專利名稱：：苔蘚抑素、苔蘚抑素類似物和其它相關(guān)物質(zhì)對(duì)缺血/中風(fēng)引起的記憶缺陷和腦損傷的療效的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用激活蛋白激酶C(PKC)或增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)或其它營(yíng)養(yǎng)因子的化合物治療中風(fēng)。
背景技術(shù)：
：A.中風(fēng)中風(fēng)也稱為腦血管意外(CVA)，是腦中某一部分供血中斷的急性神經(jīng)損傷。腦供血可通過(guò)數(shù)種方式中斷，包括阻塞(缺血性、栓塞性或血栓性中風(fēng))或血管破裂(出血性中風(fēng))。中風(fēng)包括由于腦灌注紊亂引起的神經(jīng)元功能的突然喪失。這種灌注紊亂通常發(fā)生于動(dòng)脈，但也可發(fā)生于靜脈。腦中灌注紊亂的部分不能再接受足夠的氧氣。這啟動(dòng)了缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡或嚴(yán)重?fù)p傷，破壞局部的腦功能。中風(fēng)是醫(yī)學(xué)緊急情況，如果得不到及時(shí)的診斷和治療可引起永久性神經(jīng)損傷甚至死亡。它是美國(guó)和歐洲工業(yè)化國(guó)家的第三大死因和引起成年人殘疾的最主要原因。平均來(lái)看，每45秒出現(xiàn)一例中風(fēng)，每3分鐘就有一人死于中風(fēng)。每5例中風(fēng)引起的死亡中，2例為男性，3例為女性。盡管在臨床前研究中可通過(guò)醫(yī)學(xué)緊急處理和多種藥物有效阻斷腦缺血的病理過(guò)程，但目前利用rTPA進(jìn)行溶栓治療是治療缺血性中風(fēng)的唯一可選方案。設(shè)計(jì)治療以實(shí)現(xiàn)時(shí)間依賴性的早期動(dòng)脈再通(在時(shí)間發(fā)生后3小時(shí)內(nèi)有效)。阻止梗塞發(fā)展的rTPA和其它可能藥物的有效性取決于早期給藥，甚至是如果可能在出現(xiàn)缺血事件之前給藥。在缺血性中風(fēng)的治療中狹窄的治療時(shí)間窗導(dǎo)致只有約5%候選患者接受有效的靜脈內(nèi)溶栓治療。缺血性中風(fēng)中，缺血事件后立即發(fā)生顯著的腦損傷。腦缺血/中風(fēng)中"延遲的"腦損傷和細(xì)胞死亡是一個(gè)已經(jīng)得到充分確認(rèn)的現(xiàn)象，預(yù)示著治療機(jī)會(huì)。局灶性嚴(yán)重中風(fēng)的梗塞核心中的神經(jīng)元立即死亡，無(wú)法通過(guò)藥理學(xué)介入進(jìn)行拯救。然而，局灶性缺血性中風(fēng)中核心周圍的腦組織組成的缺血半影區(qū)和全腦缺血中的敏感神經(jīng)元/網(wǎng)絡(luò)通過(guò)降低的血供得以維持。對(duì)此半影區(qū)腦組織的損傷以"延遲"方式發(fā)生，從腦缺血/中風(fēng)后4-6小時(shí)的第二階段開(kāi)始，或從腦缺血/中風(fēng)后數(shù)天和數(shù)周后的所謂第三階段開(kāi)始。例如，約15分鐘腦缺血后，2-3天內(nèi)海馬CA1錐體細(xì)胞開(kāi)始降解，在缺血事件發(fā)生后一周細(xì)胞死亡達(dá)到最大程度。全腦缺血和缺血半影區(qū)中的敏感神經(jīng)元結(jié)構(gòu)是"風(fēng)險(xiǎn)"組織。在隨后數(shù)天或數(shù)周通過(guò)介入進(jìn)行救助或進(jìn)一步損傷決定長(zhǎng)期殘疾的顯著差異。本發(fā)明提供一種新的治療方案，包括在缺血事件發(fā)生后數(shù)小時(shí)至數(shù)天至數(shù)周的較寬治療窗內(nèi)，向發(fā)生腦缺血/中風(fēng)的對(duì)象瞬時(shí)、定期或長(zhǎng)期給予PKC激活劑、其它化合物和其組合。B.蛋白激酶CPKC已被鑒定為非受體絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的最大基因家族之一。自從Nishizuka和同事們?cè)?0年代早期發(fā)現(xiàn)PKC(Kikkawa等(1982)/.C/zem.257:13341)，并將其鑒定為佛波酯的主要受體(Ashendel等(1983)C"wceriw.，43:4333)，已發(fā)現(xiàn)多種生理信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與該酶有關(guān)。對(duì)PKC的強(qiáng)烈興趣來(lái)源于其被鈣和二酰甘油(和其佛波酯模擬物)體外激活的獨(dú)特能力，它是其形成通過(guò)生長(zhǎng)和分化因子的作用與磷脂轉(zhuǎn)換相關(guān)聯(lián)的效應(yīng)物。已證明，PKC的激活能提高學(xué)習(xí)能力和記憶力。(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US02/13784;PCT/US03/07102;60/287,721;60/362,081;10/172,005;和10/476,459;各自通過(guò)引用全文納入本文)。然而，在本申請(qǐng)之前，PKC介導(dǎo)的學(xué)習(xí)能力和記憶力提高未被認(rèn)作治療中風(fēng)后記憶力缺陷和腦損傷的機(jī)制。另外，不認(rèn)為本文所述的PKC激活劑，特別是能提高學(xué)習(xí)能力和記憶力的化合物在腦缺血/中風(fēng)后具有腦功能恢復(fù)活性。歷史上，中風(fēng)治療中僅有少數(shù)療法可供選擇。例如，目前唯一可用的藥物療法由抗血栓藥(溶栓治療；如靜脈內(nèi)注射組織纖溶酶原激活劑)組成，它必須在缺血事件發(fā)生后3小時(shí)內(nèi)給予。