專利名稱：：結合細胞內prl-1多肽或prl-3多肽的抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學領域、細胞生物學領域、分子生物學領域及生物化學領域。本發(fā)明還涉及醫(yī)學領域。具體而言，本發(fā)明涉及疾病尤其是癌癥的治療和診斷，以及用于這樣的用途的組合物。
背景技術：
：癌癥是全世界的一個嚴重健康問題。在2007年，據估計全世界有760萬人死于癌癥。例如在英國，癌癥每年造成126，000人死亡。四分之一的人死于癌癥。已知用于癌癥的治療法包括外科手術、化學療法和放射療法。如果發(fā)現地夠早，許多癌癥可以被治愈。100年之前，德國化學家保羅奧利克(PaulEhrlich)提出了抗體作為“魔方”的觀念?？贵w能夠以特殊的方式識別及結合它們的抗原，因此是用于經免疫系統(tǒng)識別及破壞惡性細胞的理想制劑。由于這個原因，抗體構成了一類發(fā)展最為快速的人類癌癥療法。大量潛在的癌癥或腫瘤標記物以及癌癥抗原已經在文獻中被鑒定，并且已經開發(fā)出對抗它們中的一些的抗體治療物。例如，已知的癌癥治療物赫賽汀(Here印tin)(曲妥珠單抗(Trastuzumab))是一種能殺死HER2陽性癌細胞的單克隆抗體。赫賽汀可結合癌細胞上的HER2(人表皮生長因子受體2)抗原。同樣，貝伐單抗(Bevacizumab)(阿瓦斯汀TM(AVaStinTM))是一種靶向血管內皮生長因子(VEGF)的單克隆抗體，VEGF是一種參與新血管形成的生長因子。通過抑制血管發(fā)生，貝伐單抗可阻止腫瘤細胞接收穩(wěn)定的血液供應，從而防止接收腫瘤存活需要的氧和營養(yǎng)物。然而，抗體治療對于不同癌癥的適應性不是普遍的。妨礙抗體治療普遍應用的一個限制是抗體分子較大的體積，并因此不能通過質膜或細胞膜。在不進行改良的情況下，抗體(包括單克隆抗體)通常僅適宜于靶向位于宿主細胞表面或外部的癌癥抗原14_15。在以上的實例中，HER2受體位于細胞表面，因此是赫賽汀進行抗體結合可及的。同樣，VEGF被分泌到血液中，能夠被貝伐單抗結合。PRL是一類細胞內C末端異戊二烯化的蛋白質。缺乏異戊二烯化信號的PRL突變形式一般位于核內16_17。通過EM免疫金標記顯示PRL-I和PRL-3定位于質膜和早期內體的內葉(innerleaflet)18。PRL-3和PRL-I的過表達已被表明與多種人癌癥相關3_12’19。PRL-I和PRL-3已知與腫瘤轉移相關。已經知道，大多數癌癥患者死于轉移，而非死于他們的原發(fā)疾病。迫切需要防止癌癥轉移的有效方法。迄今為止抗體還沒有被用于靶向細胞內抗原或癌癥標記物，這是因為抗體無法通過細胞膜，因而無法接近抗原。
發(fā)明內容本發(fā)明人現已證明，針對PRL-I和PRL-3的抗體可意外地結合至它們的細胞內靶標。根據文獻中的提示，以前從未認為可能用抗體靶向細胞內PRL以消除癌細胞和癌癥轉移，這是因為PRL的細胞內定位。本發(fā)明人已表明實際情況不是這樣，并提供抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體用作癌癥治療劑，尤其是癌癥轉移的治療劑。Li等人(2005)描述了PRL-I和PRL-3特異性單克隆抗體的產生。然而，這些抗體的序列以及這些抗體的可變區(qū)序列還沒有被公開。而且，產生這些抗體的雜交瘤在當時并不為公眾可及，并且迄今為止也不為公眾可及。從而，在Li等人(2005)中描述的抗體迄今為止公眾也無法獲得。再者，考慮到PRL-I和PRL-3的細胞內定位，沒有說明所述抗體可用于治療癌癥。本發(fā)明人公開了兩種針對PRL-I的小鼠單克隆抗體(269和223)以及一種針對PRL-3的小鼠單克隆抗體(318)的可變區(qū)。本發(fā)明人公開了抗-PRL-I抗體269和抗-PRL-3抗體318的結合表位。本發(fā)明人還公開了產生這些抗體的方法，以及制備具有與這些抗體相同或相似結合性質的抗體的方法，這些方法的每一種迄今為止均是不可能的。根據本發(fā)明的第1方面，本發(fā)明人提供了一種能夠結合至PRL-I多肽或PRL-3多肽的抗體，其中所述抗體能夠結合與抗體269、抗體223或抗體318或者它們的變體、同系物、衍生物或片段結合的表位。所述抗體能夠結合至與抗體269結合的PRL-I多肽上的表位。所述抗體可包括能夠結合至表位TYKNMR和/或TLNKFI的抗-PRLl抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體能夠結合至與抗體223或抗體318結合的PRL-3多肽上的表位。所述抗體可包括能夠結合至表位KAKFYN和/或HTHKTR的抗-PRL3抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體可包含單克隆抗體269的可變區(qū)(SEQIDNO:2、SEQIDNO4)、單克隆抗體223的可變區(qū)(SEQIDNO:6、SEQIDNO8)或單克隆抗體318的可變區(qū)(SEQIDNO10、SEQIDNO12)。根據本發(fā)明的第2方面，提供了一種抗體，所述抗體包含單克隆抗體269的可變區(qū)(SEQIDN0:2、SEQIDNO4)或者它的能結合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。根據本發(fā)明的第3方面，本發(fā)明人提供了一種抗體，所述抗體包含單克隆抗體223的可變區(qū)(SEQIDNO:6、SEQIDNO8)或者它的能結合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。根據本發(fā)明的第4方面，本發(fā)明人提供了一種抗體，所述抗體包含單克隆抗體318的可變區(qū)(SEQIDNO10,SEQIDNO12)或者它的能結合PRL-3的變體、同系物、衍生物或片段。所述抗體能夠結合至細胞內PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述抗體能夠通過細胞質膜。所述抗體能夠結合并抑制PRL-I或PRL-3的生物活性，優(yōu)選蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。所述抗體能夠防止癌癥轉移，所述癌癥優(yōu)選結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。所述癌癥可包括表達PRL-I或PRL-3的癌癥。所述抗體可包括單克隆抗體或人源化單克隆抗體。作為本發(fā)明的第5方面，提供了一種包含如前述的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結合物。根據本發(fā)明的第6方面，本發(fā)明人提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含這樣的抗體或結合物，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。本發(fā)明在第7方面中提供了一種能夠結合至PRL-I或PRL-3的抗體，用于一種癌癥或癌癥轉移的治療方法或預防方法中，所述抗體可包括如前述的抗體、如上文列出的結合物或如上文列出的藥物組合物。所述方法可包括將癌細胞暴露于所述抗體或結合物。所述方法可包括將治療有效量的所述抗體、結合物或組合物給予患有或疑似患有癌癥的個體。所述癌癥可包括轉移癌。所述癌癥可為表達PRL-I或PRL-3的癌癥。所述癌癥可包括結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。治療個體中的轉移瘤數目與未治療個體相比可減少至少50%。它可減少至少60%。它可減少低至少70%。它可減少至少80%。治療個體中的轉移瘤數目與未治療的個體相比可減少至少90%。根據本發(fā)明的第8方面，提供了一種如上文列出的抗體、一種如所述的結合物或一種如所述的藥物組合物，用于癌癥或癌癥轉移的診斷方法中。根據本發(fā)明的第9方面，本發(fā)明人提供了一種診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含這樣的抗體、這樣的結合物或這樣的藥物組合物以及在癌癥或癌癥轉移的診斷中使用的說明書。根據本發(fā)明的第10方面，本發(fā)明人提供了一種多肽，所述多肽包含選自以下的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10或SEQIDNO12，或者它們能夠結合PRL的變體、同系物、衍生物或片段。根據本發(fā)明的第11方面，提供了一種核酸，所述核酸包含能夠編碼如上文列出的分子的序列，例如選自以下的序列:SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDNO:9和SEQIDNO:11或者它們能夠編碼具有PRL結合活性的多肽的變體、同系物、衍生物或片段。作為本發(fā)明的第12方面，本發(fā)明人提供了一種包含或轉化有這樣的核酸序列的細胞，或者這樣的細胞的后代。