專利名稱：能夠降解淀粉樣β肽的融合蛋白的制作方法
能夠降解淀粉樣P肽的融合蛋白
本發(fā)明涉及融合蛋白和它們?cè)诎柎暮Ｄ喜』颊叩拿钢委熤?br> 的用途。所述融合蛋白包括切割淀粉樣P ( AP)肽的成分、調(diào)節(jié)血漿 中的半衰期的另一種成分；以及任選地，連接前兩種成分的第三種成
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及通過將淀粉樣肽與特異性識(shí)別淀粉樣肽，并且通過降 解或修飾來滅活它們的酶反應(yīng)，來預(yù)防淀粉樣斑塊形成和/或生長的方 法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過施用具有改善的催化活性和/或選擇性以及 血漿中延長的活性的優(yōu)化的淀粉樣肽降解酶治療阿爾茨海默氏病的 方法。本發(fā)明還涉及醫(yī)學(xué)治療的領(lǐng)域，特別是涉及神經(jīng)變性疾病的領(lǐng) 域，并提供了在患有神經(jīng)變性疾病、特別是阿爾茨海默氏病的患者中 引發(fā)腦淀粉樣的清除機(jī)制的方法。此外，本發(fā)明涉及在引發(fā)這種機(jī)制 中有效的蛋白質(zhì)和肽的用途。
本發(fā)明描述了 A(3肽降解分子如何通過附著調(diào)節(jié)血漿中的穩(wěn)定性 和半衰期的分子來成為治療相關(guān)的試劑。本發(fā)明中描述的Ap肽降解 分子總的說來具有過短的血漿半衰期，不能用作有效的治療試劑。然 而，通過將這些降解分子與本發(fā)明中描述和例示的調(diào)節(jié)物分子組合， 產(chǎn)生了功能性試劑，通過施用這些優(yōu)化的淀粉樣肽降解酶融合蛋白， 其可以有效地用于治療阿爾茨海默氏病。
神經(jīng)變性疾病，特別是阿爾茨海默氏病(AD)對(duì)患者的生命具有 強(qiáng)烈的致虛弱(debilitating)影響。此外，這些疾病構(gòu)成了巨大的健 康、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD是最常見的年齡相關(guān)的神經(jīng)變性狀況，影 響了約10%的超過65歲的群體，以及最多達(dá)45%的超過85歲的群體 (Vickers等，尸rog"5^7Vewro6/o/og7 2000， 60:139-165 )。 當(dāng)前， 這個(gè)數(shù)量在美國、歐洲和日本估計(jì)為1千2百萬。這種情況將不可避 免，隨著發(fā)達(dá)國家中老年人數(shù)量的人口統(tǒng)計(jì)的增加而惡化。患有AD
與異常纖維狀結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形:同時(shí)發(fā)生。家族 的和單個(gè)發(fā)生的病例都共有作為常見的病理標(biāo)志的細(xì)胞外、纖維狀卩_ 淀粉樣的腦中沉積，這被認(rèn)為與神經(jīng)元功能的損傷和神經(jīng)元喪失相關(guān)
(Younkin S. G.，腸ro/. 37， 287-288， 1995; Selkoe, D. J.，淑, 399， A23-A31 ， 1999; Borchelt D. R.等，A^wrow 17, 1005-1013， 1996 )。
卩-淀粉樣沉積由幾種淀粉樣-P肽(Ap)組成；特別是A(342在淀粉樣 斑塊中逐漸地沉積。AD是進(jìn)行性疾病，其與記憶形成的早期缺陷相 關(guān)并最終引起高級(jí)認(rèn)知功能的完全侵蝕。AD的發(fā)病機(jī)理的特征是特 定的腦區(qū)域和神經(jīng)細(xì)胞的亞群對(duì)變性過程的選擇性易損性。具體地， 顳葉區(qū)域和海馬在早期受影響，在疾病的發(fā)展期間更加嚴(yán)重。另一方 面，額皮層、枕骨皮層和小腦內(nèi)的神經(jīng)元基本上仍是完整的，并且被 保護(hù)免于神經(jīng)變性 (Terry等，爿w"a/s o/ A^wra/ogy 1981 , 10:184-192 )。
遺傳學(xué)的證據(jù)表明，在許多而不是所有的引起家族性AD的遺傳 學(xué)狀況中產(chǎn)生提高量的Ap42 (Borchelt D. R.等，A^wro" 17， 1005-1013， 1996; DuffK.等，胸,383， 710-713， 1996; Scheuner D.等，A^. 2， 864-870， 1996; Citron M.等，A^wro&o/. 5， 107-116, 1998 )，指出淀粉樣形成的可能性可能是提高的APu產(chǎn)生 或降低的降解或這兩者引起的(Glabe，C.，淑.似ec/. 6， 133-134,2000)。 然而這些是早期發(fā)作的AD的實(shí)例，其可以歸因于APP、早老蛋白 (presenilin) -1和早老蛋白-2基因中的遺傳缺陷，晚期發(fā)作的單個(gè)發(fā) 生的AD的主要形式具有迄今未知的發(fā)病機(jī)理起源。然而，已經(jīng)鑒定 了使個(gè)體傾向于發(fā)生AD的幾種風(fēng)險(xiǎn)因素，在它們之中最顯著的是栽 脂蛋白E( ApoE)的e4等位基因和半胱氨酸蛋白酶抑制物C(cystatin C)的B等位基因。神經(jīng)變性病癥的晚期發(fā)作和復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理構(gòu)成 了對(duì)治療試劑開發(fā)的艱難的挑戰(zhàn)。
當(dāng)前，對(duì)AD沒有治愈方法，也沒有以高檢出率死亡前診斷AD 的方法。然而，p-淀粉樣蛋白成為為降低它的形成(Vassar， R.等， S".e匿286， 735-41， 1999)，或活化加速它從腦中清除的機(jī)制而設(shè) 計(jì)的藥物開發(fā)的主要靶點(diǎn)。
然而，Schenk等人(Nature, vol. 400, 173-177, 1999; Arch. Neurol., vol.57, 934-936, 2000 )的第一實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示了 AD的可能的新治療 策略。過量表達(dá)突變的人類APP (其中位置717的氨基酸是苯丙氨酸而不是正常的纈氨酸)的PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠以年齡和腦部區(qū)域依賴 性的方式逐漸發(fā)展出AD的許多神經(jīng)病理標(biāo)志。在AD型神經(jīng)病理(在 6周齡)的發(fā)作之前或在更大的年齡(11個(gè)月)用Ap42免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物，此時(shí)淀粉樣-P沉積和幾種隨后的神經(jīng)病理變化被良好地證實(shí)。年 輕動(dòng)物的免疫基本上防止了 p-淀粉樣斑塊形成、神經(jīng)炎營養(yǎng)不良和星 形膠質(zhì)增生的發(fā)生。更老的動(dòng)物的治療同樣顯著地降低了這些AD樣
神經(jīng)病理的程度和發(fā)展。顯示的是，A卩42免疫引起了抗A卩抗體的產(chǎn)
生，Af3免疫反應(yīng)性單核細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在殘存斑塊的區(qū)域中出現(xiàn)。 然而，主動(dòng)免疫方法可能在人類受試者中產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用和迄今未 知的并發(fā)癥。
Bard等人(Nature Medicine, Vol.6, Number 8, 916-919， 2000) 它們相對(duì)中度的血清水平，被動(dòng)施用e的抗體能夠跨越血腦屏l^并:4入
中樞神經(jīng)系統(tǒng)，修飾斑塊并誘導(dǎo)先存的淀粉樣的清除。然而，即使是 針對(duì)p-肽的被動(dòng)免疫也可能在人類患者中引起不希望的副作用。
本發(fā)明涉及使用重組蛋白質(zhì)來治療阿爾茨海默氏病患者。A卩肽
當(dāng)多的工作集中于A|3肽的產(chǎn)生，直到最近，顯著地更少的關(guān)注;給 予這些肽的清除。細(xì)胞外的AP肽的去除看起來通過兩種一般機(jī)制進(jìn) 行細(xì)胞的內(nèi)在化和細(xì)胞外的降解。本發(fā)明描述了新的方法，其將補(bǔ) 充淀粉樣(3肽的天然的分解代謝過程。
DeMattos ( PNAS 98: 8850-8855. 2001 )描述了沉沒(sink)假說， 其聲稱A(3肽可以通過降低血漿中肽的濃度間接地從CNS中除去。他 們?cè)谘獫{中使用了結(jié)合AP肽的抗體，從而從CNS中隔離Ap。因?yàn)?抗體阻止AP從血漿流入CNS,和/或由于血漿中游離A卩濃度的降低 改變了血漿和CNS之間的平衡，實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)。與抗體不相關(guān)的淀 粉樣結(jié)合試劑也已經(jīng)顯示了通過血漿中的結(jié)合在從CNS中除去淀粉 樣(3-肽方面是有效的。Matsuoka等人(J. Neuroscience, Vol. 23: 29-33, 2003 )呈現(xiàn)了利用兩種淀粉樣(3-肽結(jié)合試劑，凝溶膠蛋白(gelsolin) 和GM1的數(shù)據(jù)，其隔離血漿AP并從而降低或防止腦部淀粉樣變性。
除去或消除AP肽的另一種方法是使用降解酶，其將淀粉樣P肽 降解成沒有或具有更低毒理學(xué)效應(yīng)的更小的片段，其更易于清除。A|3
7肽的這種酶消化還通過降低血漿中淀粉樣(3肽的游離濃度的沉沒假說 機(jī)制起作用。然而，還可能的是CNS和/或CSF中淀粉樣(3肽的直接 清除。這種方法將不僅降低A|3的游離濃度，還直接清除來自全長肽 的環(huán)境。這種方法是有益的，因?yàn)樗鼘⒉粫?huì)提高血漿中A|3的總(游 離的和結(jié)合的)濃度，如同在利用淀粉樣[3肽結(jié)合試劑如抗體時(shí)的情 況中所見的。文獻(xiàn)中描述了酶，它們?cè)诙鄠€(gè)位點(diǎn)降解Ap肽，例如NEP (Leissring等，JBC. 278: 37314-37320， 2003 )。在多個(gè)位點(diǎn)的A卩 肽降解將產(chǎn)生容易從血流中清除的小片段。
附圖的簡要描述 附

圖1
淀粉樣P1-40肽(終濃度300nM )在緩沖液中被商售的中性溶酶 (2.4nig/ml)或Fc-中性溶酶融合蛋白(2.4fig/ml)降解。
附圖2
在豚鼠血漿中His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D Systems)的A卩40降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep，在4小時(shí)后測 量A(340水平。商售的中性溶酶用作陽性對(duì)照，膦酰二肽用作中性溶 酶特異性抑制物。
附圖3
豚鼠血漿中 His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems)的A卩42降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep， 4小時(shí)之后測 量AP42水平。商售的中性溶酶用作陽性對(duì)照，膦酰二肽用作中性溶 酶特異性抑制物。
附圖4
人血漿中His-Fc-Nep ( SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems ) 的A(340降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep, 4小時(shí)后測量A(340水平。 商售的中性溶酶用作陽性對(duì)照，膦酰二肽用作中性溶酶特異性抑制物。附圖5
與商售的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布圖(隨著時(shí)間 的過去的血漿濃度)。小鼠施用1 mg/kg商售的中性溶酶，或l或5 mg/kg內(nèi)部生產(chǎn)的Fc-Nep。
附圖6
與中性溶酶-Fc(Fc的C-末端融合物)相比較，細(xì)胞培養(yǎng)基中來 自Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的表達(dá)的酶活性。說明 PCEP4GW-Nep-Fc : 從pCEP4質(zhì)粒表達(dá)的中性溶酶-Fc ; PEAK10GW-Nep-Fc:從pEAK10質(zhì)粒表達(dá)的中性溶酶-Fc; com.Nep: 陽性對(duì)照，商業(yè)上可獲得的中性溶酶；PCEP4GW-Fc-Nep:從pCEP4 質(zhì)粒表達(dá)的Fc-中性溶酶；PEAK10GW-Fc-Nep:從pEAK10質(zhì)粒表 達(dá)的Fc-中性溶酶。
附圖7
雌性APPSWE-tg小鼠血漿中在用Fc-Nep急性治療以及陽性對(duì)照、 y-分泌酶抑制物M550426的治療之后的可溶Ap40水平。
附圖8
雌性APPSWE-tg小鼠血漿中在用Fc-Nep急性治療以及陽性對(duì)照、 分泌酶抑制物M550426的治療之后的可溶AP42水平。
附圖9
與中性溶酶-Fc ( Fc的C-末端融合物)相比較，純化的蛋白質(zhì)Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的酶活性。
說明Nep-Fc:在中性溶酶的C-末端部分融合到Fc的中性溶酶； Fc-Nep:在中性溶酶的N-末端部分融合到Fc的中性溶酶。
附圖10
在雌性C57BL/6小鼠的血漿中用hFc-Nep急性治療以及用陽性對(duì) 照Y-分泌酶抑制物M550426治療之后的小鼠Ap40水平。
9附圖11
在對(duì)雌性C57BL6小鼠的hFc-Nep單次注射后不同時(shí)點(diǎn)的血漿中 A(340水平。百分比顯示了與栽體相比的降低。hFc-Nep的暴露在圖表 中每個(gè)治療柱條上顯示。用陽性對(duì)照Y分泌酶抑制物M550426治療的 效果以紅色顯示。LOQ線顯示了分析中的定量限。
附圖12
在對(duì)雌性APPswE轉(zhuǎn)基因小鼠的mFc-Nep單次注射后的不同時(shí)點(diǎn) (從1.5直到336小時(shí))血漿中平均A卩40 ( A)和A卩42 ( B)水平。 百分比顯示了與栽體相比的降低。表(C)顯示了相應(yīng)組的血漿暴露。 用陽性對(duì)照Y分泌酶抑制物M550426治療的效果以紅色顯示。LOQ 柱條顯示了分析中的定量限。利用ANOVA模型中的雙側(cè)t-檢驗(yàn)、時(shí) 間和劑量作為固定因素來分析數(shù)據(jù)(* p<0.05; ** pO,Ol以及*** pO.001和n.s,不顯著)。
附圖13
藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)圖表分別顯示了 A(340和A(342的血漿效力效 果，作為所有時(shí)點(diǎn)(1.5-336小時(shí))栽體的百分比，以及相應(yīng)的mFc-Nep 血漿暴露。相應(yīng)圖表中的線顯示了預(yù)測的暴露和效果。
在C57BL/6小鼠中，mFc-Nep在所有時(shí)點(diǎn)(1.5、 168和336小時(shí)) 在5和25mg/kg下顯著地降低了血漿中小鼠A(340 (附圖14)。在168 和336小時(shí)時(shí)，分析了 5和25 mg/kg, A(340效果顯示是劑量依賴性 的。在2周后，25 mg/kg mFc-Nep的單次注射(336小時(shí))，與栽體 相比，顯著地降低血漿中小鼠A(340水平73%。在這個(gè)時(shí)點(diǎn)的血漿暴 露是48jag/ml，從而mFc-Nep顯示了具有長的血漿半衰期。
附圖14
在mFc-Nep向雌性C57BL6小鼠的單次靜脈內(nèi)注射之后的不同時(shí) 點(diǎn)(1.5、 168和336小時(shí))血漿中的平均A|340水平。百分比顯示了 與栽體相比的降低。表右側(cè)顯示了相應(yīng)組的血漿暴露。用陽性對(duì)照Y 分泌酶抑制物M550426治療的效果以紅色顯示。LOQ柱條顯示了分 析中的定量限。利用ANOVA模型中的雙側(cè)t-檢驗(yàn)、時(shí)間和劑量作為
10固定因素來分析數(shù)據(jù)(* p<0.05; **p<0.01, *** pO.001和n.s.不顯 著).
