專利名稱：用于β-淀粉樣肽的改進(jìn)檢測(cè)的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫測(cè)定領(lǐng)域，并且更具體地，涉及用于增加測(cè)定生物流體中的 β-淀粉樣肽的免疫測(cè)定的靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性·退行性疾病，其特征是進(jìn)行性的和不斷增加的記憶喪失，緊接著是喪失對(duì)肢體和身體功能的控制并最終死亡。其是癡呆癥最常見的病因，影響1-6%的65歲以上人群和10-20%的80歲以上人群。AD與其他類型癡呆癥的區(qū)別在于幾個(gè)病理學(xué)特征，包括患者大腦中在神經(jīng)元之間的細(xì)胞外隙中進(jìn)行性地出現(xiàn)老年斑。該斑塊具有淀粉樣蛋白沉積物的中心核，其主要由被變性神經(jīng)炎和膠質(zhì)細(xì)胞包繞的稱為淀粉樣β肽(Αβ)的40-42個(gè)氨基酸肽的原纖維形成。 此肽由稱為β淀粉樣蛋白前體蛋白(βΑΡΡ)的前體蛋白的蛋白水解而成。AD可以根據(jù)出現(xiàn)的年齡分為早發(fā)型(60歲以下的年齡)和遲發(fā)型(60歲以上的年齡)，根據(jù)常染色體顯性遺傳的存在分為家族性AD或散發(fā)性AD。AD的早發(fā)家族形式可能與βΑΡΡ編碼基因早老素I和早老素2(分別位于染色體21、14和I上)的已知突變有關(guān)。 這些分類不相互排斥。最常見的形式是散發(fā)性遲發(fā)形式。在臨床慣例中，使用基于典型臨床標(biāo)志的存在的臨床標(biāo)準(zhǔn)并使用神經(jīng)影像技術(shù)和血液分析排除其他類型癡呆癥進(jìn)行AD的診斷。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，診斷的可靠性是可接受的， 但是根據(jù)使用腦組織活檢完成的研究，10-20%的被診斷有AD的患者患有不同的疾病。而且，目前的診斷方法僅可以在神經(jīng)變性過程進(jìn)展到患者患有嚴(yán)重的癡呆癥并且大腦損害廣泛到治療措施數(shù)目有限的地步時(shí)才可進(jìn)行。明確診斷需要尸檢腦組織的病理學(xué)檢查。鑒于Αβ在AD患者的大腦中積累并且是AD發(fā)病機(jī)制的中心要素的事實(shí)，此蛋白已經(jīng)被認(rèn)為是作為AD生物標(biāo)志物的最合適候選物。然而，Αβ作為AD的血漿生物標(biāo)志物的使用面臨著這樣的問題，即Αβ肽(Αβ (1-40)和Αβ (1-42))在血清中的濃度極低，使得沒有足夠靈敏以便允許可靠檢測(cè)所述肽物種的測(cè)定方法。已經(jīng)使用不同的測(cè)量來測(cè)定生物樣品中的β_淀粉樣肽水平(參見，例如，由 Scheuner 等(Nature Med. ,1996,2 :864-870) ；Tamaoka A 等(J Neurol Sci. ,1996,141， 65-68) ；Suzuki, N.等(Science，1994，264 :1336-1340) ；W0200722015, Vanderstichele H 等(Amyloid,2000,7,245-258) ；Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003,60,958-964)； Mehta et al. (Arch. Neurol. 57,2000,100-105) ；Mayeux, R.等(Ann Neurol. 1999,46, 412-416) ；Lanz, T. A 和 Schacthter, J. B. (J. Neuroscience Methods, 2006，157 :71-81), W0200750359, W00162801, W00315617, W00246237, W00413172 所述的方法。然而，目前已知的所有基于ELISA的測(cè)定具有較小的檢測(cè)限，其最大也達(dá)不到單位數(shù)的pg/mL的范圍，其適于檢測(cè)CSF中的A β 40和A β 42以及檢測(cè)患有家族性AD的患者血漿中的所述物種，但不適合于檢測(cè)患有散發(fā)性AD的患者血漿中的A β 42，在散發(fā)性AD中A β 42血漿濃度低得多。至今，顯示檢測(cè)限低于單位數(shù)pg/mL的唯一的A β肽測(cè)定對(duì)應(yīng)于W0200646644中和TO2009015696中所述的測(cè)定。W0200646644描述了一種電致化學(xué)發(fā)光(ECL)夾心測(cè)定，其中mAb 21F12(識(shí)別 Αβ42的氨基酸33-42)與磁珠偶聯(lián)，然后磁珠用來捕獲含有A β 42的樣品中的A β 42肽并進(jìn)一步和與釕復(fù)合物偶聯(lián)的3D6mAb接觸。然后當(dāng)施加電能時(shí)通過由釕復(fù)合物發(fā)射的光檢測(cè)結(jié)合的3D6抗體的量。使用此測(cè)定，該發(fā)明人能夠檢測(cè)低至O. 5pg/mL的Αβ 42標(biāo)準(zhǔn)品。 然而，當(dāng)使用同一測(cè)定來比較來自AD患者和健康對(duì)照的血漿樣品中的A β 42時(shí)，在兩組患者之間沒有觀察到顯著的差異，這使得該發(fā)明人得出結(jié)論血清中完整Αβ 42的量由于降解而非常低，并且轉(zhuǎn)為使用21F12mAb的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定，該測(cè)定提供ng/mL范圍內(nèi)的較低靈敏度水平。W02009015696描述了一種高靈敏度ELISA夾心測(cè)定，其中檢測(cè)抗體與生物素標(biāo)記的顯示對(duì)所述抗體有特異性的試劑接觸。該試劑和與過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素接觸。 然后通過使用TMB的比色法檢測(cè)或使用QuantaBlue熒光檢測(cè)過氧化物酶活性。W02006053251描述了一種測(cè)定樣品中的β -淀粉樣肽物種的方法，該方法包括使樣品與變性劑接觸，從樣品-變性劑混合物中提取肽混合物，將β -淀粉樣肽從該混合物中分離，并測(cè)定β_淀粉樣肽物種的量。該方法在測(cè)定前需要分離肽的步驟，這導(dǎo)致增加的處理時(shí)間和增加的成本。
因此，在本領(lǐng)域中存在著對(duì)用于檢測(cè)Αβ -衍生肽的改進(jìn)的免疫學(xué)測(cè)定和試劑盒的需求，所述免疫學(xué)測(cè)定和試劑盒克服本領(lǐng)域中已知的方法和試劑盒的問題，具體地，它們足夠靈敏從而以可靠的方式檢測(cè)患有散發(fā)性AD的患者的血漿中的Αβ肽。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種診斷受試者中的神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段的方法，所述方法包括以下步驟⑴確定選自由下列各項(xiàng)組成的組的一種或多種參數(shù)(a)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離的淀粉樣肽的水平，(b)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離淀粉樣肽和與所述生物樣品中存在的大分子成分締合的所述 一種或多種β -淀粉樣肽的合計(jì)水平，其中所述合計(jì)水平通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β_淀粉樣肽與所述生物樣品中存在的所述成分解離的條件下接觸后定量所述樣品的無(wú)細(xì)胞級(jí)分中所述一種或多種β-淀粉樣肽的量來確定，(C)與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的一種或多種淀粉樣肽的水平， 其中所述水平通過分離所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分，將所述樣品的所述細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸來確定；(ii)將參數(shù)(b)或(C)中的至少一個(gè)的值或由參數(shù)(a)至(C)中的至少兩個(gè)算術(shù)組合產(chǎn)生的計(jì)算參數(shù)的值與參比樣品中對(duì)應(yīng)于所述參數(shù)(b)或(C)或所述計(jì)算參數(shù)的值的參比值進(jìn)行比較；以及(iii)當(dāng)相對(duì)于所述參比值所述參數(shù)的值或所述計(jì)算參數(shù)的值存在改變時(shí),診斷所述神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定生物樣品中的β_淀粉樣肽的試劑盒， 其包含(i)蛋白增溶劑，和(ii)至少一種針對(duì)β -淀粉樣肽的抗體。


