)，從而逃避宿主對(duì)瘧原蟲(chóng)的免疫攻擊。因此，CSP是NF-kB抑制劑。
迄今為止，未見(jiàn)癡原蟲(chóng)CSP抑制肺瘤增殖和遷移的相關(guān)才艮道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供瘧原蟲(chóng)CSP在制備抗腫瘤增殖和遷
移的藥物中的用途。
進(jìn)一步，所述腫瘤為肝癌和結(jié)腸癌。
3本發(fā)明的目的之二在于提供含有編碼瘧原蟲(chóng)CSP的基因的重組表達(dá)載體在
制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途。 進(jìn)一步，所述腫瘤為肝癌和結(jié)腸癌。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功構(gòu)建了 CSP的重組表達(dá)載體pFLAG-CMV8-CSP,并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將其轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株HepG2和結(jié)腸 癌細(xì)胞株SW480,研究結(jié)果顯示，CSP主要表達(dá)于HepG2細(xì)胞的胞漿內(nèi)，能夠 抑制TNF-a和脂多糖(LPS )刺激HepG2細(xì)胞和SW480細(xì)胞活化NF-kB，并抑 制SW480細(xì)胞的增殖；鑒于NF-kB在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要的作 用，因此，CSP有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤增殖和遷移的新型蛋白藥物，包含 CSP基因的重組表達(dá)載體有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤增殖和遷移的新型基因藥 物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本
發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為CSP基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖2為pFLAG-CMV8-CSP的雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖3為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后HepG2細(xì)月包中表達(dá)CSP的直4妄免疫熒光
檢測(cè)結(jié)果；
圖4為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后抑制TNF-a刺激HepG2細(xì)胞活化NF-kB 結(jié)果；
圖5為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后抑制TNF-a刺激SW480細(xì)胞活化NF-kB 結(jié)果；
圖6為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后抑制SW480細(xì)胞增殖結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)《亍詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第
三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
一、CSP的重組表達(dá)載體的制備
1、 疰原蟲(chóng)子孢子的分離和總RNA的提取
取約氏癡原蟲(chóng)BY265抹，按常規(guī)方法感染斯氏按蚊，于感染后第15天，解 剖感染斯氏按蚊的唾液腺，分離子孢子；采用Trizol試劑(Roche公司)提取子 孢子的總RNA,按照試劑說(shuō)明書操作，提取的總RNA測(cè)定吸光值(OD)，取 OD26o,28o值位于1.8 2.0之間的RNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
2、 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)CSP的基因序列(GenBank登錄號(hào)為DQ012939),設(shè)計(jì)l對(duì)引物，在 每條引物的5'端加上保護(hù)堿基，再在其后分別引入/f/m/ni或^w7// I限制性內(nèi) 切酶識(shí)別序列；設(shè)計(jì)的引物委托invitrogen公司進(jìn)行合成；引物序列如下上游 引物5'-ccc§§g^gggaagaagtgtaccattttag-3'，下劃線部分為i^m/ni酶切位點(diǎn)；下 游引物5'-cgggatcccgttaattaaagaatactaatac-3,,下劃線部分為5a附// I酶切4立點(diǎn)；
3、 CSP基因的RT-PCR擴(kuò)增和純化
以步驟1所得總RNA為模板，以01igo(dT),5為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄制備瘧 原蟲(chóng)子孢子的cDNA;反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為濃度為0.5 jig/^iL的總RNA2 pL、 濃度為0.5嗎/iuL的01igo(dT)15 1 ^L、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為12 jaL,于溫度7(TC 水浴10分鐘，立即水浴5分鐘，再加入5xMMLV酶反應(yīng)緩沖液5 |iL、濃度為 10 mmol/L的dNTPs 2 (JL、濃度為10 U/^iL的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司) 2pL、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為20 ^L,于溫度42。C水浴1小時(shí)，70。C變性15分 鐘終止反應(yīng)；
