專利名稱：一種制備β-淀粉樣多肽1-42純品的方法
一種制備P -淀粉樣多肽1-42純品的方法技術(shù)領(lǐng)域-本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法，特別涉及一種利用高效液相色譜制備e-淀粉樣多肽1-42純品的方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer' sDisease, AD)是一種發(fā)病率高、危害極大的中樞 神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床癥狀是智力進行性減退，特征性病理學(xué)改變是老年斑，神經(jīng)元纖維纏結(jié)，以海馬、皮層區(qū)域為主的神經(jīng)元數(shù)目減少。e-淀粉樣多肽1-42 (Amyloid 0 1-42 p印tide，簡稱A P 42)是存在于阿爾茨海默病患者腦組 織中的特異病理改變之物，同時它在AD患者的腦積液及血漿中有所改變。研究表 明Amyloid e 1-42 p印tide在腦內(nèi)的沉積是阿爾茨海默病的主要原因，因此純品 Amyloide 1-42 p印tide對阿爾茨海默病的病理研究有非常重要的作用。目前對Amyloid P卜42 p印tide粗品的制備方法報道的很少，而使用高效液 相色譜方法進行制備的報道僅有一篇(Vydac Advance, 1997)，且要求有柱溫箱， 使用的流動相體系比較繁瑣，不利于用于生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用高效液相色譜方法制備Amyloid e 1-42 p印tide 純品的方法。以解決現(xiàn)有高效液相色譜方法進行制備存在的設(shè)備要求高、使用的 流動相體系比較繁瑣的技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種制備e-淀粉樣多肽1-42純品的方法，采用高效液相色譜方法。包括以 下步驟1、 e-淀粉樣多肽1-42粗品的溶解在乙腈水溶液中，超聲處理，濾膜過濾, 取濾液待用。2、 以高效液相色譜儀對過濾后粗品進行制備，通過制備色譜柱采用紫外檢 測器對樣品進行監(jiān)測，分段收集需要的目標產(chǎn)物，制備色譜條件為色譜柱PLRP-S (剛性聚合物填料)，10-15um， 21. 2X250mra(L D)，流動相A: 100%水/0. 1-0.2%三氟乙酸 B: 100%乙腈/0. 1-0.2%三氟乙酸時間(min) A B0. 01 90-70% 10-30%25 10-30% 70-90%30 90-70% 10-30%流速15ml/min 波長220nm3、 以分析高效液相色譜儀對收集到的目標產(chǎn)物進行檢測，將含量95%以上部 分合并為合格產(chǎn)品。4、 將合格產(chǎn)品進行濃縮、冷凍干燥，得到白色絮狀粉末產(chǎn)品，經(jīng)檢測合格 即為最終產(chǎn)品。按照本發(fā)明，所述的Amyloide 1-42 p印tide的高效液相色譜制備方法，色 譜柱是使用聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料。本發(fā)明所述的流動相體系為水、乙腈體系，加入O. 1-0. 2%三氟乙酸作為離子 對試劑。本發(fā)明所用的樣品溶解條件為體積比乙腈水=30-50 : 70-50。 本發(fā)明所述的樣品上樣量為21. 2咖內(nèi)徑的制備柱每針上樣品100-200mg。 本發(fā)明的有益效果解決了現(xiàn)有Amyloid P 1-42 p印tide的純品制備方法使 用的流動相都比較繁瑣，而且要使用柱溫箱，增加了儀器的生產(chǎn)成本，也不利于 放大生產(chǎn)的技術(shù)問題，本發(fā)明所述的制備方法，使用的流動相是在高效液相色譜 中非常常用的試劑，除了高效液相色譜儀不再需要別的儀器，既節(jié)省成本又能夠 簡單、快速地得到需要的純品。


圖1為PLRP-S填料色譜柱的粗品色譜圖；圖2為C18鍵合相填料色譜柱的粗品色譜圖；圖3為三氟乙酸乙腈由30%到50%的制備色譜圖；圖4為三氟乙酸乙腈由10-30%到90_70%的制備色譜圖；圖5為合格產(chǎn)品的檢測色譜圖。
具體實施例方式6-淀粉樣多肽1-42粗品的溶解，過濾稱取100-200mge-淀 粉樣多肽1-42粗品溶于10ml的乙腈水溶液中，乙腈水溶液由30-50%乙腈與 70-50%水的混配，超聲處理，待樣品完全澄清，用0.45 y有機相濾膜(上海亞 東核級樹脂有限公司)過濾，取濾液待用。 色譜條件北京創(chuàng)新通恒科技有限公司的LC3000制備型高液相色譜儀(高壓雙泵，紫 外檢測器)，CXTH-3000色譜工作站。流動相A:濃度為0. 1-0.2%三氟乙酸的水 溶液，B:濃度為O. 1-0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分鐘A:B由90-70:10-30 到10-30:90-70;流速15ml/min;波長220nm;色譜柱:PLRP-S， 10-15線21.2 X250mm(I.D);進樣量100-200mg/10ml。色譜條件的選擇1. 1色譜柱的選擇AmyloidP1-42 p印tide的性質(zhì)及序列使它在色譜柱中極易造成峰形擴散， 出現(xiàn)在色譜圖中找不到目標峰的現(xiàn)象，而且我們需要的目標峰并不是色譜圖中的 主峰，因此我們的色譜條件必須使目標峰盡可能的明顯，這樣才能很好的收集到 需要的目標物。分別對以硅膠為基質(zhì)的C18鍵合相填料和以聚苯乙烯-聚乙烯基 苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料進行比較分析，發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質(zhì)的 聚合物樹脂填料(Varian公司的PLRP-S柱)做樣的峰形雖有擴散，但有明顯的 峰形，能收到合格的產(chǎn)品(見圖1)，而另一種C18鍵合相填料己找不到需要的 目標峰的位置，峰形完全擴散，無法收到目標物(見圖2)，故選擇聚苯乙烯-聚 乙烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料作為色譜柱的填料。