專利名稱：使用g-csf分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法，以及通過該方法獲得的 心肌細(xì)胞和分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑等。
背景技術(shù)：
心肌細(xì)胞盡管在出生前一邊自律搏動(dòng)一邊活躍地進(jìn)行細(xì)胞分裂，但出生后就喪失 了分裂能力，而且由于不具有未分化的前體細(xì)胞，因此如果心肌細(xì)胞由于處于心肌梗塞或 心肌炎等各種壓力下而死亡，則喪失的心肌細(xì)胞無法獲得補(bǔ)充。其結(jié)果是，殘存的心肌細(xì)胞 由于代償性肥大而保持心臟功能，但如果各種壓力持續(xù)，超過其允許范圍，則進(jìn)一步誘發(fā)心 肌細(xì)胞的疲憊、死亡，從而呈現(xiàn)心肌功能的降低(即心力衰竭)。 因此，可以認(rèn)為補(bǔ)充性移植衰弱或喪失的心肌細(xì)胞的方法對(duì)于心力衰竭的治療極 為有用。事實(shí)上，已知在使用動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中，一旦從胎兒中獲得未成熟的心肌細(xì)胞，將其移 植到成體心臟組織中，移植細(xì)胞就作為心肌細(xì)胞有效發(fā)揮作用(參照非專利文獻(xiàn)1)。但是， 該方法難以獲得大量的心肌細(xì)胞，從倫理的觀點(diǎn)考慮，也難以應(yīng)用于臨床醫(yī)療。
因此，由未分化的干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞，將其作為移植用細(xì)胞使用的方法 近年來尤為受到關(guān)注?，F(xiàn)在，由于在成體心臟組織中沒有發(fā)現(xiàn)可以明確鑒定為可以產(chǎn)生心 肌細(xì)胞的前體細(xì)胞或干細(xì)胞的細(xì)胞群，因此為了實(shí)施上述方法，可以考慮使用未分化的具 有更多分化能力的多能性干細(xì)胞。 所謂多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cells)，被定義為通過試管內(nèi)培養(yǎng)仍然 保持未分化狀態(tài)，基本可以持續(xù)地或長期地進(jìn)行細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，具 有在適當(dāng)?shù)臈l件下分化成所有三個(gè)胚層(外胚層、中胚層、和內(nèi)胚層)譜系的細(xì)胞的能力 的細(xì)胞?，F(xiàn)在，作為多能性干細(xì)胞，最熟知的是分離自早期胚胎的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells :ES細(xì)胞)和分離自胎兒期的原始生殖細(xì)胞的胚胚胎發(fā)育殖細(xì)胞(embryonic germ cells :EG細(xì)胞)、從成體骨髓中分離的成人型多能干細(xì)胞(multipotent adult progenitorcells :MAPC細(xì)胞)這3禾中。 從以前就知道，尤其是ES細(xì)胞，通過試管內(nèi)培養(yǎng)，可以分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞。初 期的研究基本都是使用小鼠來源的ES細(xì)胞進(jìn)行。若ES細(xì)胞在單一細(xì)胞狀態(tài)(通過實(shí)施 酶處理等使細(xì)胞之間不粘著，各個(gè)細(xì)胞分散的狀態(tài))下，不存在白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor :LIF)等分化抑制因子下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，則ES細(xì)胞之間粘著、凝集，形成 被稱為胚狀體(embryoid body :EB)的早期胚胎類似的結(jié)構(gòu)體。已知，這之后，通過在浮游 狀態(tài)或粘著狀態(tài)下培養(yǎng)EB，出現(xiàn)具有自律搏動(dòng)性的心肌細(xì)胞。 按上述方式制備的來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出與來源于胎兒心臟的未成熟
的心肌細(xì)胞極為相似的性狀(參照非專利文獻(xiàn)2、3)。而且，實(shí)際上，在將來源于ES細(xì)胞的
心肌細(xì)胞移植到成體心臟組織中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例中，與移植了胎兒心肌的例子相比基本沒有
變化，因此確認(rèn)其也具有極高有效性(參照專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)4)。 1995年，Thomson等人首次從靈長類中建立ES細(xì)胞，將使用來源于多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的心肌再生治療法實(shí)用化，這帶來了現(xiàn)實(shí)意義(參照專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)5)。 接著，他們從人早期胚胎中成功地分離并建立了人ES細(xì)胞株(參照非專利文獻(xiàn)6)。而且， Gearhart等人由人原始生殖細(xì)胞建立了 hEG細(xì)胞株(參照專利文獻(xiàn)7、專利文獻(xiàn)3)。
Kehat等人(參照非專利文獻(xiàn)8)和Chunhui等人(參照專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)9) 報(bào)道了，與小鼠ES細(xì)胞相同，也可以由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞。若根據(jù)這些報(bào)道， 由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞不僅具有自律搏動(dòng)能力，還隨著表達(dá)產(chǎn)生肌球蛋白重鏈/ 輕鏈或a-輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白1、心房性利尿肽(atrial natriureticp印tide ;ANP)等 心肌特異性蛋白質(zhì)、GATA-4或Nkx2. 5、 MEF-2c等心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子，而且根據(jù)細(xì)微解剖 學(xué)觀察和電生理學(xué)分析，從而可以期待胚胎發(fā)育期的未成熟的心肌細(xì)胞的性狀維持，并可 應(yīng)用于再生醫(yī)療。 另一方面，來源于多能性干細(xì)胞的心肌細(xì)胞在用于細(xì)胞移植治療和其它目的使用 時(shí)的重要問題，可以列舉如下用以往的方法由ES細(xì)胞或EG細(xì)胞所形成的EB出發(fā)，除心肌 細(xì)胞以外還混合產(chǎn)生血球系細(xì)胞和血管系細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、腸道系細(xì)胞、骨 軟骨細(xì)胞 等其它細(xì)胞。而且，在這些分化的細(xì)胞中，心肌細(xì)胞所占的比例不怎么高，只不過為總體的 5 20%左右。 從其它種類的細(xì)胞混合中只選擇性地篩選心肌細(xì)胞的方法，可以列舉，通過對(duì)ES 細(xì)胞的基因人為地進(jìn)行修飾，給予耐藥性或異位性表達(dá)能力，回收具有心肌細(xì)胞或其前體 細(xì)胞的性狀的細(xì)胞的方法。例如，F(xiàn)ield和共同研究者們通過向小鼠ES細(xì)胞中導(dǎo)入位于a 型肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子控制下的可以表達(dá)新霉素(G418)耐性基因的基因盒，只有在該ES 細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，隨之表達(dá)a型肌球蛋白重鏈基因時(shí)，才構(gòu)建出可在添加了G418的培 養(yǎng)基中生存的細(xì)胞系(參照專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)4)。確認(rèn)了通過該方法選擇為G418耐 性細(xì)胞的細(xì)胞99%以上的幾率為心肌細(xì)胞。但是，該方法中，心肌細(xì)胞的純度極高，但是最 終獲得的心肌細(xì)胞數(shù)僅僅為全部細(xì)胞數(shù)的百分之幾左右，要獲得移植治療所必需的心肌細(xì) 胞并不容易。 最近，Ch皿hui等人報(bào)道了通過用5-氮雜胞嘧啶核處理人ES細(xì)胞，EB中的肌鈣蛋 白I陽性(心肌)細(xì)胞由15%增加到44% (參照非專利文獻(xiàn)9)。但是，即使是該方法中， 心肌細(xì)胞所占的比例也不超過EB中的50%。而且，脫甲基化劑5-氮雜胞嘧啶核是通過使 結(jié)合于DNA的甲基脫離而使基因的表達(dá)狀態(tài)變化的藥劑，由于藥劑直接作用于染色體，因 此并不適于作為制備移植用細(xì)胞的藥劑。 此外，作為使ES細(xì)胞高效發(fā)生為心肌細(xì)胞的方法，例如，在小鼠ES細(xì)胞中，添加視 黃酸(參照非專利文獻(xiàn)10)或抗壞血酸(參照非專利文獻(xiàn)ll)、TGFI3、BMP-2(參照非專利 文獻(xiàn)12) 、 PDGF(參照非專利文獻(xiàn)13)、強(qiáng)啡肽(Dynorphin)B(參照非專利文獻(xiàn)14)、或使細(xì) 胞內(nèi)的活性氧類(reactive oxygen species :R0S)(參照非專利文獻(xiàn)15)和Ca"(參照非專 利文獻(xiàn)16)增加的處理促進(jìn)性作用于心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。但是，在這些方法的任意一種 中，都無法實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性的或選擇性的分化誘導(dǎo)。 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)時(shí)的某段時(shí)期，通過在培養(yǎng)基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein ;BMP)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)，尤其是Noggin，與以前的方法相比，可以 高效地選擇性地且高效地使識(shí)別為具有搏動(dòng)能力的心肌細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)生(參照專利文獻(xiàn) 5)。