附圖15
與內(nèi)部生產(chǎn)的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布圖(隨著 時(shí)間的過去的血漿濃度)。向小鼠施用單次i.v.劑量的10或50 nmol 酶/kg體重中性溶酶(Nep )或Fc-Nep ( 1和5 mg/kg )。
附圖16
表格描述了通過人類或小鼠Fc-中性溶酶在人血漿或APPswe-tg小 鼠血漿中淀粉樣卩肽1-40或1-42的降解。降解的ECso ( nM)和最高 (lOOpg/mL)濃度的人類或小鼠Fc-中性溶酶下的降解。/。。結(jié)果基于 2-3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠降解A(3肽的融合蛋白。因而，本發(fā)明 提供了具有式M-A的融合蛋白，能夠在淀粉樣|3肽氨基酸序列中一 個(gè)或更多個(gè)切割位點(diǎn)降解所述淀粉樣(3肽，其中M是延長所述融合蛋 白的半衰期的蛋白質(zhì)成分，A是切割淀粉樣p肽的蛋白質(zhì)成分，其中 所述M蛋白質(zhì)成分共價(jià)地連接到A蛋白質(zhì)成分的N-末端部分。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是蛋白酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是人類中性溶 酶(Neprilysin )。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是人類中性溶 酶，其中所述中性溶酶是細(xì)胞外的中性溶酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是細(xì)胞外的中 性溶酶，包含根據(jù)SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一個(gè)的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是胰島素降解
酶o
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是內(nèi)皮素 (endothelin)轉(zhuǎn)化酶1
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中A是支架蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是抗體的Fc 部分。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是IgG抗體。在這個(gè) 方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是IgG2抗體。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是細(xì)胞外的中性溶酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，包含根據(jù)SEQIDNO: 11的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是胰島素降解酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，包含根據(jù)SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶l。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，包含根據(jù)SEQIDNO: 13的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M選自PEG化 和糖基化。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，，提供了融合蛋白，其中M是抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中M和A用接頭L 連接在一起。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合蛋白，其中L選自肽和化學(xué) 接頭。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了降低淀粉樣P肽濃度的方法，所 述方法包括施用根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式 中，在血漿中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣(3肽的降低。在這個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施 方式中，在CSF中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣|3肽的降低。在這個(gè)方面的又一個(gè) 實(shí)施方式中，在CNS中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣(5肽的降低。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了能夠降解淀粉樣(3肽的藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受量的根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的 栽體或賦形劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了預(yù)防和/或治療狀況的方法，在所 述狀況中淀粉樣P肽的降解是有益的，包括向需要這樣的預(yù)防和/或治 療的哺乳動(dòng)物，包括人類施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。
在本發(fā)明的另 一 個(gè)方面，提供了預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病、 系統(tǒng)性淀粉樣變性或腦淀粉樣血管病的方法，包括向需要這樣的預(yù)防 和/或治療的哺乳動(dòng)物，包括人類施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的融合 蛋白。
在本發(fā)明的另 一個(gè)方面，提供了用于在醫(yī)學(xué)治療中的根據(jù)本發(fā)明 的融合蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的融合蛋白在藥物的制造
中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療其中淀粉樣|3肽的降解是有益 的的狀況。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的融合蛋白在藥物的制造 中的用途，所述藥物用于阿爾茨海默氏病，系統(tǒng)性淀粉樣變性或腦淀 粉樣血管病的預(yù)防和/或治療。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥 物降低淀粉樣(3肽濃度。在血漿、CSF和/或CNS中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣 (3肽的降低。
在整個(gè)說明書中使用的術(shù)語如下定義，除非在特定的情況中另外 限定了。
術(shù)語"調(diào)節(jié)物"是指防止降解和/或提高血漿半衰期、降低毒性、降 低免疫原性、或提高治療蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的分子。示范性的調(diào)節(jié) 物包括Fc結(jié)構(gòu)域以及線型聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚賴氨 酸、葡聚糖，等等)；支鏈的聚合物(參見，例如，美國專利NO. 4，289，872,美國專利NO. 5,229,490; W093/21259);脂質(zhì)；膽固醇 基團(tuán)(例如類固醇)；碳水化物或低聚糖；或結(jié)合補(bǔ)救受體(salvage receptor)的任何天然的或合成的蛋白質(zhì)、多肽或肽。糖基化也是調(diào)節(jié) 物的實(shí)例，其通過融合蛋白的大小的提高可以延長血漿半衰期，主要 是由于清除機(jī)制方面的改變。調(diào)節(jié)物還可以包括人血清白蛋白(HSA) 結(jié)合成分，從而其延長融合蛋白的血漿半衰期。
術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"蛋白質(zhì)成分"是指具有催化活性的分子，其通過在氨基酸序列中任何可能的位點(diǎn)蛋白水解切割來降解淀粉樣(3肽。蛋
化性抗體也可以用作蛋白質(zhì)部分。蛋白質(zhì)可以是來自任何物種(例如， 人類、猴、小鼠)的天然存在的變體，或利用合理設(shè)計(jì)或分子進(jìn)化技 術(shù)設(shè)計(jì)的變體。蛋白質(zhì)分子還可以是不同的多態(tài)性或剪接變體。蛋白
是，蛋白;可以是中性;i酶的改進(jìn)的變體，其通過氨基酸替換在結(jié)構(gòu) 中被修飾來獲得改進(jìn)的性質(zhì)，例如提高的活性、改進(jìn)的針對(duì)淀粉樣p
長的活性。
術(shù)語"融合物"是指由調(diào)節(jié)物分子和蛋白質(zhì)分子組成的分子。調(diào)節(jié) 物可以共價(jià)連接到蛋白質(zhì)部分來產(chǎn)生融合蛋白。非共價(jià)的方法也可以 用于將蛋白質(zhì)連接到調(diào)節(jié)物部分。
術(shù)語"降解(degrade) 、 (degrading)或(degradation)，，是指一 種起始分子被分成兩個(gè)或更多個(gè)分子的過程。更具體地，淀粉樣(3肽 (從氨基酸1 -43到更小的任何大小)被切割來產(chǎn)生與起始分子相比更 小的片段。切割可以通過肽鍵的水解作用或其他類型的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，
其將分子切割成更小的部分。
術(shù)語"天然Fc"是指包含產(chǎn)自完整抗體消化的非抗原結(jié)合片段的 序列的分子或序列，無論是單體還是多聚體形式。天然Fc的原始的 免疫球蛋白來源可以是人類來源，并且可以是任何免疫球蛋白，而 IgGl和1gG2是優(yōu)選的。天然Fc's由通過共價(jià)(即，二硫鍵)和非共 價(jià)締合連接成二聚或多聚形式的單體多肽構(gòu)成。天然Fc分子的單體 亞基之間分子間二硫鍵的數(shù)量取決于類(例如，IgG、 IgA、 IgE)或 亞類(例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgAl、 IgGA2) 乂人1到4個(gè)。天然 Fc的一個(gè)實(shí)例是產(chǎn)自IgG的木瓜蛋白酶消化的二疏鍵鍵合的二聚體 (參見Ellison等(1982 ) ， M/c/e!c ^c/心10:4071-9)。在此使 用的術(shù)語"天然Fc"對(duì)于單體、二聚體和多聚體形式是通用的。
術(shù)語"Fc變體"是指從天然Fc修飾但仍然包含補(bǔ)救受體FcRn的結(jié) 合位點(diǎn)的分子或序列。公開文獻(xiàn)WO 97/34631和WO 96/32478描述了 示范性的Fc變體，以及與補(bǔ)救受體的相互作用，通過引用合并在此。 因而，術(shù)語"Fc變體"包含從非人類天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被移除的位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兲峁┍景l(fā)明的融合物 分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物學(xué)活性。因而，術(shù)語"Fc變體"包括缺少 一個(gè)或更多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基的分子或序列，所述位點(diǎn)或殘基影 響或涉及(1 ) 二硫鍵形成，(2)與選定宿主細(xì)胞的不相容性，(3) 在選定宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的N-末端異質(zhì)性，(4)糖基化，(5)與補(bǔ) 體的相互作用，(6)結(jié)合除補(bǔ)救受體外的Fc受體，或(7)抗體依 賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC) 。 Fc變體在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述了 。
術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"包含上文定義的天然Fc和Fc變體分子和序列。 對(duì)于Fc變體和天然Fc，術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"包括單體或多聚體形式的分 子，不論是從完整抗體消化的還是通過其他方式產(chǎn)生的。
術(shù)語"藥理學(xué)活性"是指這樣描述的物質(zhì)被測定具有影響醫(yī)藥參數(shù) (例如，血壓、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、膽固醇水平)或疾病狀態(tài)(例如，癌癥、 自體免疫病癥、癡呆)的活性。
術(shù)語"淀粉樣P肽"、"A卩肽"或"淀粉樣(3肽"是指與人類A卩A4蛋白
質(zhì)[前體]中相應(yīng)于序列中氨基酸672-714(氨基酸1-43 )的氨基酸序列(單
字母編碼)DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIAT相
關(guān)的任何形式的肽。它還包括這個(gè)肽的任何較短的形式，例如1-38、
1_40和1-42，但不限于這些形式。此外，淀粉樣|3肽具有幾種天然存
在的形式。人類形式的淀粉樣(3肽被稱為Ap39、 AP40、 AP41、 A|342
和A(343。這些肽的序列和它們與APP前體的關(guān)系由Hardy等，TINS
20, 155-158 ( 1997 )的附圖1說明了 。例如，A卩42具有序列: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His國His-Gln-Lys-Leu-Val-
Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-
Val-Val-Ile-Ala-OH 。 A卩41、 A卩40和A卩39不同于A卩42在分別從C-末 端省略了 Ala、 Ala-lle和Ala-Ile-Val。 A卩43不同于A卩42在于C-末
端的蘇氨酸殘基的存在?？偟恼f來，淀粉樣P肽是指涉及引起阿爾茨 海默氏病的斑塊形成的肽形式。
術(shù)語"半衰期"被定義為從血漿中去除融合蛋白的一半初始濃度所 需的時(shí)間。本發(fā)明描迷了調(diào)節(jié)血漿中的半衰期的途徑。這樣的修飾可 以產(chǎn)生具有改進(jìn)的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(例如，體內(nèi)血清半衰期提高)的 融合蛋白。延長半衰期是指需要更長的時(shí)間來從血漿中除去或清除一 半的初始濃度的融合蛋白。藥物或化學(xué)化合物的半衰期是本領(lǐng)域明確定義的和已知的。
術(shù)語"連接"是指兩個(gè)或更多個(gè)部分之間共價(jià)的或可逆的連接。共 價(jià)連接可以是例如肽鍵、二硫鍵、碳-碳偶聯(lián)或任何類型的基于原子之 間的共價(jià)連接的連接?？赡娴倪B接可以是例如生物素-鏈霉抗生物素蛋 白、抗體-抗原或被分類為本領(lǐng)域已知的可逆連接的連接。例如，當(dāng)融 合蛋白的蛋白質(zhì)部分和調(diào)節(jié)物部分以重組形式從同一質(zhì)粒產(chǎn)生時(shí)，直
接獲得共價(jià)連接，因而連接是在DNA水平上設(shè)計(jì)的。
術(shù)語"共價(jià)連接"的是指之間共有電子的兩個(gè)原子之間的化學(xué)連 接。共價(jià)連接的鍵的實(shí)例有肽鍵、二疏鍵、碳-碳偶聯(lián)。融合蛋白可以 通過多肽鍵連接在一起，其中連接可以在產(chǎn)生融合蛋白時(shí)核糖體上的 翻譯加工期間實(shí)現(xiàn)。其他類型的共價(jià)連接的成分可以用PEG化試劑修 飾，所述PEG化試劑共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的氨基殘基(例如，賴氨酸) 上。例如，化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)可以是酰化或?qū)蓚€(gè)成分連接成融合蛋白的 其他適合的偶聯(lián)反應(yīng)。共價(jià)連接也可以是指調(diào)節(jié)物與蛋白質(zhì)部分連接 在一起的兩個(gè)位點(diǎn)處接頭的連接。
術(shù)語"切割位點(diǎn)"是指肽序列中可以被蛋白質(zhì)或酶切割的特定位置 /位點(diǎn)。切割通常通過連接兩個(gè)氨基酸的肽鍵的水解作用產(chǎn)生。切割也 可以利用單一的或組合的蛋白質(zhì)或酶在相同肽的多個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生。切割
位點(diǎn)也可以是肽鍵以外的其他位點(diǎn)。本發(fā)明詳細(xì)描述了淀粉樣P肽的 切割。
術(shù)語"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"是指以治療相關(guān)的親和力結(jié)合淀粉樣p肽的分 子。這些分子以大于或等于約106、 107、 108、 109或101Q M"的結(jié)合 親和力結(jié)合淀粉樣P肽。典型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是，但不限于，抗體(例 如，F(xiàn)ab、 scFv、單結(jié)構(gòu)域，都包括CDR區(qū)域)、本發(fā)明中和文獻(xiàn)中 描述的支架蛋白、以及合成產(chǎn)生的具有對(duì)淀粉樣|3肽的親和力的分子。
術(shù)語"蛋白酶"是作用于肽鍵的水解作用的任何蛋白質(zhì)分子。它包 括天然存在的蛋白水解酶，以及通過定點(diǎn)或隨機(jī)誘變或任何其他蛋白 質(zhì)工程方法獲得的其變體，蛋白水解酶的任何片段，或包含前述蛋白 質(zhì)之一的任何分子復(fù)合物或融合蛋白。蛋白酶可以是絲氨酸、半胱氨 酸、天冬氨酸或金屬蛋白酶。
術(shù)語"底物"或"肽底物"是指任何氨基酸組成、序列或長度、含有 可被蛋白酶催化水解的肽鍵的任何肽、寡肽或蛋白質(zhì)分子。被水解的
16肽鍵稱為"切割位點(diǎn)"。底物內(nèi)位置的編號(hào)根據(jù)Schlechter & Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967 ) 157-162)介紹的系統(tǒng) 進(jìn)行。鄰近切割位點(diǎn)的N-末端的氨基酸殘基被編號(hào)為Pl、 P2、 P3等 等，而鄰近切割位點(diǎn)C-末端的殘基被編號(hào)為Pl'、 P2'、 P3'，等等。本 發(fā)明的底物或肽底物是淀粉樣(3肽。
術(shù)語"特異性"是指蛋白質(zhì)或蛋白酶有選擇地識(shí)別和水解某些肽底 物而其他保持不被切割的能力。特異性可以定性地和定量地表示。"定 性的特異性"是指在肽底物的某些位置處蛋白酶接受的氨基酸殘基的 種類。僅接受所有可能的肽底物的小部分的蛋白酶具有"高特異性"。 接受幾乎任何肽底物的蛋白酶具有"低特異性"。具有非常低特異性的 蛋白酶還被稱為"非特異性蛋白酶"。
術(shù)語"演化的(evolved)蛋白酶"描述了利用隨機(jī)PCR、 DNA改 組或在DNA/RNA水平上產(chǎn)生多樣性的其他類型的方法獲得的任何蛋 白酶。描述這些方法的文獻(xiàn)例如D,A. Drummond, B.L. Iverson， G. Georgiou and F.H. Arnold, Journal of Molecular Biology 350: 806—816 (2005 )和S. McQ and D.S， Tawfik， Biochemistry 44: 5444-5452 (2005 )。在產(chǎn)生的多樣性之中進(jìn)行篩選和選擇的各種方法也在文獻(xiàn) 中描述了 (例如，Directed Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods ( Methods in Molecular Biology ) Editors: Frances H Arnold and George Georgiou. Volume 230， 2003及其參考文獻(xiàn))。各種策略可以 用于選擇性質(zhì)如提高的穩(wěn)定性、提高的活性、改善的選擇性、以及被 已知和未知抑制物降低的抑制作用。
術(shù)語"改進(jìn)的蛋白酶"描述了如果需要、具有更高催化活性的任何 蛋白酶變體。然而，在某些情況下更低的催化活性可能是優(yōu)選的。改 進(jìn)的蛋白酶還可以指與原始蛋白酶相比，相較于另一種底物，更有效 地切割某種底物的變體。改進(jìn)的是指更優(yōu)選的性質(zhì)，例如催化活性和 /或選擇性，來獲得更優(yōu)化的藥物化合物。改進(jìn)的蛋白酶還可以指具有 在例如血漿(體內(nèi)或體外或兩者)中提高的穩(wěn)定性的變體。改進(jìn)的蛋 白酶還可以指具有在例如血漿(體內(nèi)或體外或兩者)中降低的失活的 變體。降低的失活可以通過降低蛋白酶的蛋白水解降解而完成，這是 由于改變的氨基酸序列較不易于被切割。降低的蛋白水解降解還可以 通過用例如PEG化和/或糖基化修飾蛋白質(zhì)表面來保護(hù)蛋白質(zhì)免于切割而完成。降低的失活還可以通過降低已知或未知抑制物的蛋白酶抑 制作用而完成。未知的血漿抑制物的降低的抑制作用可以通過直接篩 選具有在血漿中蛋白酶活性的抑制作用降低的變體而完成。
術(shù)語"人類中性溶酶"是指任何天然形式的人類中性溶酶。這包括 人類群體中天然存在的所有剪接和多態(tài)性變體。本發(fā)明中描述了人類
中性溶酶的許多形式(SEQIDNO: l到4)。該術(shù)語還包括人類中性 溶酶的片段或延長的變體，以及人類中性溶酶的改進(jìn)的變體，如"改 進(jìn)的蛋白酶"中所描述的。
術(shù)語"支架蛋白質(zhì)"描述了結(jié)合淀粉樣(3肽的任何蛋白質(zhì)。支架蛋 白質(zhì)的實(shí)例有淀粉酶抑肽(tendamistat) 、 affibody、 anticalin和錨蛋 白(ankyrin)。這些支架蛋白質(zhì)一般被設(shè)計(jì)并基于剛性的核心結(jié)構(gòu)， 以及可以被隨機(jī)化用于結(jié)合物的鑒定的部分、環(huán)、表面或腔。這些支