根據本發(fā)明的第13方面，本發(fā)明人提供了一種產生如所述的抗體的方法，所述方法包括提供一種這樣的細胞并從所述細胞表達所述抗體。根據本發(fā)明的第14方面，本發(fā)明人提供了一種在個體中診斷癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括將來自所述個體的生物樣品暴露于如上文列出的抗體，并檢測所述抗體和PRL-I多肽或PRL-3多肽的結合情況。根據本發(fā)明的第15方面，提供了一種在患有或疑似患有癌癥的個體中治療或者預防癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括給予所述個體治療有效量的如所述的抗體、如所述的結合物或如所述的組合物。所述方法可包含如上述任一段中列出的特征。根據本發(fā)明的第16方面，本發(fā)明人提供了一種在患有或疑似患有癌癥的個體中治療或預防癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括通過如所述的方法在所述個體中診斷癌癥，并通過如所述的方法治療所述個體。根據本發(fā)明的第17方面，本發(fā)明人提供了一種檢測轉移細胞的方法，所述方法括將候選細胞暴露于如上述的抗體，并檢測所述細胞的PRL-I多肽或PRL-3多肽表達情況。根據本發(fā)明的第18方面，本發(fā)明人提供了一種產生轉移瘤動物模型的方法，所述方法包括(a)將多個轉移癌細胞例如表達PRL-I或PRL-3的癌細胞給予第一動物；(b)使所述細胞在所述第一動物中發(fā)展成轉移瘤；(c)從所述第一動物提取轉移瘤并從所述轉移瘤獲得細胞系；并(d)將所述細胞系的多個細胞給予第二動物。根據本發(fā)明的第19方面，本發(fā)明人提供了一個通過一種這樣的方法得到的動物模型。根據本發(fā)明的第20方面，本發(fā)明人提供了通過一種這樣的方法產生的動物模型或者如上文列出的動物模型作為轉移瘤模型的用途。根據本發(fā)明的第21方面，本發(fā)明人提供了一種包括以下步驟的方法提供如所述的抗體，并使所述抗體結合至PRL-I多肽或PRL-3多肽。可使所述抗體結合至表達PRL-I多肽或PRL-3多肽的細胞。所述PRL-I可包括細胞內PRL-I多肽。所述PRL-3多肽可包括細胞內PRL-3多肽。除非另外指出，否則本發(fā)明的實施將運用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些是本領域普通技術人員的能力所能及的。這些技術在文獻中有說明。例如，參見J.Sambrook，E.F.Fritsch，andΤ.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.Μ.etal.(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJames0'D.McGee,1990,InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress；D.Μ.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)；和LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些一般性文本的每一篇都通過引用的方式納入本文。圖1.快速形成侵襲性(aggressive)肺腫瘤轉移的七步動物模型。1.如以前的描述8，產生50%細胞表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的CHO穩(wěn)定混合池。2.經尾靜脈將IXlO6的這種細胞注射至裸鼠的循環(huán)系統(tǒng)中。3.在注射后3周時分離單個的EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I肺腫瘤。4.在培養(yǎng)皿中切割并剁碎所述腫瘤以產生同質的表達EGFP-PRL的細胞系(AT-3或AT-1)。5.將IXIO6個AT-3細胞或AT-I細胞經裸鼠的尾靜脈注射至循環(huán)系統(tǒng)中。6.未處理組未處理、PBS或無關小鼠抗體。7.將以AT-3細胞注射的小鼠用腹水或純IgG形式的PRL-3mAb克隆#223或#318處理，而將以AT-I細胞注射的小鼠以PBS處理或者以PRL-ImAb克隆269腹水處理。圖2.PRL-3和PRL-ImAb特異性地抑制它們各自的轉移性肺腫瘤形成。A.將1XIO6個AT3細胞(圖1中描述)經尾靜脈注射至裸鼠中。小鼠是未處理的(a，n=10)或PBS-處理的(b，η=10)，或者被以兩種無關抗體處理(c，η=5；d,η=5)。PRL_3mAb223是以純IgG(e)或腹水(g)的形式經尾靜脈給予；PRL-3mAb318是以純IgG(f)或腹水(h)的形式經尾靜脈給予。在接種AT3細胞后第3、6和9天注射所述不同的抗體。在注射后第15天切下肺并在熒光顯微鏡下照相以顯示GPF-陽性的轉移瘤。圖像a、b、e和f為雌性小鼠的肺。圖像c、d、g和h為雄性小鼠的肺。B.A中的腫瘤總數目被認為是每組腫瘤損害的平均數(Y軸)，X軸顯示經不同處理的不同組小鼠。以AT-3細胞注射的小鼠的結果顯示于第1-7列。以AT-I細胞注射的小鼠以PBS或以抗PRL-I的mAb269處理(第8_9列)。η=每組中的小鼠數目。圖3.PRL-ImAb特異性地抑制PRL-I轉移瘤，但不抑制PRL-3轉移瘤；而PRL_3mAb特異性地抑制PRL-3轉移瘤，但不抑制PRL-I轉移瘤。在第1天，本發(fā)明人將表達EGFP-PRL-I或EGFP-PRL-3的一百萬個癌細胞(AT-1或AT-3)經其尾靜脈注射至每只小鼠中。然后將小鼠分組，在注射癌細胞后第3、6和9天經它們的尾靜脈分別接受PBS、兔PRL抗體、？扎-111^13或？扎-311^13。在第15天，將來自攜帶表達EGFP-PRL-I的AT-I癌細胞的小鼠的肺(圖a-d)或來自攜帶表達EGFP-PRL-3的AT-3癌細胞的小鼠的肺(e_h)切下并拍照。肺中的PRL-I和PRL-3轉移瘤不能被模擬品PBS處理阻斷(a、e)，但都可以被兔抗體(b、f)有效阻斷。PRL-ImAb可抑制PRL-I過表達的腫瘤的形成(c)，但當PRL-3過表達時不抑制腫瘤的形成(g)。類似地，PRL-3mAb可抑制PRL-3過表達的轉移瘤的形成(h)，但在PRL-I過表達時不抑制轉移瘤的形成(d)。因此，這些各個PRL-mAb分別在對表達其靶抗原的細胞的肺轉移瘤形成進行阻斷中是特異性的。圖4.PRL-3mAb可有效地阻斷A2780PRL-3-陽性癌細胞的轉移瘤形成；但對于CT26PRL-3陰性癌細胞的轉移瘤形成沒有效應。Α.A2780細胞而非CT26細胞表達內源的PRL-3。通過蛋白質印跡法分析從CT26小鼠結腸癌細胞系和A2780人卵巢癌細胞系制備的細胞裂解物，以檢測PRL-3。將GAPDH用作上樣對照。B.PRL-3抗體處理不影響接種癌細胞后2周時CT26PRL-3陰性細胞的肺腫瘤形成。對所有主要組織檢查腫瘤形成情況。對處理小鼠(圖a)和未處理小鼠(圖b)的動物總體形態(tài)以及切下的肺拍照。在所有肺中觀測到了廣泛的腫瘤形成，由黑色箭頭標出。C.PRL-3抗體處理可抑制接種癌細胞后1個月時實驗性轉移測定中的病理表觀及A2780PRL-3陽性細胞的腫瘤形成。對所有主要組織檢查腫瘤形成情況。對動物總體形態(tài)以及從未處理動物切下的腫瘤(由黑色箭頭標出)拍照。在處理小鼠中沒有觀測到腫瘤。圖5.通過間接免疫熒光法顯示AT-3癌細胞和親本CHO細胞中的抗體攝取。A.EGFP-PRL-3在所有非透化AT-3細胞中表達，這是通過EGFP檢測的(a、d)。一些細胞被PRL-3mAb完全標記19(圖b、e中白色箭頭標出)；40%的非透化細胞被PRL_3mAb部分地標記為紅色；所述被內化的抗體似乎以極化的方式分布于細胞端部(f中單頭箭頭標出)并且一些分布在膜突出物中(f中雙頭箭頭標出)；而剩下的細胞保持未標記(c和f，僅綠色的細胞)。B.To-pro-3碘化物被用于將每個親本CHO細胞的DNA染色為藍色。能夠攝取小鼠抗-GS28抗體的活細胞(10-20%)呈現綠色(a、b和c)。血清過夜饑餓的大多數活細胞(60-70%)能夠攝取小鼠抗-GS28抗體，呈現為綠色(d、e和f)。白色箭頭標出不能攝取抗體的一些細胞(或許處于細胞周期的某些階段)。尺度條，20μm。圖6.正常細胞和癌細胞中一般的抗體攝取現象通過雙染色的間接免疫熒光法顯示Α·將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗-PTEN抗體(綠色)添加至非透化MCF-10A正常細胞。B.將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗-ρ53抗體(綠色)添加至非透化MCF-7癌細胞。C.將小鼠抗-GS28抗體(紅色)和兔抗-ρ53抗體(綠色)添加至16小時血清饑餓的非透化MCF-7細胞。將To-pro-3碘化物用于染色DNA(藍色)。尺度條，20μm。圖7.PRL-3和PRL-1在多種人癌癥中過表達。A.將PRL_3mAb(克隆223或318)用于檢查PRL-3在多個人癌癥樣品中的表達情況。