圖I A-F.對(duì)在兩個(gè)外部實(shí)驗(yàn)室(Labl和Lab2)獲得的(A)UP Αβ 1-40, (B) DPAβ 1-40，(C)CBAβ I-40，(D)UP Αβ I-42，(E)DP Αβ 1-42 和(F)CB Αβ 1-42 的測(cè)量值的點(diǎn)陣圖。大多數(shù)點(diǎn)靠近索引線(concordance line)，表明了測(cè)量值極大程度至幾乎完全程度的一致性。在每個(gè)圖表中的右下部插入指明了一致性相關(guān)系數(shù)(CCC)和95%置信區(qū)間。圖2 :Α β 1-40 (A)，A β 1-42 (B)的直接標(biāo)志物以及 A β 1-40 和 A β 1-42 (C)的計(jì)算 標(biāo)志物。Α.在健康對(duì)照(HC)，患有輕度認(rèn)知損害(MCI)的患者和患有阿爾茨海默病(AD) 的患者中以pg/ml計(jì)的血清中游離的A β 1-40 (FP)，血漿中的總A β 1-40水平(包括游離的 Αβ 1-40和與血漿成分結(jié)合的Aβ 1-40) (TP)以及與細(xì)胞結(jié)合的Aβ 1-40 (CB)的濃度。B.在健康對(duì)照(HC)，患有輕度認(rèn)知損害(MCI)的患者和患有阿爾茨海默病(AD)的患者中以pg/ ml計(jì)的血清中游離的A β 1-42 (FP)，血漿中的總A β 1_42水平(包括游離的A β 1_42和與血漿成分結(jié)合的A β 1-42) (TP)以及與細(xì)胞結(jié)合的A β 1-42 (CB)的濃度。C.以pg/ml計(jì)的總血漿Αβ 1-40(通過將血漿樣品與蛋白增溶劑接觸獲得)加上與細(xì)胞結(jié)合的Αβ 1-40 (TP+CB Αβ 1-40)的合計(jì)值，總血漿Αβ 1-42(通過將血漿樣品與蛋白增溶劑接觸獲得)加上與細(xì)胞結(jié)合的 Αβ 1-42 (TP+CB Αβ I-42)的合計(jì)值，或TP+CB Αβ 1-40和Αβ 1-42 (TP+CB Αβ I-42) 的合計(jì)值。Η、Μ和A分別表示與HC、MCI和AD相比顯著(p < O. 05)。*表示p<0.01。圖3 :A-F. HC、MCI 和AD受試者中的(A)DPAβ 1-40, (B)CB Αβ I-40，(C)UPAβ I-42， (D)DP A β 1-42，(E) T40和(F) T- β APB值的點(diǎn)陣圖。*旁邊的數(shù)值指示MCI和AD組中的異常值，為了清楚地表示，其以與縱軸不同的刻度表示。水平線表示MCI和HC之間的截止值。圖4 :患有MCI/HC的患者中l(wèi)ab40標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 510。圖5 :患有MCI/HC的患者中2ab40標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 778。圖6 :患有MCI/HC的患者中3ab40標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 458。圖7 :患有MCI/HC的患者中l(wèi)ab42標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 576。圖8 :患有MCI/HC的患者中2ab42標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 667。圖9 :患有AD/HC的患者中3ab42標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 744。圖10 :患有MCI/HC的患者中3ab42標(biāo)志物的ROC曲線。ROC曲線下面積=O. 508。圖11 :患有MCI/HC的患者中2ab40+3ab40標(biāo)志物的ROC曲線。曲線下面積為 O. 830。圖12 :患有AD/HC的患者中2ab42+3ab42標(biāo)志物的ROC曲線。曲線下面積為O. 713。圖13 :患有MCI/HC的患者中2ab42+3ab42標(biāo)志物的ROC曲線。曲線下面積為ROC O. 777。圖14 MCI/HC的2ab40+3ab40+2ab42+3ab42標(biāo)志物的ROC曲線。曲線下面積為O.848。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的作者已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)用樣品緩沖液稀釋血漿導(dǎo)致Αβ 1-40和Αβ 1-42的可檢測(cè)水平升高。不希望受任何理論約束，相信血漿的稀釋導(dǎo)致樣品內(nèi)的離子強(qiáng)度和分子相互作用的改變，引起與血漿蛋白和其他成分結(jié)合的Αβ 1-40和Αβ 1-42的釋放。因此，在血漿稀釋后測(cè)量值的增加可能是由于檢測(cè)到從蛋白和其他血漿成分釋放的Αβ肽所引起的，并且可能被解讀為血漿中Αβ總水平的估計(jì)值。無(wú)論如何，這些結(jié)果顯示血液中的A β肽水平比由簡(jiǎn)單地測(cè)定其在未稀釋血漿中的水平所估計(jì)的值高得多。總β APB血液水平的完整測(cè)定應(yīng)當(dāng)包括定量血漿中游離的肽， 與血漿蛋白結(jié)合的肽和與血細(xì)胞結(jié)合的肽。這種對(duì)β APB的不同成分的綜合定量將得到 Αβ血液水平的更精確量度并且可能有助于明確健康和疾病中Aβ肽的復(fù)雜調(diào)節(jié)作用。此夕卜，所述淀粉樣肽池的水平以及通過將不同池的濃度與游離淀粉樣肽的濃度算術(shù)組合得到的某些計(jì)算參數(shù)的值可以用于確定患者是否患有神經(jīng)退行性疾病，患者是否處于神經(jīng)退行性疾病之前的狀態(tài)和將神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)退行性疾病之前的狀態(tài)相區(qū)分。本發(fā)明的診斷方法 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及診斷受試者中的神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段的方法，所述方法包括以下步驟(i)確定選自由下列各項(xiàng)組成的組的一種或多種參數(shù)(a)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離的淀粉樣肽的水平，(b)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離淀粉樣肽和與所述生物樣品中存在的大分子成分締合的所述一種或多種β -淀粉樣肽的合計(jì)水平，其中所述合計(jì)水平通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β_淀粉樣肽與所述生物樣品中存在的所述成分解離的條件下接觸后定量所述樣品的無(wú)細(xì)胞級(jí)分中所述一種或多種β-淀粉樣肽的量來確定，(C)與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的一種或多種淀粉樣肽的水平， 其中所述水平通過分離所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分，將所述樣品的所述細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸來確定；以及(ii)將參數(shù)(b)或(C)中的至少一個(gè)的值或由參數(shù)(a)至(C)中的至少兩個(gè)算術(shù)組合產(chǎn)生的計(jì)算參數(shù)的值與參比樣品中對(duì)應(yīng)于所述參數(shù)(b)或(C)或所述計(jì)算參數(shù)的值的參比值進(jìn)行比較；以及(iii)當(dāng)相對(duì)于所述參比值所述參數(shù)的值或所述計(jì)算參數(shù)的值存在改變時(shí),診斷所述神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段。術(shù)語(yǔ)“診斷”當(dāng)在本文中使用時(shí)包括評(píng)估受試者對(duì)疾病的易感性，確定受試者目前是否具有所述疾病，以及受所述疾病影響的受試者的預(yù)后。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，這種評(píng)估通常對(duì)于要進(jìn)行診斷的受試者來說不可能100%正確，盡管優(yōu)選是100%正確的。然而，該術(shù)語(yǔ)要求統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著部分的受試者可以被鑒別為患有該疾病或具有該疾病的易患傾向。如果一部分是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，則其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用幾種公知的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)工具，例如，確定置信區(qū)間，確定P值，t檢驗(yàn),Mann-Whitney檢驗(yàn)等簡(jiǎn)單地確定。細(xì)節(jié)參見 Dowdy 和 Wearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New York 1983。優(yōu)選的置信區(qū)間為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。P值為優(yōu)選 O. 2、0· I 或 O. 05。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“受試者”涉及被歸類為哺乳動(dòng)物的所有動(dòng)物，并且包括但不限于家養(yǎng)動(dòng)物和耕作動(dòng)物，靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類，例如，人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、奶牛、馬、 豬、綿羊、山羊、犬、貓或嚙齒類動(dòng)物。優(yōu)選地，受試者是任何年齡或人種的男性或女性人類。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)退行性疾病”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指這樣的病癥或功能障礙，其中神經(jīng)元細(xì)胞由于細(xì)胞死亡而損失，引起認(rèn)知功能的衰退或?qū)е驴赡芤陨窠?jīng)性、神經(jīng)退行性、生理性、心理或行為異常為特征的損害、功能紊亂或并發(fā)癥。