雖然在臨床試驗(yàn)中檢測(cè)了許多類型的潛在神經(jīng)保護(hù)劑，但因?yàn)橛绕涫侵酗L(fēng)后使用時(shí)無(wú)效或相關(guān)毒性，沒(méi)有一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床。在動(dòng)物模型中缺血后24小時(shí)開(kāi)始治療時(shí)，已證明本發(fā)明所述化合物在人中良好耐受的劑量下(苔蘚抑素-l劑量)有效。已發(fā)現(xiàn)耙向蛋白激酶C(PKC)的化合物，例如直接PKC激活劑苔蘚抑素-1以及激活或固定神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)或其它營(yíng)養(yǎng)因子(它們可能是PKC靶點(diǎn))的增強(qiáng)劑或物質(zhì)甲基鄰苯二酚的衍生物甲基鄰苯二酚二乙酸，對(duì)大鼠(動(dòng)物中風(fēng)模型)中腦缺血誘導(dǎo)的腦損傷和記憶缺陷有治療價(jià)值。本發(fā)明將這些物質(zhì)開(kāi)發(fā)為治療中風(fēng)的治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供治療中風(fēng)的方法，所述方法包括以下步驟鑒定患有中風(fēng)的對(duì)象，給予所述對(duì)象一定量的含有蛋白激酶C(PKC)激活劑或4-甲基鄰苯二酚乙酸(MCBA)和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，所述用量能有效治療中風(fēng)的至少一種癥狀。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PKC激活劑是FGF-18、大環(huán)內(nèi)酯、苯并內(nèi)酰胺(benzolactam)、吡咯垸酮或其組合。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素或夾竹桃抑素(neristatin)。在另一實(shí)施方式中，所述夾竹桃抑素是夾竹桃抑素-1。在另一實(shí)施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。更優(yōu)選地，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，藥物組合物包含4-甲基鄰苯二酚乙酸(MCBA)、甲基鄰苯二酚的其它衍生物或腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。MCBA和甲基鄰苯二酚的其它衍生物能激活或上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)或其它營(yíng)養(yǎng)因子。NGF能激活、上調(diào)或增強(qiáng)PKC的活性，進(jìn)而上調(diào)、激活或增強(qiáng)NGF。在一個(gè)實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)發(fā)生后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內(nèi)開(kāi)始給予本發(fā)明藥物組合物。在另一實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)發(fā)生后l-2天、1-3天、1-4天、l-5天或l-7天開(kāi)始所述給藥。在另一實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)發(fā)生后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)內(nèi)開(kāi)始給予本發(fā)明藥物組合物。在又一實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)發(fā)生后1-3小時(shí)、1-5小時(shí)、1-10小時(shí)、1-24小時(shí)、3-5小時(shí)、3-10小時(shí)、3-24小時(shí)、5-10小時(shí)、5-24小時(shí)或10-24小時(shí)開(kāi)始給予本發(fā)明藥物組合物。在另一實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)/缺血事件發(fā)生后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)開(kāi)始給予本發(fā)明藥物組合物。在又一實(shí)施方式中，在所述中風(fēng)/缺血事件發(fā)生后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天開(kāi)始給予本發(fā)明藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括給予本發(fā)明藥物組合物的治療連續(xù)進(jìn)行約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。附圖簡(jiǎn)述圖1描述訓(xùn)練試驗(yàn)中大鼠的空間水迷宮表現(xiàn)。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。Bry，苔蘚抑素-l;Isch，腦缺血；MCDA，4-甲基鄰苯二酚-二乙酸。圖2描述探測(cè)試驗(yàn)中的目標(biāo)象限比值。Bry，苔蘚抑素-l;Isch，缺血；MCDA，4-甲基鄰苯二酚-二乙酸。*:/<0.05。NS:/>0.05。發(fā)明詳述定義本文所用的組合物的"給藥"包括任何給藥途徑，包括口服、皮下、腹膜內(nèi)和肌內(nèi)。本文所用的"有效量"是足以減輕與中風(fēng)有關(guān)的一種或多種癥狀的用本文所用"蛋白激酶C激活劑"或"PKC激活劑"指通過(guò)結(jié)合蛋白激酶C提高蛋白激酶C催化的反應(yīng)速率的物質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"指哺乳動(dòng)物。