PRL-3過表達的實例出現于人結腸(26/158例，a)、乳腺(19/96例，b)、食道(2/13例，c)、肺(d，虛線右手邊上方的吸煙沉淀物被染色為黑色)、陰莖(e)和宮頸癌(f)。所述PRL-3陽性信號通過用3，3'-二氨基聯苯胺色原(DAB)的免疫組織化學法被顯示為褐色。所有圖像的放大倍數都是X400。B.將PRL-ImAb(克隆269)用于檢查PRL-I在多個人癌癥樣品中的表達情況。顯示了PRL-I在人結腸(8/128例，a，X200放大倍數)、腦(5/20例，b，X200)和食道(1/13例，c，X400)中過表達的實例。圖8.PRL-3和PRL-1嵌合mAb僅特異性地與它們各自的抗原作用。A.所示的模型顯示了構建嵌合mAb的主要步驟梗概。B.通過IF，在過表達EGFP-PRL-3的DLD-I細胞上測試了PRL-3嵌合mAb(#318)(a)，并表明所述PRL-3嵌合mAb能識別這些細胞中的EGFP-PRL-3(b)。合并的圖像顯示于c中。類似地，還在過表達EGFP-PRL-I的DLD-I人結腸直腸癌細胞上測試了PRL-I嵌合mAb(#269)(d)，并表明所述PRL-ImAb能識別這些細胞中的EGFP-PRL-I(e)。合并的圖像顯示于f中。尺度條，20μπι。C.通過蛋白質印跡分析，在源自過表達EGFP-PRL-3的DLD-I細胞(第1道)、過表達myc-PRL-3(第2道)、myc-PRL-1(第3道)或myc-PRL-2(第4道)的CHO細胞的4份細胞裂解物上評估了所述PRL-3嵌合mAb。PRL-3嵌合mAb僅與EGFP-PRL-3和myc-PRL-3作用，而不與myc-PRL-l禾口myc-PRL-2作用。D.在3種GST-PRL蛋白質上評估了所述PRL-1嵌合mAb=GST-PRL-I(第1道)、GST-PRL-2(第2道)和GST-PRL-3(第3道)。PRL-I嵌合mAb僅與GST-PRL-1作用，但不與GST-PRL-2和GST-PRL-3作用。圖9.PRL-3嵌合mAb顯著地抑制表達內源性PRL-3的A2780細胞和HCTl16細胞的轉移瘤形成，但不抑制不表達內源性PRL-3的DLD-I細胞的轉移瘤形成。A.從過表達EGFP-PRL-3的HCT116、A2780、DLD-I癌細胞和DLD-I細胞提取總細胞裂解物。所述內源性PRL-3蛋白在HCT116和A2780被檢測到，但未在在DLD-I細胞中被檢測到。所述外源性EGFP-PRL-3僅在第4道被檢測到。對于B、C和D在第1天經尾靜脈以1XIO6個癌細胞注射裸鼠。所述小鼠被給予PRL-3嵌合mAb(處理的)或PBS(未處理的)。當未處理小鼠嚴重患病時，每個實驗的時長被確定并結束。在每次實驗結束時拍照片。B.HCT116細胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠。C.A2780細胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠。D.a.DLD-I細胞的處理，左為處理的小鼠，右為未處理的小鼠；b.表達EGFP-PRL-3的DLD-I細胞的處理，左為未處理的小鼠，右為處理的小鼠。圖10.PRL-3可增強肺轉移瘤形成和血液循環(huán)中的癌細胞存活。A.顯示了來自處理小鼠和未處理小鼠的肺切片。在熒光顯微鏡下，多個微腫瘤(以Micro-T標出)出現在來自未處理小鼠的肺切片中，但很少出現在來自處理小鼠的肺切片中。B.將從處理小鼠和未處理小鼠的尾靜脈得到的血液樣品涂于載玻片上，并在熒光顯微鏡下檢查EGFP-PRL-3癌細胞。箭頭標示出了EGFP-PRL-3陽性的癌細胞。圖11.PRL-3嵌合抗體可有效地抑制表達內源性PRL-3的B16F0細胞的轉移瘤形成，但不抑制不表達內源性PRL-3的B16F10細胞的轉移瘤形成。A.從B16F0和B16F10癌細胞制備總細胞裂解物。所述內源性PRL-3蛋白僅在B16F0細胞被檢測到，但未在B16F10細胞中被檢測到。B.在嵌合mAb處理后第1天以IXIO6個B16F0細胞注射裸鼠。左側顯示處理的小鼠，右側顯示未處理的小鼠。腫瘤出現于未處理的小鼠的腎上腺、肝、骨和腹部中。PRL-3mAb可消除處理小鼠大多數組織中的腫瘤形成。C.在第1天以1XIO6個B16F10細胞注射裸鼠。上圖顯示處理的小鼠，下圖顯示未處理的小鼠。數十個肺轉移瘤出現于處理小鼠中和未處理小鼠中。圖12.抗-PRL3抗體318可結合細胞內的和外部化的/分泌的PRL-3多肽。A.細胞內PRL3，B.GAPDH對照，C.外部化的/分泌的PRL-3多肽。圖13.抗-PRLl抗體269和抗-PRL3抗體318的表位作圖。A.通過蛋白質印跡顯示的抗-PRLl抗體269結合的肽。B.通過蛋白質印跡顯示的抗-PRL3抗體318結合的肽。具體實施例方式抗-PRL抗體本文實施例描述了抗PRL蛋白的抗體(即抗-PRL抗體)的形成和生產。這些抗-PRL抗體能夠結合PRL-I或PRL-3，優(yōu)選細胞內PRL-I或PRL-3。單克隆抗體和人源化單克隆抗體兩者以及它們的性質都詳述于本文和實施例。所述抗體包括能夠結合至PRL-I的單克隆抗體269。所述抗體還包括能夠結合至PRL-3的單克隆抗體223和單克隆抗體318。這些抗體中每一種的人源化形式也被公開。為了避免歧義，除非在上下文中另外指出，否則在本文中如果提及一個特別的抗體命名，那么將認為這包括提及了小鼠單克隆抗體(由一種雜交瘤分泌)以及它的人源化形式。因此，例如，如果抗體269被提及，則這包括單克隆抗體269(即小鼠雜交瘤分泌的被命名為269的抗體)以及人源化單克隆抗體269。本領域技術人員通過本文中公開的信息并應用本發(fā)明人亦詳述的分子生物學技術，可產生本文中描述的特定抗體?；诖四康?，本發(fā)明人公開了單克隆抗體269、單克隆抗體223和單克隆抗體318的可變區(qū)序列。本發(fā)明人還公開了這些可變區(qū)的變體、同系物、片段和衍生物。本領域技術人員使用這些序列信息可產生包含這些可變區(qū)或它們的變體、同系物、片段和衍生物的抗體。本發(fā)明人還公開了用于表達這些單克隆抗體的核酸構建體的序列。這些構建體的序列能夠產生具有與269、223或318相同的序列的單克隆抗體。本發(fā)明人還公開了269、223和318的變體、同系物、片段和衍生物。最后，本發(fā)明人公開了能夠表達所述人源化單克隆抗體269、223或318的構建體的序列。本發(fā)明人描述了從以所述構建體以及這些人源化構建體的變體、同系物、片段和衍生物轉染的細胞表達所需抗體的方法。本領域技術人員使用這些序列和表達方法可容易地轉染相關的宿主細胞，并使它們表達整個單克隆的或者人源化的抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體，或者它們的變體、同系物、片段和衍生物。本發(fā)明人還提供了一般具有PRL結合活性的多肽。這些多肽包括抗-PRL抗體，例如抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體。所述PRL結合多肽可具有與所述單克隆抗體269、223和318相同或相似的一種或多種性質。為了方便之目的，所述多肽將被統(tǒng)稱為“抗-PRL抗體，，。讀者有能力構建這樣的結合分子，即這些分子可以不是(或者可以不被記述為)抗體或免疫球蛋白，但具有如本文所述的抗-PRL結合活性。因此，只要前后文允許，術語“抗-PRL抗體”應被認為包括任何分子，只要這種分子能夠結合PRL。這些分子不僅可包括抗體和免疫球蛋白，還可包括多肽、小分子，并且可通過本領域中已知的多種方法進行鑒定，例如通過就PRL結合活性篩選合適的文庫進行鑒定。所述抗-PRL抗體(包括PRL結合分子)可具有與所述單克隆抗體269、223和318相似或相同的性質。這些相似或相同的性質可具體包括結合性質。所述抗-PRL抗體一般能夠結合至PRL多肽，例如PRL-I和PRL-3。因此，術語“抗-PRL抗體”將被認為包括單克隆抗體269、223和318(以及它們的人源化對應物)。還包括包含抗體269、223或318的可變區(qū)或者其變體、同系物、片段和衍生物的多肽。如果上下文允許，該術語還應被認為包括是指抗-PRL抗體的變體、同系物、片段和衍生物。PRLl和raL3表位所述抗-PRL抗體可具有與269、223或318相同或相似的結合特異性、結合親和性和/或結合親和性。所述抗-PRL抗體可特異性地結合至抗體269結合的表位、抗體223結合的表位或抗體318結合的表位。確定具體抗體結合的表位的方法在本領域中是已知的。這種表位作圖方法記載于例如Hansonetal.，(2006).RespiratoryResearch，7126中。此外，本領域技術人員將能夠形成抗體并就具體的性質對其進行篩選。一種這樣的方法的詳細描述顯示于實施例27中。因此，本領域技術人員將能容易鑒定可結合于與269、223和318所結合表位相同的表位的抗-PRL抗體。實施例27顯示，抗-PRLl抗體269可結合于表位TYKNMR和TLNKFI。因此，本發(fā)明人提供了諸如能結合序列TYKNMR的抗-PRLl抗體的抗-PRL抗體。本發(fā)明人還提供了諸如能夠結合TLNKFI的抗-PRLl抗體的抗-PRL抗體。所述抗-PRL抗體可以有能力同時結合這兩個序列。再者，實施例27顯示，抗-PRL3抗體可結合表位KAKFYN和HTHKTR。