可以采用本發(fā)明的方法診斷的合適的神經(jīng)退行性疾病包括，而不限于，年齡相關(guān)性黃斑變性、克雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、阿爾茨海默病(Alzheimer' s Disease)、放療誘發(fā)的癡呆癥、軸突損傷、急性皮層擴(kuò)布性抑制(acute cortical spreading depression)、α -共核蛋白病(alpha-synucleinopathies)、腦缺血、亨廷頓病、持續(xù)性局灶性腦缺血、周圍神經(jīng)再生、癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型(post-status epilepticus model)、脊髓損傷、散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化和傳染性海綿狀腦病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病。術(shù)語(yǔ)"阿爾茨海默病"(或"老年性癡呆")是指與特定的退行性腦病相關(guān)的精神衰退，所述特定的退行性腦病的特征為老年斑、神經(jīng)炎性纏結(jié)(neuritic tangles)和進(jìn)行性神經(jīng)元喪失,其在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退、意識(shí)混亂、行為問題、個(gè)人不能自理、漸進(jìn)性體質(zhì)惡化(gradual physical deterioration)和，最終死亡?；加邪柎暮Ｄ〉幕颊呤褂肗INCDS-ADRDA標(biāo)準(zhǔn)(⑶R = I,麗SE 16至24分和在Scheltens量表中顳葉內(nèi)側(cè)萎縮(通過MRI確定)> 3 分進(jìn)行鑒別。術(shù)語(yǔ)“所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指在正常個(gè)體和患有神經(jīng)退行性疾病的受試者之間發(fā)生的一種過渡性狀況，其特征為出現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病的一些體征和癥狀或出現(xiàn)在患有神經(jīng)退行性疾病的患者中觀察到的體征和癥狀亞群。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段是輕度認(rèn)知損害(此后稱為MCI)，其是指在正常衰老和早期阿爾茨海默病之間的認(rèn)知損害過渡期。如果患者滿足Mayo臨床標(biāo)準(zhǔn) (⑶R = 0. 5，他們顯示顳葉內(nèi)側(cè)萎縮(通過MRI確定)，在Scheltens量表中大于3分，則他們通常被鑒別為MCI，他們?cè)诓捎?8-氟脫氧葡萄糖的正電子斷層掃描儀(PET-FDG)中顯示頂葉和/或顳葉代謝減退的表現(xiàn)(提示AD)。術(shù)語(yǔ)“區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段”是指區(qū)分處于神經(jīng)退行性疾病之前的階段或前驅(qū)期的患者與已經(jīng)患有該疾病的患者的能力。在具體的情況下，神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病，本發(fā)明的方法允許區(qū)分阿爾茨海默病 和已知為輕度認(rèn)知損害(MCI)的所述疾病的前驅(qū)期在第一步驟中，本發(fā)明的方法包括確定選自由下列各項(xiàng)組成的組的至少一種參數(shù)
(a)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離的β_淀粉樣肽的水平，(b)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離淀粉樣肽和與所述生物樣品中存在的大分子成分締合的所述一種或多種β -淀粉樣肽的合計(jì)水平，其中所述合計(jì)水平通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β_淀粉樣肽與所述生物樣品中存在的所述成分解離的條件下接觸后定量所述樣品的無(wú)細(xì)胞級(jí)分中所述一種或多種β-淀粉樣肽的量來確定，(c)與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的一種或多種淀粉樣肽的水平， 其中所述水平通過分離所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分，將所述樣品的所述細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述β-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸來確定。術(shù)語(yǔ)“β_淀粉樣肽”在本文中與 “Αβ ”、" Abeta"、" β AP "、" Abeta 肽"或"Αβ肽”可互換使用，并且是指為在阿爾茨海默病(AD)、唐氏綜合癥(Down' s Syndrome)和遺傳性腦出血伴荷蘭型淀粉樣變(HCHWA-D)患者腦中中發(fā)現(xiàn)的老年斑和血管淀粉樣蛋白沉積物(淀粉樣蛋白血管病)的主要化學(xué)成分的肽家族。B-淀粉樣肽是β-淀粉樣前體蛋白的片段(APP)，其包含可變數(shù)目的氨基酸，一般為38-43個(gè)氨基酸。
B-淀粉樣肽通常表示為"Αβ (x-y)"其中x表示β _淀粉樣肽的氨基末端的氨基酸編號(hào)，y表示羧基末端的氨基酸編號(hào)。例如，Αβ (1-40)是其氨基末端以氨基酸編號(hào)I開始且羧基末端以氨基酸編號(hào)40結(jié)束的β-淀粉樣肽，其序列由SEQ IDNO :1給出。β_淀粉樣肽的實(shí)例包括可以用本發(fā)明的方法確定的那些，包括，不限于，Αβ (1-38) (SEQ ID NO :2)、Αβ (1-39) (SEQ ID NO :3)、Αβ (1-40) (SEQ IDNO :1)、Αβ (1-41) (SEQ ID NO 4), and Αβ (1-42) (SEQ ID NO ；5), Αβ (1-43) (SEQ ID NO :6)、Aβ (11—42) (SEQ ID NO 7), Αβ (3-40) (SEQ ID NO :8)、Αβ (3-42) (SEQ ID NO :9)、Αβ (4-42) (SEQ ID NO 10)、A β (6-42)(SEQ IDNO : 11)、A β (7-42)(SEQ ID NO : 12)、A13(8-42)(SEQ ID NO : 13)、 Αβ (9-42) (SEQ ID Ν0:14)、Αβ (χ_40)、Αβ (χ-42)和 Αβ (χ_38)，以及總 β-淀粉樣肽，后者是指多個(gè)β_淀粉樣肽物種，其中不區(qū)分單個(gè)物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)的β_淀粉樣妝是Αβ (1-40)和Αβ (1_42)。術(shù)語(yǔ)“Αβ (1-42)”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，涉及對(duì)應(yīng)于APP的氨基酸672至713 (SEQ ID N05)的42個(gè)氨基酸肽，其通過淀粉樣前體蛋白(SEQ ID NO 15)被β-和Y -分泌酶相繼溶蛋白性裂解而產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“Αβ (1-40)”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，涉及對(duì)應(yīng)于氨基酸672至711 (SEQ IDNO I)的40個(gè)氨基酸肽，其通過淀粉樣前體蛋白(SEQ ID NO 15)被β-和Y -分泌酶相繼溶蛋白性裂解而產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”，當(dāng)在本發(fā)明中理解時(shí)，包括(I)生物流體諸如全血、血清、血漿、 尿、淋巴、唾液、精液、痰、眼淚、粘液、汗液、乳、腦提取物和腦脊液；(2)血液成分，諸如血漿、血清、血細(xì)胞和血小板；(3)從實(shí)體組織或器官諸如腦獲得的提取物；和(4)來自人或動(dòng)物細(xì)胞系或原代細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述原代細(xì)胞諸如原代人神經(jīng)元，和來自攜帶人APP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的原代神經(jīng)元，例如，來自轉(zhuǎn)基因PDAPP動(dòng)物(例如，小鼠)的細(xì)胞，以及 293人腎細(xì)胞系，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，人HeLa細(xì)胞系，原代內(nèi)皮細(xì)胞系(例如，HUVEC細(xì)胞)，原代人成纖維細(xì)胞系或原代淋巴母細(xì)胞系(包含來源于具有APP突變的患者的內(nèi)源性細(xì)胞)，原代人混合腦細(xì)胞培養(yǎng)物(包含神經(jīng)元、星形細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì))，或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞系。本發(fā)明的方法特別適合于測(cè)量人或非人動(dòng)物的血液樣品中的Αβ，所述血液樣品諸如全血、血漿，或包含任何量的任何血液成分的樣品。術(shù)語(yǔ)“全血”是指來自人或動(dòng)物的包含細(xì)胞成分和液體成分兩者的血液。全血可以處于凝固狀態(tài)或非凝固狀態(tài)?！叭边€包括其中一部分或全部細(xì)胞成分諸如白細(xì)胞或紅細(xì)胞已經(jīng)被溶解的血液。術(shù)語(yǔ)“血漿”是指全血的液體成分。