粒細(xì)胞集落剌激因子(以下稱為G-CSF)是被發(fā)現(xiàn)為粒細(xì)胞系造血干細(xì)胞的分 化誘導(dǎo)因子的造血因子，在生物體中促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞造血，因此可作為骨髓移植或癌癥 化療后的嗜中性粒細(xì)胞減少癥治療劑在臨床中應(yīng)用。而且，除了上述作用之外，據(jù)報(bào)道人 G-CSF還具有作用于干細(xì)胞剌激其分化增殖的作用和將骨髓中的干細(xì)胞移動(dòng)到末梢血中的 作用。有報(bào)道指出在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中由于G-CSF而募集的骨髓干細(xì)胞在募集的組織中分化成心 肌細(xì)胞(專利文獻(xiàn)6，非專利文獻(xiàn)17)。但是，并沒有報(bào)道指出G-CSF直接使骨髓干細(xì)胞分 化成心肌細(xì)胞，而且也沒有報(bào)道指出G-CSF在胚胎期的心肌細(xì)胞中表達(dá)或直接用于心肌細(xì) 胞的分化誘導(dǎo)。而且，也完全沒有關(guān)于G-CSF直接作用于ES細(xì)胞，用于向心肌細(xì)胞的分化 誘導(dǎo)的報(bào)道。 如上所述，單獨(dú)用以往的方法的心肌誘導(dǎo)效率低，需要一種更有效且選擇性分化 誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法。 專利文獻(xiàn)1 :美國專利第6， 015， 671號(hào)說明書 專利文獻(xiàn)2 :美國專利第5， 843， 780號(hào)說明書 專利文獻(xiàn)3 :美國專利第6， 090， 622號(hào)說明書 專利文獻(xiàn)4 :國際公開WO 03/06950小冊(cè)子 專利文獻(xiàn)5 :國際公開WO 05/033298小冊(cè)子 專利文獻(xiàn)6 :國際公開W004/054604小冊(cè)子 非專利文獻(xiàn)1 :Soonpaa等人，Science, 264 :98， 1994 非專利文獻(xiàn)2 :Maltsev等人，Mech. Dev. ， 44 :41 ， 1993 非專利文獻(xiàn)3 :Maltsev等人，Circ. Res. ， 75 :233， 1994 非專利文獻(xiàn)4 :Klug等人，J. Clin. Invest. ， 98 :216， 1996 非專利文獻(xiàn)5 :Thomson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 92 :7844， 1995 非專利文獻(xiàn)6 -Thomson等人，Science, 282 :114,1998 非專利文獻(xiàn)7 :Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95 :13726， 1998 非專利文獻(xiàn)8 :Kehat等人，J. Clin. Invest. ， 108 :407， 2001 非專利文獻(xiàn)9 :Chunhui等人，Circ. Res. ，91 :501,2002 非專利文獻(xiàn)10 :Wobus等人，J.Mol. Cell. Cardiol. ，29 :1525， 1997 非專利文獻(xiàn)11 :Takahashi等人，Circulation, 107 :1912,2003 非專利文獻(xiàn)12 :Behfar等人，F(xiàn)ASEB J. ， 16 :1558,2002 非專利文獻(xiàn)13 :Sachinidis等人，Cardiovasc. Res. ， 58 :278， 2003 非專利文獻(xiàn)14 :Ventura等人，Circ. Res. ， 92 :623， 2003 非專利文獻(xiàn)15 :Sauer等人，F(xiàn)EBS Letters, 476 :218， 2000 非專利文獻(xiàn)16 :Li等人，J. Cell Biol. ， 158 :103， 2002 非專利文獻(xiàn)17 :Minatoguchi等人，Circulation, 109 :2572， 200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題 本發(fā)明的課題在于提供高效且有選擇性地將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方 法，由該方法獲得的心肌細(xì)胞，以及分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑等。
用于解決問題的方法 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)G-CSF受體在小鼠胚胎期的心肌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，并且G-CSF與胚胎 期的心肌細(xì)胞的增殖相關(guān)。而且，本發(fā)明人采用ES細(xì)胞對(duì)向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的條件反復(fù) 進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基中添加針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑，產(chǎn)生了具有搏 動(dòng)能力的且被鑒定為心肌細(xì)胞的細(xì)胞，而且G-CSF在ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞時(shí)，對(duì)心肌細(xì) 胞具有強(qiáng)增殖活性。本發(fā)明人基于這種認(rèn)識(shí)完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明提供以下內(nèi)容 (1)將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法，其包括使ES細(xì)胞與針對(duì)G-CSF受體的 激動(dòng)劑接觸。 (2)前述(1)所述的方法，其包括在針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞。
(3)前述(1)或(2)所述的方法，所述針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G_CSF。
(4)前述(1)_(3)任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下工序
(a)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加G-CSF的工序，和
(b)使用(a)的培養(yǎng)液培養(yǎng)ES細(xì)胞的工序。 (5)前述(1)_(4)任一項(xiàng)所述的方法，ES細(xì)胞與G-CSF的接觸在體外進(jìn)行。
(6)前述(1) - (5)任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在使ES細(xì)胞與針對(duì)G-CSF受體的 激動(dòng)劑接觸之前，在抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞的工序。
(7)前述(6)所述的方法，抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)是Noggin。 [OO54] (8)通過前述(1)_(7)任一項(xiàng)所述的方法獲得的心肌細(xì)胞。 (9)由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其包括針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng) 劑。 (10)前述(9)所述的分化誘導(dǎo)劑，針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G_CSF。
(11)前述(9)或(10)所述的分化誘導(dǎo)劑，其是在體外使用的。
(12)針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑在使ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的用途。