本文所用術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受載體"指可與活性成分混合，混合后可用于將活性成分給予對(duì)象的化學(xué)組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)"生理可接受的"酯或鹽指，與藥物組合物的任何其它其他成分相容、并且對(duì)該組合物所給對(duì)象無(wú)害的活性成分的酯或鹽形式。本文所用"藥學(xué)可接受載體"也包括但不限于以下一種或多種物質(zhì)賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；成粒劑和崩解劑；粘合劑；潤(rùn)滑劑；甜味劑；調(diào)味劑；著色劑；防腐劑；生理可降解組合物如明膠；水性運(yùn)載體和溶劑；油性運(yùn)載體和溶劑；助懸劑；分散劑或濕潤(rùn)劑；乳化劑，緩和劑；緩沖液；鹽；增稠劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩(wěn)定劑；和藥學(xué)上可接受的聚合材料或疏水性材料。本發(fā)明藥物組合物可包含的其他"額外成分"是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如Genaro編，1985，雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences),賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(MackPublishingCo.，Easton，Pa.)，通過(guò)引用納入本文。本文所述藥物組合物的制劑可通過(guò)藥理學(xué)領(lǐng)域已知或隨后開(kāi)發(fā)的任何方法制備。通常，這些制備方法包括將活性成分與載體或一種或多種其他輔助成分混合的步驟，然后，如果必要或需要，使所述產(chǎn)品形成或包裝成所需的單劑量單元或多劑量單元。雖然有關(guān)本文所述藥物組合物的描述主要涉及在倫理上適合給予人的藥物組合物，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這類組合物通常也適合給予所有種類的動(dòng)物。改變適合給予人的藥物組合物以使該組合物適合給予各種動(dòng)物的方法是眾所周知的，獸醫(yī)藥理學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)(如果需要)設(shè)計(jì)并進(jìn)行這種改變。給予本發(fā)明藥物組合物的對(duì)象包括但不限于人和其他靈長(zhǎng)動(dòng)物，以及其他哺乳動(dòng)物。盡管新治療劑的開(kāi)發(fā)和幾種動(dòng)物模型的實(shí)用性已有進(jìn)展，但仍然迫切地需要改進(jìn)的用于篩選的動(dòng)物模型。B.蛋白激酶C(PKC)PKC基因家族目前由ll種基因組成，它們分成以下4個(gè)亞組l)經(jīng)典PKCot、^、P2(^和(32是同一基因的另路剪接形式)和Y，2)新的PKCS、s、Tl和e，3)非典型PKC(;、X、T]和/和4)PKCp。PKCp類似于新的PKC同種型，但不同之處是具有推定的跨膜域(綜述見(jiàn)Blohe等(1994)Meto"Zev.13:411;Ilug等(1993)BiochemJ.291:329;Kikkawa等(1989)」朋.Zev.58:31)。a、卩!、卩2和y同種型是Ca2+、磷脂和二酰甘油依賴性的，它們代表PKC的經(jīng)典同種型，而其他同種型能被磷脂和二酰甘油激活，但不依賴Ca2、所有同種型均包括5可變區(qū)(V1-V5)，a、(3和y同種型含有高度保守的四個(gè)(C1-C4)結(jié)構(gòu)域。除PKCa、P和y外，所有同種型均缺少C2結(jié)構(gòu)域，？^和n同種型還缺少二酰甘油結(jié)合的Cl中兩個(gè)富半胱氨酸鋅指結(jié)構(gòu)域中的九個(gè)。Cl結(jié)構(gòu)域也含有所有同種型中高度保守的假底物序列，它通過(guò)阻斷底物結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生該酶的無(wú)活性構(gòu)象而起到自身調(diào)節(jié)功能(House等(1987)Science238，1726)。由于這些結(jié)構(gòu)特征，認(rèn)為各種PKC同種型在響應(yīng)生理刺激的信號(hào)傳導(dǎo)(Nishizuka(1989)C薩er10:1892)以及腫瘤轉(zhuǎn)化和分化(Glazer(1994)蛋白激酶C(ProteinKinaseC)，J.F.Kuo編，牛津大學(xué)出版社(OxfordU.Press),第171-198頁(yè))中具有高度特化的功能。已知PKC調(diào)節(jié)劑的討論參見(jiàn)PCT/US97/08141，美國(guó)專利5,652,232;6,080,784;5,891,906;5,962,498;5,955,501;5,891,870和5,962,504(各自通過(guò)引用全文納入本文)。有越來(lái)越多的證據(jù)表明，單獨(dú)的PKC同工酶在提供藥理學(xué)探索基礎(chǔ)的生物過(guò)程中起到重要作用。一個(gè)是設(shè)計(jì)PKC的特異性(優(yōu)選同工酶特異性)激活劑。由于催化域不是主要負(fù)責(zé)PKC同工酶特異性的結(jié)構(gòu)域，所以這種方法比較復(fù)雜。它們可提供規(guī)避具有相反生物學(xué)作用的其他信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響的方式。