取決于使用的分離方法，血漿可以完全不含有細(xì)胞成分，或可以含有不同量的血小板和/或小量的其他細(xì)胞成分。術(shù)語(yǔ)“血清”是指不含凝血蛋白纖維蛋白原和其他凝血因子的血漿。術(shù)語(yǔ)“游離的β_淀粉樣肽”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指不與生物樣品的任何成分締合并且易于與特異性抗體結(jié)合的β_淀粉樣肽。該肽可以通過常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)通過將生物樣品與對(duì)所述肽特異的抗體接觸來測(cè)定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，游離淀粉樣肽的水平在血衆(zhòng)中測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“與大分子成分締合的β -淀粉樣肽”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指與被研究的生物樣品中存在的分子非共價(jià)結(jié)合或連接的β_淀粉樣肽。該肽通常不容易被利用用于免疫學(xué)檢測(cè)并且因此需要對(duì)生物樣品預(yù)處理以便實(shí)現(xiàn)該肽與所述成分的分離。在這些條件下，與 大分子成分連接的β-淀粉樣肽將從所述成分釋放并且將變得可被利用用于使用特異性抗體的免疫學(xué)檢測(cè)。由于生物樣品已經(jīng)含有特定量的游離β_淀粉樣肽，因此在將樣品與蛋白增溶劑接觸后游離淀粉樣肽的總量將為初始存在的游離β-淀粉樣肽和在用蛋白增溶劑處理后已經(jīng)釋放的β_淀粉樣肽水平的合計(jì)水平。在需要測(cè)定與生物樣品中存在的大分子成分締合的β_淀粉樣肽的水平的情況下，通?？梢匀缦聛硗瓿蓽y(cè)定用蛋白增溶劑處理前游離β_淀粉樣肽的水平和用蛋白增溶劑處理后游離β_淀粉樣肽的水平，并將第二值減去第一值。為了本發(fā)明的目的，其通常足以測(cè)定游離β_淀粉樣肽的合計(jì)水平， 該合計(jì)水平包括初始的游離β-淀粉樣肽以及在用蛋白增溶劑處理后已經(jīng)從大分子成分釋放的β_淀粉樣肽的水平。因此，通常當(dāng)樣品被處理以便將淀粉樣肽從大分子成分解離時(shí)測(cè)定的參數(shù)對(duì)應(yīng)于樣品中存在的游離肽加上與大分子成分締合的肽。可以結(jié)合β -淀粉樣肽并且有助于與大分子成分締合的β -淀粉樣肽的池的樣品大分子成分包括蛋白以及脂質(zhì)兩者。在血液或血漿樣品中進(jìn)行所述方法的具體情況下，所述大分子成分包括，不限于，血液蛋白和脂質(zhì)。示例性的血液蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白 G、免疫球蛋白Ε、免疫球蛋白Μ、免疫球蛋白Α、纖維蛋白原(纖維蛋白及其降解產(chǎn)物)、α -I 抗胰蛋白酶、前白蛋白、α I抗胰蛋白酶、α I酸性糖蛋白、α I甲胎蛋白、觸珠蛋白α 2、巨球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、C3/C4i32微球蛋白、β脂蛋白；α、β和Υ球蛋白、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、凝血酶原、甲狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白等。示例性的血液脂質(zhì)包括游離脂肪酸、膽固醇、甘油三酯、磷脂、鞘脂等。與大分子成分締合的β_淀粉樣肽的量可以通過將生物樣品的無(wú)細(xì)胞樣品與蛋白增溶劑在適于誘導(dǎo)所述β-淀粉樣肽從大分子成分釋放的條件下接觸來確定。對(duì)于接觸，其在本文中是指向樣品加入足量的包含蛋白增溶劑的溶液使得混合物中蛋白增溶劑的濃度足以 有效地溶解與樣品中的蛋白和細(xì)胞結(jié)合的β_淀粉樣肽。優(yōu)選地，所述蛋白增溶劑以緩沖溶液的形式存在于溶液中使得蛋白增溶劑的添加不會(huì)導(dǎo)致樣品pH的大幅改變。術(shù)語(yǔ)“蛋白增溶劑”當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指能夠改變多肽的二級(jí)、三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)同時(shí)保留一級(jí)結(jié)構(gòu)完整的任何化合物或組合物。由于這些性質(zhì)，蛋白增溶劑能夠增加樣品中蛋白的溶解度以及防止蛋白的分子間和分子內(nèi)聚集。適合于在本發(fā)明中使用的蛋白增溶劑包括，不限于，洗滌劑、離液劑、還原劑及其混合物。術(shù)語(yǔ)“洗滌劑”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，通常作為表面活性劑的同義詞使用，是指兩親性表面活性劑，其當(dāng)加入至液體時(shí)，與缺少洗滌劑時(shí)的相同液體相比，減少液體的表面張力。洗滌劑還能夠防止蛋白的聚集和防止污染物與目的蛋白的非特異性相互作用或結(jié)合。 適合于在本發(fā)明中使用的洗滌劑包括，不限于，非離子(中性)、陰離子、陽(yáng)離子或兩性離子洗滌劑。 非離子或中性洗滌劑的實(shí)例包括，不限于，Tween系列的洗滌劑，諸如Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 61、Tween 65、Tween 80、 Tween 81、Tween 85 ；Span⑩系列的洗滌劑，諸如Span 20 ；TergitoI系列的洗滌劑，諸如 Tergitol 型號(hào) 15-S-12系列的洗滌劑，諸如Brij 35、Brp> 56、Brij 72、Brij 76、Brij 92V、Brij 97、Brij 58P ；Tween 系列的洗滌劑，諸如Tween 20、 Tween. 2l、Tween 40 > Tween 60、Tween ⑩ 6l、Tween 65 > Tween 80、Tween 81、Tween 85 ; Triton 系列的洗漆劑，諸如Triton⑩ X-100、Triton X-114、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton⑩ X-102、 Triton X-15 > Triton X-151>TritonC X-207> Triton X-165> Triton X-305> Triton X-405、Triton X~45> Triton X-705-70,或至少一種所述洗滌劑的非尚子保守的變體。陰離子洗滌劑的實(shí)例包括，不限于，膽酸及其衍生物，?；悄懰?、TritonX-200, Triton ff-30、Triton-30、Triton-770、磺基丁二酸二辛酯、N5N- 二甲基十二烷基胺 N-氧化物、I-烷基磺酸鈉、N-月桂酰肌氨酸或脂肪酸鹽。陽(yáng)離子洗滌劑的實(shí)例包括，不限于，一和二-甲基脂肪胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基胺乙酸鹽、三烷基乙酸銨、烷基二甲基芐基銨鹽、二烷基甲基芐基銨鹽、 齒化燒基卩比淀鐵和燒基(燒基取代的)卩比淀鐵鹽、燒基甲硫基卩比淀鐵鹽、燒基酸胺基甲基批淀鐵鹽、燒基喧琳鐵鹽、燒基異喧琳鐵鹽、N，N-燒基甲基批略燒鐵鹽、I，I- _■燒基喊淀鐵鹽、4,4- _■燒基硫嗎琳鐵鹽、4,4-而燒基硫嗎琳鐵-I-氧化物鹽、甲基二(燒基乙基)~2~燒基甲基硫酸咪唑鎗鹽(和其他鹽類)、甲基雙(烷基酰胺基乙基)-2_羥乙基甲基硫酸銨(和其他鹽類)、烷基酰胺基丙基一二甲基芐基銨鹽、羧基烷基-烷基二甲基銨鹽、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡啶鎗)鹽、聚(乙烯基吡啶)鹽、聚乙烯亞胺、 二燒基鱗碳酸龜!鹽(和其他鹽類)、二燒基甲基鱗鹽、燒基乙基甲基琉鹽和燒基_■甲基氧化琉鹽。兩性離子洗滌劑的實(shí)例包括，不限于，3_[ (3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-I-丙磺酸鹽(CHAPS) ;3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-I-丙磺酸鹽(CHAPSO)； N-(烷基C10-C 16)-N, N-二甲基甘氨酸甜菜堿(EMPIGEN BB);硫代甜菜堿(SB3-10)；
3-[N, N- 二甲基(3-肉豆蘧?；被?銨基]丙磺酸鹽(酰胺基磺基甜菜堿-14 ； ASB-14) ;N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨基-I-丙磺酸鹽(3_14洗滌劑；ZWITTERGENT)； N-十二烷基-N，N' - 二甲基-3-銨基-I-丙磺酸鹽；N-十八烷基-N，N-二甲基-3-銨基-I-丙磺酸鹽；N-癸基-N,N-二甲基-3-銨-I-丙磺酸鹽；Mirataine CB ；Mirataine BB; Mirataine CBR ；Mirataine ACS ；Miracare2MHT 和 Miracare 2MCA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白增溶劑是洗滌劑。在另外更優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌劑是Tween 20。在另外更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tween 20以O(shè). 5%的濃度使用?！半x液劑”，當(dāng)在本文中使用時(shí)涉及破壞蛋白之間和蛋白內(nèi)的氫鍵和疏水相互作用化合物或化合物的混合物。當(dāng)以高濃度使用時(shí)，離液劑破壞二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)并使否則為不溶的蛋白進(jìn)入溶液中。