因此，本發(fā)明人提供了諸如能結合序列KAKFYN的抗-PRL3抗體的抗-PRL抗體。本發(fā)明人還提供了諸如能夠結合HTHKTR的抗-PRL3抗體的抗-PRL抗體。所述抗-PRL抗體可以有能力同時結合這兩個序列。所述抗-PRL抗體可包含抗體269的可變區(qū)、抗體223的可變區(qū)或抗體318的可變區(qū)，它們中的每個均在下文中詳述。它們可以在單個抗體分子中包含相同的或不同的可變區(qū)。它們可包含一個可變區(qū)，或者多于一個可變區(qū)。因此，本發(fā)明人使得本領域技術人員有能力產生具有與抗體269、223或318有相同或相似結合反應性的任何數目的抗體。這種抗體可包括序列完整或基本完整的抗體(即重鏈和輕鏈)，或者它們可以包括完整抗體的片段(例如Fv、F(ab')和F(ab')2片段，或者單鏈抗體(scFv))。所述抗體還可包括包含所述抗體的抗原結合位點的融合蛋白或合成蛋白，如下文中的詳述。還顯而易見的是，可以就所需的性質例如降低的宿主反應性、減少的排斥反應等設計這些抗體。所述設計可包括“人源化”，本發(fā)明人使用該術語指在抗體序列例如小鼠抗體序列中納入(或替換)有一個或多個人殘基或序列?！叭嗽椿痹诒疚纳舷挛闹邪ā扒逗稀笨贵w，其中所述抗體包含不連續(xù)部分的小鼠和人序列，例如所述可變區(qū)中的一個或兩個都包含小鼠序列，而所述抗體分子的剩余部分(例如恒定區(qū))包含人序列。在這些嵌合抗體中，例如小鼠抗體或大鼠抗體的完整可變區(qū)可以同人恒定區(qū)一起表達。這提供了這樣一種具有人效應物功能的嵌合抗體，并且還降低了由鼠Fc區(qū)引起的免疫原性(HAMA)。一般而言，“嵌合抗體”可以指這樣的一種抗體，即該抗體具有由源自鼠免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈或輕鏈，以及由源自人免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈或輕鏈?！叭嗽椿边€包括⑶R移植的或重構的抗體。因此，它包括更不連續(xù)水平的設計，例如其中小鼠可變區(qū)已被突變來包括人殘基從而降低免疫原性的抗體。在這樣的抗體中，僅來自嚙齒動物抗體V區(qū)的互補決定區(qū)可以與來自人V區(qū)的框架區(qū)結合。這樣的抗體與嵌合抗體相比應該更加人源化，并且免疫原性更低。通常，所述抗-PRL抗體在許多狀態(tài)下都能夠結合至PRL多肽。在一個實施方案中，所述結合環(huán)境包括細胞內狀態(tài)。也就是說，所述抗-PRL抗體能夠結合至完整細胞或非透化細胞中的PRL多肽。這樣的非透化細胞可包括這樣的細胞，即所述細胞未暴露于或者基本未暴露于透化劑例如洗滌劑(如TritonX-100)或毛地黃皂苷(digitonin)中。如本文描述的抗-PRL-3抗體能夠結合至以下情況下的PRL-3，即所述PRL-3在細胞內、細胞膜內或者被包裹在細胞中。類似地，如本文大體描述的，PRL-I多肽在細胞內部組成的環(huán)境中可被抗-PRL-I抗體結合。所述抗-PRL-I抗體和抗-PRL3抗體具體地能夠結合至細胞內PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述細胞內PRL多肽可以與一種或多種細胞結構相關聯，所述細胞結構例如細胞膜的內葉、細胞器、細胞骨架結構、核膜等。所述PRL多肽可位于核內。在這其中的每種情況中，所述抗-PRL抗體能夠結合至細胞內環(huán)境中的PRL多肽。所述抗-PRL抗體能夠以多種方式結合至細胞內環(huán)境中的PRL多肽。所述抗-PRL抗體能夠通過質膜。它能夠以別的方式接近所述PRL多肽的結合區(qū)，例如通過細胞攝取。它可以通過任何方式被內化或被易位或者另外被送遞至細胞中。在另一個實施方案中，所述結合條件包括細胞外條件。所述抗-PRL抗體因此能夠在細胞外環(huán)境中結合至它的同系PRL多肽。所述抗-PRL抗體因此能夠在細胞外結合至PRL多肽。換句話說，本文描述的抗-PRL-I抗體能夠在PRL-I在細胞外時與之結合。類似地，如本文大體描述的，PRL-3多肽在細胞內部之外的環(huán)境中可被抗-PRL-3抗體結合。所述抗-PRL抗體能夠結合至分泌的PRL-I多肽或PRL-3多肽(視情況而定)。所述PRL-I多肽或PRL-3多肽可包括循環(huán)的PRL-I多肽或PRL-3多肽。所述抗-PRL抗體能夠結合至外部的或外化的PRL多肽。它們可結合至血液循環(huán)中的分泌的PRL多肽。所述抗-PRL抗體及其靶標之間的結合可以是更強的或更弱的、短暫的、半永久的或永久性的。所述抗-PRL抗體與所述PRL多肽的結合可發(fā)生在細胞內。這樣的結合可使所述PRL多肽的活性失活、被抑制或降低。所述結合可中和PRL的活性。所述活性可包括由所述PRL多肽引起的或與之相關的任何生物活性。所述活性可包括與另一種蛋白例如下游蛋白或因子的結合?？?PRL抗體與PRL多肽的結合可使下游蛋白或因子的活性失活、被抑制或降低。所述活性可包括與其他細胞的通訊，所述細胞例如循環(huán)系統(tǒng)中的轉移癌細胞。因此，所述抗-PRL抗體可中和血液循環(huán)中的PRL多肽，以阻止PRL-磷酸酶與下游因子結合，或者阻止它們與循環(huán)系統(tǒng)中的其他細胞通訊。所述活性可包括生物化學活性或病原性活性。所述生物化學活性可包括催化活性。所述催化活性可包括磷酸酶活性。所述活性可包括生長調節(jié)活性、癌活性、致癌活性或轉移活性。所述單克隆抗體269、223和318可用于治療人或其他動物中的疾病。本發(fā)明人在實施例中表明這些抗-PRL抗體具有抗癌活性。具體地，實施例表明，所述抗-PRL抗體能夠阻止癌腫瘤的轉移擴散。實施例9記載了PRL過表達腫瘤在小鼠中的生成，并提供了一個用于轉移和癌癥治療的動物模型。實施例10-12表明，與未用抗-PRL抗體處理的動物相比，以抗-PRL抗體處理的動物顯示了顯著更低的轉移性肺腫瘤。具體地，所述處理動物顯示出比未處理動物少約90%的腫瘤。所述抗-PRL抗體能夠結合PRL多肽并阻斷其活性，盡管該PRL多肽定位在細胞內。本發(fā)明人的研究代表了通過使用抗各自的磷酸酶(盡管它們定位于細胞內)的單克隆抗體可有效地(約90%)阻斷轉移的首批例證。本發(fā)明人還表明，抗-PRL-3單克隆抗體可有效地阻斷表達內源性PRL-3蛋白的人卵巢癌細胞系A2780的轉移瘤形成。因此，本發(fā)明人提供了抗-PRL抗體在疾病例如癌癥治療或預防中的用途。所述癌癥可包括轉移癌。所述抗-PRL抗體可被用作藥物或治療劑以治療癌癥例如已形成腫瘤的轉移。它們可被用于預防癌癥或癌癥轉移?？芍斡蚩深A防的癌癥可包括這樣的癌癥，即該癌癥與PRL蛋白的表達或過表達有關。所述PRL蛋白可以是其家族的一個相關成員。本發(fā)明人以此表示，通過抗-PRL-I抗體例如269或具有相似或相同性質的抗體，與PRL-I蛋白的表達或過表達相關的癌癥是可以治愈的或可以預防的。類似地，通過抗-PRL-3抗體例如223或318或者具有相似或相同性質的抗體，與PRL-3的表達或過表達相關的癌癥是可以治愈的或可以預防的。所述癌癥可包括多種癌癥的任一種，例如結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。所述治療通?？砂▽┘毎蛞伤茷榘┘毎募毎c抗-PRL抗體相接觸?？蓪⑺黾毎┞队诳?PRL-I抗體。可將它暴露于或另外暴露于抗-PRL-3抗體?？蓪⑺瑫r暴露于抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體。在這種情況下，可將所述細胞同時暴露于兩種抗體，或者依次暴露于各抗體?？蓪⒃摫┞吨貜蛿荡??？梢允褂萌魏蔚牧炕蛳鄬α考叭魏蔚谋┞稌r間的任何組合的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體。因此，本發(fā)明人提供了如上述的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結合物在治療疾病例如癌癥中的用途。所述細胞可是單個細胞，或者它可以在細胞塊例如癌細胞塊或腫瘤細胞塊中。所述細胞可位于生物體的體內。所述生物體可以是已知患有癌癥的生物體，或者可能是疑似患有癌癥的生物體。所述治療可包括將所述一種或多種抗體給予所述生物體。如上文，可給予單獨一種抗體，或者可給予抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體的結合物。如上述，所述給予可以是同時的或序貫的。因此，所述治療可包括將抗-PRL-I抗體與抗-PRL-3抗體同時地或序貫地給予所述個體。如下文中更詳述的，所述抗-PRL抗體通常包括能夠結合至PRL分子的任何免疫球蛋白。PRL-I下文從OMIM條目601585修改而來。PRL-I也被稱為蛋白酪氨酸磷酸酶，4a型，1；PTP4A1,肝再生磷酸酶1，PTP(CAAXl)。PRL-I的染色體定位在基因圖譜座位6ql2。涉及生長、分化和代謝的細胞過程經常部分地被蛋白質磷酸化和脫磷酸化調節(jié)。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)水解酪氨酸殘基的磷酸單酯，全都共有一個活性位點基序，并被分成3類。