(13)前述(12)所述的用途，所述針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G_CSF。
(14)前述(12)或(13)所述的用途，其是在體外使用。 而且，本發(fā)明的實(shí)施中，使用ES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)生，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的 一般方法可以參照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書。它們包括Guideto Techniques in Mouse Development (Wasserman等 人 編，AcademicPress，1993) ;Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M. V. Wiles， Meth. Enzymol. 225 :900，1993) -Manipulating the MouseEmbryo :A laboratory manual (Hogan等人編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1994); Embryonic Stem Cells (Turksen編，Humana Press, 2002)。本說明書中參照的用于細(xì)胞培 養(yǎng)，發(fā)生*細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的試劑和試劑盒類可以從Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司 等商家購買。


圖1是表示小鼠胚胎的心臟中小鼠G-CSF受體(csf3r)和心肌特異轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2. 5的表達(dá)的原位雜交的照片。 圖2是表示小鼠胚胎的心臟切片中G-CSF受體(G-CSFR)或心肌特異性的蛋白質(zhì)a-輔肌動(dòng)蛋白的表達(dá)的免疫染色的照片。核酸用DAPI(4' ，6-二脒-2-苯基吲哚二鹽酸 鹽Sigma Aldrich)染色。 圖3是通過RT-PCR試驗(yàn)胚胎發(fā)育第9. 5天，胚胎發(fā)育第10. 5天和胚胎發(fā)育第13. 5 天的小鼠胚胎心臟，新生小鼠心臟，成體小鼠心臟和小鼠肝臟中G-CSFR， G-CSF的表達(dá)的照 片。采用GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)作為對(duì)照。 圖4是在妊娠小鼠中施用G-CSF或作為對(duì)照的PBS (磷酸緩沖生理食鹽水)，然后 給母體腹腔內(nèi)施用BrdU(溴脫氧尿嘧啶核苷)時(shí)胚胎心臟切片的免疫染色的照片。
圖5是表示給妊娠小鼠施用G-CSF時(shí)的效果，圖5a是用蘇木精伊紅對(duì)與圖4相同 的心臟切片進(jìn)行染色，再用顯微鏡觀察獲得的照片。圖5b是用蘇木精 伊紅對(duì)G-CSFR敲 除小鼠和野生型小鼠的心臟切片進(jìn)行染色，再用顯微鏡觀察獲得的照片。圖中LV表示左心 室，RV表示右心室，LA表示左心房，RA表示右心房。 圖6是計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)(labeling index)，進(jìn)行圖示的坐標(biāo)圖。 圖7是對(duì)妊娠小鼠母體施用G-CSF后，取出胚胎制作心臟切片，用Phospho-Histon
H3進(jìn)行免疫染色的照片。 圖8是計(jì)算Phospho-Histon H3標(biāo)記指數(shù)(labeling index)，進(jìn)行圖示的坐標(biāo)圖。
圖9是對(duì)胚胎發(fā)育第10. 5天的心臟進(jìn)行Tunel染色的照片。
圖10是表示制作來源于經(jīng)Noggin處理(Noggin (+)組)的ES細(xì)胞的EB和來源 于未經(jīng)Noggin處理(Noggin (-)組)的ES細(xì)胞的EB，通過RT-PCR測(cè)定EB中的G-CSFR的 表達(dá)結(jié)果的照片。使用特異于心肌細(xì)胞的基因GAPDH作為對(duì)照。 圖11是表示制作來源于經(jīng)Noggin處理(Noggin (+)組)的ES細(xì)胞的EB和來源 于未經(jīng)Noggin處理(Noggin (-)組)的ES細(xì)胞的EB，通過免疫染色對(duì)EB中的G-CSFR的表 達(dá)進(jìn)行測(cè)定所獲結(jié)果的照片。 圖12是表示EB形成后第6天，第7天和第8天的EB中，G-CSFR或心肌特異性蛋 白質(zhì)a-輔肌動(dòng)蛋白表達(dá)的免疫染色的照片。 圖13是表示采用G-CSF的心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)試驗(yàn)方法的圖。 圖14是表示心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中G-CSF施用的最適時(shí)期的坐標(biāo)圖。 圖15是表示使用EB形成后的第9天的EB，通過RT-PCR法和免疫染色法對(duì)各種心
肌中特異性基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定所獲結(jié)果的照片。 圖16是表示為了研究G-CSF的最適濃度，在胚胎發(fā)育第6天添加各種濃度的
G-CSF，通過RT-PCR法研究各心肌標(biāo)記物的表達(dá)的結(jié)果的照片。 圖17是表示心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中G-CSF的最適濃度的坐標(biāo)圖。 圖18是表示為了研究抗G-CSF抗體對(duì)由G_CSF處理產(chǎn)生的ES細(xì)胞的心肌分化誘
導(dǎo)促進(jìn)效果的影響，使各種濃度的抗G-CSF抗體共存，通過RT-PCR法研究各心肌標(biāo)記物的
表達(dá)的結(jié)果的照片。 圖19是表示為了測(cè)定G-CSF對(duì)來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，在胚 胎發(fā)育第6天時(shí)通過RT-PCR法研究G-CSF添加組和未添加組以及G-CSF+諾考達(dá)唑添加組 中各心肌標(biāo)記物的表達(dá)的結(jié)果的照片。 圖20是表示在G-CSF添加組和未添加組中，用抗BrdU抗體和抗mef2c抗體進(jìn)行 雙重免疫染色的結(jié)果的照片(左側(cè))和計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)(labeling index)，進(jìn)行圖示的圖(右側(cè))。 圖21表示G-CSF對(duì)普通絨猴ES(CMES)細(xì)胞的效果，圖21a表示對(duì)普通絨猴 ES(CMES)細(xì)胞的自律搏動(dòng)性進(jìn)行觀察的結(jié)果。圖21b是表示添加小鼠G-CSF或人G-CSF， 通過RT-PCR研究CMES細(xì)胞中各種心肌標(biāo)記物的表達(dá)的結(jié)果的照片。圖21c是表示通過免 疫染色調(diào)查G-CSF添加組和未添加組中，來源于CMES的EB的心臟肌f丐蛋白I和Nkx2. 5的 表達(dá)的結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式
可以在本發(fā)明中使用的ES細(xì)胞可以列舉已經(jīng)作為培養(yǎng)細(xì)胞被廣泛使用的小鼠， 猴，人等來源于哺乳動(dòng)物的ES細(xì)胞。作為來源于小鼠的ES細(xì)胞的具體例子，可以列舉EB3 細(xì)胞，E14細(xì)胞，D3細(xì)胞，CCE細(xì)胞，Rl細(xì)胞，129SV細(xì)胞，Jl細(xì)胞等。作為來源于猴的ES細(xì) 胞的具體例子，可以列舉普通絨猴ES細(xì)胞。此外，就ES細(xì)胞的制作，傳代，保持方法，已經(jīng) 建立了標(biāo)準(zhǔn)的程序，實(shí)施者通過參照前面列舉的參考書籍和多種參考文獻(xiàn)(Matsui等人， Cell 70 :841， 1992 ;Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 :13726， 1998 ;美國專利 第6090622號(hào)；Jiang等人，Nature 418 :41， 2002 ;W001/11011A)，可以容易地獲得這些細(xì) 胞。 本發(fā)明中，所謂"心肌細(xì)胞"是指包括具有將來可以形成有功能的心肌細(xì)胞的能力 的心肌前體細(xì)胞，胎兒型心肌細(xì)胞，成體型心肌細(xì)胞這所有的分化階段的細(xì)胞在內(nèi)的，通過 以下記載的至少1種、優(yōu)選多種方法，可以確認(rèn)1個(gè)、優(yōu)選多個(gè)標(biāo)記物或基準(zhǔn)的細(xì)胞。
特異于心肌細(xì)胞的各種標(biāo)記物的表達(dá)可以通過以往的生物化學(xué)或免疫化學(xué)方法 檢測(cè)。其方法沒有特別的限定，優(yōu)選使用免疫組織化學(xué)染色法或免疫電泳法等各種免疫化 學(xué)方法。這些方法中可以使用與心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記特異性多克隆抗體或 單克隆抗體。以各個(gè)特異性標(biāo)記作為靶的抗體已有市售，可以容易地使用。特異于心肌前 體細(xì)胞或心肌細(xì)胞的標(biāo)記物可以列舉例如、肌球蛋白重鏈/輕鏈或a -輔肌動(dòng)蛋白J幾鈣蛋 白1、ANP、GATA-4、Nkx2. 5、MEF-2c等。 或者，心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)，并沒有特別的方法，但可以通
過逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和雜交分析等用于擴(kuò)增、檢測(cè)、分析編碼任意
標(biāo)記蛋白質(zhì)的mRNA的以往經(jīng)常使用的分子生物學(xué)的方法進(jìn)行確認(rèn)。編碼特異于心肌前體
細(xì)胞或心肌細(xì)胞的標(biāo)記物(例如、肌球蛋白重鏈/輕鏈或a-輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白1、ANP、
GATA-4、 Nkx2. 5、 MEF-2c)蛋白質(zhì)的核酸序列是已知的，在GenBank等各種公共數(shù)據(jù)庫中可
以使用，可以容易地確定用于作為引物或探針使用的所需要的標(biāo)記特異性序列。 進(jìn)而，為了確認(rèn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，還可以附加使用生理學(xué)的基準(zhǔn)。也就
是說，以來源于ES細(xì)胞的細(xì)胞具有自律的搏動(dòng)性，各種離子通道表達(dá)，可以在電生理剌激
中反應(yīng)等作為有用的指標(biāo)。 本發(fā)明中"針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑"只要是與G-CSF受體結(jié)合可以誘導(dǎo)G-CSF受 體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)，就沒有特別限定。針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑可以使肽、激動(dòng)劑抗體， 低分子化合物等任何物質(zhì)。G-CSF受體的氨基酸序列是公知的(W091/14776A)。
針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑的優(yōu)選例子可以列舉G-CSF。本發(fā)明中使用的G-CSF盡管 可以使用任何一種G-CSF，但優(yōu)選高度純化的G-CSF，更具體的是哺乳動(dòng)物G-CSF，尤其是人G-CSF及具有基本相同生物學(xué)活性的物質(zhì)。G-CSF的來源沒有特別限定，可以使用天然來源的G-CSF，通過基因重組法獲得的G-CSF等，但優(yōu)選是通過基因重組法獲得的G-CSF。可以是通過基因重組法獲得的G-CSF中與天然來源的G-CSF的氨基酸序列相同者，或者由于該氨基酸序列中進(jìn)行了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、添加等，具有與天然來源的G-CSF相同的生物學(xué)活性的G-CSF等。天然來源的G-CSF的氨基酸序列是公知的(SEQ IDN0:1)。氨基酸的缺失、取代、添加等方式可以通過公知的方法進(jìn)行。例如，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，使用定點(diǎn)誘變法(Gotoh，T.等人(1995)Gene 152， 271-275 ;Zoller， M. J. and Smith, M. (1983)MethodsEnzymol. 100,468-500 ;Kramer， W等人(1984)Nucleic AcidsRes. 12,9441-9456 ;Kramer, W and Fritz， H.J. (1987)MethodsEnzymol. 154,350-367 ;Kunkel， T. A. (1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492 ;Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，通過在G-CSF的氨基酸中導(dǎo)入適當(dāng)變異，可以制備與G-CSF功能相同的多肽。而且，氨基酸的變異在自然界也會(huì)發(fā)生。進(jìn)行了取代、缺失、添加等的氨基酸數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為30個(gè)氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選在20個(gè)氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選在10個(gè)氨基酸以內(nèi)(例如5個(gè)氨基酸以內(nèi))。而且，一般與G-CSF功能等同的多肽與SEQ ID N0:1的氨基酸序列具有高同源性。本發(fā)明中所謂高同源性是指與SEQ ID冊(cè)1的氨基酸序列具有70%以上的同源性，優(yōu)選80%以上的同源性，更優(yōu)選90%以上的同源性，更優(yōu)選95%以上的同源性。氨基酸的同源性可以通過文獻(xiàn)(Wilbur, W. J. andLipman， D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983) 80，726-730)中記載的算法來確定。 一般而言，待取代的氨基酸殘基優(yōu)選被保留了氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的其它氨基酸取代。例如，作為氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，可以列舉疏水性氨基酸(A， I，L， M， F， P， W， Y， V)、親水性氨基酸(R， D， N， C， E， Q， G， H， K， S， T)、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G， A， V， L， I， P)、具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S， T， Y)，具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C，M)、具有含羧酸和酰胺的側(cè)鏈的氨基酸(D， N， E， Q)，具有含堿基側(cè)鏈的氨基酸(R， K， H)，具有含芳香族的側(cè)鏈的氨基酸(H， F， Y， W)(括號(hào)內(nèi)內(nèi)容都用單字符表示氨基酸)。具有對(duì)某個(gè)氨基酸序列進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、添加和/或用其它氨基酸進(jìn)行取代來修飾的氨基酸序列的多肽維持其生物學(xué)活性這是已知的(Mark, D. F.等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA(1984)81 ，5662-5666 ;Zoller，M. J. &Smith，M. Nucleic Acids Research(1982) 10，6487-6500 ;Wang， A.等人，Science 224， 1431-1433 ;Dalbadie-McFarland， G.等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1982)79， 6409-6413)。 而且，還可以使用G-CSF和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。在制作融合蛋白質(zhì)時(shí)，可以將例如編碼G-CSF的DNA和編碼其它蛋白質(zhì)的DNA按框架一致方式連接，再導(dǎo)入于表達(dá)載體中，使之在宿主中表達(dá)。作為本發(fā)明的與G-CSF融合的其它蛋白質(zhì)沒有特別限定。
此外，還可以使用經(jīng)化學(xué)修飾的G-CSF。經(jīng)化學(xué)修飾的G-CSF的例子，可以列舉，例如進(jìn)行了糖鏈的結(jié)構(gòu)改變 添加 缺失操作的G-CSF，或結(jié)合了聚乙二醇、維生素B12等無機(jī)或有機(jī)化合物等化合物的G-CSF等。 此外還可以使用G-CSF的部分肽。G-CSF的部分肽沒有特別限定，通常具有與G-CSF受體的結(jié)合活性。 本發(fā)明中使用的G-CSF可以用任意一種方法制造，例如，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞或產(chǎn)生人G-CSF的雜交瘤的細(xì)胞株，通過各種方法從中提取，并進(jìn)行分離純化的G-CSF，或通過基因工程的方法使之在大腸桿菌、酵母菌、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)，C127細(xì)胞，COS細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，BHK細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞等中產(chǎn)生，通過各種方法提取，并進(jìn)行分離純化的G-CSF等?？梢栽诒景l(fā)明中使用的G-CSF優(yōu)選是通過基因工程方法制造的G-CSF，優(yōu)選是使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(尤其是CHO細(xì)胞)制造的G-CSF(例如，特公平1-44200號(hào)公報(bào)，特公平2-5395號(hào)公報(bào)，特開昭62-129298號(hào)公報(bào)，特開昭62-132899號(hào)公報(bào)，特開昭62-236488號(hào)公報(bào)，特開昭64-85098號(hào)公報(bào))。 