合適的離液劑包括，不限于，尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉(NaSCN)、鹽酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀、或三氟乙酸銫。術(shù)語(yǔ)“還原劑”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指將巰基保持在還原狀態(tài)并且還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵的任何化合物或物質(zhì)。作為實(shí)例，適合于本發(fā)明的方法的還原劑包括巰基或膦還原劑。巰基還原劑的實(shí)例包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)和β-巰基乙醇。膦還原劑的實(shí)例包括三丁基膦(TBP)和三-羧基乙基膦(TCEP)。典型地，生物樣品首先被處理以去除細(xì)胞級(jí)分。然后無(wú)細(xì)胞樣品與蛋白增溶劑接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品使用包含蛋白增溶劑的緩沖液稀釋。典型地，樣品在包含 Tween 20的緩沖溶液中稀釋5倍?！ぎ?dāng)在本文中使用時(shí)，“緩沖溶液”是能夠中和酸和堿兩者而一點(diǎn)也不會(huì)改變?nèi)芤旱某跏妓岫然驂A度的處于溶液中的任何物質(zhì)或化合物的混合物。待在本發(fā)明的方法中使用的合適的緩沖溶液包括，不限于，Tris緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液、碳酸鹽緩沖溶液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液等。優(yōu)選地，緩沖溶液是磷酸鹽緩沖溶液諸如磷酸鹽-緩沖鹽水或PBS。加入至生物樣品的包含蛋白增溶劑的溶液的量不是至關(guān)重要的，只要實(shí)現(xiàn)淀粉樣肽的充分解離即可。作為實(shí)例，生物流體可以在包含蛋白增溶劑的溶液中以至少 1/2 (ν/ν)、1/3 (ν/ν)、1/4 (ν/ν)、1/5 (ν/ν)、1/6 (ν/ν)、1/7 (ν/ν)、1/8 (ν/ν)、1/9 (ν/ν)、 1/10 (ν/ν)、1/20 (ν/ν)、1/50 (ν/ν)、1/60 (ν/ν)、1/80 (ν/ν)、1/90 (ν/ν)、1/100 (ν/ν)或更大的稀釋度稀釋。專業(yè)技術(shù)人員將理解，可以使用所述稀釋率的任意組合和所述蛋白增溶劑濃度的任意組合，只要蛋白增溶劑的終濃度足以達(dá)到所需的作用即可。例如，包含蛋白增溶劑的溶液可以包含濃度在O. 001%至O. 5% (w/v)范圍的所述選擇的一種或多種蛋白增溶齊U。在包含蛋白增溶劑的所述溶液中已經(jīng)稀釋后，所述生物流體典型地含有處于小于O. I % (w/v)、優(yōu)選小于O. 6% (w/v)、更優(yōu)選不多于O. 5% (w/v)、最優(yōu)選不多于O. 45% (w/v)和甚至最優(yōu)選O. 5%的所述一種或多種表面活性劑。用于本發(fā)明的合適的緩沖體系包括Tris-HCl緩沖液，其包含鹽諸如NaCl或KCl 和，任選地包含BSA。具體的緩沖體系包括，不限于，50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，O. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20, IM GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20, IM GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-80 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-80 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl ；0. 05% ；BSA,0. 05% Triton X-100
50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0· 05% ；BSA,0. 05% Triton X-100 ；50mM Tris-HCl pH 8 ；0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 1% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 1% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 1% ；BSA,0. 1% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，IM NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，I. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；
50mM Tris-HCl pH 8，2M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，2，5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，3M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl,0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20,10% DMSO ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20,0. 5M GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 6,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 7,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 9,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl,0. 05% ;BSA。例如，當(dāng)Tween 20用作蛋白增溶劑時(shí)，優(yōu)選的濃度為0. 004-0. 02 %，更優(yōu)選 O. 005-0. 01% (w/v) ο優(yōu)選在低溫下進(jìn)行接觸步驟以便抑制樣品中存在的蛋白水解活性。合適的溫度為約0-10攝氏度，優(yōu)選約3-5攝氏度，例如，約4攝氏度。一旦生物流體與包含蛋白增溶劑的溶液接觸，兩種流體就可以被混合?；旌峡梢酝ㄟ^攪拌，優(yōu)選通過搖動(dòng)，更優(yōu)選通過高速搖動(dòng)，最優(yōu)選通過渦旋至少5秒、優(yōu)選至少10秒、 更優(yōu)選至少15秒(例如，15-50秒)來進(jìn)行。所述混合、攪拌、搖動(dòng)、高速搖動(dòng)或渦旋的有利速度包括至少250rpm、優(yōu)選至少500rpm、更優(yōu)選至少1，OOOrpm、最優(yōu)選約2，000-2, 500rpm 的速度。在適于實(shí)現(xiàn)β_淀粉樣肽從生物樣品中存在的蛋白和脂質(zhì)部分地或優(yōu)選全部解離的條件下來進(jìn)行接觸步驟。所述條件可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過監(jiān)測(cè)在接觸步驟前可檢測(cè)到的β-淀粉樣肽的量和在已經(jīng)進(jìn)行接觸步驟后不同的時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行性地監(jiān)測(cè) β-淀粉樣肽的量來適當(dāng)?shù)卮_定。時(shí)程實(shí)驗(yàn)可以如實(shí)驗(yàn)部分的實(shí)施例中所述進(jìn)行確定。專業(yè)技術(shù)人員要理解的是當(dāng)通過用包含蛋白增溶試劑的緩沖液稀釋生物樣品來測(cè)定β-淀粉樣肽的水平時(shí)，通過免疫學(xué)測(cè)定獲得的游離β -淀粉樣肽的水平要進(jìn)行校正以便考慮先前應(yīng)用于生物樣品的稀釋因子。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟α)中確定的參數(shù)為選自由下列各項(xiàng)組成的組的一種或多種參數(shù)所述受試者的生物樣品中游離ΑΒΕΤΑ40肽的水平 (此后稱為lab40或UP Αβ (1-40))，生物樣品中的游離ΑΒΕΤΑ40肽和如上所述獲得的與所述生物樣品的成分締合的ABETA40肽的合計(jì)水平(此后稱為2ab40或DP A β (1-40))，生物樣品中的游離ΑΒΕΤΑ42肽的水平(此后稱為lab42或UP Αβ (1-42))和生物樣品中的游離 ABETA42肽和如上所述獲得的與所述生物樣品的成分締合的ABETA42肽的合計(jì)水平(此后稱為 2ab42 或 DP Αβ (1-42))