這3類包括受體樣PTP、細胞內PTP和雙特異性PTP，所述雙特異性PTP不但可以脫去酪氨酸的磷酸，而且可以脫去絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的磷酸。Diamondetal.1994，Cell.Biol.14:3752_3762描述了一種來自再生的大鼠肝的PTP，這種PTP是第四類的一成員。該基因被命名為Prll，是許多立即早期基因中的一種，主要在核內表達。Prll在穩(wěn)定轉染的細胞中的過表達導致了表型的轉變，這表明它可能在腫瘤發(fā)生中起到某些作用。通過使用體外異戊二烯化篩查，Catesetal.，1996，CancerLett.110:49_55分離了2種編碼PRLl同系物的cDNA(被命名為PTP(CAAXl)禾ΠPTP(CAAX2)(PRL2；601584)),所述PRLl同系物被哺乳動物的法尼基蛋白質轉移酶體外法尼基化。這些PTP在上皮細胞中的過表達引起培養(yǎng)細胞的表型轉變和裸鼠中的腫瘤生長。這些作者得出結論，PTP(CAAXl)和PTP(CAAX2)代表異戊二烯化的致瘤PTP的一個新類。Pengetal.1998,J.Biol.Chem.273:17286-17295報道，人PTP(CAAXl)基因(即PRL1)包含6個外顯子并含有2個啟動子。預測的小鼠、大鼠和人PRLl蛋白是相同的。Zengetal.1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.244:421_427確定，人PRLl和PRL2蛋白具有87%的氨基酸序列同一性。Pengetal.(1998)通過FISH將PRLl基因定位至6ql2。如果使用術語“PRL-1”，那么它將被認為是指任何的PRL-I序列，包括PRL-1蛋白或PRL-I核酸，以及它們的任何片段、變體同系物、衍生物或變體。PRL-I的性質和活性被記載于本文中，例如在參考文獻中。[從OMIM修改的內容結束]小鼠和人PRL-I蛋白被記載于Zengetal(1998)，見上文。PRL-I序列本文描述的方法和組合物利用了PRL-I多肽，所述PRL-I多肽在下文中詳述。如本文中使用的，術語“PRL-1，，意欲指如下表Dl中列出的序列。Unigene描述NM_003463.3人蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型，成員1(PTP4A1)，mRNACR602427.1人(Homosapiens)HeLa細胞Cot25-正態(tài)化的全長cDNA克隆CSODKO12YJ03CR599216.1人神經母細胞瘤的全長cDNA克隆CL0BB007ZF05CR596545.1人HeLa細胞Cot25-正態(tài)化的全長cDNA克隆CSODKO10YM06CR749458.1人mRNA；cDNADKFZp779M0721(來自克隆DKFZp779M0721)BC045571.1人蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型，成員l，mRNA(cDNA克隆MGC:57320IMAGE4826233)，全長cdsAJ420505.1人mRNA全長插入cDNA克隆EUR0IMAGE2096405AK312526.1人cDNA,FLJ92892BC023975.2人蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型，成員l，mRNA(cDNA克隆MGC:1659IMAGE:2960001)，全長cdsU69701.1人蛋白酪氨酸磷酸酶hPRL-ΙΝmRNA,部分cds<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表Dl.PRL-I序列"PRL-1多肽”可包括人PRL-I多肽或者由人PRL-I多肽組成，例如具有Unigene登記號NM_003463.3的序列。還包括了任一、一些或全部的這些多肽的同系物變體和衍生物。例如，PRL-I可包括登記號U84411.1的Unigene。PRL-3下文從OMIM條目606449修改而來。PRL-3也被稱為蛋白酪氨酸磷酸酶，4a型，3；PTP4A3。PRL-3的染色體定位在基因圖譜座位8q24.3。蛋白激酶在心臟中調節(jié)收縮、離子轉運、代謝和基因表達。磷酸酶除了在脫磷酸化中起作用外，還參與至心臟肥大和心臟功能障礙中。通過數據庫搜索和對心臟cDNA庫的篩查，Matteretal.2001,Biochem.Biophys.Res.Commun.2831061-1068鑒定了一種編碼PTP4A3的cDNA，他們將其命名為PRL3。該推定的PRL3蛋白與PRL1(PTP4A1；601585)是76%相同的，與小鼠Prl3是96%相同的。RNA印跡分析顯示了大約2.3kb的PRL3轉錄物主要在心臟和骨骼肌中表達，在胰臟中表達較低。這種表達模式不同于PRLl和PRL2(PTP4A2;601584)的更廣泛表達。原位雜交分析將PRL3的表達定位于心肌細胞。Tris甘氨酸凝膠分析表明PRL3表達為22-kD的蛋白。功能和突變分析表明，磷酸切割依賴于PRL3的cysl04。PRL3的過表達導致了細胞生長的提高。蛋白質印跡分析顯示了pl30Cas(BCARl；602941)響應血管緊張素II(106150)脫磷酸化，這表明了PRL3在調節(jié)由血管緊張素II誘導的短暫細胞內鈣中起作用。為了了解轉移的分子基礎，Sahaetal.2001，Science2941343-1346比較了轉移結腸直腸癌和原發(fā)癌、良性結腸直腸腫瘤和正常結腸直腸上皮的全基因表達譜。PRL3在所研究的18個癌癥轉移中的每個中均以高水平表達，但在非轉移腫瘤和正常結腸直腸上皮中以較低水平表達。在所檢查的12個轉移的3個中，多拷貝的PRL3基因出現在位于染色體8q24.3處的小擴增子中。Saha等人(2001)得出這樣的結論，PRL3基因對于結腸直腸癌癥轉移是重要的。使用斯坦福G3輻射雜交板(StanfordG3radiationhybridpanel)和數據庫序列分析，Saha等人(2001)將PRL3基因作譜于標記物145.20附近。PRL3基因還緊密連接于標記物SHGC-22154，SHGC-22154位于8q24.3，距8q端粒大約3Mb。[從OMIM修改的內容結束]小鼠和人PRL-3蛋白被詳細記載于Lietal(2005)，ClinCancerRes；112195-204。PRL-3序列本文描述的方法和組合物利用了PRL-3多肽，所述PRL-3多肽在下文中詳述。如本文中使用的，術語“PRL-3”意欲是指如下表D2中列出的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>"PRL-3多肽”可包括人PRL-3多肽或者由人PRL-3多肽組成，例如具有Unigene登記號AF041434.1的序列。還包括了任一、一些或全部的這些多肽的同系物變體和衍生物。例如，PRL-3可包括登記號BC066043.1的Unigene。PRL-I多肽和PRL-3多肽PRL-I多肽和PRL-3多肽可被用于多種方法中，例如用于產生或篩查抗_PRL_1劑和抗-PRL-3劑，例如特異性PRL-I結合劑和PRL-3結合劑，尤其是抗-PRL抗體。這些在下文中進一步詳述?？梢詸z測PRL-I多肽和PRL-3多肽的表達，用于診斷或檢測癌癥，尤其是乳腺癌?！岸嚯摹笔侵赴ㄟ^肽鍵或修飾肽鍵即肽電子等排體彼此連接的兩個或多個氨基酸的任何肽或蛋白質?！岸嚯摹奔戎竿ǔ７Q為肽、寡肽或寡聚物的短鏈，也指通常稱為蛋白質的較長鏈。多肽可包含20種基因編碼氨基酸以外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^自然過程如翻譯后加工，或者通過本領域中公知的化學修飾技術修飾的氨基酸序列。這樣的修飾被詳細記載于基礎教科書和更詳細的專著，以及分卷的研究文獻中。修飾可發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。應理解相同類型的修飾可以相同或不同的程度存在于給定多肽的數個位點處。而且，給定多肽可包含多種類型的修飾。多肽可由于遍在蛋白化作用而具有分支，而且它們也可以是具有或沒有分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可以由翻譯后自然過程或者通過合成方法產生。修飾可包括乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、Y羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒?；?、硫酸鹽化、轉運RNA介導的氨基酸至蛋白質的添加諸如精氛酷化及遍在蛋白化°參見例如Proteins-StructureandMolecularProperties,2ndEd.,Τ.Ε.