或者，通過(guò)在迅速激活后誘導(dǎo)PKC下調(diào)，PKC激活劑可引起長(zhǎng)期拮抗作用。目前，苔蘚抑素作為抗癌劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。已知苔蘚抑素能結(jié)合PKC的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，并激活該酶。苔蘚抑素是PKC的同工酶選擇性激活劑的例子。(參見(jiàn)例如WO97/43268;通過(guò)引用全文納入本文)。已知PKC調(diào)節(jié)劑的討論參見(jiàn)PCT/US97/08141，美國(guó)專利5,652,232;6，043，270;6,080,784;5,891,906;5,962,498;5,955,501;5,891,870禾口5,962,504(各自通過(guò)引用全文納入本文)。已經(jīng)鑒定到幾種類型的PKC激活劑。然而，佛波酯不適合最終開(kāi)發(fā)成藥物，因?yàn)樗哂写倌[瘤活性(Ibarreta等(1999)NeuroReport10(5和6):1035-40)。特別感興趣的是用于刺激PKC的大環(huán)內(nèi)酯(即苔蘚抑素類型和夾竹桃抑素類型)。苔蘚抑素類型的化合物中，已證明苔蘚抑素-1能激活PKC，并且不具有促腫瘤活性。作為PKC激活劑的苔蘚抑素-1也特別有用，因?yàn)樘μ\抑素-1的劑量反應(yīng)曲線具有兩相性。此外，苔蘚抑素-1能差異調(diào)節(jié)PKC同工酶，包括PKCa、PKCS禾nPKCs。己在動(dòng)物和人中對(duì)苔蘚抑素-1進(jìn)行了毒性和安全性研究，并被積極評(píng)價(jià)為抗癌劑。苔蘚抑素-1在這些研究中的應(yīng)用確定，在人體內(nèi)的主要副反應(yīng)是肌痛。有效劑量的一個(gè)例子是每周靜脈內(nèi)注射40pg/m2。大環(huán)內(nèi)酯，具體是苔蘚抑素-l可參見(jiàn)美國(guó)專利4，560,774(通過(guò)引用全文納入本文)。大環(huán)內(nèi)酯和其衍生物的描述參見(jiàn)美國(guó)專利6,187,568、美國(guó)專利6,043,270、美國(guó)專利5,393,897、美國(guó)專利5,072,004、美國(guó)專利5,196,447、美國(guó)專利4,833,257和美國(guó)專利4,611,066(通過(guò)引用全文納入本文)。上述專利描述了大環(huán)內(nèi)酯的各種化合物和各種應(yīng)用，包括其作為抗炎劑或抗腫瘤劑的應(yīng)用。(Szallasi等(1994)Jowr"a/C/zem^^y269(3):2118-24;Zhang等(1996)Omer7e^wc/z56:802-808;Hennings等(1987)G3n:/wogewew、8(9):1343-1346;Varterasian等(2000)C7/m'ca/C"wcerie濯rc/6:825-828;Mutter等(2000)腸org腦'ccfeMeWc/"a/C7zem旨^y8:1841-1860)(各自通過(guò)引用全文納入本文)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也應(yīng)理解，大環(huán)內(nèi)酯化合物和其衍生物，特別是苔蘚抑素類型的化合物可用組合合成技術(shù)合成，因此可產(chǎn)生化合物文庫(kù)，以優(yōu)化藥理參數(shù)，包括但不限于該組合物的效能和安全性。此外，可測(cè)定這些文庫(kù)，以確定優(yōu)先調(diào)節(jié)a-胰泌素和/或PKC的那些成員。對(duì)天然產(chǎn)物和發(fā)酵肉湯進(jìn)行組合文庫(kù)高通量篩選能夠發(fā)現(xiàn)幾種新的藥物。目前，產(chǎn)生和篩選大量化合物被廣泛用作發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的主要技術(shù)，這肯定是藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域主要的基礎(chǔ)性進(jìn)步。此外，即使在鑒定到"先導(dǎo)"化合物之后，組合技術(shù)也能作為優(yōu)化所需生物學(xué)活性的有價(jià)值的工具。應(yīng)理解，主題反應(yīng)能夠產(chǎn)生篩選藥物，或其他生物學(xué)或醫(yī)學(xué)相關(guān)活性或者材料相關(guān)品質(zhì)所需的組合化合物文庫(kù)。用于本發(fā)明目的的組合文庫(kù)是多種化學(xué)相關(guān)化合物的混合物，可對(duì)其中的所需特性進(jìn)行篩選；所述文庫(kù)可以是溶液形式或者共價(jià)偶聯(lián)于固體支持物。在單一反應(yīng)中制備許多相關(guān)化合物大大降低和簡(jiǎn)化了需要進(jìn)行的篩選過(guò)程的數(shù)量?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)方法篩選合適的生物學(xué)特性。因此，本發(fā)明也提供測(cè)定一種或多種本發(fā)明化合物結(jié)合并有效調(diào)節(jié)a-胰泌素和/或PKC的能力的方法?？蓮谋绢I(lǐng)域獲得產(chǎn)生組合文庫(kù)的各種技術(shù)，如下所述，但應(yīng)理解，本發(fā)明不僅限于上述例子和描述。(參見(jiàn)例如，Blondelle等(1995)TrendsAnal.Chem.14:83;美國(guó)專利5,359,115;5,362,899;U.S.5,288,514;PCT公開(kāi)WO94/08051;Chen等(1994)JACCS16:266l:Kerr等(1993)JACCSI15:252;PCT公開(kāi)W092/10092,W093/09668;W091/07087;和W093/20242;各自通過(guò)引用納入本文)。