術(shù)語(yǔ)“與細(xì)胞締合的β_淀粉樣肽”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指與生物樣品中存在的細(xì)胞表面非共價(jià)締合并且不能被利用用于與添加至樣品的抗體結(jié)合，因此不能被免疫學(xué)檢測(cè)到的β_淀粉樣肽。典型地，如果生物樣品是血液，則β_淀粉樣肽締合至紅細(xì)胞、白細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，以及血小板?？梢源_定指定樣品中與細(xì)胞締合的β_淀粉樣肽的量，并且該值可以單獨(dú)使用或結(jié)合本發(fā)明的方法中的涉及β_淀粉樣肽的其他參數(shù)一起使用。為此目的，首先需要從生物樣品中分離細(xì)胞級(jí)分。這可以使用專業(yè)技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，諸如離心、沉降、過濾等。一旦生物樣品的細(xì)胞級(jí)分已經(jīng)被分離，則將細(xì)胞與蛋白增溶劑接觸。合適的蛋白增溶劑包括如上所定義的洗滌劑、離液劑和還原劑，并且通常在緩沖溶液中以適宜的濃度提供。合適的試劑、緩沖溶液和緩沖溶液中試劑的濃度已經(jīng)在上面進(jìn)行了描述。接觸步驟基本上如上面在釋放與生物樣品的成分(蛋白和脂質(zhì))連接的淀粉樣肽的方法中所解釋的那樣進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白增溶劑是洗滌劑。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗漆劑是Tween 20。用作蛋白增溶劑的Tween 20的合適濃度如上面所定義，即，O. 004-0. 02%,更優(yōu)選 O. 005-0. 01% (w/v)。優(yōu)選在低溫下進(jìn)行接觸步驟以便抑制樣品中存在的蛋白水解活性。合適的溫度為約0-10攝氏度，優(yōu)選約3-5攝氏度，例如，約4攝氏度。典型地，接觸步驟通過用包含蛋白增溶劑的溶液重懸浮生物樣品中的細(xì)胞級(jí)分來進(jìn)行。所述重懸浮 可以通過輕柔地上下吹吸，通過攪拌，優(yōu)選通過搖動(dòng)，更優(yōu)選通過高速搖動(dòng)，最優(yōu)選通過渦旋至少5秒，優(yōu)選至少10秒，更優(yōu)選至少15秒(例如，15-50秒)來進(jìn)行。 所述混合、攪拌、搖動(dòng)、高速搖動(dòng)或潤(rùn)旋的有利速度包括至少250rpm、優(yōu)選至少500rpm、更優(yōu)選至少1，OOOrpm、最優(yōu)選約2，000-2, 500rpm的速度。在足以實(shí)現(xiàn)淀粉樣肽從生物樣品中存在的細(xì)胞部分地或優(yōu)選全部解離的條件下來進(jìn)行接觸步驟。所述條件可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過監(jiān)測(cè)在接觸步驟前可檢測(cè)到的β_淀粉樣肽的量和在已經(jīng)進(jìn)行接觸步驟后不同的時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行性地監(jiān)測(cè)β_淀粉樣肽的量來適當(dāng)?shù)卮_定。時(shí)程實(shí)驗(yàn)可以如實(shí)驗(yàn)部分的實(shí)施例中所述進(jìn)行確定。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟(i)中確定的參數(shù)為選自由下列各項(xiàng)組成的組的一種或多種參數(shù)與生物樣品中存在的細(xì)胞締合的ABETA40的水平 (此后稱為3ab40或CB Αβ (1_40))和與生物樣品中存在的細(xì)胞締合的ΑΒΕΤΑ42的水平(此后稱為 3ab42 或 CB A β (1-42))。本發(fā)明的方法的下列步驟包括將參數(shù)(b)或(C)中的至少一個(gè)的值或由參數(shù)(a) 至(C)中的一個(gè)或多個(gè)算術(shù)組合產(chǎn)生的計(jì)算參數(shù)的值與參比樣品中對(duì)應(yīng)于所述參數(shù)(b)或 (C)或所述計(jì)算參數(shù)的值的參比值進(jìn)行比較；其中(a)、(b)和(C)已經(jīng)在上面被詳細(xì)地定義，并且分別對(duì)應(yīng)于所述受試者的生物樣品中游離淀粉樣肽的水平(a)，所述受試者的生物樣品中的游離淀粉樣肽和與所述生物樣品中存在的大分子成分締合的所述β_淀粉樣肽的合計(jì)水平(b)以及與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的β_淀粉樣肽的水平
(C)。在本發(fā)明的方法的步驟(ii)中使用的參數(shù)是直接參數(shù)，即，可以如上面所定義的那樣直接測(cè)定的參數(shù)，其對(duì)應(yīng)于前面被定義為2ab40、3ab40、2ab42和3ab42的那些。備選地，還能夠?qū)⒁环N或多種直接參數(shù)算術(shù)組合以便獲得計(jì)算參數(shù)。在實(shí)踐中，兩種以上參數(shù)的任意算術(shù)組合可以具有診斷價(jià)值的計(jì)算參數(shù)，包括加法、減法、乘法、除法和它們的組合。用于本發(fā)明的方法中的具體計(jì)算標(biāo)志物包括，不限于，2ab40/2ab42、 3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、lab40+2ab40、lab40+3ab40、2ab40+3ab40、 Iab40+2ab40+3ab40>Iab42+2ab42>Iab42+3ab42> 2ab42+3ab42>Iab42+2ab42+3ab42、 Iab40+2ab40+lab42+2ab42>Iab40+3ab40+lab42+3ab42> 2ab40+3ab40+2ab42+3ab42> Iab40 + 2ab40 + 3ab40 + lab42 + 2ab42 + 3ab42、(Iab40 + 2ab40)/(Iab42 + 2ab42)、 (Iab40+3ab40)/(Iab42+3ab42)、 (2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、 (Iab40+2ab403ab40)/ (Iab42+2ab42+3ab42)、 (Iab42+2ab42)/(Iab40+2ab40)、 (Iab42+3ab42)/(Iab40+3ab40)、 (2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、 (Iab42+2ab423ab42)/(Iab40+2ab40+3ab40)、 2ab40-lab40、2ab42-lab42y (2ab40_lab40) / (2ab42_lab42)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，計(jì)算參數(shù)由2ab40和3ab40參數(shù)相加得到(此后稱為T40)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，計(jì)算參數(shù)由2ab42和3ab42參數(shù)相加得到(此后稱為T42)。還在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，計(jì)算參數(shù)由2ab40、3ab40、2ab42和3ab42參數(shù)相加得到(此后稱為T-β APB)。術(shù)語(yǔ)“參比值”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指用于比較并且已經(jīng)在未患 有神經(jīng)退行性疾病或沒有任何神經(jīng)退行性疾病史的受試者中測(cè)定的參數(shù)的值。優(yōu)選地，從其獲得用于不同參數(shù)和計(jì)算參數(shù)的參比值的受試者是顯示沒有記憶主訴，在神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試中表現(xiàn)正常且在MRI中沒有結(jié)構(gòu)改變的患者。具體地，選擇參比值，能夠獲得大于85%的靈敏度和大于75%的特異性。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇參比值以便獲得大于70%的靈敏度和大于70%的特異性。優(yōu)選地，參比值能夠獲得具有至少80%的準(zhǔn)確度或精確度的預(yù)測(cè)。在本發(fā)明的方法的步驟(iii)中，使用特定組的標(biāo)志物或計(jì)算標(biāo)志物來進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的診斷，對(duì)神經(jīng)退行性疾病之前的階段的檢測(cè)或神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)退行性疾病之前的階段的區(qū)分，所述特定組的標(biāo)志物或計(jì)算標(biāo)志物提供特別適宜的特異性和靈敏度水平。因此，在具體實(shí)施例中，神經(jīng)退行性疾病的診斷通過比較選自由3ab40和2ab42組成的組的參數(shù)的值或選自由2ab40+3ab40和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42組成的組的計(jì)算參數(shù)的值來進(jìn)行。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，對(duì)神經(jīng)退行性疾病之前的階段的檢測(cè)通過比較選自由2ab40、3ab40和2ab42組成的組的參數(shù)的值或選自由 2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+ 3ab42、lab40+2ab40+3ab40，lab42+2ab42+3ab42、lab40+lab42+2ab42+3ab42， Iab40+2ab40+lab42+2ab42 和 Iab40+3ab40+lab42+3ab42 組成的組的計(jì)算參數(shù)的值來進(jìn)行。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段的區(qū)分通過比較選自由3ab40和2ab42組成的組的參數(shù)的值或通過比較選自由2ab40+3ab40、 2ab40+3ab40+2ab42+3ab42 和 Iab40+2ab40+lab42+2ab42 組成的組的計(jì)算參數(shù)的值來進(jìn)行。用于本發(fā)明的不同診斷方法的適當(dāng)參比值概括在表I中。
權(quán)利要求