以反轉(zhuǎn)錄制備的瘧原蟲(chóng)子孢子的cDNA為模板，采用步驟2所得上下游引物，進(jìn)行CSP基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為模板1^L、濃度為10(imol/L的 上、下游引物各0.5^iL、濃度為1Ommol/L的dNTPs0.5 pL、 10xDNA聚合酶反 應(yīng)緩沖液2.5 ^L、濃度為5 U/pL的DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.25 ^L、濃度 為25 mmol/L的MgCl2溶液1.5 pL、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為25 (iL;反應(yīng)條件為 溫度95。C預(yù)變性3分鐘，然后溫度94。C變性30秒、42。C退火30秒、72'C延伸 l分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸5分鐘；
PCR產(chǎn)物用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1 所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為PCR產(chǎn)物，^^圖可知，PCR 產(chǎn)物在約1280 bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與目的片段預(yù)期大小相符；
按照上述方法重復(fù)進(jìn)行5次PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 選擇約1280 bp的目的片段切膠，采用Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega 公司)回收純化目的片段，按照試劑盒說(shuō)明書操作，即得純化的CSP基因；
4、重組表達(dá)載體pFLAG-CMV8-CSP的構(gòu)建和鑒定
將步驟3所得純化的CSP基因用歷m/ III和Sam/f I ( TaKaRa公司)進(jìn)行 雙酶切，雙酶切方法為濃度為20 ng/|iL的CSP基因30 ^L、濃度為15 U/|iL 的歷Wni3iiL、濃度為15U/nL的^wz// I 3pL、 10x緩沖液5nL、雙蒸水補(bǔ) 充至總體積為50 (iL，于溫度37。C孵育20小時(shí)；雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行酚、氯仿法純 化，方法如下取雙酶切產(chǎn)物40 ^L，加入々包和酚40 [iL，溫和混勻后12000 g 離心5分鐘，取上清液，加入氯仿40nL，溫和混勻后12000g離心5分鐘，取 上清液，加入無(wú)水乙醇80 pL和濃度為3 mol/L、 pH值為5.2的乙酸鈉溶液4 |iL, 混勻后于溫度-70。C靜置1小時(shí)，14000 g離心30分鐘，棄上清，沉淀用濃度為 750 mL/L的乙醇1 mL、 12000 g離心5分鐘洗滌后，再加入雙蒸水10 pL稀釋， 制得純化的CSP基因片段；將真核表達(dá)載體pFLAG-CMV8 ( Sigma公司)按照 上述同樣方法用///m/III和Sam// I進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，選擇約4700bp片段進(jìn)行切膠回收，獲得純化的pFLAG-CMV8片段；將上 述純化的CSP基因片段與pFLAG-CMV8片段進(jìn)行連接，連接方法為濃度為
630ng/pL的CSP基因片段5 nL、濃度為50 ng/pL的pFLAG-CMV8片段1 pL、 濃度為5 U/|iL的T4 DNA連接酶(NEB公司)1 pL、 10xT4 DNA連接酶反應(yīng) 緩沖液2nL、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為20 nL,于溫度16。C孵育16小時(shí)；
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法為將連接產(chǎn) 物10pL加至XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞100pL中，冰浴30分鐘，溫度42。C熱休克 45秒，立即水浴2分鐘，再轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至溫度37。C的LB液體培養(yǎng)基350 pL中， 在溫度37°C 、振搖速度225轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)1小時(shí)；
取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨節(jié)青霉素(AMP)的LB平板上，于溫度37。C孵 育18小時(shí)，從平板上挑取單個(gè)菌落，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基4mL 中，在溫度37。C、振搖速度225轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)16小時(shí)，用質(zhì)粒抽 提試劑盒(OMEGA公司)小量抽提重組質(zhì)粒，按照試劑盒說(shuō)明書操作；
將所得重組質(zhì)粒用//"/w/III和5am// I進(jìn)行雙酶切鑒定，取雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，l泳道為 重組質(zhì)粒，2泳道為雙酶切產(chǎn)物，從圖可知，雙酶切產(chǎn)物在約1280bp的位置出 現(xiàn)一條特異性DNA條帶，表明重組質(zhì)粒中含有CSP基因；將雙酶切法鑒定為 陽(yáng)性的重組質(zhì)粒委托Invitrogen公司對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果重組質(zhì)粒中插入 片段的核香酸序列和開(kāi)放閱讀框架與GenBank登錄的CSP基因序列完全一致， 表明pFLAG-CMV8-CSP構(gòu)建成功；