因此，可合成約16至1，000,000或更多多樣異構(gòu)體(diversomer)數(shù)量級(jí)的各種文庫(kù)，并篩選特定的活性或特性。苔蘚抑素的類似物通常稱為苔蘚抑素類似物，它們是適用于本發(fā)明方法的一種特定類型的PKC激活劑。下表總結(jié)了幾種苔蘚抑素類似物的結(jié)構(gòu)特征，證明苔蘚抑素類似物與PKC的親和力變化很大(從0.25nM至10pM)。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似。雖然苔蘚抑素-1具有兩個(gè)吡喃環(huán)和一個(gè)六元環(huán)狀縮醛，但在大部分苔蘚抑素類似物中，苔蘚抑素-1的一個(gè)吡喃被第二個(gè)六元縮醛環(huán)取代。與苔蘚抑素-1相比，這種改變降低了苔蘚抑素類似物在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的穩(wěn)定性，但在生理pH下影響很小。與苔蘚抑素-l(988)相比，苔蘚抑素類似物還具有較低的分子量(約600至755)，該特性有利于其通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>類似物1(Wender等(2004)CurrDrugDiscovTechnol.l;Wender等(1998)ProcNatlAcadSciUSA95:6624;Wender等(2002)AmChemSoc.124:13648(各自通過(guò)引用全文納入本文))與PKC親和力最高。這種苔蘚抑素類似物的強(qiáng)度是苔蘚抑素-1的約100倍。只有類似物1與PKC的親和力高于苔蘚抑素。缺少苔蘚抑素-l的A環(huán)的類似物2是最簡(jiǎn)單的類似物，其保留了與PKC的高親和力。除了活性苔蘚抑素類似物以外，26位乙?；念愃莆?d與PKC基本上沒(méi)有親和力。苔蘚抑素1;Ki=1.35nM類似物1;i=0.25nMB-環(huán)苔蘚抑素類似物也適用于本發(fā)明方法。這些合成的苔蘚抑素類似物的親和力在低納摩爾范圍(Wender等(2006)OrgLett.5299(通過(guò)引用全文納入本文))。B-環(huán)苔蘚抑素類似物具有全合成的優(yōu)點(diǎn)，不需要由天然來(lái)源純化。5:PKCKj-3.0土0.5nM6:PKCK！=2.6±0.5nMB-環(huán)苔蘚抑素類似物的PKC結(jié)合親和力第三類合適的苔蘚抑素類似物是A-環(huán)苔蘚抑素類似物。這類苔蘚抑素類似物與PKC的親和力略低于苔蘚抑素I(苔蘚抑素類似物3、4和5的親和力分別為6.5、2.3和1.9nM)，但分子量較低。許多二酰甘油(DAG)的衍生物能結(jié)合和激活蛋白激酶C(Niedel等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:36;Mori等(1982)J.Biochem(Tokyo)91:427;Kaibuchi等(1983)J.Biol.Chem.258:6701)。然而，DAG禾卩DAG衍生物的藥用價(jià)值有限。二酰甘油對(duì)PKC的激活作用是瞬時(shí)的，因?yàn)樗鼈儽欢８视图っ负椭秆杆俅x(Bishop等(1986)J.Biol.Chem.261:6993;Chung等(1993)Am.J.Physiol.265:C927;通過(guò)引用將其全文納入本文)。脂肪酸取代決定激活的強(qiáng)度。具有不飽和脂肪酸的二酰甘油活性最高。立體異構(gòu)構(gòu)型也至關(guān)重要。具有1,2-sn構(gòu)型的脂肪酸具有活性，而2,3-sn-二酰甘油和1，3-二酰甘油不結(jié)合PKC。順式-不飽和脂肪酸與二酰甘油有協(xié)同作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"PKC激活劑"明確排除DAG或DAG衍生物，如佛波酯。類異戊二烯是適用于本發(fā)明方法的PKC激活劑。例如，法呢基硫代三唑是以Kd2.5pM激活PKC的合成類異戊二烯。例如，法呢基硫代三唑的強(qiáng)度與二油酰甘油相等(Gilbert等(1995)Biochemistry34:3916;通過(guò)引用全文納入本文)，但不具有可水解的脂肪酸酯。法呢基硫代三唑和相關(guān)化合物是穩(wěn)定的持續(xù)性PKC激活劑。由于其低MW(305.5)和不帶電，法呢基硫代三唑易于通過(guò)血腦屏障。辛基吲哚內(nèi)酰胺V(OctylindolactamV)是與殺魚(yú)菌素有關(guān)的非佛波醇蛋白激酶C激活劑。辛基吲哚內(nèi)酰胺V，特別是(-)-對(duì)映異構(gòu)體的優(yōu)點(diǎn)包括較高的代謝穩(wěn)定性、高強(qiáng)度(Fujiki等(1987)Adv.CancerRes.223;Collins等(1982)Biochem.Biophys.Res.Commun.104:1159;各自通過(guò)引用全文納入本文)(EC5(H29nM)和有利于跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的低分子量。格尼迪木靈是瑞香烷型二萜，它在0.1-1nM的濃度下對(duì)鼠白血病和實(shí)體瘤具有強(qiáng)效抗腫瘤活性。在K562細(xì)胞中，濃度約為3nM時(shí)它用作PKC激活劑，并通過(guò)抑制Cdc25A和隨后抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(Cdk2)(5ng/ml時(shí)實(shí)現(xiàn)100%抑制)而將細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)節(jié)在Gl/S期。格尼迪木靈是類似于苔蘚抑素、但分子量略低(MW-774.9)的雜環(huán)天然產(chǎn)物。伊利帕利達(dá)(Iripallidal)是由白鳶尾(Irispallida)分離的雙環(huán)三萜類化合物。