本發(fā)明人如后所述的實(shí)施例記載的，發(fā)現(xiàn)G-CSF受體在小鼠胚胎期的心肌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，并且G-CSF與胚胎期的心肌細(xì)胞的增殖相關(guān)。而且，首次確認(rèn)G-CSF在體內(nèi)顯著促進(jìn)胚胎期的心肌細(xì)胞的增殖。此外，本發(fā)明中表明G-CSF對(duì)于靈長類的心肌細(xì)胞增殖而言是必需的，這提示出G-CSF在包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物中的作用。 本發(fā)明中，作為由ES細(xì)胞制作心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，只要是適于心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的方法，可以使用任意一種。例如，可以列舉懸浮凝集培養(yǎng)法，懸滴(hanging drop)培養(yǎng)法，與飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)法，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，軟瓊脂培養(yǎng)法，微載體培養(yǎng)法等。作為具體的方法的例子，例如在浮游凝集培養(yǎng)法時(shí)，將呈單一細(xì)胞狀態(tài)(通過實(shí)施酶消化等細(xì)胞之間不粘著，使各個(gè)細(xì)胞在液相中分散的狀態(tài))的ES細(xì)胞優(yōu)選按10細(xì)胞/mL-1 X 107細(xì)胞/mL，更優(yōu)選100細(xì)胞/mL-1 X 106細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度懸浮于培養(yǎng)基中，接種在培養(yǎng)皿中后，在4-30天內(nèi)，優(yōu)選6-15天內(nèi)，于37t:通氣5%二氧化碳的C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)的方法。
而且，作為其它實(shí)施方式，在使用與飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)法時(shí)，作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，沒有特別限定，但可以列舉，優(yōu)選具有間充質(zhì)類細(xì)胞性狀的細(xì)胞，更優(yōu)選ST2細(xì)胞，0P9細(xì)胞，PA6細(xì)胞等具有骨髓基質(zhì)細(xì)胞樣的性狀的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^高密度培養(yǎng)，絲裂霉素C處理或放射線照射等方法飼養(yǎng)化這些飼養(yǎng)層細(xì)胞，在其上以至1細(xì)胞/mL-1 X 106細(xì)胞/mL，優(yōu)選100細(xì)胞/mL-1 X 105細(xì)胞/mL，更優(yōu)選1 X 103細(xì)胞/mL-1 X 104細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種懸浮的單一細(xì)胞狀態(tài)的ES細(xì)胞后，在4-30天內(nèi)，優(yōu)選6-15天內(nèi)，于37t:通氣5%二氧化碳的C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 本發(fā)明中，通過使針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑(優(yōu)選G-CSF)與ES細(xì)胞接觸，促進(jìn)ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞。優(yōu)選，可列舉在培養(yǎng)基中添加純化重組G-CSF的方法。此外，只要是與在培養(yǎng)基中添加純化重組G-CSF的方法呈現(xiàn)相同效果的方法，可以使用任意一種。例如，可以列舉向ES細(xì)胞自身導(dǎo)入G-CSF的基因表達(dá)載體的方法，向飼養(yǎng)層細(xì)胞中導(dǎo)入G-CSF的基因表達(dá)載體，并將該導(dǎo)入細(xì)胞作為共培養(yǎng)細(xì)胞使用的方法，或者使用該導(dǎo)入細(xì)胞的培養(yǎng)上清等細(xì)胞產(chǎn)生物的方法等，本發(fā)明涉及的方法中包括任何作為向培養(yǎng)基中添加針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑的實(shí)施方式。
具體的是，例如，本發(fā)明包括以下工序
(a)向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加G-CSF的工序和
(b)用(a)的培養(yǎng)液培養(yǎng)ES細(xì)胞的工序。 在本發(fā)明的實(shí)施中，使用的針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑優(yōu)選與作為ES細(xì)胞的來源的
動(dòng)物同種的動(dòng)物來源的，也可以使用來源于異種動(dòng)物的。 此外，本發(fā)明中，優(yōu)選在體外進(jìn)行ES細(xì)胞和G-CSF的接觸。 本發(fā)明的實(shí)施中，為了將ES細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，優(yōu)選，根據(jù)該ES細(xì)胞的動(dòng)物品種，在通常使用的條件下培養(yǎng)。即，小鼠ES細(xì)胞的情況下，優(yōu)選在培養(yǎng)基中預(yù)先添加100-10000U/mL，優(yōu)選500-2000U/mL濃度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitory
10factor :UF)。 然后，在除去LIF的分化用培養(yǎng)基中將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)至心肌細(xì)胞。優(yōu)選，在分化誘導(dǎo)開始時(shí)，在使ES細(xì)胞與針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑接觸之前，在ES細(xì)胞和抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞。在使用BMP拮抗體(例如，Noggin蛋白質(zhì)、Chordin蛋白質(zhì)等)作為抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)時(shí)，在無菌除去老的培養(yǎng)基后，用含有濃度為lng/mL-2ii g/mL，優(yōu)選5ng/mH000ng/mL，更優(yōu)選10ng/mL-500ng/mL的Noggin蛋白質(zhì)或Chordin蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基替換，優(yōu)選繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日，更優(yōu)選繼續(xù)培養(yǎng)3天。 然后，在使用G-CSF作為針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑時(shí)，在無菌除去老的培養(yǎng)基后，以培養(yǎng)基中的終濃度達(dá)到0. 01ng/mL-500ng/mL，優(yōu)選0. 05ng/mL-300ng/mL，更優(yōu)選0. 75ng/mL-25ng/mL或2. 5ng/mL-25ng/mL添加G-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)。添加G-CSF時(shí)期為分化開始后第3-10天，更優(yōu)選為第5-8天，最適濃度或適用天數(shù)可適當(dāng)改變。
通過上述方法，由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，接著通過用公知方法進(jìn)行的細(xì)胞回收，分離，純化法，可以有效且大量地獲得高純度的心肌細(xì)胞。 心肌細(xì)胞的純化方法，只要是公知的細(xì)胞分離純化方法就可以使用任意一種，作為具體的例子，可以列舉流式細(xì)胞儀或磁珠，淘選法(panning)等基于抗原-抗體反應(yīng)的方法(Monoclonal Antibodies-principles and practice,第三片反(Acad. Press, 1993);AntibodyEngineering :A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press,1996))，或通過使用蔗糖、Percoll等載體的密度梯度離心進(jìn)行細(xì)胞分級(jí)法。而且，作為其它的心肌細(xì)胞選擇法，可以列舉作為基礎(chǔ)的ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的基因中預(yù)先進(jìn)行人為修飾，給予藥物耐受性或異位性蛋白質(zhì)的表達(dá)能力，回收具有作為心肌細(xì)胞的性狀的細(xì)胞的方法。例如、Field和共同研究者，通過向小鼠ES細(xì)胞中導(dǎo)入位于a型肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子的控制下的可以表達(dá)新霉素(G418)耐受性基因的基因盒，只有在該ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，隨之表達(dá)a型肌球蛋白重鏈基因時(shí)，構(gòu)建出在添加了G418的培養(yǎng)基中可以生存的細(xì)胞系，確認(rèn)通過該方法選擇為G418耐受性細(xì)胞的細(xì)胞99X以上的幾率為心肌細(xì)胞(美國專利第6， 015， 671號(hào)；Klug et al. ， J. Clin. Invest. 98 :216， 1996)。