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993andWold,F.,PosttranslationalProteinModifications!PerspectivesandProspects,pgs.1-12inPosttranslationalCovalentModificationOFProteins,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,1983；Seifteretal.,"Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors",MethEnzymol(1990)182:626_646andRattanetal,"ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging",AnnNYAcadSci(1992)66348-62。術語“多肽”包括本領域中已知的多種合成肽變體，例如反向釋放D肽(retroinversoDpeptide)0所述肽可以是抗原決定簇和/或T細胞表位。所述肽可以在體內是免疫原性的。所述肽能夠在體內誘導抗體被中和。正如適用于PRL-I和PRL-3那樣，所產生的氨基酸序列可具有一種或多種活性，例如與PRL-I多肽或PRL-3多肽(如人PRL-I多肽或PRL-3多肽)相同的生物活性。例如，與在正常乳腺細胞中相比，PRL-I或PRL-3同系物在癌細胞中的表達水平可升高。具體而言，術語“同系物”意在涵蓋結構和/或功能方面的同一性，前提是所得到的氨基酸序列具有PRL-I或PRL-3活性。就序列同一性(即相似性)而言，可有至少70%，例如至少75%，例如至少85%，例如至少90%的序列同一性。可有至少95%，例如至少98%的序列同一性。這些術語還涵蓋由為所述PRL-I核酸或PRL-3核酸序列的等位基因變異體的氨基酸得到的多肽。在提及多肽諸如PRL-I和PRL-3的“活性”或“生物學活性”時，這些術語意指PRL-I和PRL-3的代謝或生理功能，包括類似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的這些活性。還包括PRL-I和PRL-3的抗原性和免疫原性活性。這些活性的實例以及測定和定量這些活性的方法在本領域中是已知的，并且被詳細記載于本文的其他地方。抗體如果上下文允許，本文中使用的術語“抗體”和“免疫球蛋白”可互換使用。這些術語包括抗體分子的這樣的蛋白水解切割部分或重組制備部分的片段，即這些片段能夠選擇性地與PRL-I或PRL-3或者它們的表位相互作用，或者識別之，所述表位例如被269結合的PRL-I的表位或被223或318結合的PRL-3的表位。PRL-I的表位包括TYKWR和TLNKFI。PRL-3的表位包括KAKFYN和HTHKTR。這種水解和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv片段，以及包含通過肽連接子結合的VL和VH區(qū)的單鏈抗體(scFv)。這些Fv可以共價地或非共價地連接，以形成具有兩個或多個結合位點的抗體。本發(fā)明人以“ScFv分子”表示VH和VL配對區(qū)通過靈活的寡肽連接的分子。涉及保持了其特異性結合位點的抗體片段合成的一般性技術綜述見Winter&MilStein(1991)Nature349，293-299。完整抗體和F(ab')2片段是“二價物”。本發(fā)明人以“二價物”表示所述抗體和F(ab')片段具有兩個抗原結合位點。相反，Fab、Fv,ScFv和dAb是僅具有一個抗原結合位點的一價物。所述抗-PRL抗體可包括解離速率(offrate)為10-2s-1-10-4s-1的高親和性抗體。所述解離速率可以為約2X10-4s-1.本文中使用的術語“解離速率”是指抗體例如本文公開的抗-PRL抗體的離解速率(k。ff)。解離速率可使用BIAevaluation軟件(Pharmacia)測量。低解離速率是需要的，這是因為它可反映Fab片段對于抗原的親和性。術語“親和性”以抗體例如抗-PRL抗體的離解速率或解離速率(koff)定義。所述解離速率越低，則抗體例如抗-PRL抗體具有的對抗原例如PRL-I或PRL-3的親和性就越高。所述抗-PRL抗體可包括肽本身或者可形成融合蛋白的一部分。本文描述的抗-PRL抗體包括任何具有PRL-I或PRL-3結合活性的抗體，所述結合活性為例如結合至細胞內PRL-I或PRL-3的能力，或者結合至與269、223或318結合的相同表位(包括TYKNMR、TLNKFI、KAKFYN和HTHKTR)(視情況而定)的能力。所述抗-PRL抗體還包括小鼠的、人源化的或人的整個或完整抗體，例如抗體衍生物和生物學活性片段。它們可包括這樣的具有PRL-I或PRL-3結合活性的抗體片段，即所述抗體片段具有氨基酸置換或者具有糖分子或其他分子粘附于氨基酸官能團等。所述抗-PRL抗體可包括分離的抗體或純化的抗體。它可以從任何合適的天然源或非天然源得到或由其產生，或者它可以是合成的抗-PRL抗體、半合成的抗-PRL抗體、衍生的抗-PRL抗體或重組抗-PRL抗體。如果所述抗-PRL抗體為非天然的抗-PRL抗體，那么它可包括至少一部分通過重組DNA技術制備的抗-PRL抗體，或者通過化學合成技術產生的抗-PRL抗體，或者它們的組合。本文中使用的術語“衍生物”包括經化學修飾的抗-PRL抗體。例如，示例性的這種修飾可以是以烷基、酰基或氨基替換氫。所述抗-PRL抗體的序列可以與天然存在形式的序列相同，或者它可以是其變體、同系物、片段或衍生物?？贵w可變區(qū)本文使用的術語“可變區(qū)”是指輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區(qū)或域，所述可變區(qū)或域可包含所述抗體對PRL-I或PRL-3(或者變體、同系物、片段或衍生物)(視情況而定)的結合識別特異性決定簇和總親和性決定簇。每對輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變域參與至抗原識別并形成抗原結合位點。輕鏈域和重鏈域具有相同的整體結構，并且每個域具有4個框架(FR)區(qū)，所述框架區(qū)的序列相對保守，由3個互補決定區(qū)(OTR)連接。所述FR區(qū)保持可變域的結構完整性。所述⑶R是可變域中介導抗原結合的多肽區(qū)段。本文使用的術語“恒定區(qū)”是指抗體(或者變體、同系物、片段或衍生物)這樣的輕鏈域(CL)和重鏈域(CH)，即所述輕鏈域(CL)和重鏈域(CH)提供了結構穩(wěn)定性和其他生物學功能，例如抗體鏈關聯、分泌、經胎盤移動性和互補結合，但不參與結合PRL-I或PRL-3表位。恒定區(qū)基因的氨基酸序列和相應外顯子序列將依賴于它所源自的物種。然而，對于一物種中的具體恒定區(qū)來說，導致同種異型的氨基酸序列的變化是相對有限的?！巴N異型”是可區(qū)分等位基因的抗原決定簇(或者表位)。每條鏈的可變區(qū)通過連接性多肽序列與恒定區(qū)相接。所述連接序列由輕鏈基因中的“J”序列以及重鏈基因中的“D”序列和“J”序列的聯合序列編碼?？贵w269、223和318可變區(qū)序列抗體269單克隆抗體269可變區(qū)重鏈的核酸序列如下(SEQIDN0:1)GGGAATTCATGAAATGCAGCTGGGTTATTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGTTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTTACTAGTTATCGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGCTATGGTAACTTCGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTAAGCTTGGGA單克隆抗體269可變區(qū)重鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO2)EFMKCSWVILFLFSVTAGVHSQVQFQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYRMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYGNFGYWGQGTTLTVSSESQSFPNVFPLVSLG單克隆抗體269可變區(qū)輕鏈的核酸序列如下(SEQIDNO3)CTGTCTACTGCTCTCTGGTGAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGAAAGCAGATGGAACCATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCTCACTGGAGATCCTGCAGATCACGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT單克隆抗體269可變區(qū)輕鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO4)VYCSLVRVSLTCRASQDIGSSLNWLQQKADGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPWTFGGGTKLEIKRADAAPHWRSCRSRELWLHHLSSSSRHLMSS抗體223單克隆抗體223可變區(qū)重鏈的核酸序列如下(SEQIDNO5)GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTGAGTACAATGAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCACCCGTCTATCCCTTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA單克隆抗體223可變區(qū)重鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO6)EFMEWSWVILFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTEYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEERNYPWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPPVYPLVPGSLG單克隆抗體223可變區(qū)輕鏈的核酸序列如下(SEQIDNO7)TGGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGAAGATGATGGTGAAAATTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG單克隆抗體223可變區(qū)輕鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO8)WEFMETDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVEDDGENYMNWYQQKPGQSPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG抗體318單克隆抗體318可變區(qū)重鏈的核酸序列如下(SEQIDNO9)GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTTATTACAATGAGAAGTTCAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCCGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA單克隆抗體318可變區(qū)重鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO=IO)EFMEffSffVFLFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNYYMHWVKQRPGQGLEffIGffIYPGNVNTYYNEKFRARPH.LQTNPPAQPTCSSAA.PLRTLRSISVQVRRELPLVCLLGPRDSGHCLCSQNDTPIRLSPGPffKLG單克隆抗體318可變區(qū)輕鏈的核酸序列如下(SEQIDNO=Il)ACTAGTCGACATGGAGTCAGACACACTGCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATAAGCTTGGGA單克隆抗體318可變區(qū)輕鏈的氨基酸序列如下(SEQIDNO12)LVDMESDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK根據本文描述的方法和組合物，可通過本領域中已知的方法從這些可變區(qū)序列生成抗-PRL1抗體和抗-PRL3抗體。例如，通過本領域技術人員已知的重組基因工程技術，可將所述重鏈和輕鏈序列重組成為選擇抗體的恒定序列。恒定區(qū)序列是本領域中已知的，并且可從多個數據庫獲得，所述數據庫例如IMGT/LIGM-DB數據庫(記載于Giudicellietal，2006，NucleicAcidsResearch34(DatabaseIssue):D781-D784andLeFrancetal(1995)LIGM-DB/IMGT:AnIntegratedDatabaseofIgandTcR,PartofthelmmunogeneticsDatabase.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences764(l)，47-47doi:10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x)和IMGT/GENE-DB數據庫(記載于Giudicellietal，2005，NucleicAcidsRes.2005Jan1；33(Databaseissue):D256-61)。IMGT/LIGM-DB和IMGT/GENE-DB是位于www.ebi.ac.uk/imgt/的ImMunoGeneTicsDatabase的一部分。用于將可變區(qū)與給定序列和恒定區(qū)結合以產生完整抗體的方法是本領域中已知的，并被記載于例如實施例16和Hansonetal.，(2006).RespiratoryResearch，7126中。完整抗體的片段例如Fv、F(ab')和F(ab')2片段或者單鏈抗體(scFv)可通過本領域中已知的方法產生。例如，使用文獻中公開的序列和方法，可將具有上文所示序列的抗體318可變區(qū)的重鏈和輕鏈轉基因地融合至小鼠IgG恒定區(qū)序列，以產生小鼠單克隆抗-PRL-3抗體。類似地，318可變區(qū)可與人IgG抗體的恒定區(qū)重組地表達，以產生一種人源化的抗-PRL-3抗體。223抗體和269抗體的可變區(qū)可以被設計來與小鼠或人IgG恒定區(qū)在一起，以產生能夠結合至PRL-1多肽的小鼠單克隆抗體或人源化抗體。檢測和診斷方法對PRL-1和PRL-3表達的檢測PRL-1和PRL-3在癌癥組織中的表達與正常組織相比是上調的。因此，本發(fā)明人提供了一種診斷癌癥包括轉移性、侵襲性或侵入性(invasive)癌癥的方法，包括在個體的細胞或組織中檢測PRL-1和PRL-3的表達調節(jié)，例如PRL-1和PRL-3表達的上調。所述方法可包括使用本文中描述的抗-PRL抗體。所述抗-PRL抗體可用于免疫測定中，以檢測和測定生物樣品中PRL-1或PRL-3的量，從而提供PRL-1或PRL-3在所述樣品所來源的細胞、組織、器官或個體中的表達水平的指標。免疫測定包括ELISA、蛋白質印跡等，并且應用它們評估PRL-1和PRL-3表達的方法是本領域技術人員已知的。對PRL-1和PRL-3表達、活性和量的檢測可用于提供一種確定細胞增殖狀態(tài)的方法。因此，增殖細胞與正常細胞相比具有較高水平的PRL-1和PRL-3表達、活性或量。類似地，非增殖細胞與正常細胞相比具有低水平的PRL-1和PRL-3表達、活性或量。這樣的檢測還可用于確定細胞是否會變成侵入性的或侵襲性的。因此，在細胞中檢測到高水平的PRL-1和PRL-3表達、量或活性可指示所述細胞可能是或者可變成侵襲性的、轉移性的或侵入性的。類似地，如果細胞具有低水平的PRL-1和PRL-3表達、量或活性，那么所述細胞不是或者可能不是侵襲性的、轉移性的或侵入性的。應了解，由于PRL-1和PRL-3的水平會隨腫瘤的侵襲性變化，因此對PRL-1和PRL-3表達、量或活性的檢測還可用于預測癌癥個體的存活率，即高水平的PRL-1和PRL-3指示較低的存活率或幾率，低水平的PRL-1和PRL-3指示較高的存活率或幾率，這兩種情況均是與具有正常水平PRL-1和PRL-3的個體或同類種群相比較。對PRL-1和PRL-3的表達、量或活性的檢測因此可用作一種癌癥患者的預后方法。對PRL-1和PRL-3表達、量或水平的檢測可用于確定一種具體的療法在癌癥個體中成功的可能性。它可用于一種確定腫瘤在個體中是否是或者是否可能是一種侵入瘤或轉移瘤的方法中。本文中描述的診斷方法可與所述治療方法結合。因此，本發(fā)明人提供了一種在個體中治療、預防或緩解癌癥的方法，所述方法包括在所述個體的細胞中檢測PRL-1和PRL-3的表達、量或活性的調節(jié)，并基于所述腫瘤的侵襲性將合適的治療物給予所述個體。一般而言，將物理檢查X-射線用于檢測癌癥。一般采取腫瘤的活檢組織，用于診斷癌癥的組織病理學檢查。對PRL-1和PRL-3表達、量或活性的檢測可與標準組織病理學方法一塊用于診斷癌癥，或者進一步確認癌癥的診斷。這在組織病理學分析不能產生一個清晰的結果時可能是特別有用的。如下文進一步詳述的，可檢測PRL-1和PRL-3多肽及PRL-1和PRL-3核酸在樣品中的存在和量。因此，通過包括以下步驟的方法可診斷與PRL-1和PRL-3相關的疾病(包括癌癥)從源自受試者的樣品確定PRL-1和PRL-3多肽或者PRL-1和PRL_3mRNA表達、量或活性的非正常降低或升高，例如表達、量或活性的升高。所述樣品可包括來自患有或疑似患有這樣的疾病的生物體或個體的細胞樣品或組織樣品，即該疾病與升高的、降低的或者要不然異常的PRL-1和PRL-3表達、量或活性有關，包括表達、量或活性的水平或模式的空間變化或時間變化。