架蛋白質(zhì)是文獻(xiàn)中很好地描述的。
本發(fā)明表明了使用優(yōu)化的重組Ap降解酶通過降低A(3的腦水平抑 制淀粉樣斑塊形成的可能性。結(jié)果，淀粉樣斑塊相關(guān)的星形膠質(zhì)增生 也將被降低。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，治療化合物是完全人類來源的。融合蛋白 全部由人類蛋白質(zhì)組成，其利用具有最低可能的免疫原性活性的接頭 來連接在一起。
相對(duì)于結(jié)合分子如抗體，利用降解酶的優(yōu)點(diǎn)是
與結(jié)合方法相比，使用淀粉樣|3肽的酶的降解將直接除 去毒性效應(yīng)，結(jié)合方法中淀粉樣p肽的濃度可能潛在地提高，如 果與淀粉樣卩肽復(fù)合的結(jié)合分子沒有被足夠快速地清除。如果淀 粉樣P肽濃度在外周提高這可能是特別有害的，。
淀粉樣P肽的催化降解將比結(jié)合更有效地除去肽。僅僅 催化量的降解酶是除去足夠淀粉樣P肽所必需的，而結(jié)合分子如 抗體為了治療效果需要化學(xué)計(jì)量的量。這將對(duì)治療處理所需的量 有很大影響。
如果結(jié)合分子是抗體并且穿越BBB容許結(jié)合斑塊中的淀 粉樣P肽，有害的潛在免疫學(xué)反應(yīng)是有可能的。另一方面，催化 性的融合蛋白將不結(jié)合斑塊和利用Fc反應(yīng)性，而僅僅降低淀粉 樣f3肽的游離濃度。因而，催化酶將僅降解淀粉樣P肽的游離庫。結(jié)合試劑如抗體可能潛在地進(jìn)入CNS，并通過Fc活性溶解斑塊。 如果大量的淀粉樣p肽被釋放到斑塊的附近這可能是不利的，并 且它們對(duì)細(xì)胞是有毒的。
在A卩分解代謝中的一種重要的酶是中性溶酶，也稱為中性內(nèi)肽 酶畫24.11或NEP。 Iwata等人(Nature Medicine, 6: 143-149， 2000) 顯示了， APM2肽通過由生物化學(xué)分析相似或相同于中性溶酶的NEP 介導(dǎo)的有限的蛋白水解作用經(jīng)歷完全的降解。 一致地，NEP抑制物輸
注引起了腦中內(nèi)源A(342的生物化學(xué)的和病理學(xué)的沉積。發(fā)現(xiàn)的是，這
種NEP催化的蛋白水解作用因而限制了 AP42分解代謝的速率。
NEP是涉及幾種生物學(xué)活性肽包括腦啡肽、速激肽、舒緩激肽、 內(nèi)皮素和心房鈉尿肽的滅活的94kD， 二型膜結(jié)合Zn金屬肽酶。NEP 存在于CNS的肽能神經(jīng)元中，它在腦中的表達(dá)以細(xì)胞特異性的方式 被調(diào)節(jié)(Roques B. P.等，尸/mrwflco/. / ev, 45， 87-146， 1993; Lu B.等， ￡^/7, A/e《181， 2271-2275， 1995; Lu B,等，^"". Mr.780, 156-163， 1996 )。雖然2型NEP轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不存在于CNS中，1型和 3型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別定位于神經(jīng)元中和胼胝體的少突膠質(zhì)細(xì)胞中(Li C. 等，丄5/o/. CTiew. 270， 5723-5728， 1995 )。蛋白酶和內(nèi)肽酶的中性 溶酶家族包括NEP的結(jié)構(gòu)上或功能上同源的成員，例如近來描述的 NEP II基因和它的同種型(Ouimet T.等，肌oc/iew. 'o; ^s. Co畫w". 271:565-570， 2000),其以與NEP互補(bǔ)的模式在CNS中表 達(dá)。這個(gè)家族的另一成員是NL-1 (中性溶酶樣1 )， 一種被NEP抑 制物膦酰二肽有效地抑制的可溶蛋白質(zhì)(GhaddarG.等，丄 347: 419-429， 2000)。
還已經(jīng)描述了已知分解代謝AP的其他酶。鋅金屬肽酶胰島素降 解酶(IDE, EC. 3.4.22.11 )將A(3mo和ApM2切割成看起來無害的產(chǎn) 物。IDE是真正的肽酶；它不水解蛋白質(zhì)。該酶在體外切割有限數(shù)量 的肽，包括胰島素和胰島素相關(guān)肽、卩內(nèi)啡肽和A卩肽。IDE被暗示是 生理學(xué)的Ap代謝酶之一 (W. Q. Qui等(1998 ) 5/o/. CViem. 273， 32730-32738 ) 。 Kurichkin和Goto ( I. V. Kurochkin and S. Gato ( 1994 ) 345， 33-37 )首先報(bào)道了胰島素降解酶可以水解A(3mo。這 個(gè)發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)獨(dú)立的研究中被證實(shí)(W. Q. Qui等(1998 U S/o/. C/ie/n. 273, 32730-32738; and J， R. McDermott and A. M. Gibson ( 1997 )A^wrocAew./ 仏22， 49-56)。此外， 一種近來被鑒定為A卩降解酶的 金屬蛋白酶24.15 ( Yamin R.等，/ CTiew. 274, 18777-18784， 1999 )也不響應(yīng)于A卩注射而改變。血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)， 一 種不相關(guān)的神經(jīng)元Zn金屬內(nèi)肽酶也被提及作為可能的A(3肽降解酶 (Barnes N. M.等，尸Aarm"co/. 200， 289-292,1991; Alvarez R. 等,《/. jVewro/. jVewroi^rg.尸57c/j/a^y 67, 733-736， 1999; Amouyel P.等， A^Uca乂 <SW. 903， 437-441， 2000),具有對(duì)A(3的未知的親和 力(McDermott J. R. and Gibson A. M,， A^歸cA亂22， 49-56, 1997 )。組織蛋白酶B ( CatB )也顯示了降解A卩肽(Neuron. 2006 Sep 21; 51 ( 6 ) :703-14 )。
來自中性溶酶的使用的序列可以是蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部分。細(xì)胞外 的部分被定義為被確定為膜區(qū)域之外的中性溶酶的部分。本發(fā)明還包 括中性溶酶的完整序列作為淀粉樣|3肽降解成分的用途。本發(fā)明還包 括中性溶酶的較小的片段，只要相對(duì)于淀粉樣(3肽的催化活性被保留。 本發(fā)明還包括中性溶酶的任何多態(tài)性變體和剪接變體。本發(fā)明還包括 中性溶酶的任何改進(jìn)的變體。
本發(fā)明描述了新的和可選擇的策略來在它們形成淀粉樣斑塊之 前水解A(3肽，或至少防止現(xiàn)有斑塊的進(jìn)一步發(fā)展。還可能的是通過 水解與游離A(3肽平衡的任何斑塊衍生的AP肽來除去現(xiàn)有的斑塊。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及由以高親和力結(jié)合淀粉樣P肽的部 分組成的分子。這種親和力在結(jié)合結(jié)合親和力上低于微摩爾。對(duì)淀粉 樣P肽的結(jié)合親和力優(yōu)選的在結(jié)合親和力上是處在納摩爾的。涉及與
一個(gè)或更
多個(gè)位點(diǎn)切割淀粉樣|3肽的活性成分。將都識(shí)別淀粉樣p肽的催化活 性部分與結(jié)合部分組合在一起的原因是，結(jié)合部分結(jié)合淀粉樣(3肽， 從而提高局部濃度(結(jié)合部分和催化部分)，結(jié)合到淀粉樣p肽的解 離的形式。某一些特異性地結(jié)合解離的形式而不結(jié)合聚集的形式。某 一些結(jié)合聚集和解離的形式。某些這樣的抗體結(jié)合淀粉樣(3肽的天然 存在的A(3短形式(即，共價(jià)地或以其他方式連接在一起)以被活性 部分切割，所述活性部分由于雙官能分子中工程化的連接而在局部附
過有或者沒有接頭成分的血漿半衰期調(diào)節(jié)物成分來介導(dǎo)。、 '在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，治療試劑包括特異性結(jié)合淀粉樣P 肽或淀粉樣斑塊的其他成分的融合蛋白。這樣的化合物可以是單克隆
的或多克隆的或任何其他淀粉樣(3肽結(jié)合試劑的部分。這些化合物以 大于或等于約106、 107、 108、 109或101Q M"的結(jié)合親和力結(jié)合淀粉 樣(3肽。這些結(jié)合成分優(yōu)選的與淀粉樣卩肽降解成分連接。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及抗體的"Fc"結(jié)構(gòu)域與融合蛋白中淀粉樣|3 肽降解成分的組合?？贵w包含兩個(gè)功能上獨(dú)立的部分，稱為"Fab"的可 變區(qū)，其結(jié)合抗原，稱為"Fc"的恒定區(qū)，其涉及效應(yīng)物功能如補(bǔ)體激 活和吞噬細(xì)胞的攻擊。Fc具有長血清半衰期，而Fab是短壽的(C叩on 等(1989) , Nature 337: 525-31 )。當(dāng)與治療蛋白質(zhì)構(gòu)建在一起時(shí)， Fc結(jié)構(gòu)域可以提供更長的半衰期，或包括這些功能如Fc受體結(jié)合、 蛋白A結(jié)合、補(bǔ)體固定和可能甚至胎盤的轉(zhuǎn)移。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的分子是Fc連接的淀粉樣p肽降解蛋白質(zhì)， 例如NEP-相關(guān)蛋白質(zhì)。
在標(biāo)題為"Modified Peptides as Therapeutic Agents"( WO99/25044 ) 的公開文獻(xiàn)中詳細(xì)討論了通過與抗體的Fc結(jié)構(gòu)域融合的蛋白質(zhì)治療 試劑的有用的修飾。該公開文獻(xiàn)討論了連接到"栽體"例如PEG、葡聚 糖或Fc結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了連接到Fc結(jié)構(gòu)域的C-末端部分 作為可能的方法(Protein Eng. 1998 11:495-500)。這容許融合蛋白的 蛋白質(zhì)部分上N-末端連接。本發(fā)明描述了利用這種策略獲得具有體內(nèi) 效力的優(yōu)化性質(zhì)的融合蛋白的這種方法和有益效果。
IgG分子與特異于抗體的IgG類的三類Fc受體(FcR)相互作用， 即，F(xiàn)cyRI、 FcyRII和Fc丫RIII。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，融合蛋白的免 疫球蛋白(Ig)成分具有IgG的恒定區(qū)的至少一部分，其具有對(duì)FcyRI、 FcyRII或FcyRIII的至少一種的低結(jié)合親和力。在本發(fā)明的一個(gè)方面， Fc受體的融合蛋白的結(jié)合親和力通過使用重鏈同種型作為融合物配 偶體來降低，所述重鏈同種型具有對(duì)細(xì)胞上Fc受體的降低的結(jié)合親 和力。例如，人類IgGl和IgG3已經(jīng)被報(bào)道以高親和力結(jié)合FcRyI， 而IgG4的結(jié)合性是十分之一，IgG2根本不結(jié)合。對(duì)于IgG與Fc受體 的結(jié)合的重要序列已經(jīng)被報(bào)道位于CH2結(jié)構(gòu)域中。因而，在優(yōu)選的實(shí) 施方式中，具有增強(qiáng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期的、基于抗體的融合蛋白通過 將IgG2或IgG4的至少CH2結(jié)構(gòu)域連接到第二非免疫球蛋白蛋白質(zhì)來獲得。例如，在四種已知的IgG同種型中，IgGl(Cyl )和IgG3(Cy3) 已知以高親和力結(jié)合FcRyI，而IgG4 ( Cy4 )的結(jié)合親和力是十分之 一，IgG2 (Cy2)不結(jié)合FcR丫I。
在一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白的Aj3肽降解成分是酶。術(shù)語"酶" 在此使用來描述蛋白質(zhì)、其類似物、和其片段，其作為蛋白酶或肽酶 是有活性的。優(yōu)選的，酶包括絲氨酸、天冬氨酸、金屬和半胱氨酸蛋 白酶。優(yōu)選的，本發(fā)明的融合蛋白顯示酶的生物學(xué)活性。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域選自IgG的Fc結(jié)構(gòu)域、 IgG的重鏈以及IgG的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白中抗體 的恒定區(qū)將是人類來源的，屬于來自免疫球蛋白的IgG類的免疫球蛋 白家族，特別是來自類IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4，優(yōu)選的來自類IgG2 或IgG4。做為選擇還可能的是使用屬于來自其他哺乳動(dòng)物的IgG類的 免疫球蛋白的恒定區(qū)，特別是來自嚙齒動(dòng)物或靈長類；然而還可能的 是，根椐本發(fā)明的，使用免疫球蛋白類IgD、 IgM、 IgA或IgE的恒定 區(qū)。 一般地，存在于根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體中的抗體片段將包含F(xiàn)c結(jié) 構(gòu)域CH3或其部分，以及Fc結(jié)構(gòu)域CH2的至少一個(gè)部分片段。做為 選擇，還可能的是設(shè)想根椐本發(fā)明的融合構(gòu)建體，其含有CH3結(jié)構(gòu)域 和絞鏈區(qū)作為成分(A)用于二聚化。
然而，還可能的是使用在天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白序列的衍 生物，特別是含有至少一個(gè)替換、缺失和/或插入的那些變體(在此組 合到術(shù)語"變體"下)。一般地，這樣的變體具有與天然序列的至少90%、 優(yōu)選的至少95%、更優(yōu)選的至少98%的序列同一性。在這種情境中特 別優(yōu)選的變體是替換變體，其一般含有與相應(yīng)的天然序列相比低于10 個(gè)、優(yōu)選的低于5個(gè)、非常特別優(yōu)選的低于3個(gè)的替換。注意的是以 下的替換可能性是優(yōu)選的用Met、 Val、 Leu、 Ile、 Phe、 His或Tyr 替換Trp,或反之亦然；用Ser、 Thr、 Gly、 Val、 lie或Leu替換Ala， 或反之亦然；用Gln、 Asp或Asn替換Glu，或反之亦然；用Glu、 Gln 或Asn替換Asp，或反之亦然；用Lys替換Arg，或反之亦然；用Thr、 Ala、 Val或Cys替換Ser,或反之亦然；用His、 Phe或Trp替換Tyr, 或反之亦然；用其他19個(gè)天然氨基酸之一替換Gly或Pro,或反之亦 然。
可溶的受體-IgG融合蛋白是常見的免疫學(xué)試劑，它們的構(gòu)建方法
22是本領(lǐng)域已知的(參見，例如美國專利NO. 5，225，538 )。功能性淀粉 樣卩肽降解結(jié)構(gòu)域可以融合到來自免疫球蛋白類或亞類的免疫球蛋白 Fc結(jié)構(gòu)域。屬于不同Ig類或亞類的抗體的Fc結(jié)構(gòu)域可以活化各種二 級(jí)效應(yīng)物功能。當(dāng)Fc結(jié)構(gòu)域被相關(guān)的Fc受體結(jié)合時(shí)發(fā)生活化。二級(jí) 效應(yīng)物功能包括活化補(bǔ)體系統(tǒng)、跨越胎盤、以及結(jié)合各種微生物蛋白 質(zhì)的能力。不同類和亞類的免疫球蛋白的性質(zhì)在Roitt等， Immunology, p. 4.8 ( Mosby-Year Book Europe Ltd., 3d ed. 1993 )中 描述了?？乖Y(jié)合IgGl、 IgG3和IgM抗體的Fc結(jié)構(gòu)域可以活化補(bǔ)體 酶級(jí)聯(lián)。IgG2的Fc結(jié)構(gòu)域看起來是較低效果的，IgG4、 IgA、 IgD和 IgE的Fc結(jié)構(gòu)域在活化補(bǔ)體方面無效。因而人們可以根據(jù)它們相關(guān)的 二級(jí)效應(yīng)物功能對(duì)于特定的免疫反應(yīng)或用所述淀粉樣|3肽降解-Fc融 合蛋白治療的疾病是否是希望的來選擇Fc結(jié)構(gòu)域。如果損害或殺傷 目標(biāo)細(xì)胞是有益的，人們可以選擇特別活性的Fc結(jié)構(gòu)域UgGl )來 制造淀粉樣p肽降解-Fc融合蛋白。做為選擇，如果希望的是產(chǎn)生不 觸發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)的淀粉樣(3肽降解-Fc融合物，可以選擇無活性的IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明描述了融合蛋白，其具有與Fc部分而不是直接結(jié) 合成分連接的催化成分。這意味著來自Fc的效果和活性將是有限的， 因?yàn)樵S多Fc效應(yīng)是通過結(jié)合介導(dǎo)的。例如，補(bǔ)體激活取決于結(jié)合和 網(wǎng)絡(luò)的形成。
免疫球蛋白片段，根椐本發(fā)明的融合物構(gòu)建體的C-末端一般地、 而不是必然地含有催化和調(diào)節(jié)部分之間的過渡區(qū)域，所述過渡區(qū)域可 以再含有接頭序列，該接頭序列優(yōu)選的是肽序列。這種肽序列可以具
有1直到70個(gè)氨基酸之間的長度，在合適時(shí)甚至更多的氨基酸，優(yōu) 選的10到50個(gè)氨基酸，特別優(yōu)逸的12到30個(gè)氨基酸之間。過渡序 列的接頭區(qū)域可以側(cè)翼是另外的短肽序列，其可以例如，相應(yīng)于DNA 限制性切割位點(diǎn)。分子生物學(xué)的熟練技術(shù)人員熟悉的任何限制性切割 位點(diǎn)可以用于這種連接中。適合的接頭序列優(yōu)選的是人工序列，其含 有高數(shù)量的脯氨酸殘基(例如，在接頭區(qū)域中每兩個(gè)位置上)，除此 之外，優(yōu)選的具有總體上的親水性特征。由至少30%脯氨酸殘基組成 的接頭序列是優(yōu)選的。親水性特性可以優(yōu)選的通過具有正電荷的至少 一種氨基酸，例如賴氨酸或精氨酸，或具有負(fù)電荷的例如天冬氨酸或 谷氨酸來實(shí)現(xiàn)。總的說來，因而接頭區(qū)域還優(yōu)選地含有高數(shù)量的甘氨酸和/或脯氨酸殘基，以賦予所述接頭區(qū)域需要的柔性和/或剛性。
然而，天然的序列，例如位于細(xì)胞外、但直接作用細(xì)胞膜，即，
在細(xì)胞膜之前的，屬于NEP家族的配體的那些片段，也適合于用作接 頭，當(dāng)適當(dāng)時(shí)也在天然片段的替換、缺失或插入之后。這些片段優(yōu)選 的是細(xì)胞外跨膜區(qū)域之后的50 AA，或這前50AA的子片段。然而， 偏愛的是在于與相應(yīng)的天然人類序列具有至少85%序列同 一性的這 些片段，特別偏愛的是至少95%序列同一性，特別偏愛的是至少99% 序列同 一 性，以限制在根椐本發(fā)明的融合蛋白中的這些接頭區(qū)域的免 疫原性，并且不引發(fā)任何先天的體液防御反應(yīng)。在本發(fā)明的情境中， 接頭區(qū)域應(yīng)當(dāng)優(yōu)選的不具有任何免疫原性。
然而，作為對(duì)通過酰胺樣鍵連接到淀粉樣P肽降解成分和血漿半 衰期調(diào)節(jié)物成分的肽序列的替代，還可能的是使用具有非肽或偽肽 (pseudopeptide )特征的或基于非共價(jià)鍵的化合物。就此而論可以提 及的實(shí)例有，特別是，N-羥基琥珀酰亞胺酯和異雙功能接頭，例如 >1-琥珀酰亞胺基-3- ( 2-吡咬二疏代)丙酸酯(SPDP )或類似的交聯(lián)劑。
調(diào)節(jié)血漿半衰期的其他途徑是使用PEG化或提高分子量的其他 類型的修飾，例如糖基化。
如上所述，也可以使用聚合物調(diào)節(jié)物。附著作為調(diào)節(jié)物有用的化 學(xué)部分的各種方式是當(dāng)前可獲得的，參見，例如，標(biāo)題"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods"的專利申請(qǐng) W096/11953,通過引用完全合并在此。該P(yáng)CT公開文獻(xiàn)公開了水溶 性聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的N-末端的選擇性附著，等等。
優(yōu)選的聚合物調(diào)節(jié)物是聚乙二醇(PEG) 。 PEG基團(tuán)可以是任何 方便的分子量，可以是線型或分支的。PEG的平均分子量優(yōu)選的從約 2千道爾頓("kD")到約100 kDa，更優(yōu)選的從約5 kDa到約50kDa， 最優(yōu)選的從約5 kDa到約10 kDa。 PEG基團(tuán)一般經(jīng)由通過PEG部分 上的反應(yīng)基團(tuán)(例如，醛、氨基、硫醇或酯基)與化合物上的反應(yīng)基 團(tuán)(例如，醛、氨基或酯基)的?；蜻€原性烷基化附著于本發(fā)明的 化合物。
蛋白質(zhì)的PEG化的有用的策略由通過在溶液中形成共軛鍵來組 合蛋白質(zhì)和PEG部分組成，其各自具有針對(duì)對(duì)方相互反應(yīng)性的特定官 能度。蛋白質(zhì)可以用常規(guī)的重組表達(dá)技術(shù)制備。蛋白質(zhì)是在特定位點(diǎn)用合適的官能團(tuán)"預(yù)先活化的"。在與PEG部分反應(yīng)之前，純化前體并 完全表征。蛋白質(zhì)與PEG的連接通常在水相中發(fā)生，可以通過反相分 析HPLC容易地監(jiān)測。PEG化的蛋白質(zhì)可以通過制備型HPLC容易地 純化，通過分析性HPLC、氨基酸分析和激光解吸質(zhì)語法來表征。
多糖聚合物是可以用于蛋白質(zhì)修飾的另 一種水溶性聚合物。葡聚 糖是多糖聚合物，由主要通過al-6鍵連接的葡萄糖的各個(gè)亞基組成。 葡聚糖本身可以以多種分子量范圍獲得，在約1 kD到約70 kD的分 子量中是易于獲得的。作為單獨(dú)的調(diào)節(jié)物或與其他調(diào)節(jié)物(例如，F(xiàn)c) 組合，葡聚糖是本發(fā)明中使用的適合的水溶性聚合物，參見，例如 WO 96/1 1953和WO 96/05309。已經(jīng)報(bào)道了共軛到治療性或診斷性免 疫球蛋白的葡聚糖的用途；參見，例如，歐洲專利公開EP 0 315 456, 通過引用合并在此。約l kD到約20 kD的葡聚糖是優(yōu)選的，此時(shí)葡 聚糖用作根據(jù)本發(fā)明的栽體。