作為其它的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及使用上述本發(fā)明的分化誘導(dǎo)方法通過分化誘導(dǎo)ES細(xì)胞制做的心肌細(xì)胞，即呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)，生理學(xué)和/或免疫學(xué)特征的細(xì)胞。生理學(xué)和/或免疫學(xué)特征沒有特別限定，通過本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞可以表達(dá)作為心肌細(xì)胞被識(shí)別的物異于心肌細(xì)胞的1個(gè)或1個(gè)以上的標(biāo)記。 此外，在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及含有針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑的將ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)劑。優(yōu)選針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑為G-CSF，而且優(yōu)選在體外使用。 此外，在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑用于使ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的使用。針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑優(yōu)選是G-CSF，而且優(yōu)選在體外使用。
根據(jù)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞可以作為心肌再生藥或心臟疾病的治療藥使用。作為心臟疾病，可以列舉心肌梗塞、缺血性心臟疾病、充血性心力衰竭、肥大型心肌癥、擴(kuò)張型心肌癥、心肌炎、慢性心力衰竭等。作為心肌再生藥或心臟疾病治療藥，只要是以高純度含有根據(jù)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞即可，可以采用使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基等水性載體上的，將細(xì)胞包埋于生物體分解性基質(zhì)等支持體中的，或加工成單層或多層心肌細(xì)胞層(Shimizu etal， Circ. Res. 90 :e40，2002)的藥物等各種形狀的藥物。 作為向障礙部位輸送上述治療藥的方法，可以列舉開胸，用注射器直接注入到心臟中的方法，外科切開心臟的一部分再移植的方法，以及通過使用導(dǎo)管的經(jīng)血管的方法進(jìn)行移植的方法等(Murry et al. ， Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 67 :519， 2002 ;Menasche、 Ann.Thorac. Surg. 75 :S20， 2003 ;Dowell et al. ， Cardiovasc. Res. 58 :336，2003)，但并沒有特別的限定。據(jù)報(bào)道若通過這樣的方法，將從胎兒心臟回收的心肌細(xì)胞移植到心臟受損的動(dòng)物的心臟中，則呈現(xiàn)極好的治療效果(Menasche、 Ann. Thorac. Surg. 75 :S20，2003 ;Reffelmann等人，Heart Fail. Rev. 8 :201， 2003) 。 ES細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出與來源于胎兒心臟的心肌細(xì)胞極為相似的性狀(Maltsev et al. ， Mech. Dev. 44 :41，1993 ;Circ. Res. 75 :233， 1994)。而且，實(shí)際上在將ES細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞移植到成體心臟中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例中，也確認(rèn)了與移植了胎兒心肌的例子相比幾乎沒有變化，顯示出極高的生長附著性(Klug等人，J. Clin. Invest. 98 :216,1996)。因此，在由心肌細(xì)胞的疲憊和脫落引起的上述心臟疾病中，通過在不健康的心臟組織中補(bǔ)充性移植用本發(fā)明記載的方法制備的心肌細(xì)胞，可以期待促進(jìn)心臟功能的改善。
發(fā)明的效果 通過使用本發(fā)明的方法，可以有效且有選擇性地由ES細(xì)胞生產(chǎn)心肌細(xì)胞。尤其是，由于本發(fā)明的方法作用于剛分化后的心肌，因此通過與已知方法組合，可以進(jìn)一步提高誘導(dǎo)效率。這樣制備的心肌細(xì)胞可以用于對(duì)心臟疾病有效的藥物的探索和開發(fā)，基于此，可以在對(duì)嚴(yán)重心臟疾病的心臟移植治療中使用。
實(shí)施例 下面，通過列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但以下的實(shí)施例只不過是本發(fā)明的例示，不對(duì)本發(fā)明的范圍做任何限定。 實(shí)施例1 :來源于小鼠胚胎心臟的心肌中G-CSF受體的表達(dá) 用以下的方法研究來源于小鼠胚胎心臟的心肌中G-CSF受體的表達(dá)。 (1)通過原位雜交進(jìn)行研究 從日本CLEA購買妊娠的ICR野生型小鼠。在胚胎發(fā)育第7.5天、第8.5天、第9.5天和第10. 5天時(shí)取出胚胎，使用地高辛標(biāo)記的RNA探針，按照文獻(xiàn)記載的方法(Sasaki H等人，Developmentl 18， 47-59 (1993))進(jìn)行心臟的整體原位雜交(WISH)。小鼠G-CSF受體(csf3r)和心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2. 5(登錄號(hào)分別為NMJ)08711， NM_008700)的全長cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得，將其亞克隆到pBluescript質(zhì)粒中。使用5 ' -CCCCTC AAA CCT ATC CTG CCT C-3' (SEQID NO :2)作為csf3r的正義引物，5' -TCC AGG CAGAGA TCA GCG AATG-3' (SEQ ID NO :3)作為反義引物，使用5' -CAG TGG AGC TGG ACAAAGGG-3' (SEQ ID NO :4)作為Nkx2. 5的正義引物，5' -TAG CGA TTC TGG MCCA-3' (SEQID N0:5)作為其反義引物。用T3或T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄探針。獲得的結(jié)果示于圖1 。 G-CSF受體(csf3r)在胚胎發(fā)育第7. 5天和胚胎發(fā)育第8. 5天時(shí)強(qiáng)表達(dá)，但在這之后的階段沒有檢測(cè)到。而Nkx2. 5在后半階段表達(dá)。
(2)通過免疫染色進(jìn)行研究 用4%多聚甲醛將胚胎發(fā)育第8. 5天、第9. 5天和第10. 5天時(shí)的小鼠心臟固定45分鐘，用Tissue-Tek OCT(Sakura Finetek)包埋，制作切片。使各個(gè)試樣與G-CSF受體(G-CSFR) (H176 :santa cruz公司)或者針對(duì)心肌特異性蛋白質(zhì)a -輔肌動(dòng)蛋白的1級(jí)抗體結(jié)合。再與經(jīng)Alexa 488標(biāo)記的2級(jí)抗體(Molecular Probes公司)依次反應(yīng)后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。核酸用DAPI(4' ，6-二脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽Sigma Aldrich)染色。結(jié)果示于圖2。確認(rèn)了在心臟和體節(jié)中從胚胎發(fā)育第8.5天開始表達(dá)G-CSF受體，這之后第9.5天達(dá)到頂點(diǎn)。 (3)通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)反應(yīng)進(jìn)行研究 研究胚胎發(fā)育第9.5天、第10.5天和第13.5天的小鼠胚胎心臟、新生小鼠心臟，成體小鼠心臟和小鼠肝臟中G-CSFR，G-CSF的表達(dá)。使用特異于心肌細(xì)胞的基因GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)作為對(duì)照。用Trizol試劑(GIBCO)從各組織中提取總RNA，用文獻(xiàn)記載的方法(Niwa，H等人，Nat. Genet. 24,372-376(2000))進(jìn)行RT-PCR。獲得的結(jié)果示于圖3。確認(rèn)了 G-CSF4在胚胎發(fā)育第9. 5天、第10. 5天的胚胎心臟中強(qiáng)表達(dá)。