5、重組表達(dá)載體pFLAG-CMV8-CSP的大量制備
取步驟4鑒定正確的含有pFLAG-CMV8-CSP的大腸桿菌XL1-Blue,接種 于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C 、振搖速度225轉(zhuǎn)/分鐘的條件 下振搖培養(yǎng)至4卯nm波長(zhǎng)處的OD值達(dá)到1 ~ 1.5,采用去內(nèi)毒素超純質(zhì)粒抽提 試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)大量抽提重組質(zhì)粒，按照 試劑盒說(shuō)明書操作，所得重組質(zhì)粒用雙蒸水溶解，紫外分光光度法測(cè)定純度和 濃度，置溫度-20。C保存，備用。
二、 CSP的體外表達(dá)檢測(cè)
7方法采用直接免疫焚光法，將人肝癌細(xì)胞株HepG2接種于放有蓋玻片的 24孔板中，每孔1.5xl()S個(gè)細(xì)胞，用含有濃度為100 mL/L的小牛血清(FCS) 的DMEM培養(yǎng)液，在溫度37°C 、 C02氣體濃度為50 mL/m3的條件下培養(yǎng)24小 時(shí)，待細(xì)胞融合率達(dá)到約80%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)將pFLAG-CMV8-CSP轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，按照試劑說(shuō)明書 操作，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞爬片(即蓋玻片)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂 洗3次，用固定液(即濃度為40mg/mL、 pH值為7.2 ~ 7.6的多聚曱醛溶液)于 室溫下固定20分鐘，以PBS漂洗3次，再用通透液(即含有濃度為2 mL/L的 曲拉通X-100的PBS )于室溫下通透5分鐘，以PBS漂洗3次，再用封閉液(即 含有濃度為10mg/mL的牛血清白蛋白的PBS)于室溫下封閉1小時(shí)，棄去封閉 液，加入l : 500封閉液稀釋的異辟b氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗FLAGM2單 克隆抗體(Sigma公司)，于室溫下孵育1小時(shí)，以PBS漂洗5次，自然干燥后 用濃度為400 mL/L的甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察；同時(shí)設(shè)pFLAG-CMV8 對(duì)照組(以pFLAG-CMV8替代pFLAG-CMV8-CSP );
結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后HepG2細(xì)胞的胞漿內(nèi)有明 顯的強(qiáng)染，細(xì)胞膜上也有少量強(qiáng)染，而轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8的HepG2細(xì)胞只有 一些非特異的比較微弱的熒光，表明FLAG-CSP融合蛋白主要分布在HepG2細(xì) 胞的胞漿內(nèi)，在細(xì)胞膜上也有少量表達(dá)。
三、CSP抑制肺瘤細(xì)胞NF-kB的活化能力檢測(cè)
方法采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司)，按照試劑 盒說(shuō)明書操作，分別將人肝癌細(xì)胞抹H印G2和結(jié)腸癌細(xì)胞抹SW480接種于24 孔板中，每孔1.5xl()S個(gè)細(xì)胞，用含有濃度為100 mL/L的FCS的DMEM培養(yǎng) 液，在溫度37。C、 C02氣體濃度為50 mL/m3的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融 合率達(dá)到約90%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將pFLAG-CMV8-CSP 5嗎、營(yíng)火蟲(chóng)焚光素酶報(bào)告質(zhì)粒pBxII-luc 0.2略和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 RL-TK 2 ng分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞和SW480細(xì)胞，按照試劑說(shuō)明書操作，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入濃度為100ng/mL的TNF-a ( eBioscience公司)刺激6小時(shí)，吸去培養(yǎng)上清，用PBS洗板1次，再加入lxPBL裂解液
(Promega公司)100 |iL,于室溫下作用15分鐘后，取細(xì)胞裂解液20pL，加入螢火蟲(chóng)焚光素酶底物和海腎熒光素酶底物各100 pL，用化學(xué)發(fā)光分析儀
(luminometer)讀取菱光素酶活性，并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性(即海腎熒光素酶活性與螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的比值)；同時(shí)設(shè)pFLAG-CMV8對(duì)照組(以pFLAG-CMV8替代pFLAG-CMV8-CSP )和陰性對(duì)照組(未加入TNF-a);