伊利帕利達(dá)在NCI60種細(xì)胞系篩選中顯示出抗增殖活性，GI50(抑制50%生長(zhǎng)所需的濃度)值在微摩爾至納摩爾范圍。它以高親和力結(jié)合PKCa(Ki=75.6nM)。它以RasGRP3-依賴方式誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化。M.W.486.7。伊利帕利達(dá)的大小大約只有苔蘚抑素的一半，且不帶電。巨大戟二萜醇是與佛波醇有關(guān)、但毒性小得多的雙萜類化合物。它衍生自乳草屬植物南歐大戟(Euphorbiapeplus)。例如，巨大戟二萜醇3,20-二苯甲酸酯與[3H]佛波醇二丁酸酯競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PKC(結(jié)合的Ki=240nM)(Winkler等(1995)J.Org.Chem.60:1381;通過(guò)引用納入本文)。巨大戟二葙醇-3-當(dāng)歸酸酯外用時(shí)，對(duì)鱗狀細(xì)胞癌和黑素瘤具有抗腫瘤活性(Ogbourne等(2007)AnticancerDrugs.357;通過(guò)引用納入本文)。o萘磺酰胺，包括N-(正庚基)-5-氯-l-萘磺酰胺(SC-10)和N-(6-苯基己基)-5-氯-l-萘磺酰胺，是另一類型的PKC激活劑的成員。SC-10以鈣依賴方式，采用類似于磷脂酰絲氨酸的機(jī)制激活PKC(Ito等(1986)Biochemistry25:4179;通過(guò)引用納入本文)。萘磺酰胺通過(guò)不同于苔蘚抑素的機(jī)制起作用，預(yù)計(jì)它與苔蘚抑素有協(xié)同作用，或者是另一類型的PKC激活劑的成員。萘磺酰胺的結(jié)構(gòu)類似于鈣調(diào)蛋白(CaM)拮抗劑W-7，但據(jù)報(bào)道對(duì)CaM激酶沒(méi)有作用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>亞油酸衍生物DCP-LA(2-[(2-戊基環(huán)丙基)甲基]環(huán)丙基辛酸)是少數(shù)已知的同種型特異性PKC激活劑之一。DCP-LA選擇性激活PKCe，在100nM時(shí)達(dá)到最大作用。(Kanno等(2006;U丄^Wi",47:1146)。類似于SC-10，DCP-LA與PKC的磷脂酰絲氨酸結(jié)合位點(diǎn)，而不是二酰甘油結(jié)合位點(diǎn)相互作用。另一種直接激活PKC的方法是提高內(nèi)源性激活劑二酰甘油的水平。二酰甘油激酶抑制劑如6-(2-(4-[(4-氟苯基)苯基亞甲基]-l-哌啶基)乙基)-7-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮(R59022)和[3-[2-[4-(雙(4-氟苯基)亞甲基]哌啶-l-基)乙基]-2，3-二氫-2-硫代-4(lH)-喹唑酮(R59949)能提高內(nèi)源性配體二酰甘油的水平，從而激活PKC(Meinhardt等(2002)Anti-CancerDrugs13:725)。各種生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(FGF-18)和胰島素生長(zhǎng)因子均通過(guò)PKC途徑起作用。在學(xué)習(xí)過(guò)程中，F(xiàn)GF-18表達(dá)上調(diào)，胰島素生長(zhǎng)因子受體也與學(xué)習(xí)有關(guān)。這些或其他生長(zhǎng)因子激活PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑提供了另一種激活蛋白激酶C的可能方式。刺激生長(zhǎng)因子如NGF和BDNF的合成和/或激活的生長(zhǎng)因子激活劑，如4-鄰苯二酚衍生物，如4-甲基鄰苯二酚乙酸(MCBA)也激活PKC以及負(fù)責(zé)突觸發(fā)生和/或神經(jīng)分枝(neuriticbranching)的會(huì)聚途徑。可通過(guò)各種途徑、以各種劑型給予本發(fā)明化合物，包括適合口服、直腸、胃腸外(如皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))、硬膜外、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、局部和含服給藥的途徑和劑型。成人的劑量范圍取決于多種因素，包括患者的年齡、體重和身體狀況以及給藥途徑。本文中述及的所有書(shū)籍、文章、專利和其他發(fā)表物均通過(guò)引用全文納入本文。本文提到的任何化合物均包括外消旋物以及單個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。實(shí)施例以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:中風(fēng)的全腦缺血模型將大鼠(雄性，維斯達(dá)大鼠(Wistar)，200-225g)隨機(jī)分成6組(每組8只)，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。瞬時(shí)或永久性限制腦血流和氧供導(dǎo)致缺血性中風(fēng)。用于誘導(dǎo)血管記憶缺陷的全腦缺血模型是合并出現(xiàn)短期全身缺氧的雙側(cè)血管閉塞。在麻醉(戊巴比妥，60mg/kg，i.p.)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后恢復(fù)一周后，使大鼠暴露于缺氧條件14分鐘(在玻璃罐中5%氧氣條件下)。對(duì)照大鼠(假操作和運(yùn)載體對(duì)照)也進(jìn)行相同的切開(kāi)術(shù)，以分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并暴露于空氣條件14分鐘(玻璃罐中)。在手術(shù)過(guò)程中用熱光源將體溫保持在37-37.5°C，直到動(dòng)物完全蘇醒。