碳水化物(低聚糖)基團(tuán)可以方便地附著到蛋白質(zhì)中已知為糖基 化位點(diǎn)的位點(diǎn)。 一般地，O-連接的低聚糖被附著于絲氨酸(Ser)或蘇 氨酸(Thr)殘基，而N-連接的低聚糖附著于天冬酰胺(Asn)殘基， 此時(shí)它們是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除脯氨酸外 的任何氨基酸。X優(yōu)選的是除脯氨酸外的19種天然存在的氨基酸之 一 。N-連接的和O-連接的低聚糖的結(jié)構(gòu)和每種類型中發(fā)現(xiàn)的糖殘基是 不同的。通常在兩種中都發(fā)現(xiàn)的 一種類型的糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(稱 為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接的和O-連接的低聚糖的末端殘基， 憑借它的負(fù)電荷，可以為糖基化的化合物賦予酸性性質(zhì)。這樣的位點(diǎn) 可以摻入本發(fā)明的化合物的接頭中，優(yōu)選的在多肽化合物的重組生產(chǎn) 期間被細(xì)胞糖基化(例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO、 BHK、 COS中)。 然而，這些位點(diǎn)可以進(jìn)一步通過本領(lǐng)域已知的合成或半合成操作被糖 基化。適合于糖基化的氨基酸可以摻入調(diào)節(jié)物和蛋白質(zhì)部分中的特定 位點(diǎn)。用于工程化這些特定氨基酸的優(yōu)選的技術(shù)是定點(diǎn)誘變或可比較 的方法。其他可能的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K 氨酰殘基的羥基基團(tuán)的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，賴氨酸、精氨 酸和組氨酸側(cè)鏈的a-氨基的曱基化。Creighton, /Vo,ei7rr 5Vrw"w" 飾/ecw/e尸，eW^ ( W. H. Freeman & Co., San Francisco ) ， pp. 79-86 (1983 )。因而，淀粉樣p肽降解成分中的糖基化位點(diǎn)可以被工程化。例如，優(yōu)選地在中性溶酶結(jié)構(gòu)的表面上的殘基被修飾以容許糖基化。
中性溶酶的3D結(jié)構(gòu)是已知的，可以用于選擇適合的氨基酸替換，用 于導(dǎo)入糖基化和PEG化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)利用例如Asn-X-Ser/Thr序 列導(dǎo)入。對(duì)于PEG化，適合的表面暴露的氨基酸例如被替換為胱氨酸 殘基，用于PEG化成分的特異性和有效偶聯(lián)。
本發(fā)明的化合物也可以在DNA水平被改變?；衔锏娜魏尾糠?的DNA序列可以改變成與選定宿主細(xì)胞更相容的密碼子。對(duì)于優(yōu)選 的宿主細(xì)胞大腸桿菌(E.co//)，優(yōu)化的密碼子是本領(lǐng)域已知的。密碼 子可以被替換以消除限制性位點(diǎn)，或包括沉默的限制性位點(diǎn)，其可以 幫助DNA在選定的宿主細(xì)胞中的加工。栽體、接頭和肽DNA序列可 以被修飾以包括任何上述序列改變。
接頭任何"接頭"基團(tuán)是可選的。當(dāng)存在時(shí)，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)不是 關(guān)鍵的，因?yàn)樗饕洚?dāng)間隔區(qū)。接頭優(yōu)選的由通過肽鍵連接在一起 的氨基酸組成。因而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，接頭由通過肽鍵連接的 1到20個(gè)氨基酸組成，其中所述氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。 這些氨基酸的某些可以被糖基化，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員很好地理解 的。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1到20個(gè)氨基酸選自甘氨酸、丙 氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。再更優(yōu)選的，接頭大 部分由空間上無阻礙的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸組成。因而，優(yōu)選 的接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly) 4、 (Giy) 5)、聚(Gly-Ala )和 聚丙氨基酸。
蛋白酶的定量的特異性在大的范圍上變動(dòng)。存在著非常非特異性 的已知蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，其切割含有苯丙氨酸、纈氨酸或亮 氨酸殘基的所有多肽，或胰蛋白酶，其切割含有精氨酸或賴氨酸殘基 的所有多肽。另一方面，存在著已知的高度特異性蛋白酶，例如組織 型纖溶酶原激活物(t-PA),其僅在單個(gè)特異性序列處切割纖溶酶原。 具有高度底物特異性的蛋白酶在活生物體中蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)方面 起到重要作用。例如，多肽底物的特異性切割活化了前體蛋白質(zhì)或鈍 化活性的蛋白質(zhì)或酶，從而調(diào)節(jié)它們的功能。具有高度底物特異性的 幾種蛋白酶被用于醫(yī)藥應(yīng)用中。通過特異性多肽底物的切割活化或鈍 化的藥物的實(shí)例有，t-PA在急性心肌梗塞中的應(yīng)用，其活化纖溶酶原 來溶解纖維蛋白凝塊，或安克洛酶(Ancrod)在中風(fēng)中的應(yīng)用，其鈍
26化纖維蛋白原，從而降低血液粘度并增強(qiáng)它的輸送能力。t-PA是具有 人類血液調(diào)節(jié)中的必需活性的人類蛋白酶，安克洛酶是非人類蛋白 酶。它是從毒蛇紅口蝮蛇(JgA^&odo" Wiof/oWow")分離的，包含蛇 毒的主要成分。因而，存在著幾種具有治療可用性的非人類蛋白酶。 然而，它們的鑒定通常是高度偶然的。通過施用藥物治療疾病一般基 于所述藥物引發(fā)的分子機(jī)制，其活化或滅活患者身體中的特定蛋白質(zhì) 功能，所述蛋白質(zhì)是內(nèi)源蛋白質(zhì)或感染性微生物或病毒的蛋白質(zhì)。雖 然化學(xué)藥物對(duì)這些耙點(diǎn)的作用仍然難以理解或預(yù)測，蛋白質(zhì)藥物能夠 特異性識(shí)別數(shù)百萬其他蛋白質(zhì)中的這些目標(biāo)蛋白質(zhì)。具有識(shí)別其他蛋
白質(zhì)的固有可能性的蛋白質(zhì)的突出的實(shí)例是抗體、受體和蛋白酶。雖 然存在著巨大數(shù)量的潛在目標(biāo)蛋白質(zhì)，當(dāng)今僅非常少數(shù)的蛋白酶可用
于指向這些目標(biāo)蛋白質(zhì)。由于它們的蛋白質(zhì)分解活性，蛋白酶特別適 合于蛋白質(zhì)或肽目標(biāo)的滅活。當(dāng)僅考慮人類蛋白質(zhì)時(shí)，潛在目標(biāo)蛋白 質(zhì)的數(shù)量仍是巨大的。估計(jì)人類基因組包含30,000到100，000個(gè)基因， 每一個(gè)編碼不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)或肽的許多涉及人類疾病，因 而是潛在的藥物靶點(diǎn)。不大可能的是通過篩選天然分離物來找到具有 特定的定性特異性的蛋白酶。因而，需要優(yōu)化已知蛋白酶或其它支架 蛋白質(zhì)包括催化性抗體的催化選擇性。
用于已知特異性的蛋白酶的選擇系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，例如，來 自Smith等，Proc. Natl. Acad. SciUSA， Vol. 88 ( 1991 )。作為舉例， 所述系統(tǒng)包含酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4作為可選擇標(biāo)記，插入到GAL4中 的預(yù)定的和可切割的目標(biāo)序列，以及TEV蛋白酶。切割將DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域從轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域上分離，因而使得轉(zhuǎn)錄因子無活性。產(chǎn)生的 細(xì)胞代謝半乳糖的表型失能可以通過量熱分析或通過在自殺底物2-脫氧半乳糖上選擇來檢測。
進(jìn)一步的，選擇可以通過使用具有修飾的肽底物來進(jìn)行，所述修 飾例如基于如ACC的基團(tuán)的焚光部分，由Harris等人早先描述(US 2002/022243 )。
可以使用相同的或類似的方法來鑒定或產(chǎn)生本發(fā)明中描述的有 效的淀粉樣(3肽降解成分。工程化這種淀粉樣P肽降解成分的出發(fā)點(diǎn) 可以是具有對(duì)淀粉樣P肽的某些活性或根本沒有活性的酶。其他成分 可以是支架蛋白質(zhì)，其中特異性區(qū)域被隨機(jī)化來具有針對(duì)淀粉樣卩肽的活性。在文獻(xiàn)中描述了各種支架蛋白質(zhì)，其中支架結(jié)構(gòu)的一個(gè)部分 是核心結(jié)構(gòu)，其在相對(duì)固定的位置具有隨機(jī)化的部分來產(chǎn)生結(jié)合或活
性位點(diǎn)。具有針對(duì)淀粉樣(3肽的某些活性的酶可以是被描述降解淀粉 樣(3肽的天然的蛋白酶。例如，中性溶酶可以通過理論設(shè)計(jì)或更為隨 機(jī)的方法被工程化來變得作為淀粉樣|3肽降解成分更有效。
產(chǎn)生具有改變的序列特異性的蛋白水解酶的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)是原理 上已知的。它們可以通過它們的表達(dá)和選擇系統(tǒng)來分類。遺傳選擇是 指在生物體內(nèi)產(chǎn)生蛋白酶或任何其他蛋白質(zhì)，所述蛋白酶或任何其他 蛋白質(zhì)能夠切割前體蛋白質(zhì)，其轉(zhuǎn)而引起生產(chǎn)生物體的生長特性的改
性的^些。這種;i由Davis等人所報(bào)道(美國專利NO. 5258289)。 噬菌體系統(tǒng)的生產(chǎn)取決于噬菌體蛋白質(zhì)的切割，其在存在蛋白水解 酶，或能夠切割噬菌體蛋白質(zhì)的抗體的情況下被活化。選定的蛋白水 解酶、支架或抗體將具有切割氨基酸序列的能力，用于噬菌體生產(chǎn)的 活化。
解酶的系統(tǒng)。Iverson等人(WO 98/49286 )描述了用于在細(xì)胞的表面 上展示的膜結(jié)合蛋白酶的表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵元素是催化反應(yīng) 必須在細(xì)胞表面進(jìn)行，即，底物和產(chǎn)物必須與在表面上表達(dá)酶的細(xì)菌 保持相連。選擇系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例是利用在細(xì)胞表面表達(dá)活性蛋白質(zhì) 并且分選含有具有改善的性質(zhì)的變體的細(xì)胞的FACS分選 (Varadarajan等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 102, 6855( 2005 ))。 它們顯示了對(duì)蛋白酶切割位點(diǎn)的特異性方面三百萬倍的改變。
使用自分泌性蛋白酶產(chǎn)生具有改變的序列特異性的蛋白水解酶 的系統(tǒng)也是已知的。Duff等人(WO 98/11237 )描述了自分泌蛋白酶 的表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵元素是通過膜結(jié)合前體分子的自我蛋白 水解加工，催化反應(yīng)作用于蛋白酶本身，來從細(xì)胞膜將成熟蛋白酶釋 放到細(xì)胞外環(huán)境中。
Broad等人(WO 99/11801 )公開了適合于改變蛋白酶的特異性的 異源細(xì)胞系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含轉(zhuǎn)錄因子前體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子與膜 錨定結(jié)構(gòu)域經(jīng)由蛋白酶切割位點(diǎn)連接。在蛋白酶切割位點(diǎn)處通過蛋白 酶的切割釋放所述轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)而啟動(dòng)相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的目標(biāo)基因表達(dá)。改變特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由蛋白酶切割位點(diǎn)插入修飾的序列， 以及使蛋白酶經(jīng)歷誘變組成。
根據(jù)本發(fā)明，任何蛋白質(zhì)或肽可以直接使用或作為出發(fā)點(diǎn)來產(chǎn)生 適合的淀粉樣P肽降解成分。例如，根據(jù)本發(fā)明，任何蛋白酶可以用 作第一蛋白酶。優(yōu)選的，使用人類來源的任何蛋白質(zhì)或肽。如果使用 通常存在于人體中的天然蛋白質(zhì)或肽，最小可能性的改變是優(yōu)選的。 在某些方法中，具有不同的結(jié)合特異性和/或降解活性的兩種或更多融 合蛋白同時(shí)地施用，在這種情況下，施用的每種融合蛋白的劑量落入 所標(biāo)明的范圍內(nèi)。融合蛋白通常在多個(gè)時(shí)機(jī)施用。單次給藥之間的間 隔可以是，例如，每周、每月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不規(guī) 則的，通過測量患者的血漿中融合蛋白的血液水平來指示。在某些方
法中，劑量被調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)1-1000 ng/ml的血漿融合蛋白濃度，在某些 方法中25-300 pg/ml。同樣在某些方法中，劑量被調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn) l-1000ng/ml的血漿融合蛋白濃度，在某些方法中25-300 ng/ml。做為 選擇，融合蛋白可以施用作為持續(xù)釋放制劑，在這種情況下需要較低 頻率的施用。劑量和頻率取決于患者中融合蛋白的半衰期而變化。一 般地，具有Fc部分的融合蛋白顯示了長半衰期。施用的劑量和頻率 可以取決于治療是預(yù)防性的還是治療性的來變化。在預(yù)防性的應(yīng)用 中，在長期的時(shí)間段上以相對(duì)低頻率的間隔施用相對(duì)低的劑量。某些 患者在他們生命的剩余時(shí)間持續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，相對(duì)短間 隔的相對(duì)高劑量有時(shí)是需要的，直到疾病的進(jìn)展被降低或終止，優(yōu)選 的直到患者顯示了疾病的癥狀的部分或完全改善。此后，本專利可以 施用預(yù)防性的方案。預(yù)計(jì)的是，催化活性淀粉樣p肽降解融合蛋白可 以以比結(jié)合試劑例如抗體更低的劑量施用。
本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際的劑量水平可以變化， 以獲得活性成分的量，所述量對(duì)實(shí)現(xiàn)特定患者、組合物和施用方式的 希望的治療反應(yīng)是有效的，而對(duì)于患者沒有毒性。選定的劑量水平將 取決于多種藥物動(dòng)力學(xué)因素，包括采用的本發(fā)明的特定組合物或其 酯，鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時(shí)間、采用的特定化合物的排 出速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與采用的特定組合物聯(lián)合使用的其他藥物、 化合物和/或材料、要治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、 一般健 康情況和先前的病史，以及醫(yī)藥領(lǐng)域中公知的類似因素。引用完全合并在此，它們顯 示了本發(fā)明之時(shí)的本領(lǐng)域的狀態(tài)，和/或提供了本發(fā)明的描述和實(shí)現(xiàn)。 公開文獻(xiàn)是指任何科學(xué)或?qū)＠墓_文獻(xiàn)，或以任何媒介形式可獲得 的任何其他信息，包括所有記錄的、電子的或打印的形式。以下參考
文獻(xiàn)通過引用完全合并在此Ausubel，等，ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y， ( 1987-2001 ); Sambrook, 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. ( 1989 ) ; Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. ( 1989); Colligan，等， eds,， Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001 ); Colligan等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY， N.Y., ( 1997-2001 )。
本發(fā)明的一個(gè)方面是修飾天然的野生型蛋白質(zhì)以在降解淀粉樣P 肽方面變得更有選擇性的可能性。定點(diǎn)誘變可以用于在野生型序列中 引入/替換氨基酸。 一種方法是通過研究降解酶的活性位點(diǎn)來運(yùn)用合理 的設(shè)計(jì)。將潛在地改變選擇性分布(與其他肽/蛋白質(zhì)相比淀粉樣p 肽的降解)的氨基酸可以用其他氨基酸替換，可以在本領(lǐng)域已知的切 割分析中測試新的變體。優(yōu)選的，與其他相關(guān)肽相比，具有對(duì)淀粉樣 (3肽的更高催化降解活性的變體是有用的。其他相關(guān)肽包括但不限于 腦啡肽、神經(jīng)肽Y、 P物質(zhì)、somastatin和膽嚢收縮素。
中性溶酶的三維結(jié)構(gòu)是已知的(Oefner等(2000) J. Mol. Biol. 296:341-9; Sahli等(2005 ) Helv.Chim.Acta. 88:731 )。這種結(jié)構(gòu)可 以指導(dǎo)在結(jié)構(gòu)中引入改變的途徑，以及哪一部分是最有效來改變的， 以產(chǎn)生用于篩選或選擇的庫。中性溶酶的活性部位非常深地包埋在結(jié) 構(gòu)中，表明該酶偏愛小的底物，如具有低于約5000 Da分子量的肽片 段?；钚晕稽c(diǎn)殘基包括N542、 H583、 H587、 E646和R717?？拷?性位點(diǎn)的氨基酸殘基還包括V580、 F563、 F564、 M579、 F716、 1718、 F106、 1558、 F563、 F579、 V580、 H583、 V692、 W693和A543 ( Voisin 等(2004 ) JBC 279:46172-81 )。這些和其他殘基可以通過研究三維 結(jié)構(gòu)的理論設(shè)計(jì)來改變，或在各種庫中隨機(jī)地改變來獲得中性溶酶的 改進(jìn)的變體。
本發(fā)明的目的是提供方法和材料，其適合于開發(fā)神經(jīng)變性疾病的治療以及這樣的疾病中的治療介入有用的化合物的鑒定?；谮嗟矸?樣蛋白可以通過優(yōu)化的酶介導(dǎo)的機(jī)制清除的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明致力于提供 這樣的方法和材料，如在權(quán)利要求小節(jié)中列出的和下文中描述的。
本發(fā)明提供了預(yù)防和治療神經(jīng)變性病癥的方法，包括向哺乳動(dòng) 物的外周系統(tǒng)施用有效量的優(yōu)化的酶活性化合物。特別是，所述酶活 性化合物是融合蛋白，其中一個(gè)部分具有酶活性，另一個(gè)部分調(diào)節(jié)血 漿中的半衰期。所述方法適合于預(yù)防和治療腦淀粉樣變性，例如阿爾 茨海默氏病。本發(fā)明還提供了不同的分析原理——生物化學(xué)的和特別 是細(xì)胞學(xué)的分析，用于測試優(yōu)化的酶化合物，優(yōu)選的篩選調(diào)節(jié)活性和 血漿半衰期的復(fù)數(shù)的化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述分析包括 在檢測所述酶活性之前添加中性溶酶家族成員的已知的抑制物。適合
的抑制物是例如膦酰二肽、thiorphan、 spinorphin或上述物質(zhì)的功能 衍生物。
一般意義上，根據(jù)本發(fā)明的分析體內(nèi)和體外地測量血漿中的酶活 性和半衰期。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生藥物的方法，包括步驟(i)鑒 定降解AP肽的化合物，優(yōu)選的高度特異性并具有高Ap肽降解活性 的化合物，(ii)將這種A(3肽降解化合物連接到?jīng)Q定血漿中的半衰期 的調(diào)節(jié)化合物。
本發(fā)明的化合物可以利用重組DNA技術(shù)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中產(chǎn) 生。為了這樣做，制備編碼融合蛋白的重組DNA分子。制備這種DNA 分子的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，編碼調(diào)節(jié)物和蛋白質(zhì)的序列可以 利用適合的限制性內(nèi)切酶從DNA上切下。做為選擇，DNA分子可以 利用化學(xué)合成技術(shù)，例如氨基磷酸酯方法來合成。同樣，可以使用這 些技術(shù)的組合。