實(shí)施例2 :心臟發(fā)生中G-CSF的體內(nèi)作用(1) 在妊娠第9. 0天對(duì)小鼠開腹，在子宮內(nèi)直接施用G-CSF(100ng/kg)或作為對(duì)照的PBS(磷酸緩沖液生理鹽水)。然后在妊娠第9. 5天向母體內(nèi)腹腔內(nèi)施用BrdU(溴脫氧尿嘧啶核苷)。BrdU在DNA合成時(shí)被吸收，可以通過免疫染色評(píng)價(jià)增殖。在妊娠第12. 5天取出胚胎制作心臟的切片。用與實(shí)施例1(2)中記載的免疫染色相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果示于圖4?？梢源_認(rèn)G-CSF促進(jìn)胚胎的心肌增殖。 此外，用蘇木精，伊紅對(duì)心臟切片染色，用顯微鏡觀察的結(jié)果示于圖5a。經(jīng)G-CSF施用的胚胎的心臟中，觀察到了小梁層(trabecularlayer)延長。 進(jìn)而，在缺失了 G-CSF受體的G-CSFR敲除小鼠(以下記載為G-CSF-/-小鼠)(由Washington University, School of Medison的Dr. Daniel C丄ink惠貝曾)(Richards等人，Blood， 102， 3562-3568， (2003))中實(shí)施同樣的試驗(yàn)，與野生型小鼠進(jìn)行比較。用蘇木精*伊紅對(duì)心臟切片染色，用顯微鏡觀察的結(jié)果示于圖5b。 G-CSF-/-小鼠中，胚胎心臟的心房壁和心室壁顯著薄于野生型小鼠，在幾只小鼠中發(fā)現(xiàn)心房中有心房間隔缺損。這些小鼠的約50%在后期胚階段死亡。 進(jìn)而，為了定量心肌增殖促進(jìn)效果，通過下式計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)。并且，本試驗(yàn)
中，用野生型小鼠，在妊娠第10. 5天施用BrdU，在第12. 5天時(shí)分析。 BrdU標(biāo)記指數(shù)=BrdU陽性核/總核X 100 (% ) 獲得的結(jié)果示于圖6。觀察到G-CSF施用增強(qiáng)心肌的增殖。 實(shí)施例3 :心臟發(fā)生中G-CSF的體內(nèi)作用(2) 在妊娠第9. 0天時(shí)向妊娠小鼠母體子宮內(nèi)直接施用2ng。妊娠第13. 5天時(shí)取出胚胎，制作心臟的切片，通過Phospho-Histon H3進(jìn)行免疫染色。Phospho-Histon H3是在細(xì)胞增殖過程中被特異染色的色素。獲得的結(jié)果示于圖7。觀察到G-CS施用促進(jìn)胚胎的心肌增殖。 通過下式計(jì)算標(biāo)記指數(shù)。 標(biāo)記指數(shù)=Phospho-Histon H3陽性核/總核X 100 (% ) 獲得的結(jié)果示于圖8。觀察到G-CSF從胚胎發(fā)育第8. 5天到第10. 5天強(qiáng)烈增強(qiáng)心肌增殖。
此外，為了研究G-CSF對(duì)胚胎發(fā)育期心臟的凋亡的影響，對(duì)胚胎發(fā)育第10. 5天的心臟進(jìn)行T皿el染色。Timel染色是可以識(shí)別凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA片段的染色法。獲得的結(jié)果示于圖9。胚胎發(fā)育第10. 5天的心臟中幾乎沒有觀察到凋亡。
實(shí)施例4 :來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞中G-CSF受體的表達(dá) 在以下的實(shí)驗(yàn)中，使用EB3細(xì)胞(由丹羽仁史博士 [理科學(xué)研究所]惠贈(zèng))和Rl細(xì)胞(由Andrew Nagy博士 [Mount Sinai醫(yī)院；加拿大]惠贈(zèng))。這些ES細(xì)胞在含有10%胎兒牛血清，2mM L-谷氨酰胺，O. lmM非必需氨基酸液，lmM丙酮酸鈉，O. ImM 2-硫基乙醇和2000U/mL白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor :LIF) (ESGR0 ;Chemicon公司)的Glasgow最少必需培養(yǎng)值(GMEM ;Sigma公司)培養(yǎng)基中，在經(jīng)明膠包被的培養(yǎng)皿中維持。
用于使ES細(xì)胞形成EB的懸浮培養(yǎng)如下述方式進(jìn)行。在含有10%胎牛血清，2慮L-谷氨酰胺，O. lmM非必需氨基酸液，lmM丙酮酸鈉，O. ImM 2-硫基乙醇和2000U/mL白血病抑制因子和O. 15ii g/ml Noggin (Noggin-Fc， R&D公司)的a-MEM培養(yǎng)基中，在經(jīng)明膠包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天。然后通過用胰蛋白酶溶液處理ES細(xì)胞達(dá)到單一細(xì)胞狀態(tài)，然后在未包被的平皿上，用三維培養(yǎng)系統(tǒng)在與上述相同的分化培養(yǎng)基(但不含LIF)中培養(yǎng)，使之形成球狀體，誘導(dǎo)EB(肺樣體)。在本實(shí)驗(yàn)條件下，在懸浮培養(yǎng)后馬上確認(rèn)了 ES細(xì)胞凝集，形成EB，懸浮培養(yǎng)后第7-8天就開始觀察到一部分EB中有自律搏動(dòng)性。 通過上述方法制作來源于經(jīng)Noggin處理的(Noggin (+)組)的ES細(xì)胞的EB和來源于未經(jīng)Noggin處理的(Noggin (-)組)ES細(xì)胞的EB，通過RT-PCR對(duì)EB中G-CSFR的表達(dá)進(jìn)行試驗(yàn)。使用特異于心肌細(xì)胞的基因GAPDH作為對(duì)照。獲得的結(jié)果示于圖IO。來源于經(jīng)Noggin處理(Noggin (+)組)的ES細(xì)胞的EB中觀察到G-CSFR在EB形成后第5天以后表達(dá)。 此外，使用EB形成后第6天的EB，進(jìn)行免疫染色的結(jié)果示于圖11。在來源于經(jīng)Noggin處理(Noggin (+)組)的ES細(xì)胞的EB中G-CSFR的表達(dá)增加，這表明由Noggin導(dǎo)致的心肌誘導(dǎo)增加G-CSFR的表達(dá)。 然后，使用EB形成后第6天，第7天和第8天的EB，使用與實(shí)施例1 (2)相同的方法進(jìn)行免疫染色，結(jié)果示于圖12。通過用0CT包埋EB制作切片，按1 : 50的比率使之與作為一級(jí)抗體的上述G-CSF受體抗體反應(yīng)，按1 : 800的比率使a輔肌動(dòng)蛋白抗體(EA_53，Sigma)反應(yīng)，與作為2級(jí)抗體的Alexa488和Alexa546反應(yīng)后，進(jìn)行核染。在EB形成后第6天，第7天和第8天的EB中，心肌標(biāo)記物a輔肌動(dòng)蛋白與G-CSF共表達(dá)，這表明在將ES分化誘導(dǎo)至心肌細(xì)胞時(shí)，G-CSF與心肌標(biāo)記物共表達(dá)。
實(shí)施例5 :G-CSF對(duì)來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用
使用G-CSF的心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)試驗(yàn)按圖13中所示方法進(jìn)行。即，在包被了明膠的培養(yǎng)皿上在LIF存在下將ES細(xì)胞維持未分化的狀態(tài)，在第0天時(shí)在不存在LIF下懸浮培養(yǎng)，一旦ES細(xì)胞開始分化，在第9天可以獲得分化成心肌細(xì)胞的EB。在第5天，第6天，第7天和第8天添加G-CSF(2.5ng/ml)，研究對(duì)EB形成的作用，其結(jié)果示于圖14。對(duì)于本作用，通過自律搏動(dòng)的EB數(shù)除以總EB數(shù)來計(jì)算。在第6天施用G-CSF時(shí)對(duì)EB形成最有效果，這表明G-CSF施用的最適時(shí)期是第6天。 然后，用第9天的EB1，通過RT-PCR法和免疫染色法對(duì)各種特異于心肌的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。RT-PCR法中使用的心肌標(biāo)記物是Txb-5， MEF-2c (肌肉增強(qiáng)因子_2c)，Nkx2. 5，GATA-4， PMHC(P肌球蛋白重鏈)，MLC-2v(肌球蛋白輕鏈_2v) ， aMHC(a-肌球蛋白重鏈)，BNP(大腦性利尿肽，brain natriuretic p印tide) ， ANP(心房性利尿肽，atrialnatriuretic p印tide)和GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)。免疫染色法中使用的心肌標(biāo)記物是a-輔肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)蛋白，肌鈣蛋白l-C、MF20和ANP。獲得的結(jié)果示于圖15。 G-CSF施用組中所有的心肌標(biāo)記物的表達(dá)都增加了 。 進(jìn)而，為了研究G-CSF的最適濃度，在胚胎發(fā)育第6天添加各個(gè)濃度(0. 25， 0. 75，2. 5， 7. 5， 25， 75ng/ml)的G-CSF，用RT-PCR法研究各心肌標(biāo)記物的表達(dá)。并且，在試驗(yàn)中使用H(2X103細(xì)胞/ml)和L(5Xl(^細(xì)胞/ml)這兩種細(xì)胞密度的EB。獲得的結(jié)果示于圖16。不依賴于細(xì)胞密度，收縮蛋白，轉(zhuǎn)錄因子，分泌蛋白的表達(dá)均由于O. 25-25ng/ml的G-CSF添加而比對(duì)照組有所上升，我們認(rèn)為該濃度是最適濃度。 根據(jù)上述結(jié)果求出G-CSF的最適濃度，其結(jié)果示于圖17。最適濃度的研究，通過比較通過用自律搏動(dòng)的EB數(shù)除以總EB數(shù)求出的數(shù)值來實(shí)施。其結(jié)果是，觀察到G-CSF的最適濃度為0. 75ng/ml。 實(shí)施例6 :G-CSF抗體對(duì)G-CSF的心肌分化誘導(dǎo)作用的抑制效果 為了確認(rèn)由G-CSF處理產(chǎn)生的ES細(xì)胞的心肌分化誘導(dǎo)促進(jìn)效果是通過內(nèi)源性