1.診斷受試者中的神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段的方法，所述方法包括以下步驟 (i)確定選自以下的一種或多種參數(shù) (a)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離的￠-淀粉樣肽的水平， (b)所述受試者的生物樣品中一種或多種游離淀粉樣肽和與所述生物樣品中存在的大分子成分締合的所述一種或多種3 -淀粉樣肽的合計(jì)水平，其中所述合計(jì)水平通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述￠-淀粉樣肽與所述生物樣品中存在的成分解離的條件下接觸后定量所述樣品的無(wú)細(xì)胞級(jí)分中所述一種或多種￠-淀粉樣肽的量來確定， (C)與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的一種或多種￠-淀粉樣肽的水平，其中所述水平通過分離所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分，將所述樣品的所述細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)一種或多種所述P-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸來確定；以及 (ii)將參數(shù)(b)或(c)中的至少一個(gè)的值或由參數(shù)(a)至(c)中的至少兩個(gè)算術(shù)組合產(chǎn)生的計(jì)算參數(shù)的值與參比樣品中對(duì)應(yīng)于所述參數(shù)(b)或(C)或所述計(jì)算參數(shù)的值的參比值進(jìn)行比較；以及 (iii)當(dāng)所述參數(shù)的值或所述計(jì)算參數(shù)的值相對(duì)于所述參比值存在改變時(shí)，診斷所述神經(jīng)退行性疾病、檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中在步驟(i)中確定的參數(shù)是選自下列的一個(gè)或多個(gè)參數(shù) (a)lab40，對(duì)應(yīng)于所述受試者的生物樣品中游離ABETA40肽的水平， (b)lab42，對(duì)應(yīng)于所述受試者的生物樣品中游離ABETA42肽的水平， (c)2ab40，對(duì)應(yīng)于所述受試者的生物樣品中游離ABETA40肽和與所述生物樣品的成分締合的ABETA40肽的合計(jì)水平，其中通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)ABETA40肽與所述生物樣品中存在的所述成分解離的條件下接觸后定量所述樣品中的ABETA40肽的量來確定2ab40， (d)2ab42，對(duì)應(yīng)于所述受試者的生物樣品中的游離ABETA42肽和與所述生物樣品的成分締合的ABETA42肽的合計(jì)水平，其中通過在將所述樣品與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)ABETA42肽與所述生物樣品中存在的所述成分解離的條件下接觸后定量所述樣品中的ABETA42肽的量來確定2ab42， (e)3ab40,對(duì)應(yīng)于與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的ABETA40肽的水平，其中通過在將所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)￠-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸后定量ABETA40肽的量來確定3ab40，和 (f)3ab42，對(duì)應(yīng)于與所述受試者的生物樣品中的細(xì)胞締合的ABETA42肽的水平，其中通過在將所述生物樣品的細(xì)胞級(jí)分與蛋白增溶劑在足以促進(jìn)￠-淀粉樣肽與所述樣品中存在的所述細(xì)胞解離的條件下接觸后定量ABETA42肽的量來確定3ab42。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(ii)中獲得的所述計(jì)算參數(shù)選自下組2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、lab40+2ab40、lab40+3ab40、2ab40+3ab40、lab40+2ab40+3ab40、lab42+2ab42、lab42+3ab42、2ab42+3ab42、Iab42+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+lab42+2ab42、lab40+3ab40+lab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42Uab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42, (Iab40+2ab40) /(Iab42+2ab42)、(Iab40+3ab40)/(Iab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(Iab40 + 2ab403ab40)/ (Iab42+2ab42 + 3ab42)、(Iab42 + 2ab42)/ (Iab40+2ab40)、(Iab42+3ab42)/(Iab40+3ab40)、 (2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、 (Iab42+2ab42+3ab42)/(Iab40+2ab40+3ab40)、2ab40-lab40、2ab42_lab42 和(2ab40_lab40)/(2ab42_lab42)。
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其中 (i)通過比較選自由3ab40和2ab42組成的組的參數(shù)的值或選自由2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42組成的組的計(jì)算參數(shù)的值進(jìn)行對(duì)神經(jīng)退行性疾病的診斷， (ii)通過比較選自由2ab40、3ab40、lab42和2ab42組成的組的參數(shù)的值或選自由 2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42、Iab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+lab42+2ab42 和 Iab40+3ab40+lab42+3ab42 組成的組的計(jì)算參數(shù)的值進(jìn)行對(duì)神經(jīng)退行性疾病之前的階段的檢測(cè)，或 (iii)通過比較由3ab40和2ab42組成的組的參數(shù)的值或通過比較由2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42 和 Iab40+2ab40+lab42+2ab42 組成的組的計(jì)算參數(shù)的值區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(ii)中用來比較所述參數(shù)的值或所述計(jì)算參數(shù)的值的所述參比值選自以下 (i)當(dāng)所述參數(shù)2ab40用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為63.8pg/ml, (ii)當(dāng)所述參數(shù)3ab40用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為71.9pg/ml, (iii)當(dāng)所述參數(shù)3ab40用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為71.lpg/ml, (iv)當(dāng)所述參數(shù)3ab40用于區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為 211. 3pg/ml, (V)當(dāng)所述參數(shù)2ab42用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為47. 4pg/ml, (vi)當(dāng)所述參數(shù)2ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為50.3pg/ml, (vii)當(dāng)所述參數(shù)2ab42用于區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為 151. 7pg/ml， (viii)當(dāng)所述參數(shù)為3ab42且用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為76.9pg/ml, (ix)當(dāng)所述參數(shù)為3ab42且用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為58.8pg/ml, (X)當(dāng)所述參數(shù)2ab40+3ab40用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為132. 7pg/ml, (xi)當(dāng)所述參數(shù)2ab40+3ab40用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為132.7pg/ml, (xii)當(dāng)所述參數(shù)2ab40+3ab40用于區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為550. 