實(shí)施例2:苔蘚抑素和MCDA處理從缺氧處理結(jié)束后24小時(shí)開(kāi)始，給予20pg/t^苔蘚抑素-l(尾靜脈注射，2個(gè)劑量/周，共給10個(gè)劑量)。在另一組大鼠中，給予1.0mg/kg4-甲基鄰苯二酚-二乙酸(MCDA，可能的NGF和BDNF增強(qiáng)劑)(每天腹膜內(nèi)給藥，同樣持續(xù)5周)。最后一次苔蘚抑素-1、MCDA或運(yùn)載體給藥后1周，用水迷宮空間學(xué)習(xí)任務(wù)訓(xùn)練大鼠(每天進(jìn)行2次訓(xùn)練試驗(yàn)，持續(xù)4天)，然后進(jìn)行探測(cè)試驗(yàn)。在探測(cè)試驗(yàn)后進(jìn)行可見(jiàn)的平臺(tái)試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1?？傊?，6組之間存在顯著的學(xué)習(xí)差異(圖1;F5，383=27.480，/7<0.001;ANOVA)。詳細(xì)分析揭示，缺血組未學(xué)會(huì)空間迷宮任務(wù)，因?yàn)樵囼?yàn)中的逃離潛伏期沒(méi)有顯著差異^7,63=0.102，p>0.05)，與對(duì)照大鼠(組差異F^2f79.751，p〈0.001)相比學(xué)習(xí)能力明顯受損，而其他5組大鼠均學(xué)會(huì)該任務(wù)(試驗(yàn)中，用MCDA治療的缺血大鼠p<0.05,其他4組p<0.001)。苔蘚抑素-1治療顯著提高其表現(xiàn)(用苔蘚抑素-l治療的缺血組相對(duì)于缺血大鼠F^^72.782，p<0.001)，提高至與對(duì)照大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的表現(xiàn)水平(用苔蘚抑素-l治療的缺血組相對(duì)于對(duì)照大鼠FU27=0.001，p>0.05)。MCDA治療也提高了缺血大鼠的學(xué)習(xí)能力(NCDA治療的缺血組相對(duì)于缺血大鼠FU27=15.584，p<0.001)，但在治療5周后用MCDA治療的缺血組和對(duì)照大鼠之間仍然有顯著性差異(用NCDA治療的缺血組相對(duì)于對(duì)照大鼠FU27=16.618，p<0.001)。對(duì)照和僅用苔蘚抑素-1之間沒(méi)有差異(苔蘚抑素-l相對(duì)于對(duì)照FU27=0.010，p>0.05),且對(duì)照和僅用MCDA之間沒(méi)有差異(MCDA相對(duì)于對(duì)照Fw2f0.272，p>0.05)。缺血組的大鼠在探測(cè)試驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出目標(biāo)優(yōu)選性(F3,3產(chǎn)0.096，p>0.05)，而另外5組大鼠在探測(cè)試驗(yàn)中均表現(xiàn)出目標(biāo)象限優(yōu)選性(所有p<0.005)。用目標(biāo)象限比值(用探針試驗(yàn)中的目標(biāo)象限距離除以非目標(biāo)象限值的平均值；圖2)分析數(shù)據(jù)。各組之間的目標(biāo)象限比值存在顯著性差異(F5,47=5.081，p<0.001)。詳細(xì)分析揭示出，對(duì)照和缺血大鼠之間(Fl,15=9.451，p<0.01)、缺血組和用苔蘚抑素-1治療的缺血組之間(Fl,15=10.328，p<O.Ol)以及用MCDA治療的缺血組和缺血大鼠之間(Fl,15=5.623，p〈0.05)存在組間差異，但對(duì)照和用苔蘚抑素-1治療的缺血大鼠之間(Fl,15=0.013，p>0.05)、用MCDA治療的缺血大鼠和對(duì)照之間(Fl,15=2.997，p>0.05)、對(duì)照和只用苔蘚抑素-1治療的大鼠之間(Fl,15=0.064，p>0.05)以及對(duì)照和只用MCDA治療的大鼠之間(Fl,15i.0392，p〉0.05)沒(méi)有差異。在探測(cè)試驗(yàn)后測(cè)定的可見(jiàn)平臺(tái)試驗(yàn)證明，組間沒(méi)有顯著差異(F5,474.115，p>0.05)，這表明大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)能力方面沒(méi)有顯著的組間差異。實(shí)施例3:苔蘚抑素治療通過(guò)永久閉塞雙側(cè)頸總動(dòng)脈，合并約14分鐘的低氧(約5%)處理，在雄性維斯達(dá)大鼠(225-250g)中誘導(dǎo)全腦缺血/缺氧。從缺血/缺氧處理結(jié)束后約24小時(shí)開(kāi)始，給予15pg/n^苔蘚抑素-l(通過(guò)尾靜脈注射，2個(gè)劑量周，共給10個(gè)劑量)。在最后一次給藥9天后，進(jìn)行空間學(xué)習(xí)(2次試驗(yàn)/天，共4天)和記憶(最后一次試驗(yàn)后24小時(shí)進(jìn)行1分鐘探測(cè)試驗(yàn))任務(wù)。總之，組間(F3,255二31.856，pO.001)和組x試驗(yàn)間(F21,255=1.648，pO.05)存在顯著性差異。全腦缺血損傷了空間學(xué)習(xí)能力(缺血組相對(duì)于假操作組Fl，127=79.751，p>0.001)。學(xué)習(xí)能力受損被苔蘚抑素-1治療恢復(fù)(苔蘚抑素-l+缺血相對(duì)于缺血Fl,127=50.233，p<0.001)，而單獨(dú)的苔蘚抑素-1不影響學(xué)習(xí)能力(苔蘚抑素-l相對(duì)于假操作組Fl,127=2.258，p>0.05;最后一次給藥9天后)。在記憶保持試驗(yàn)中，接受假操作的大鼠顯示出目標(biāo)象限優(yōu)選性。但在缺血大鼠中沒(méi)有觀察到這種良好的記憶保持能力，表明其空間記憶受損。缺血后苔蘚抑素-1治療將記憶保持能力有效恢復(fù)至假操作大鼠的水平。與假操作對(duì)照大鼠相比，單獨(dú)的苔蘚抑素-1對(duì)目標(biāo)象限優(yōu)選性沒(méi)有顯著影響。