1.2流動相的選擇分別選用制備多肽常用的乙腈、水加三氟乙酸體系及乙腈、醋酸胺緩沖液體 系，發(fā)現(xiàn)兩種體系分離效果基本一樣，沒有什么區(qū)別，故選用更易配制的乙腈、 水加三氟乙酸體系。1.3梯度的選擇分別用極寬的梯度乙腈由10-30%到90-70%和較窄的梯度乙腈由30%到50%來 做樣，發(fā)現(xiàn)窄梯度下樣品擴散厲害，不能形成一個明顯的峰(見圖3)，根本無 法判斷目標峰的具體保留時間，因此收不到合格的產(chǎn)品，而用寬梯度做樣，可以形成一個明顯的目標峰(見圖4)，能夠很容易的收到需要的目標產(chǎn)物，經(jīng)檢測 產(chǎn)品也能合格(見圖5)，故選用寬梯度做為色譜條件。上樣量的選擇樣品的溶解性不太好，以流動相試劑水和乙腈溶解(比例為乙腈水 =30-50:70-50)，根據(jù)制備柱內(nèi)徑及長度(21. 2X250mm(I. D))分別上不同的樣 品量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100-200mg的上樣量比較合適，樣品量太低雖然峰形更好些但 從制備成本上考慮不合算，成倍太高，而樣品量太高分離度降低了，收不到合格 的，故經(jīng)過不同上樣量的實驗發(fā)現(xiàn)100-200mg是這根柱子(21.2X250mra(I.D)) 的最佳上樣量。樣品含量的檢測以分析高效液相色譜儀對收集到的產(chǎn)品進行含量檢測，檢測器為紫外檢測 器，色譜柱為PLRP-S， 5線4.6X250mm(I.D),流動相A:濃度為0.1-0. 2%三 氟乙酸的水溶液，B:濃度為O. 1-0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分鐘A:B由 90-70:10-30到10-30:90-70,流速1. Oml/min,波長220nm,進樣量20n 1。由于 樣品的峰形擴散極為嚴重，只能以這種寬梯度來進行分析檢測，否則就不能形成 一個明顯的峰而變成一個很寬的鼓包從而無法判斷產(chǎn)品是否合格。最終凍干的成 品也以此法進行檢測。實施例1:上樣量為100mg，流動相A:濃度為0. 1%三氟乙酸的水溶液， B:濃度為0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，樣品溶解條件為體積比乙腈水=30: 70， 0到25分鐘A:B由90:10到10:90，其余同上。實施例2，上樣量為150rag，流動相A:濃度為0.15%三氟乙酸的水溶液， B:濃度為0.15%三氟乙酸的乙腈溶液，樣品溶解條件為體積比乙腈水=40: 60， 0到25分鐘A:B由80:20到20:80,其余同上。^施例3，上樣量為200mg，流動相A:濃度為0.2%三氟乙酸的水溶液， B:濃度為0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，樣品溶解條件為體積比乙腈水=50: 50， 0到25分鐘A:B由70:30到30:70，其余同上。
權(quán)利要求
1、一種制備β-淀粉樣多肽1-42純品的方法，采用高效液相色譜方法，其特征是包括以下步驟a、β-淀粉樣多肽1-42粗品的溶解在乙腈水溶液中，超聲處理，濾膜過濾，取濾液待用；b、以高效液相色譜儀對過濾后粗品進行制備，通過制備色譜柱采用紫外檢測器對樣品進行監(jiān)測，分段收集需要的目標產(chǎn)物，制備色譜條件為色譜柱PLRP-S，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，流動相A濃度為0.1-0.2％三氟乙酸的水溶液，B濃度為0.1-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液時間 A B0.01min90-70％10-30％25min 10-30％70-90％30min 90-70％10-30％流速15ml/min波長220nm；c、以分析高效液相色譜儀對收集到的目標產(chǎn)物進行檢測，將含量95％以上部分合并為合格產(chǎn)品；d、將合格產(chǎn)品進行濃縮、冷凍干燥，得到白色絮狀粉末產(chǎn)品，經(jīng)檢測合格即為最終產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備3 -淀粉樣多肽1-42純品的方法，其特 征是乙腈水溶液配置時體積比乙腈水=30_50:70-50。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備e-淀粉樣多肽1-42純品的方法，其特 征是所述的色譜柱內(nèi)裝填聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備e-淀粉樣多肽卜42純品的方法，其特 征是步驟b中的流動相梯度選擇0到25分鐘A:B由90-70:10-30到 10-30:90-70。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法，特別涉及一種利用高效液相色譜制備β-淀粉樣多肽1-42純品的方法。以解決現(xiàn)有高效液相色譜方法進行制備存在的設(shè)備要求高、使用的流動相體系比較繁瑣的技術(shù)問題。其制備條件為色譜柱PLRP-S，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，流動相A0.1-0.2％三氟乙酸水，B0.1-0.2％三氟乙酸乙腈，0到25分鐘A∶B由90-70∶10-30到10-30∶90-70，流速15ml/min，波長220nm，樣品濃度100-200mg/10ml，上樣量100-200mg。本發(fā)明所述的制備方法，使用的流動相是在高效液相色譜中非常常用的試劑，除了高效液相色譜儀不再需要別的儀器，既節(jié)省成本又能夠簡單、快速地得到需要的純品。
文檔編號C07K1/16GK101235076SQ20081004314
公開日2008年8月6日 申請日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日
發(fā)明者任麗萍, 徐紅巖, 李冬冬 申請人:吉爾生化(上海)有限公司