8pg/ml， (xiii)當(dāng)所述參數(shù)為2ab42+3ab42且用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為115.8pg/ml， (xiv)當(dāng)所述參數(shù)為2ab42+3ab42且用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為103.3pg/ml,(XV)當(dāng)所述參數(shù)2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為235. 5pg/ml, (xvi)當(dāng)參數(shù)2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為235.5pg/ml, (xvii)當(dāng)所述參數(shù)2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為778. lpg/ml， (xviii)當(dāng)所述參數(shù)Iab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾 病之前的階段時(shí)為272. lpg/ml， (xix)當(dāng)所述參數(shù)Iab40+2ab40+3ab40用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為 155.8pg/ml, (xx)當(dāng)所述參數(shù)Iab42+2ab42+3ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為124.3pg/ml,(xxi)當(dāng)所述參數(shù)Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于診斷神經(jīng)退行性疾病時(shí)為158.3pg/ml, (xxii)當(dāng)參數(shù)Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為142. 4pg/ml, (xxiii)當(dāng)所述參數(shù)Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為161. 2pg/ml,以及 (xxiv)當(dāng)所述參數(shù)Iab40+3ab40+lab42+3ab42用于檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段時(shí)為 154. 7pg/ml。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述參數(shù)的值或所述計(jì)算參數(shù)的值相對(duì)于所述參比值的改變是增加。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白增溶劑是洗滌劑，優(yōu)選Tween20。
8.權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品是血漿或血液。
9.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中Iab40、lab42、2ab40、2ab42、3ab40和3ab42中的至少一種或多種的確定步驟通過免疫學(xué)方法來進(jìn)行。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述免疫學(xué)方法是ELISA測(cè)定。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述ELISA測(cè)定是ELISA夾心測(cè)定。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述ELISA夾心測(cè)定中的捕獲抗體是針對(duì)P-淀粉樣肽的N-末端區(qū)的抗體。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的N-末端區(qū)的抗體針對(duì)位于ABETA40和ABETA42的氨基酸I至7內(nèi)的表位。
14.權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ELISA夾心測(cè)定中的檢測(cè)抗體是對(duì)位于￠-淀粉樣肽的C-末端區(qū)中的表位特異的抗體。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中對(duì)所述￠-淀粉樣肽的C-末端區(qū)特異的抗體選自下列 (i)針對(duì)對(duì)應(yīng)于ABETA42肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異性地結(jié)合ABETA42，但與ABETA40不產(chǎn)生任何實(shí)質(zhì)性的交叉反應(yīng)，(ii)針對(duì)對(duì)應(yīng)于ABETA40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異性地結(jié)合ABETA40，但與ABETA42不產(chǎn)生任何實(shí)質(zhì)性的交叉反應(yīng)，和 (iii)同時(shí)識(shí)別ABETA40和ABETA42兩者的C-末端區(qū)的抗體和(iv)⑴和(ii)項(xiàng)所述的抗體的組合。
16.權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中該檢測(cè)抗體使用對(duì)所述抗體顯示親和性的試劑進(jìn)一步檢測(cè)，所述試劑與結(jié)合對(duì)的第一成員偶聯(lián)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中使用與可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)的結(jié)合對(duì)的第二成員進(jìn)行所述檢測(cè)。
18.權(quán)利要求I至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病和/或所述神經(jīng)退行性疾病之前的階段是輕度認(rèn)知損害。
19.一種用于測(cè)定生物樣品中的￠-淀粉樣肽的試劑盒，其包含 (i)蛋白增溶劑，和 (ii)至少一種針對(duì)￠-淀粉樣肽的抗體。
20.權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述蛋白增溶劑是洗滌劑，優(yōu)選Tween20。
21.權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中至少一種針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的抗體選自下列 (i)針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的N-末端區(qū)的抗體， (ii)針對(duì)所述P-淀粉樣肽的C-末端區(qū)的抗體，以及 (iii)針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的N-末端區(qū)的抗體和針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的C-末端區(qū)的抗體的組合。
22.權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的N-末端區(qū)的抗體針對(duì)位于ABETA40和ABETA42的氨基酸I至16內(nèi)的表位和/或其中對(duì)所述P -淀粉樣肽的C-末端區(qū)特異的抗體選自下列 (i)針對(duì)對(duì)應(yīng)于ABETA42肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異性地結(jié)合ABETA42，但與ABETA40不產(chǎn)生任何實(shí)質(zhì)性的交叉反應(yīng)， (ii)針對(duì)對(duì)應(yīng)于ABETA40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異性地結(jié)合ABETA40，但與ABETA42不產(chǎn)生任何實(shí)質(zhì)性的交叉反應(yīng)，和 (iii)同時(shí)識(shí)別ABETA40和ABETA42兩者的C-末端區(qū)的抗體和(iv)⑴和(ii)項(xiàng)所述的抗體的組合。
23.權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中針對(duì)所述￠-淀粉樣肽的所述抗體與固相載體偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷神經(jīng)退行性疾病，檢測(cè)神經(jīng)退行性疾病之前的階段或基于β-淀粉樣肽的特定池的水平以及特定的計(jì)算參數(shù)區(qū)分神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)退行性疾病之前的階段的方法，所述β-淀粉樣肽的特定池與血漿成分結(jié)合或與血細(xì)胞結(jié)合，所述特定的計(jì)算參數(shù)通過一個(gè)或多個(gè)的淀粉樣肽水平的算術(shù)組合獲得。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施上述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102713633SQ201080062241
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者J·曼紐爾·薩拉薩巴里歐 申請(qǐng)人:艾拉科隆生物技術(shù)公司