結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后TNF-a刺激HepG2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性為0.2282，明顯低于pFLAG-CMV8對(duì)照組(0.5706),甚至低于陰性對(duì)照組(0.4384);如圖5所示，轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后TNF-a刺激SW480細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性為0.2599,明顯4氐于pFLAG-CMV8對(duì)照組(0.5223 )，甚至低于陰性對(duì)照組(0.3217);表明培養(yǎng)液中可能存在痕量LPS,可通過(guò)TLR4活化NF-kB,同時(shí)表明CSP不但能抑制TNF-a刺激HepG2細(xì)胞和SW480細(xì)胞活化NF-kB,而且還能抑制培養(yǎng)液中痕量LPS通過(guò)TLR4活化NF-kB,顯示CSP對(duì)腫瘤細(xì)胞NF-kb的活化具有很強(qiáng)的抑制作用。四、CSP抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞抹SW480接種于12孔板中，每孔3xl()s個(gè)細(xì)胞，用含有濃度為100 mL/L的FCS的DMEM培養(yǎng)液，在溫度37°C 、 C02氣體濃度為50 mL/n^的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合率達(dá)到約90%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，分別轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8 1.6 pg和pFLAG-CMV8腸CSP 0.4嗎、0.8嗎、1.2嗎、1.6嗎(轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭坎蛔?,6嗎者，用pFLAG-CMV8補(bǔ)充至1.6嗎)至SW480細(xì)胞中，按照試劑說(shuō)明書操作，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，取各培養(yǎng)上清100 (iL,加入10 SunBio Am-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑(上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司)，37。C孵育1小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD57Q OD,值；
結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP后，其能以劑量依賴的方式抑
9制SW480細(xì)胞的增殖，而轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8后對(duì)SW480細(xì)力包的增殖無(wú)影響。
最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
10
權(quán)利要求
1、瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白在制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疾原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白在制備抗腫瘤增殖和遷移的 藥物中的用途，其特征在于所述腫瘤為肝癌和結(jié)腸癌。
3、 含有編碼權(quán)利要求1所述的疾原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白的基因的重組表達(dá)載體 在制備抗肺瘤增殖和遷移的藥物中的用途。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有編碼癡原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白的基因的重組表達(dá) 載體在制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途，其特征在于所述腫瘤為肝癌 和結(jié)腸癌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白即CSP用于制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物的新用途；本發(fā)明成功構(gòu)建了CSP的重組表達(dá)載體pFLAG-CMV8-CSP，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將其轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株HepG2和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，研究結(jié)果顯示，CSP主要表達(dá)于HepG2細(xì)胞的胞漿內(nèi)，能夠抑制TNF-α和LPS刺激HepG2細(xì)胞和SW480細(xì)胞活化NF-κB，并抑制SW480細(xì)胞的增殖，有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤增殖和遷移的新型蛋白藥物，包含CSP基因的重組表達(dá)載體有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤增殖和遷移的新型基因藥物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101480489SQ200810233209
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者艷 丁, 徐文岳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)