本發(fā)明還包括能夠在合適的宿主中表達(dá)調(diào)節(jié)物、蛋白質(zhì)或融合 物的栽體。所述栽體包含編碼所述調(diào)節(jié)物、蛋白質(zhì)和/或融合物、可 操作地連接到合適的表達(dá)控制序列的DNA分子。在DNA分子被插入 栽體之前或之后產(chǎn)生這種可操作的連接的方法是公知的。表達(dá)控制 序列包括啟動(dòng)子、活化子、增強(qiáng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起 始信號(hào)、終止信號(hào)、cap信號(hào)、多腺苷酸化信號(hào)、和涉及轉(zhuǎn)錄或翻譯 的控制的其他信號(hào)。產(chǎn)生的其上具有DNA分子的栽體被用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。這種 轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用大 量可用的和公知的宿主細(xì)胞的任一種。特定宿主的選擇取決于本領(lǐng)域 公認(rèn)的許多因素。這些包括，例如，與所選表達(dá)栽體的兼容性、DNA 分子編碼的融合物的毒性、轉(zhuǎn)化率、融合物回收的容易、表達(dá)特征、 生物安全性和成本。這些因素的平衡必須理解，不是所有的宿主可以 同樣有效地表達(dá)特定的DNA序列。在這些一般準(zhǔn)則之內(nèi)，有用的微 生物宿主包括培養(yǎng)中的細(xì)菌(例如，大腸桿菌屬(￡.co//^.))、酵 母(例如，酵母屬(5^cc/mrow7cw ))和其他真菌、昆蟲、植物、 哺乳動(dòng)物(包括人類)細(xì)胞，或其他本領(lǐng)域已知的宿主。
然后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主并純化。宿主細(xì)胞可以在常規(guī)的發(fā)酵條件 下培養(yǎng)從而表達(dá)希望的化合物。這樣的發(fā)酵條件是本領(lǐng)域公知的。最 后，通過本領(lǐng)域公知的方法從培養(yǎng)物純化融合物。當(dāng)使用Fc部分作 為調(diào)節(jié)物時(shí)， 一種優(yōu)選的方法是使用蛋白A或類似的技術(shù)來純化融合 蛋白。調(diào)節(jié)物、蛋白質(zhì)和融合物也可以通過合成方法制成。例如，可 以使用固相合成技術(shù)。適合的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，包括在Merrifield
(1973 ) ， C7i線尸o(y/ e/7"fi^， pp. 335-61 ( Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield( 1963 )， /.敘C/im. Soc. 85: 2149; Davis等(1985 ), ^/oc/ em. /"A 10: 394-414; Stewart and Young ( 1969 ) ， <So"W尸A(^e S聲/^/r，美國專利No. 3,941,763; Finn等(1976 ) ， 77ie /Vo/e/"s ( 3rd ed.) 2: 105-253;以及Erickson等(1976 ) ， /Vo&/"s
(3rd ed.) 2: 257-527中描述的那些。固相合成是制造單獨(dú)的肽或蛋 白質(zhì)的優(yōu)選的技術(shù)，因?yàn)樗钱a(chǎn)生小肽或蛋白質(zhì)的最有成本效率的方 法。
一般地，本發(fā)明的化合物具有藥理學(xué)活性，其產(chǎn)自它們體內(nèi)降解 淀粉樣(3肽的能力。這些化合物的活性可以通過本領(lǐng)域已知的分析來 測量。對(duì)于Fc-Nep化合物，在此處的實(shí)施例小節(jié)進(jìn)一步描述了體內(nèi) 分析。
一般地，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明化合物的藥物組合物的可能 性。這樣的藥物組合物可以是注射施用、或口服、肺部、鼻部、經(jīng)皮 的或其他形式的施用。 一般地，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含有效 量的本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳
32化劑、佐劑和/或栽體。這樣的組合物包括各種緩沖劑內(nèi)容(例如，
Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH值和離子強(qiáng)度的稀釋劑；添加劑例 如洗滌劑和增溶劑(例如，Tween80、聚山梨酯80)、抗氧化劑(例 如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，Thimersol、苯曱醇) 和填充物質(zhì)(例如，乳糖、甘露醇)；所迷材料摻入到聚合化合物如 聚乳酸、聚乙醇酸等等的顆粒制品中，或摻入脂質(zhì)體中。也可以使用 透明質(zhì)酸，這可能具有促進(jìn)循環(huán)中的維持持續(xù)時(shí)間的效果。這種組合 物可以影響當(dāng)前蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率 和體內(nèi)清除速率。參見，例^(口， Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. ( 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 ) 1435-1712 頁，通過引用將其合并在此。組合物可以以液態(tài)形式制備，或可以是 干粉，例如凍千形式。可植入的持續(xù)釋放制劑也是期待的，經(jīng)皮制劑 也是期待的。這些施用選擇是本領(lǐng)域公知的。
治療上述狀況的方法中涉及的給藥方案可以由主治醫(yī)師確定，考 慮到改變藥物作用的各種因素，例如，患者的年齡、狀況、體重、性 別和膳食，任何感染的嚴(yán)重度，施用的時(shí)間和其他臨床因素。 一般地， 每天的方案應(yīng)當(dāng)在每公斤體重O.卜IOOO微克本發(fā)明化合物的范圍內(nèi)， 優(yōu)選的每公斤0.1-150微克。
本發(fā)明清楚地描述了淀粉樣p降解蛋白質(zhì)可以以特定方式修飾來 維持顯著的降解活性并變得適合于體內(nèi)使用。公開了支持本發(fā)明的實(shí) 驗(yàn)證據(jù)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療A卩相關(guān)病理的方法，例 如唐氏綜合征(Downs syndrome )和P-淀粉樣血管病，例如但不限于 腦淀粉樣血管病、系統(tǒng)性淀粉樣變性、遺傳腦出血、與認(rèn)知損傷相關(guān) 的病癥，例如但不限于MCI ("中度認(rèn)知損傷")、阿爾茨海默氏病、 失憶、與阿爾茨海默氏病相關(guān)的注意力缺陷癥狀、與疾病如阿爾茨海 默氏病相關(guān)的神經(jīng)變性，或癡呆，包括混合的血管和變性起源的癡呆、 早老性癡呆、老年癡呆和與帕金森氏病相關(guān)的癡呆、漸進(jìn)性的核上麻 痹或皮層基底變性，包括向哺乳動(dòng)物(包括人類)施用治療有效量根 據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。
實(shí)施例在此通過以下非限制性的實(shí)施例進(jìn) 一 步描述本發(fā)明實(shí)施例1
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的描述
中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域被定義為氨基酸51-749 (排除第一曱疏氨酸)(SEQIDNO:卜4 )。存在著兩個(gè)多態(tài)性導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域中鑒定的氨基酸差異，不同變體的氨基酸序列在SEQIDNO: 1-4中描述。
IDE(胰島素降解酶)是1018個(gè)氨基酸長度的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:5)。描述了 IDE的剪接變體和多態(tài)性變體。在一種剪接變體中，一個(gè)外顯子被替換為同樣大小的另一個(gè)外顯子，其編碼類似于"wt"外顯子的肽序列(在SEQ ID NO: 6中描述)。這個(gè)變體已經(jīng)被描述為在降解胰島素和A|3方面較低效率。在描述的IDE基因中存在著幾種多態(tài)性，其引起這個(gè)結(jié)構(gòu)域中鑒定的氨基酸差異D947N、 E612K、 L298F和E408G (根據(jù)SEQ ID NO: 5的編號(hào))。這些多態(tài)性的所有組合也是可能的。
ECE1 (內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 7)是681氨基酸長度的蛋白質(zhì)，定義為全長的膜結(jié)合ECE1蛋白質(zhì)的氨基酸90-770。 ECE1基因含有幾種引起氨基酸差異的可能的多態(tài)性R665C、 W541R、 L494Q和T252L這些多態(tài)性的所有組合也是可能的。
中性溶酶、IDE和ECE1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合到人類IgG2 Fc結(jié)構(gòu)域(包括絞鏈區(qū))。信號(hào)序列(SEQIDNO: 8)被導(dǎo)入以允許蛋白質(zhì)在表達(dá)期間分泌到培養(yǎng)基中。絞鏈區(qū)的序列在SEQIDNO: 9中顯示，IgG2 Fc結(jié)構(gòu)域在SEQ ID NO: 10中顯示。具有相應(yīng)于SEQ ID NO:1的人類中性溶酶變體、相應(yīng)于SEQ IDNO:5的IDE以及相應(yīng)于SEQID NO: 7的ECE1的完整融合蛋白(排除信號(hào)序列)在SEQ ID NO:H-13中描述。最終的融合蛋白(排除信號(hào)序列)具有預(yù)測分子量211kDa ( Fc-Nep作為二聚體)、294 kDa ( Fc-IDE作為二聚體)和206 kDa(Fc-ECEl作為二聚體)。
實(shí)施例2
構(gòu)建編碼融合蛋白Fc-中性溶酶的基因的^L明合成地產(chǎn)生融合到編碼IgG2的Fc結(jié)構(gòu)域的基因的、編碼中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的基因(GeneArt)。包括信號(hào)序列的完整基因(編碼Fc-中性溶酶)從GeneArt栽體(pCR-Script, pGA4或pUC-Kana )轉(zhuǎn)移到Gateway供體栽體。Gateway供體栽體被用于將完整基因?qū)霂讉€(gè)表達(dá)栽體中。通過使用Gateway系統(tǒng)，從供體栽體到表達(dá)栽體的轉(zhuǎn)移可以通過利用重組而不是限制性內(nèi)切酶來進(jìn)行。所研究的哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體主要是pCEP4 、 pEAK10、 pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway適應(yīng)的)。所有這些是基于CMV啟動(dòng)子(pCEP4 、 pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或 EF-la啟動(dòng)子(pEF5/FRT/V5-DEST )的標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體。在所有克隆步驟之后基因被測序來證實(shí)DNA序列。
實(shí)施例3
構(gòu)建編碼融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1的基因的說明合成地產(chǎn)生融合到編碼IgG2的Fc結(jié)構(gòu)域的基因的、編碼酶IDE和ECE1的基因。完整的基因(編碼包括信號(hào)序列的Fc-IDE和Fc-ECEl融合蛋白)從起始克隆栽體(pCR-Script、 pGA4或pUC-Kana )轉(zhuǎn)移到Gateway供體栽體。Gateway供體栽體被用于將完整基因?qū)霂讉€(gè)表達(dá)栽體中。所研究的哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體主要是pCEP4、 pEAK10、pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway適應(yīng)的)。所有這些是基于CMV啟動(dòng)子(pCEP4、pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或EF-la啟動(dòng)子(pEF5/FRT/V5-DEST )的標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體。在所有克隆步驟之后基因被測序來證實(shí)DNA效率。
實(shí)施例4
中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和融合蛋白Fc-中性溶酶在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)
蛋白質(zhì)中性溶酶(僅細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)和Fc-中性溶酶(Fc-Nep)在懸浮適應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中短暫地表達(dá)。用于生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系是來自 HEK293 的細(xì)胞系，包括HEK293S 、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA細(xì)胞。測試了來自編碼感興趣蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pCEP4和pEAK10的表達(dá)。用濃度范圍0.3-0.8pg/ml細(xì)胞懸液(終濃度)的質(zhì)粒DNA在大約0.5-lxl(^的細(xì)胞密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。測試的轉(zhuǎn)染試劑是2(ig/ml細(xì)月包懸液(終濃度)的Polyethylenimine ( Polyscience)。表達(dá)在30 ml到1000 ml的細(xì)胞培養(yǎng)體積(搖動(dòng)燒瓶)和5L到10L的Wave生物反應(yīng)器中進(jìn)行。表達(dá)繼之以在不同的天數(shù)從培養(yǎng)物上清液采集樣品，分析細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。通過離心在4到14天后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)基被用于蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)。所有的質(zhì)粒濃度和栽體都是成功的，得到不同的生產(chǎn)水平，一般在l-3mg/L的范圍內(nèi)。
實(shí)施例5
融合蛋白Fc-IDE和FcECEl在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)蛋白質(zhì)Fc-IDE和Fc-ECE1在懸浮適應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中短暫地表達(dá)。用于生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系是來自HEK293的細(xì)胞系，包括HEK293S、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA細(xì)胞。測試了來自編碼感興趣蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pCEP4和pEAK10的表達(dá)。用濃度范圍0.3-0.8ng/ml細(xì)胞懸液(終濃度)的質(zhì)粒DNA在大約0.5-^106的細(xì)胞密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。測試的轉(zhuǎn)染試劑是2ng/ml細(xì)胞懸液(終濃度)的Polyethylenimine(Polyscience )。表達(dá)在30 ml到1000 ml的細(xì)胞培養(yǎng)體積(搖動(dòng)燒瓶)和5L到10L的Wave生物反應(yīng)器中進(jìn)行。表達(dá)繼之以在不同的天數(shù)從培養(yǎng)物上清液采集樣品，分析細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。通過離心在4到14天后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)基被用于蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例6
中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和融合蛋白Fc-中性溶酶在CHO-S細(xì)胞中的表達(dá)
蛋白質(zhì)中性溶酶(僅細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)和Fc-Nep在懸浮適應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)。生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中使用的宿主細(xì)胞是Flpln CHO細(xì)胞(Invitrogen)，其已經(jīng)適應(yīng)于懸浮生長。測試了從編碼感興趣蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表達(dá)。表達(dá)由CMV啟動(dòng)子或EF1 cc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。轉(zhuǎn)染在F12培養(yǎng)基中利用約0.1ng/ml (終濃度)濃度的質(zhì)粒DNA在大約lxl0"田胞/ml的細(xì)胞
36密度下進(jìn)行。編碼重組酶的輔助質(zhì)粒pOG44在0.8 )^g/ml的終濃度下共轉(zhuǎn)染。2jag/ml細(xì)月包懸液(終濃度)6勺Polyethylenimine ( Polyscience )用作轉(zhuǎn)染試劑。表達(dá)在搖動(dòng)燒瓶中30 ml到1000 ml的細(xì)胞培養(yǎng)體積中進(jìn)行。來自培養(yǎng)物上清液的樣品在不同的天數(shù)采集，分析細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。通過離心在4到11天后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。最后，細(xì)胞培養(yǎng)基被用于蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)。使用的兩種表達(dá)栽體在生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)的方面都是成功的。生產(chǎn)水平一般在10-50 mg/L的范圍內(nèi)。
實(shí)施例7
融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1在CHO-S細(xì)胞中的表達(dá)蛋白質(zhì)Fc-IDE和Fc-ECE1在懸浮適應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)。生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中使用的宿主細(xì)胞是FlpInCHO細(xì)胞(Invitrogen),其已經(jīng)適應(yīng)于懸浮生長。測試了從編碼感興趣蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表達(dá)。表達(dá)由CMV啟動(dòng)子或EF1 oc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。轉(zhuǎn)染在F12培養(yǎng)基中利用約0.1pg/ml(終濃度)濃度的質(zhì)粒DNA在大約lxl0M田胞/ml的細(xì)胞密度下進(jìn)行。編碼重組酶的輔助質(zhì)粒pOG44在0.8 ng/ml的終濃度下共轉(zhuǎn)染。2pg/ml纟田月包懸液(纟冬f農(nóng)度)的Polyethylenimine ( Polyscience )用作專爭染^式齊'J 。表達(dá)在搖動(dòng)燒瓶中30 ml到1000 ml的細(xì)胞培養(yǎng)體積中進(jìn)行。來自培養(yǎng)物上清液的樣品在不同的天數(shù)采集，分析細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。通過離心在4到11天后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。
實(shí)施例8
表達(dá)的Fc-中性溶酶蛋白質(zhì)通過親和層析純化
進(jìn)行。純化通過親和層析(蛋白A)進(jìn)行，隨后是低pH值洗脫，在AKTA層析系統(tǒng)(Explorer或Purifier, GE Healthcare )上進(jìn)行。XK26柱(GE Healthcare )中的rProtein A Sepharose FF ( GE Healthcare )用IO倍柱體積(CV )的PBS( 2.7 mM KC1,138 mM NaCl， 1.5 mM KH2P04,8 mM Na2HP04-7H20, pH 6.7-7.0, Invitrogen)平衡。具有表達(dá)的融合蛋白(Fc-中性溶酶)的細(xì)胞培養(yǎng)基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗涂，之后結(jié)合的蛋白質(zhì)用洗脫緩沖液(O.l M甘氨酸，pH3.0)洗脫。純化的部份立刻通過向lml洗脫的蛋白質(zhì)中添加50pl的lMTris堿來中和。集中純化的部份，緩沖液利用PD10柱(GE Healthcare)交換成50 mM Tris-HCl、pH 7.5、 150 mM NaCl。純化的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上分析，發(fā)現(xiàn)是大約90%純度。
實(shí)施例9
表達(dá)的Fc-IDE和Fc-ECE1通過親和層析純化
融合蛋白的純化利用來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行。XK26柱(GE Healthcare)中的rProtein A Sepharose FF ( GEHealthcare )用10倍柱體積(CV )的PBS( 2.7 mM KC1， 138mMNaCl，1.5mMKH2P04， 8 mM Na2HP04-7H20， pH 6.7-7.0, Invitrogen )平衡。具有表達(dá)的融合蛋白(Fc-IDE或Fc-ECEl )的細(xì)胞培養(yǎng)基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗滌，之后結(jié)合的蛋白質(zhì)用洗脫緩沖液(0.1 M甘氨酸，pH3.0)洗脫。純化的部分立即通過向lml洗脫的蛋白質(zhì)中添加50|iil 1MTris堿來中和。集中純化的部份，緩沖液利用PD10柱(GEHealthcare)交換成50 mM Tris-HCl、 pH7.5、 150mMNaCl。