G-CSF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的可能性，在G-CSF處理的同時(shí)在培養(yǎng)基中添加抗G-CSF抗體(R&D
systems公司)，研究其效果。在胚胎發(fā)育第6天時(shí)在添加G-CSF(7. 5ng/mL)的同時(shí)，使各
種濃度(0，1，3，9ng/mL)的抗G-CSF抗體共存，用各種心肌標(biāo)記物研究其影響，其結(jié)果示于
圖18。觀察到抗G-CSF抗體以濃度依賴性使心肌標(biāo)記物表達(dá)降低。 實(shí)施例7 :G-CSF對(duì)來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用 為了就G-CSF對(duì)來源于ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用進(jìn)行試驗(yàn)，在胚胎發(fā)育
第6天制作G-CSF (7. 5ng/mL)添加組和未添加組以及G-CSF+諾考達(dá)唑(0. 2 y g/mL)添加
組。諾考達(dá)唑是一種通過紡錘絲形成抑制作用特異性抑制細(xì)胞分裂的藥劑。對(duì)這3組，使
用各種心肌標(biāo)記通過RT-PCR研究，其結(jié)果示于圖19。在使G-CSF與EB作用的同時(shí)，添加諾
考達(dá)唑，通過抑制細(xì)胞分離導(dǎo)致心肌標(biāo)記物的表達(dá)上升被消除。這表明G-CSF的作用促進(jìn)
心肌的前體細(xì)胞的增殖。此外，在胚胎發(fā)育第6天制備G-CSF(2. 5ng/mL)添加組和未添加組，然后與BrdU一起溫育18小時(shí)。對(duì)它們用抗BrdU抗體(Roche公司制)和抗mef2c抗體(Santa Cruz公司制)進(jìn)行雙重免疫染色，其結(jié)果示于圖20(左)。此外，計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)，結(jié)果示于圖20 (右)。確認(rèn)了 G-CSF促進(jìn)心肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。
實(shí)施例8 :G-CSF在靈長類的心臟發(fā)生中的作用
普通絨猴ES (Common Marmoset ES :CMES)細(xì)胞的制作 為了試驗(yàn)G-CSF在靈長類的心臟發(fā)生中的作用，使用普通絨猴ES (CommonMarmoset ES:CMES)細(xì)胞(#20)(Sasaki等人，Stem Cells23，1304-1313 (2005))。 在Knockout DMEM(GIBCO)培養(yǎng)基(補(bǔ)充20% Knockout血清替代品(KSR ;GIBCO) 、 ImM L_谷氨酰胺(GIBCO) 、0. lmMMEM非必需氨基酸液(GIBCO) 、0. ImmM P -巰基乙醇(2-ME ;Sigma)，10ng/ml成纖維細(xì)胞增殖因子(Bfgf ;Invitrogen)和10ng/ml人白血病抑制因子(hLIF ;Alomone labs))中，在有絲分裂非活性化小鼠胚成纖維細(xì)胞(MEF)的層上維持。通過每5天傳代一次CMES細(xì)胞，維持在未分化狀態(tài)。
EB的制作將未分化的CMES細(xì)胞從MEF飼養(yǎng)層剝離，用人及猴ES細(xì)胞用剝離液(R印roCELL，日本)分離小集落，接下來將其在不含bFGF和hLIF的培養(yǎng)基中用Hydro Cell(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)皿(CellSeed，日本)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而得到EB。
G-CSF的作用的研究 EB形成后，在第4天，第6天和第9天時(shí)添加G-CSF (2. 5ng/mL)，觀察自我搏動(dòng)性。所得結(jié)果示于圖21a。最好的是，在EB形成后第6天時(shí)添加時(shí)，G-CSF添加組和未添加組的差異在第14天變得明顯了。觀察到G-CSF添加對(duì)心臟形成的作用在EB形成后第6天時(shí)最大，這之前，之后都變小。 添加小鼠G-CSF或人G-CSF，通過RT-PCR調(diào)查CMES細(xì)胞中各種心肌標(biāo)記物的表達(dá)，結(jié)果示于圖21b。觀察到小鼠G-CSF和人G-CSF均強(qiáng)烈增強(qiáng)心肌標(biāo)記物的表達(dá)。而且，通過免疫染色調(diào)查的結(jié)果示于圖21c。 G-CSF增強(qiáng)來源于CMES細(xì)胞的EB的心臟肌f丐蛋白I和Nkx2. 5陽性區(qū)域。
根據(jù)這些結(jié)果，表明G-CSF是靈長類的心肌細(xì)胞增殖所必需的，這提示出其在包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物中的作用。
權(quán)利要求
將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法，其包括使ES細(xì)胞與針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑接觸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其包括在針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G-CSF。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下步驟(a) 向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加G-CSF的工序，禾口(b) 使用(a)的培養(yǎng)液培養(yǎng)ES細(xì)胞的工序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，ES細(xì)胞與G-CSF的接觸在體外進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，還包括在使ES細(xì)胞與針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng) 劑接觸之前，在抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞的工序。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)是Noggin。
8. 通過權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法獲得的心肌細(xì)胞。
9. 由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其包括針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分化誘導(dǎo)劑，針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G-CSF。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的分化誘導(dǎo)劑，其是在體外使用的。
12. 針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑在使ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的用途。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，所述針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑是G-CSF。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用途，其是在體外使用。
全文摘要
一種將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法，其包括使與ES細(xì)胞針對(duì)G-CSF受體的激動(dòng)劑接觸。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101720355SQ20088001921
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者下地顯一郎, 湯淺慎介, 福田惠一 申請(qǐng)人:福田惠一