各組之間的象限比值(用目標(biāo)象限游泳距離除以非目標(biāo)象限的平均游泳距離計(jì)算；F3,31=6.181，pO.005)存在顯著性差異。詳細(xì)分析證明，缺血大鼠和假操作對(duì)照大鼠之間(Fl,15=9.451，p<0.01)，缺血大鼠和用苔蘚抑素-1治療的缺血大鼠之間(Fl,15=10.328，p〈0.01)存在顯著性差異，但用苔蘚抑素-1治療的缺血大鼠和假操作對(duì)照之間(F1，15^.0131，pX).05)以及假操作對(duì)照大鼠和單用苔蘚抑素-1治療的大鼠之間(Fl，15二0.161，pX).05)沒(méi)有顯著性差異。這些結(jié)果證明，在缺血事件發(fā)生后約7周檢測(cè)時(shí)，腦缺血/缺氧對(duì)空間學(xué)習(xí)能力和記憶力產(chǎn)生損傷。在沒(méi)有適當(dāng)介入的時(shí)間框中，這種損傷是持續(xù)的并且不可恢復(fù)，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期苔蘚抑素-1治療可恢復(fù)，甚至在缺血事件發(fā)生后24小時(shí)開(kāi)始治療也可恢復(fù)，治療時(shí)間窗較寬。權(quán)利要求1.一種治療中風(fēng)的方法，所述方法包括以下步驟鑒定患有缺血病癥的對(duì)象，給予所述對(duì)象一定量的含有蛋白激酶C(PKC)激活劑或4-甲基鄰苯二酚乙酸(MCBA)或甲基鄰苯二酚的其它衍生物和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，所述用量能有效治療中風(fēng)的至少一種癥狀。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC激活劑是FGF-18、大環(huán)內(nèi)酯、苯并內(nèi)酰胺、吡咯垸酮或其組合。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素或夾竹桃抑素。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述夾竹桃抑素是夾竹桃抑素-1。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物包含4-甲基鄰苯二酚乙酸。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述給藥是在所述中風(fēng)發(fā)生后l天內(nèi)開(kāi)始的。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述給藥是在所述中風(fēng)發(fā)生后2天內(nèi)開(kāi)始的。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于生后3天內(nèi)開(kāi)始的。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于生后l-2天內(nèi)開(kāi)始的。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于生后l-3天內(nèi)開(kāi)始的。13.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于14.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述給藥是在所述中風(fēng)發(fā)，所述給藥是在所述中風(fēng)發(fā)，所述給藥是在所述中風(fēng)發(fā)，所述治療連續(xù)進(jìn)行l(wèi)周。，所述治療連續(xù)進(jìn)行2周。15.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述治療連續(xù)進(jìn)行3周。16.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述治療連續(xù)進(jìn)行4周。17.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述治療連續(xù)進(jìn)行6周。18.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述治療逆轉(zhuǎn)中風(fēng)引起的腦損傷。19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療逆轉(zhuǎn)中風(fēng)引起的記憶缺陷。全文摘要本發(fā)明提供神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)或其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白激酶激活劑或增強(qiáng)劑在治療中風(fēng)中的應(yīng)用。具體說(shuō)，本發(fā)明提供治療中風(fēng)的方法，所述方法包括以下步驟鑒定患有中風(fēng)的對(duì)象，給予所述對(duì)象一定量的含有蛋白激酶C(PKC)激活劑或4-甲基鄰苯二酚乙酸(MCBA)和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，以治療中風(fēng)的至少一種癥狀。文檔編號(hào)A61K31/395GK101678080SQ200880001730公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年2月11日優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日發(fā)明者D·L·阿爾康,M·孫申請(qǐng)人:布朗歇特洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所