實(shí)施例10
Fc-中性溶酶的表達(dá)的SDS-PAGE和Western印跡分析來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)基利用Western印跡來分析。20 pi細(xì)胞培養(yǎng)基在包含樣品還原劑(Invitrogen)的4xLDS樣品緩沖液(Invitrogen)中稀釋。樣品加熱到95。C 5分鐘，加栽到SDS-PAGE凝膠上(4-12%梯度凝膠，10孑L (1mm) ， invitrogen)。MES緩沖液用作運(yùn)行緩沖液。凝膠在200V電泳(run) 35分鐘。在30 V進(jìn)行電印跡1小時(shí)，來將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在包括5% BSA的TBST ( TBS ( 20 mM Tris、 500 mM NaCl， pH 7.5 ( BioRad )加0.05% Tween-20)中封閉過夜，之后它們與30 pi —抗(生物素化的山羊抗人類中性溶酶抗體，50pg/ml (R&D Systems))在15 mLTBST中孵育。膜在室溫下孵育兩個(gè)小時(shí)，用TBST洗滌三次，與鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化酶綴合物(GE Healthcare, 1:10 000稀釋(15ml TBST中1.5pl)孵育1小時(shí)。膜用TBST洗滌三次用水洗滌三說明書第35/56頁
次，之后利用ECL plus試劑(GE Healthcare)和ECL膠片(GE Healthcare )顯現(xiàn)。SDS-PAGE顯示了純化的蛋白質(zhì)具有正確大小和大 約90%純度。Western印跡證實(shí)了中性溶酶結(jié)構(gòu)域的身份。
實(shí)施例11
中性溶酶酶活性FRET分析
中性溶酶酶活性在焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析中測定。重組 人類中性溶酶(R & D Systems)、來自中性溶酶或Fc-中性溶酶生產(chǎn) 細(xì)胞(AZ S6dertaije )的培養(yǎng)基、或純化的中性溶酶或Fc-中性溶酶添 加到含有iO)tiM熒光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys
(Dnp) -OH (R&D Systems)的96孔平板中。對(duì)照的重組人類中性 溶酶的終濃度是0.1或0.25 pg/ml。 10 的中性溶酶抑制物膦酰二肽
(phosphoramidone ) ( BIOMOL )添加到一些孔中，以控制分析中信 號(hào)的特異性和證實(shí)特異性中性溶酶活性。在向反應(yīng)孔添加所有的成分 之后，平板立即置入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發(fā)340 nm和發(fā) 射405 nm處每分鐘記錄信號(hào)持續(xù)20分鐘。酶活性通過計(jì)算反應(yīng)速度 一斜率系數(shù)-S ARFU/At來評(píng)估。為了比較商售的重組中性溶酶和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我們引入了比活性系數(shù)，其根據(jù)這個(gè)公 式計(jì)算比活性=斜率系數(shù)/分析中中性溶酶或Fc-中性溶酶單體的 pmol。
實(shí)施例12
IDE和CEC1酶活性FRET分析
酶活性在焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析中測定。沒有Fc結(jié)構(gòu) 域的重組酶(商售的或內(nèi)部生產(chǎn)的)、培養(yǎng)基(來自Fc-IDE或Fc-ECEl 生產(chǎn)細(xì)胞)或純化的蛋白質(zhì)(Fc-IDE或Fc-ECEl )添加到含有l(wèi)O^M 熒光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys( D叩)-OH( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發(fā)340 nm和發(fā)射405 nm處每分 鐘記錄信號(hào)持續(xù)20分鐘。酶活性通過計(jì)算反應(yīng)速度-斜率系數(shù)- S ARFU/At來評(píng)估。為了比較對(duì)照(商售的重組酶)的比活性，比活性 系數(shù)根據(jù)這個(gè)公式來計(jì)算比活性=斜率系數(shù)/分析中酶結(jié)構(gòu)域的pmol。
實(shí)施例13
細(xì)胞培養(yǎng)上清液中中性溶酶和Fc-中性溶酶濃度的測定 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的中性溶酶濃度利用GyrosTM BioaffyTM CD微 實(shí)驗(yàn)室方法和Gyrolab Workstation LIF設(shè)備(Gyros AB, Sweden )測 量。來自不同細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑(Gyros AB)中稀釋， 置入Thermo-Fas t 96孔PCR平板(Abgene， UK )中。單克隆小鼠 生物素化抗人類中性溶酶抗體(Serotec)用作捕獲試劑(終濃度0.05 mg/ml)，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標(biāo)記的多克隆 山羊抗人類中性溶酶抗體(R&D systems)充當(dāng)檢測抗體(終濃度 100nM)，用于中性溶酶濃度的測量。商售的重組中性溶酶(R&D systems)用作標(biāo)準(zhǔn)物，濃度范圍從10 ng/ml到10000ng/ml以構(gòu)建標(biāo) 準(zhǔn)曲線。多克隆生物素化的抗人類中性溶酶抗體(R&Dsystems)用 作捕獲抗體，而用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標(biāo)記的多 克隆山羊抗人類IgG抗體(Molecular Probes)用作檢測抗體用于Fc-中性溶酶構(gòu)建體檢測。內(nèi)部生產(chǎn)的和純化的Fc-中性溶酶融合蛋白充 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物，濃度范圍從10ng/ml到10000ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)物、捕獲和檢測 抗體置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene )中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF儀器，使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐廠家方案進(jìn)行濃度測量。
實(shí)施例14
細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECEl濃度的測量 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)濃度利用Gyros BioaffyTM CD微實(shí) 驗(yàn)室方法和Gyrolab Workstation LIF設(shè)備(Gyros AB, Sweden )測量。 來自不同細(xì)胞培養(yǎng)條件的樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑(Gyros AB)中稀釋，置 入Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK )中。生物素化的IDE 或ECEl特異性抗體用作捕荻試劑，Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes)標(biāo)記的IDE或ECEl特異性抗體用作檢測抗體。商售的或內(nèi) 部生產(chǎn)重組IDE和ECEl被用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)測量Fc-IDE或 Fc-ECEl濃度時(shí)，差別是用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標(biāo)記的多克隆山羊抗人類IgG抗體(Molecular Probes )用作檢測抗體。 標(biāo)準(zhǔn)物、捕獲和檢測抗體置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene) 中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF 儀器，使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根據(jù)廠家方
案進(jìn)行濃度測量。
實(shí)施例15
在緩沖液中Fc-中性溶酶和中性溶酶對(duì)淀粉樣P肽的降解 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)Fc-中性溶酶能夠降解淀粉樣pi-40肽。該 分析是在有或者沒有中性溶酶抑制物、存在中性溶酶(R&D Systems ) 或Fc-中性溶酶的情況下孵育后測量殘余的淀粉樣(31-40肽(Bachem) 濃度。含有淀粉樣pi-40肽(終濃度，300、 30或3 nM)和/或中性溶 酶(2.4pg/ml)和/或Fc-中性溶酶構(gòu)建體(2.4pg/ml)和/或磷酰二肽 (10pM)的100 pl反應(yīng)混合物在圓底96孔聚丙烯平板中在37°。孵育 2.5小時(shí)。在孵育之后，10 ^tl的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到含有10 標(biāo)準(zhǔn)稀 釋劑(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene ， UK ) 中。淀粉樣卩1-40濃度利用Gyrolab Workstation LIF系統(tǒng)測定。生物 素化的抗淀粉樣P抗體(6E10;終濃度50pg/ml; Signet)用作捕獲抗 體，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標(biāo)記的多克隆抗人類 淀粉樣p抗體(44-348; Biosource)用作檢測抗體。淀粉樣pi-40肽 濃度測量使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐廠家 方案進(jìn)行。中性溶酶的淀粉樣)31-40肽降解被計(jì)算為在存在中性溶酶 的情況下孵育后留下的淀粉樣P1-40肽、與不存在中性溶酶的情況下 的淀粉樣pi-40肽濃度相比較的百分比。
在2.4jag/ml的濃度下重組人類中性溶酶在37°C 2.5小時(shí)的孵育后 降解了 64%的淀粉樣|31-40肽(300 nM)。內(nèi)部生產(chǎn)的Fc-中性溶酶 構(gòu)建體在大約相同的濃度(2.4pg/ml)下降解50% (批次1)和42% (批次2 )的淀粉樣pl-40肽(300 nM )。在存在10 膦酰二肽的
情況下特異性中性溶酶活性幾乎完全地消除(附圖1)。這個(gè)實(shí)施例 顯示了 Fc-中性溶酶有效地降解淀粉樣卩l(xiāng)-40肽。
實(shí)施例16
41在緩沖液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECE1的淀粉樣卩肽降解 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)Fc-IDE和Fc-ECEl能夠降解淀粉樣卩1-40 肽。該分析測量在存在酶(Fc-IDE或Fc-ECE1 )的情況下孵育后殘余 淀粉樣(31-40肽(Bachem)的濃度。含有淀粉樣(31-40肽(終濃度， 300、 30或3 nM ) 、 Fc-IDE或Fc-ECE1的100 pl反應(yīng)混合物在37°C 孵育2.5小時(shí)。在孵育之后，10 pl的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到含有10 標(biāo) 準(zhǔn)稀釋劑(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK ) 中。淀粉樣卩1-40濃度使用Gyrolab Workstation LIF系統(tǒng)測量。生物 素化的抗淀粉樣P抗體(6E10;終濃度5(Vg/ml; Signet)用作捕獲抗 體，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標(biāo)記的多克隆抗人類 淀粉樣(3抗體(44-348; Biosource )用作^r測抗體。中性溶酶的淀粉 樣pi-40肽降解被計(jì)算為在存在酶的情況下孵育之后留下的淀粉樣 pi-40肽、相比不存在酶的情況下的淀粉樣pi-40肽濃度的百分比。
實(shí)施例17
在豚鼠血漿中Fc-中性溶酶對(duì)淀粉樣(3肽l-40和淀粉樣(3肽1-42 的降解
中性溶酶對(duì)淀粉樣卩肽1-40 ( A卩40 )和淀粉樣|3肽1-42 ( A卩42 ) 的降解利用來自體重250-300g的雄性Dimkin Hartley豚鼠 (HBLidk6ping ka )的肝素化血漿來研究。通過心臟穿刺從麻醉的豚 鼠抽取血液。在采樣的20分鐘內(nèi)，血液采集到預(yù)冷的肝素-血漿試管 中，在4°C 3000xg離心10分鐘。血漿樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的聚丙烯試管 中，立即在干水上冷凍，使用前保持在-70。C。實(shí)驗(yàn)在來自七只豚鼠的 血漿庫上進(jìn)行。His-Fc-Nep ( 6ng/ml或208ng/ml)或5 |ag/ml重組人 類中性溶酶(R&D systems )和相應(yīng)的栽體(50 mM Tris-HCl、 150mM NaCl pH 7,5或25mM Tris-HCl、 0掘NaCl pH 8.0)在存在或缺少 10pM膦酰二肽(BIOMOL)的情況下與血漿的庫在37。C孵育0和4 小時(shí)。終濃度4.7mM的EDTA添加到試管中，之后A卩40和Ap42的 量利用獲自Biosource( A卩卜40)或Innogenetics( A(31-42 )的商售ELISA 試劑盒來分析。
與栽體相比較，在37。C用豚鼠血漿和6pg/ml或208pg/ml His-Fc-Nep的4小時(shí)離體(e;c-v/vo )孵育分別產(chǎn)生了 A(340的26%和51%的降低。與栽體相比，商售的人類重組中性溶酶(5 pg/ml)降解 了 AP40 49%。在添加10^M膦酰二肽之后A(340水平不受影響(附圖 2)。
當(dāng)用208 |ng/ml His-Fc-Nep或5ng/ml中性溶酶(R&D systems ) 孵育時(shí)，與栽體相比，豚鼠血漿中的A|342水平降低超過57%。當(dāng)與 208ng/ml的His-Fc-Nep組合時(shí)，A卩42的降低不受膦酰二肽的抑制。 低濃度的His-Fc-Nep沒有Ap42中的降解(附圖3 )。
實(shí)施例18
在人血漿中Fc-中性溶酶的淀粉樣卩肽l-40降解 在兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)在醫(yī)療中心(AstraZeneca )將來自八位個(gè)體 (5男性和3女性)的血液采集到預(yù)冷卻的肝素-血漿試管中。在采樣 的30分鐘內(nèi)，血漿通過在4。C在2500xg離心20分鐘來制備。血漿樣 品轉(zhuǎn)移到預(yù)冷卻的聚丙烯試管，立即冷凍，在使用前保存在-70。C。 His-Fc-Nep ( 6pg/ml)或5^g/ml重組人類中性溶酶(R&D systems ) 和相應(yīng)的栽體(50 mM Tris-HCl、150 mMNaCl pH7.5或25mM Tris-HCl 0.1 M NaCl pH 8.0)在存在或缺少10nM膦酰二肽的情況下 與血漿庫在37。C孵育0和4小時(shí)。終濃度4.7mM的EDTA添加到試 管中，之后使用獲自Biosource的商售的ELISA試劑盒分析Ap40的 量。與栽體相比在37。C孵育4小時(shí)之后，His-Fc-Nep ( 6(ig/ml)和商 售的人類重組中性溶酶(5pg/ml)分別降解A卩40 33%和70%。 A(340 水平在添加10pM膦酰二肽后不受影響(附圖4)。
實(shí)施例19
在豚鼠血漿中內(nèi)部生產(chǎn)的Fc-N印的淀粉樣(3肽1-40和淀粉樣P 肽1-42的降解(體內(nèi)研究)
進(jìn)行豚鼠中的體內(nèi)研究以測試內(nèi)部生產(chǎn)的Fc-Nep的體內(nèi)效力。 讀數(shù)是血漿AP水平和血漿藥物濃度。Y-分泌酶抑制物AZ10420130 (M550426 )被用作參考(血漿A|3水平降低的陽性對(duì)照)。
豚鼠(雄性Dunkin Hartley豚鼠，250-300 g )被稱重，i.v.施用單 劑量。目的是，劑量在結(jié)束時(shí)應(yīng)得到O、 5和20pg/ml的血漿暴露。在 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行動(dòng)物健康狀態(tài)的觀察。在每個(gè)時(shí)點(diǎn)包括8只動(dòng)物，每個(gè)時(shí)點(diǎn)具有其自身的栽體組。動(dòng)物用異氟烷麻醉，通過心臟穿刺采
集血液。對(duì)關(guān)于血液樣品的信息，處理并分析Api-40或Api-42 (參 見實(shí)施例23)。所有血漿樣品將進(jìn)行PK研究來測定藥物暴露(方法 描述參見實(shí)施例20)。
實(shí)施例20
Fc-Nep和僅中性溶酶的藥物動(dòng)力學(xué)
開發(fā)Fc-Nep融合蛋白來改善中性溶酶藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)質(zhì)，特別地 針對(duì)降低清除和改善半衰期。為了測試這一點(diǎn)，我們向小鼠i.v.施用 了 1 mg/kg商售的中性溶酶或1或5 mg/kg內(nèi)部生產(chǎn)的Fc-Nep的單次 劑量。在給藥后設(shè)定的時(shí)間，在最后從尾部靜脈或通過心臟穿剌抽取 血液樣品。在采樣到含有EDTA的試管中時(shí)，將等分量置于冰上。通 過在采樣的15分鐘內(nèi)離心來制備血漿(一般1500g 4°C IO分鐘)并 立即冷凍。對(duì)商售中性溶酶使用抗-Nep、或?qū)c-Nep使用抗人類IgG 作為捕獲抗體，而兩種物質(zhì)都通過抗Nep抗體檢測，通過免疫分析測 定Fc-Nep和中性溶酶的血漿濃度。使用軟件包(WinNonlin, Pharsight Corporation, USA )計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在這個(gè)實(shí)施例實(shí)驗(yàn)中，計(jì) 算的半衰期從對(duì)于N印的約5分鐘提高到對(duì)于Fc-Nep約20小時(shí)。結(jié) 果在附圖5中顯示。
實(shí)施例21
利用酶活性FRET分析在細(xì)胞培養(yǎng)基中中性溶酶-Fc和Fc-中性 溶酶的酶活性的比較
為了比較Fc的C-末端與中性溶酶的融合物和Fc的N-末端與中 性溶酶的融合物，根椐實(shí)施例4產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì)(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如實(shí)施例8描述的純化。細(xì)胞培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的酶活性在 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析中測試。重組人類中性溶酶(R&D systems)、來自Fc-中性溶酶生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基、以及來自中性溶酶 -Fc生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基添加到含有 10 nM 熒光肽底物 V曙Mca-Arg曙Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems ) 的96孔平板中。對(duì)照重組人類中性溶酶的終濃度是0,1或0.25pg/ml。 在向孔添加所有的成分之后，平板立即置入焚光板讀取器(Ascent)
44中，在激發(fā)340 nm和發(fā)射405 nm處每分鐘記錄信號(hào)持續(xù)20分鐘。 通過計(jì)算反應(yīng)速度-斜率系數(shù)-SARFU/厶t來評(píng)估酶活性。為了比較商 售的重組中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋白和Fc-中性溶酶融合蛋白的 比活性，我們引入了比活性系數(shù)，其根據(jù)這個(gè)公式計(jì)算比活性=斜 率系數(shù)/分析中中性溶酶或融合蛋白單體的pmol。結(jié)果(附圖6中所 示)顯示了 Nep-Fc的表達(dá)產(chǎn)生了非常低的比活性(對(duì)于用pCEP4栽 體表達(dá)為O.l，用pEAK 10栽體表達(dá)為0.55 ),但是Fc-Nep的表達(dá)產(chǎn) 生了高得多的比活性(用pCEP4栽體表達(dá)為13.4，用pEAK10栽體表 達(dá)為15.2)。
實(shí)施例22
利用酶活性FRET分析比較純化的中性溶酶-Fc和Fc-中性溶酶的 酶活性
為了比較Fc的C-末端與中性溶酶的融合物和Fc的N-末端與中 性溶酶的融合物，根據(jù)實(shí)施例4產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì)(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如實(shí)施例8描述的純化。中性溶酶酶活性在熒光共振能量 轉(zhuǎn)移(FRET)分析中測定。重組人類中性溶酶(R&D systems)、 純化的中性溶酶-Fc蛋白質(zhì)和純化的Fc-中性溶酶添加到含有10|iM熒 光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發(fā)340 nm和發(fā)射405 nm處每分 鐘記錄信號(hào)持續(xù)20分鐘。通過計(jì)算反應(yīng)速度-斜率系數(shù)- S厶RFU/At 來評(píng)估酶活性。為了比較商售的重組中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋 白和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我們引入了比活性系數(shù)，其根 據(jù)這個(gè)公式計(jì)算比活性=斜率系數(shù)/分析中中性溶酶或中性溶酶-Fc 單體的pmol。結(jié)果(附圖9中顯示)顯示了純化的融合蛋白Nep-Fc 的比活性是非常低的(0.001)，但是純化的融合蛋白Fc-Nep的比活 性高得多(14.1 )。
實(shí)施例23
在APPswE-轉(zhuǎn)基因小鼠中血漿中用Fc-中性溶酶對(duì)可溶的A卩水平 的處理這項(xiàng)研究的目的是評(píng)估在急性的靜脈內(nèi)處理之后在雌性
APPSWE-tg小鼠的血漿中Fc-Nep的時(shí)間和劑量-反應(yīng)效果。特定目的是 發(fā)現(xiàn)對(duì)血漿A(34o和A^2的效果。？分泌酶抑制物M-550426被包括作 為參考化合物。
25-31周齡雌性APPswE-轉(zhuǎn)基因小鼠(10只小鼠/組)以l或5mg/kg 單次靜脈內(nèi)注射接受栽體或Fc-Nep。作為參考化合物，使用300 pmol/kg的Y-分泌酶抑制物M-550426,這些動(dòng)物在3小時(shí)內(nèi)處理(4 只小鼠)?？瞻捉M(4只未處理的小鼠)還被包括在研究中。在給藥 后1.5和3小時(shí)從栽體和化合物處理的動(dòng)物采集血液。通過心臟穿剌 從麻醉的小鼠抽出血液到預(yù)冷卻的含EDTA的微試管中。離心之前， 血液樣品立即置于冰上。在采樣的20分鐘內(nèi)，血漿通過在大約3000xg 在+4。C離心10分鐘來制備。在血液采集之后，小鼠被終結(jié)。血漿中 AP40和A卩42水平通過分別獲自Biosource和Innogenetics的商售 ELISA試劑盒來分析。
根椐實(shí)施例20中描述的操作，分析血漿中和制劑中Fc-Nep的濃 度。在來自未處理的動(dòng)物的樣品(空白)和來自用M550426處理的動(dòng) 物的樣品中，分析血漿的暴露。
結(jié)果
在APP面轉(zhuǎn)基因小鼠中在1或5 mg/kg i.v注射給藥之后1.5小時(shí) 而非給藥之后3小時(shí)的血漿中，與栽體相比，F(xiàn)c-Nep顯著地降低可溶 的A卩40的水平大約20%( P<0,05 )。在1和5 mg/kg在1.5小時(shí)，F(xiàn)c-Nep 的平均血漿暴露分別是9.8和33細(xì)/ml。 3小時(shí)后沒有見到A卩40的 顯著的變化，而1和5 mg/kg的Fc-Nep血漿暴露分別是7.6和 27.3|ig/ml。如所預(yù)計(jì)的，在用陽性對(duì)照，y-分泌酶抑制物M550426處 理后的血漿中觀察到A|340的降低的水平。在給藥后3小時(shí)M550426 的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是33.5 (附圖7)。
在用5 mg/kg Fc-Nep處理1.5小后血漿中的A(342水平與栽體相 比降低了約20% (P<0.05)。在1 mg/kg施用1.5小后沒有見到顯著 的變化。在3小時(shí)后任何劑量中沒有見到AP42的顯著的變化，而在 1和5 mg/kg的Fc-Nep血漿暴露分別是7.6和27.3ng/ml。在用陽性對(duì) 照，？分泌酶抑制物M550426處理后的血漿中》見察到AP42的降低的水平。在給藥后3小時(shí)M550426的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg 的小鼠中是33.5nM (附圖8)。
實(shí)施例24
在C57BL/6小鼠的用hFc-Nep處理和對(duì)血漿中可溶的A(3水平的 影響(時(shí)間和劑量反應(yīng)研究1.5和3小時(shí))
這項(xiàng)研究的目的是評(píng)估在急性處理之后在雌性C57BL/6小鼠的 血漿中hFc-Nep的時(shí)間和劑量-反應(yīng)效果。特定目的是找到對(duì)血漿A(340 的效果和將效果與血漿中hFc-Nep的暴露程度相關(guān)。？分泌酶抑制物 M-550426被包括作為陽性對(duì)照。
13周齡雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/組)以1或5 mg/kg單次 靜脈內(nèi)注射接受栽體或hFc-Nep。在終止前3小時(shí)以300 pmol/kg 口服 地施用M-550426?？瞻捉M也被包括在研究中。在給藥后1.5和3小時(shí) 從栽體和化合物處理的動(dòng)物采集血液。通過心臟穿刺從麻醉的小鼠抽 出血液到預(yù)冷卻的含EDTA的微試管中。離心之前，血液樣品立即置 于冰上。在采樣的20分鐘內(nèi)通過在+4。C大約3000xg離心10分鐘制 備血漿。在血液采集之后，小鼠被終結(jié)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行動(dòng)物健 康狀態(tài)的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血漿中的小鼠A|340水平 通過獲自Biosource的商售ELISA試劑盒分析。根據(jù)實(shí)施例27中描述 的操作，分析血漿中和制劑中Fc-Nep的濃度。
結(jié)果
結(jié)果顯示了在C57BL/6小鼠中1.5和3小時(shí)后通過用hFc-Nep處 理小鼠AP40以劑量依賴性方式顯著地降低。在1.5小時(shí)之后，與栽 體相比，在1 mg/kg刑量見到A卩40的17。/。降低(p- 0.1638 )，在5mg/kg 劑量76%降低(pO.0001 )。在1.5小時(shí)1和5 mg/kg下hFc-Nep的 平均血漿暴露分別是14和89ng/ml。在3小時(shí)后，與栽體相比，在l mg/kg劑量A卩40被顯著降低36% ( p<0.005 )，在5mg/kg劑量降低 72%。在3小時(shí)在1和5 mg/kg下hFc-N印的平均血漿暴露分別是17 和78pg/ml。如所預(yù)計(jì)的，在用陽性對(duì)照，Y分泌酶抑制物M-550426 處理后在血漿中也觀察到AP40的降低的水平。在給藥后3小時(shí) M-550426的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是42 pM (附圖10)。
實(shí)施例25
利用作為單劑量經(jīng)由靜脈內(nèi)注射給予C57BL/6小鼠的hFc-Nep的 時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系
這項(xiàng)研究的目的是評(píng)估在單劑量之后在雌性C57BL/6小鼠的血 漿中hFc-Nep的時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系。特定目的是發(fā)現(xiàn)hFc-Nep的降低效果 在血漿中保持多久，以及將效果與血漿中測試化合物暴露水平相關(guān)。 Y-分泌酶抑制物M-550426被包括作為陽性化合物。
20-12周齡雌性C57BL/6小鼠(8只小鼠/組)接受5 mg/kg的栽 體或hFc-Nep的單次靜脈內(nèi)注射，在注射后不同的時(shí)點(diǎn)分析A(340 (1.5-168小時(shí)之間，即，直到1周)。y-分泌酶抑制物M-550426 口 服地給藥，動(dòng)物被處理3小時(shí)?？瞻捉M也被包括在研究中。在整個(gè)實(shí) 驗(yàn)期間進(jìn)行動(dòng)物健康狀態(tài)的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血液采 集、血漿加工和血漿中小鼠A(340水平的測量基本上如實(shí)施例27所描 述的。
結(jié)果
結(jié)果(附圖11)顯示，當(dāng)作為對(duì)C57BL/6小鼠的單次靜脈內(nèi)注 射，在hFc-Nep的1.5-168小時(shí)處理之后血漿AP40被顯著地降低。在 所有的時(shí)間點(diǎn)(1.5、 6、 12、 24、 36、 72和168小時(shí))A卩40降低是 持續(xù)的(與栽體相比67-80%之間)。在1.5小時(shí)在5 mg/kg下hFc-Nep 的平均血漿暴露是87Mg/ml，在l周后(168小時(shí))慢慢地降低到38pg/ml 的水平。這些數(shù)據(jù)顯示了在小鼠中Fc-Nep的半衰期是顯著地長的。 如所預(yù)計(jì)的，在用陽性對(duì)照，，分泌酶抑制物M550426處理后的血漿 中觀察到AP40的降低的水平。在給藥后3小時(shí)M-550426的平均血 漿暴露在接受300 |amol/kg的小鼠中是34 pM (附圖11 )。
實(shí)施例26
利用作為單劑量經(jīng)由靜脈內(nèi)注射給予APPSWE-tg小鼠和C57BL/6 的小鼠Fc-Nep的時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系
這項(xiàng)研究的目的是評(píng)估在單劑量之后在雌性APPSWE-tg小鼠和
48平相關(guān)。" 分泌酶抑制物M-550426被包括作為陽性化合物。21-23周齡雌性APP匿-tg小鼠和24周齡雌性C57BL/6小鼠(6 只小鼠/組)接受單次靜脈內(nèi)注射的5或25 mg/kg的栽體或mFc-Nep， 在注射后不同時(shí)點(diǎn)分析A卩40 ( 1.5-336小時(shí)之間，即，直至2周)。 在終止之前3小時(shí)M-550426以300 pmol/kg 口服地施用。對(duì)于兩種小 鼠模型，包括了 APPSWE-tg和C57BL/6、陽性對(duì)照和空白組。對(duì)于 APPswE-tg小鼠包括了以下的組25 me/kg: 1.5、 72、 168和336小時(shí)； 5 mg/kg: 336小時(shí)(2周)。對(duì)于C57BL/6小鼠25 mg/kg: 168和 336小時(shí)；5 mg/kg: 1.5、 168和336小時(shí)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行動(dòng)物 健康狀態(tài)的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血液采集和血漿加工基 本上如實(shí)施例25描述的進(jìn)行。C57BL6小鼠血漿中小鼠AP40水平的 分析如實(shí)施例25描述的進(jìn)行。APPSWE-tg小鼠血漿中人類A|340和 A卩42水平的分析如實(shí)施例25中描述的進(jìn)行(如在最后的APP-tg研究 中描述的)。結(jié)果在APPswE-轉(zhuǎn)基因小鼠中，在單次施用25mg/kg后，在所有時(shí)間 點(diǎn)，mFc-Nep顯著地降低血漿中的人AJ340和A(342(附圖12， a和b )。 在1.5小時(shí)之后，當(dāng)與栽體相比時(shí)，AP40和AP42的A卩水平分別是 91%和87%，當(dāng)暴露被降低時(shí)A(3水平逐漸地提高。在兩周(336小時(shí)) 后，與栽體相比，A(340和A(342的八(3水平分別是58%和44%。在兩 周后，在25 mg/ml mFc-Nep的單次靜脈內(nèi)注射后的暴露從299pg/ml (1.5小時(shí))降低到60pg/ml ( 336小時(shí))(附圖12， c)。對(duì)于168 和336小時(shí)，使用了給予5 mg/kg的其他組的動(dòng)物。如附圖12， a和 b中所示，對(duì)于A(340和Ap42兩者，在那些時(shí)間點(diǎn)A卩以劑量依賴性 方式降解。A(340和AP42的血漿效力效果與mFc-Nep的血漿暴露是反 相關(guān)的(附圖13)。這些結(jié)果表明，mFc-Nep的A卩降解效果對(duì)A卩40 比對(duì)AP42更大。在C57BL/6小鼠中，在所有時(shí)間點(diǎn)(1.5、 168和336小時(shí))在5和25mg/kg下mFc-Nep顯著地降低血漿中的小鼠A卩40 (附圖14)。 在168和336小時(shí)，分析了 5和25 mg/kg兩者，Ap40效果顯示是劑 量依賴性的。在2周后，與栽體相比，25mg/kgmFc-Nep的單次注射 (336小時(shí))顯著地降低血漿中小鼠A(340水平73%。這個(gè)時(shí)點(diǎn)的血 漿暴露是48ng/ml，因而mFc-Nep顯示了具有長血漿半衰期。實(shí)施例27Fc-Nep和內(nèi)部生產(chǎn)的中性溶酶的藥物動(dòng)力學(xué)利用Fc-Nepa和Nep的不同批次重復(fù)藥物動(dòng)力學(xué)研究，獲得不同 的PK分布圖。最重要的是包括IgG的Fc部分的化合物的血漿半衰期 的顯著延長。開發(fā)Fc-Nep融合蛋白來改善中性溶酶藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)質(zhì)，特別地 針對(duì)降低清除和改善半衰期。為了測試這一點(diǎn)，我們向小鼠i.v.施用 了單次的10或50 nmol酶/kg體重的中性溶酶(Nep )或Fc-N印(1 和5 mg/kg)。在設(shè)定的時(shí)間，在最后從尾部靜脈或通過心臟穿刺抽 取血液樣品。在采樣到含有EDTA的試管中時(shí)，將等分量置于冰上。 在采樣的15分鐘內(nèi)通過離心制備血漿(一般1500g 4°C IO分鐘)并 立即冷凍。對(duì)Nep使用抗-N印、或?qū)c-Nep 4吏用抗人類IgG作為捕 獲抗體，而兩種物質(zhì)都通過抗Nep抗體^r測，通過免疫分析測定Nep 和Fc-Nep的血漿濃度。使用軟件包(WinNonlin, Pharsight Co卬oration， USA)計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在這個(gè)實(shí)施例實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算的半衰期從 對(duì)于Nep的約1天提高到對(duì)于Fc-Nep的約2.5周。結(jié)果在附圖15中 示出。實(shí)施例28在人類和APPSWE-tg小鼠血漿中人類或小鼠Fc-中性溶酶的淀粉 樣|3肽1-40、 1-42的降解在三不同的時(shí)間點(diǎn)在醫(yī)療中心(AstraZeneca )將來自十二位個(gè)體 (6男性和6女性)的血液采集到預(yù)冷卻的肝素-血漿試管中。通過在 4。C在2500xg離心20分鐘制備血漿。采集血漿樣品并轉(zhuǎn)移到預(yù)先冷 卻的聚丙烯試管中，立即冷凍，在使用前-70。C保存。就在實(shí)驗(yàn)前將來 自12位個(gè)體的血漿解凍并集中。血漿庫中的Api-40和1-42通過具有相應(yīng)栽體(50mMTris-HCl， 150 mM NaCl pH 7.5 )的人類Fc-Nep或 小鼠Fc-Nep降解。使用以下終濃度的Fc-Nep構(gòu)建體，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml，在室溫下在定軌搖動(dòng)器上搖動(dòng)進(jìn)行降解 l小時(shí)。通過添加膦酰二肽(10 ^M終濃度)來停止酶反應(yīng)。人血漿 庫中的淀粉樣(31-40的濃度利用ELISA試劑盒(Biosource; KHB3481 ) 根據(jù)廠家說明書測量。終濃度4.7 mM EDTA添加到試管，之后使用ELISA試劑盒 Innotest P-AmyloidM2 (I,genetics， lot# 177462, ref弁80177 )根據(jù) 廠家說明書分析AP42的濃度。與沒有Fc-N印處理的血漿相比，最高濃度(100pg/ml)的人類 Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分別降解人血漿淀粉樣(31-40 66%和71%，分 別降解A卩1-42 28%和19。/。。人類Fc-Nep和小鼠Fc-Nep的降解的EC50 值對(duì)于人類Api-40分別是0.58piM和0.40|iiM,對(duì)于A(31-42分別是 0.25jliM和0.18pM。結(jié)果在附圖16中概述。采集自9只動(dòng)物的小鼠血漿保存在-70。C。就在實(shí)驗(yàn)前將血漿解凍 并集中。血漿庫中的A卩1-40和1-42由具有相應(yīng)栽體(50 mM Tris-HCl， 150mMNaClpH7.5)的人類Fc-N印或小鼠Fc-Nep降解。使用以下 終濃度的Fc-Nep構(gòu)建體，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml， 在室溫下在定軌搖動(dòng)器上搖動(dòng)進(jìn)行降解1小時(shí)。酶反應(yīng)通過添加膦酰 二肽(10 終濃度)來停止。在降解之后，在使用ELISA試劑盒(Biosource; KHB3481 )測量 tg-小鼠血漿庫中的淀粉樣(31-40的濃度之前，根據(jù)廠家說明書將血漿 樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑緩沖液中稀釋2 0倍。在降解之后，終濃度4.7 mM EDTA添加到tg-小鼠血漿試管中， 血漿樣品在樣品稀釋劑中稀釋3倍，之后使用ELISA試劑盒Innotest P-AmyloidM2 ( Innogenetics， lot# 177462, re併80177 )根據(jù)廠家說明 書分析AP42的濃度。與沒有Fc-Nep處理的血漿相比，最高濃度(IOO fag/ml)的人類Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分別降解人血漿淀粉樣pi-40 71% 和77%,分別降解A(3 1-42 34%和53%。人類Fc-Nep和小鼠Fc-N印 的降解的ECso值對(duì)于人類A|3l-40分別是0.47nM和0,34 ^M，對(duì)于 A|31-42分別是1.3pM和0,82(_tM。結(jié)果在附圖16中概述。SE(3 ID NO 1中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，形式lYDDGICKSSDCIKSAARLIQ畫DATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTE匿AVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDC PRLGLPSRDYYECTG1YKEACTAYVDFMISVARLIR卿RLPIDEN(5LALE顧KVMELEKE腦ATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMST雨SITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLGNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIC TLDDLTWMDAE丁KXRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFEN11QNLKFSQSKQLKXLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGLQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRJIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 2中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，形式2YDDGICKSSDCIKSAARUQ雇DATTEPCRDFFKYACGGWUCRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQ10NNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVN1SITNEEDVVVYAPEYLTKLKP1LTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIGTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDD1VSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQ1VFPAG1LQPPFFSAQQSNSLNYGG1GMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKJCNGEEKXLPGLDLNHKQLFF匿AQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 3
中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，形式3
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNF
DILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDI
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SEQ ID NO 4
中性溶酶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，形式4
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53SEQ ID NO 5
IDE (胰島素降解酶)的氨基酸序列
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LNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFPQLLSRL
HIEALLHGNITKQAALG1MQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFV
YQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQI1SEPCFNTLRTKEQLGYIVFS
GPRRANGIQSLRFHQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRR
LDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDA
PRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPL
FPLVKP訓(xùn)FMAAKLSEQ ID NO 6
IDE (胰島素降解酶)的氨基酸序列(剪接變體) MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITK
SPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHM
LFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFF
LCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNK
YTLETRPNQEGIDV,LLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEV
ENKNVPLPEFPEHPF(JEEHLK(3LYKJVPIKDIRNLYVTFPIPDLC KYYKSNPGHYLG
HLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFHNVDLTEEGLLHVEDIIL
HMFQYIQKLRAEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSK1AGILHYYPLE
EVLTAEYLLEEFRPDL麵VLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQE
AIPDEVIKKWQNADLNGKFKXPTKNEFIPTNFE1LPLEKEATPYPALIKDTAMSKLW
FKC DDKFFLPKACLNFEFFSRYIYADPLHCNMTYLFIRLLKDDLKEYTYAARLSGL
SYGIASGMNAILLSVKGYNDKQPILLKKJIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFR
AEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALL
HGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNE
VHNNCGIEIYYQTDMQSTSE麗FLELFCQHSEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRAN
GIQGLRF1IQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDFCPKK
LSAECAKYWGEI1SQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKJYKEMLAVDAPRRHKV
SVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV1CP
畫FMAAKL
SEQ ID NO 7
ECE1 (內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1 )的氨基酸序列
QYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGW1KANPVPDGHSR
WGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLM
ELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQV
DQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILD
FETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIV
VYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMI糊LVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYG
TKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATEIILEIKKAFEESLS
TLKWMDEETRKSAKEKADAIVNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYT
RSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTE
CMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGE隱DNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLP
TLGLTNT^LFFLGFAC VWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFR
CPPGSP訓(xùn)PPHKCEVW
SE()IDN0 8
表達(dá)構(gòu)建體中使用的信號(hào)肽的氨基酸序列METDTIXLWVLLXWVPGSTGD
SEQ ID NO 9
鉸鏈區(qū)域的氨基酸序列(來自IgG2)ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO 10
Fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(來自IgG2)
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKXTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 11
完整融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQF
NWYVDGVEVKNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKYDDGICKSSDC1KSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPE
TSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEP
LUCLLPDIYGWPVATE麗EQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHID(5PRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVD圖SVARLIR卿RLPIDEN
QLALE讓KVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFS
WLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDL()NLMSWRFIMD
LVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAF
AGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALA1KERIGYPDDIVS
NDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVN
AFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKD
GDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNG
GLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSI
KTDVHSPGNFRIIGTLC NSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
SE(5 ID NO 12
完整融合蛋白Fc-IDE的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ簡TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEKNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKJDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPF卿HLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFI雨DLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKJAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLP
DRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQ
LGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQ
ALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEM
LAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQ畫TEF
KRGLPLFPLVKP畫FMAAKL
SEQ ID NO 13
完整融合蛋白Fc-ECEl的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVC F
NWYVDGVEVHNAKTKPREEGFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKT1SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKQYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANP
VPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEE
LRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNS
NSNV1QVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQ
MQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVE1
NESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKF
MEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATE1ILEIKK
AFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPD
LYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGIL
C APFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEA
FKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNG
AEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKE
FSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVWSEQ ID NO 14
完整鼠融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVPRDCGCKPCICTVPPVSSVFIFPPKPKDVLTITLT
PKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQD
WLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCM
ITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTF
TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDASVEPCTDF
FKYACGGWLKRNVIPETSSRYSNFDILRDELEVILKDVLQEPKTEDIVAVQKAKTL
YRSCINESAIDSRGGQPLLKLLPDIYGWPVASDNWDQTYGTSWTAEKSIAQLNSKY
GKKVLINFFVGTDDKNST卿IHFDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMIS
VARLIRQEQSLPIDENQLSLEMNKVMELEKEIANATTKPEDRNDPMLLYNKMTLA
KLQNNFSLEVNGKSFSWSNFTNEIMST雨NIQNEEEVWYAPEYLTKLKPILTKYS
PRDLC NLMSWRFIMDLVSSLSRNYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG
剛ENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKKAEE
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KVDKX)EWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGH
EITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSANNFKDQSQCMVYQYGNFSWDLAGG
QHLNGINTLGENIADNGGIGQAYRAYQNYVKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFA
QVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFADAFHCRKNSYMNPERK
CRVW
SEQ ID NO 15
人類淀粉樣P肽1-38的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQICLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
SEG ID NO 16
人類淀粉樣(3肽1-39的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAHGLMVGGV
SEQ ID NO 17
人類淀粉樣(3肽1-40的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAnGLMVGGVVSEQ ID NO 18
人類淀粉樣P肽1-41的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI
SEQ ID NO 19
人類淀粉樣|3肽1-42的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHH(3KLWFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
SEQ ID NO 20
人類淀粉樣(3肽1-43的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGUvTVGGWIAT
權(quán)利要求
1.一種具有式M-A的融合蛋白，能夠在淀粉樣β肽氨基酸序列中一個(gè)或更多個(gè)切割位點(diǎn)降解所述淀粉樣β肽，其中M是延長所述融合蛋白的半衰期的蛋白質(zhì)成分，A是切割所述淀粉樣β肽的蛋白質(zhì)成分，其中所述M蛋白質(zhì)成分共價(jià)地連接到A蛋白質(zhì)成分的N-末端部分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中A是蛋白酶。
3，根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中A是人類中性溶酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的融合蛋白，其中所述中性溶酶是細(xì)胞外的中 性溶酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞外的中性溶酶，包含根據(jù)SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一個(gè)的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中A是胰島素降解酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中A是內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中A是支架蛋白質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中M是抗體的 Fc部分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述抗體是IgG抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述抗體是IgG2抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，并且A是細(xì)胞外的中性溶酶。
13. 根椐權(quán)利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 11的氨 基酸序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，并且A是胰島素降解酶。
15. 根椐權(quán)利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 12的氨基酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，A是內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1。
17. 根椐權(quán)利要求1的融合蛋白，包含根據(jù)SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中M選自PEG 化和糖基化。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中M是HSA。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中M是HSA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中M是抗體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中M和A通過接頭L連接 在一起。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的融合蛋白，其中L選自肽和化學(xué)接頭。
24. —種降低淀粉樣|3肽濃度的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán) 利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在血漿中實(shí)現(xiàn)淀粉樣P肽的降低。
26. 根椐權(quán)利要求24的方法，其中在CSF中實(shí)現(xiàn)淀粉樣|3肽的 降低。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在CNS中實(shí)現(xiàn)淀粉樣P肽的 降低。
28. —種能夠降解淀粉樣|3肽的藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受 量的、根據(jù)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受 的栽體或賦形劑。
29. —種預(yù)防和/或治療其中淀粉樣p肽的降解是有益的的狀況的 方法，包括向需要這種預(yù)防和/或治療的哺乳動(dòng)物，包括人，施用治療 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白。
30. —種預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病、系統(tǒng)性淀粉樣變性或腦 淀粉樣血管病的方法，包括向需要這樣的預(yù)防和/或治療的哺乳動(dòng)物， 包括人類，施用治療有效量的根椐權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合 蛋白。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白，其用于醫(yī)學(xué)治療。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白在制造藥物中的用 途，所述藥物用于其中淀粉樣P肽的降解是有益的的狀況的預(yù)防和/ 或治療。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的融合蛋白在制造藥物中的用 途，所述藥物用于阿爾茨海默氏病、系統(tǒng)性淀粉樣變性或腦淀粉樣血 管病的預(yù)防和/或治療。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32或33的用途，其中所述藥物降低淀粉樣P 肽濃度。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中在血漿中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣卩肽 的降低。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中在CSF中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣p 肽的降低。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中在CNS中實(shí)現(xiàn)所述淀粉樣(3 肽的降低。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合蛋白和它們?cè)诎柎暮Ｄ喜』颊叩拿钢委熤械挠猛?。所述融合蛋白具有式M-A，能夠在淀粉樣β肽的氨基酸序列中一個(gè)或更多個(gè)切割位點(diǎn)降解淀粉樣β肽，其中M是延長融合蛋白的半衰期的蛋白質(zhì)成分，并且A是切割淀粉樣β肽的蛋白質(zhì)成分。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101668545SQ200880010294
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日
發(fā)明者C·安德松, P·-O·弗雷斯克加德 申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司