PRL-1和PRL-3的表達、量或活性在患有或疑似患有這種疾病的生物體中的水平或模式可用于與表達、量或活性在正常生物體中的水平或模式比較，作為一種診斷疾病的方法。所述樣品可包括來自患有或疑似患有癌癥的個體的細胞樣品或組織樣品，例如相關的組織樣品或細胞樣品。在一些實施方案中，在所述樣品中檢測到水平升高的PRL-1和PRL-3的表達、量或活性。PRL-1和PRL-3的水平與正常細胞或已知不是癌癥的細胞相比可提高至一個顯著的程度。這種細胞可獲自被試驗的個體或其他個體，例如那些與所述試驗個體在年齡、體重、生活方式等上匹配的個體。在一些實施方案中，PRL-1和PRL-3的表達、量或活性的水平升高10%、20%、30%或40%，或者升高更多。在一些實施方案中，PRL-1和PRL-3的表達、量或活性的水平升高45%或更多，例如50%或更多，這通過cDNA雜交判斷。如本領域中已知的以及下文中進一步詳述的，PRL-1和PRL-3的表達、量或活性可以多種方式檢測。一般而言，在來自個體的組織樣品中測量PRL-1和PRL-3的量，并將該量與來自未感染個體的樣品比較。除了可以檢測PRL-1和PRL-3多肽的水平，還可以檢測PRL-1和PRL-3核酸的水平。對PRL-1和PRL-3的量、活性或表達的檢測可用于對癌癥分級。例如，高水平的PRL-1和PRL-3量、活性或表達可指示一種侵襲性的、侵入性的或轉移性的癌。類似地，低水平的PRL-1和PRL-3量、活性或表達可指示一種非侵襲性的、非侵入性的或非轉移性的癌。這種分級體系可與已確立的分級體系結合使用。可使用多種不同技術確定PRL-1和PRL-3基因表達的水平。對RNA水平的PRL-1和PRL-3表達的測量可以在RNA水平檢測PRL-1和PRL-3的基因表達。因此在一個實施方案中，本發(fā)明人公開了一種通過以下方式在一個樣品中檢測包括PRL-1和PRL-3核酸的核酸存在情況的方法將所述樣品與對所述PRL-1和PRL-3核酸特異的至少一種核酸探針接觸，并對所述樣品監(jiān)測PRL-1和PRL-3核酸的存在情況。例如，所述核酸探針可特異性地結合至PRL-1和PRL-3核酸或其一部分，并且還可檢測兩種被檢測物之間的結合情況和所述復合物自身的存在情況。PRL-1和PRL-3表達的RNA檢測可用于補充多肽表達測定，如下文所述，所述多肽表達測定可應用本文所述的抗-PRL抗體。因此，在一個實施方案中，可以在一個樣品中測量PRL-1和PRL_3mRNA形式的PRL-1和PRL-3核酸的量。PRL-1和PRL_3mRNA的測定可通過原位雜交、RNA印跡和反轉錄酶-聚合酶鏈式反應。核酸序列的鑒定可通過原位雜交、DNA印跡、單鏈構象多態(tài)性分析、使用特異性引物的PCR擴增和DNA芯片分析。(Kawasaki，1990；Sambrook,1992；Lichteretal,1990；Oritaetal,1989；Fodoretal.，1993；Peaseetal.，1994)。可以使用RNA提取技術從細胞提取PRL-1和PRL-3RNA，所述RNA提取技術包括例如酸性酚/異硫氰酸胍提取(RNAzolBbiogenesis)或者RNeasyRNA制備試劑盒(Qiagen)。利用核糖核酸雜交的一般性測定形式包括核連綴分析(nuclearrun-onassay)、RT_PCR和RNA酶保護測定(Meltonetal.，Nuc.AcidsRes.12:7035)?？杀粦玫臋z測方法包括放射性標記、酶標記、化學發(fā)光標記、熒光標記和其他合適的標記。這些方法中的每種均允許進行定量測定，并且這些方法是本領域中熟知的。因此，可使用任何本領域中熟知的多核苷酸定量方法測量RNA水平的PRL-1和PRL-3表達、量或活性的降低或升高。來自PRL-1和PRL-3序列的任何合適探針例如合適的人PRL-1和PRL-3序列的任何部分可用作探針。用于設計PRL-1和PRL-3探針的序列可包括登記號匪015472的序列或其部分。一般而言，使用RT-PCR來擴增RNA靶標。在該方法中，使用反轉錄酶來將RNA轉換成互補DNA(cDNA)，然后可擴增cDNA以有利于檢測。許多DNA擴增方法是已知的，它們中的大多數依賴于酶鏈式反應(例如聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應或自主序列復制)或者來自對其中克隆它的載體的全部或部分的復制。28許多靶標和信號擴增方法已在文獻中有記載，例如這些方法的一般性綜述見Landegren,U.etal.,Science242:229_237(1988)禾口Lewis,R.,GeneticEngineeringNews10:1,54-55(1990)例如，聚合酶鏈式反應可應用于檢測PRL-1和PRL_3mRNA。“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是一種核酸擴增方法，記載于美國專利4，683，195、4，683，202等。在診斷中，PCR可用于擴增任何已知的核酸(Moketal.，1994，GynaecologicOncology52:247_252)。自主序列復制(3SR)是TAS的一種變化形式，它涉及經以下途經的核酸模板等溫擴增由酶混合物和合適的寡核苷酸引物介導的反轉錄酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性的連續(xù)循環(huán)(Guatellietal.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874)。連接擴增反應或連接擴增體系使用DNA連接酶和4種寡核苷酸——每條靶鏈2種。該技術記載于ffu,D.Y.andWallace,R.B.,1989,Genomics4:560。在Q3復制酶技術中，將復制單鏈RNA的噬菌體Q3的RNA復制酶用于擴增靶DNA，如Lizardietal.,1988,Bio/Technology61197所記載的。PCR過程基本包括(1)處理提取的DNA以形成單鏈的互補鏈；(2)添加一對寡核苷酸引物，其中該對引物的一個引物與所述序列有義鏈的一部分基本互補，每對引物的另一個引物與同一序列互補反義鏈的不同部分基本互補；(3)使所述配對的引物與所述互補序列退火；(4)同時從每個引物的3'端延伸所述退火引物，以合成一個與同每個引物退火的鏈互補的延伸產物，其中所述延伸產物在從所述互補物分離后作為模板，用于為每對引物的另一個引物合成延伸產物；(5)從所述模板分離所述延伸產物，以產生單鏈的分子；及(6)通過重復至少一次所述退火、延伸和分離步驟擴增所述單鏈分子?？蓱梅崔D錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。還可使用定量RT-PCR。這些PCR技術在本領域中是熟知的，并且可應用來自PRL-1和PRL-3序列的任何合適的引物。還可利用另一種擴增技術。例如，滾環(huán)擴增技術(Lizardietal.,1998,NatGenet19225)是一種商業(yè)化的擴增技術(RCAT)，該技術由DNA聚合酶驅動并且可在等溫條件下以線性動力學或幾何動力學復制環(huán)形的寡核苷酸探針。另一種技術——鏈置換擴增(SDA；Walkeretal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80392)開始于特定靶標所特有的明確確定的序列。對多肽水平的PRL-1和PRL-3表達的測量可以在多肽水平檢測PRL-1和PRL-3的表達。因此，在又一個實施方案中，可以通過在一個樣品中檢測PRL-1和PRL-3多肽的存在或量而檢測PRL-1和PRL-3表達、量或活性。這一點可通過使用結合PRL-1和PRL-3多肽的分子實現。直接或間接結合于PRL-1和PRL-3多肽以檢測其存在情況的合適分子/制劑包括天然存在的分子例如肽和蛋白質(例如抗體)，或者它們可以是合成的分子。因此，本發(fā)明人公開了一種通過以下方式檢測PRL-1和PRL-3多肽存在情況的方法將一個細胞樣品與一種能夠結合所述多肽的抗體接觸，及監(jiān)測所述樣品的所述多肽的存在情況。例如，可以使用本文描述的抗-PRL-1抗體和抗-PRL-3抗體檢測所述PRL-1和PRL-3多肽。這樣的抗體可通過本文中詳述的方法制備。在一個具體的實例中，抗-PRL-1抗體可包括能夠結合至與單克隆抗體269所結合表位相同的表位的抗體。這可包括單克隆抗體269本身、包含抗體269可變區(qū)的抗體或者人源化的單克隆抗體269。類似地，抗-PRL-3抗體可包括能夠結合至與單克隆抗體223或318所結合表位相同的表位的抗體。這可包括單克隆抗體223或318本身、包含抗體223或318可變區(qū)的抗體或者人源化的單克隆抗體223或318。該測定可方便地通過以下方式取得監(jiān)測所述抗體和所述多肽之間形成的復合物的存在情況，或者監(jiān)測所述多肽和所述抗體之間的結合情況。檢測兩個實體之間的結合情況的方法在本領域中是已知的，包括FRET(熒光共振能量轉移)、表面等離子體共振等。標準的實驗室技術例如上述的免疫印跡可用于檢測與相同細胞群中未處理的細胞相比PRL-I和PRL-3蛋白的水平改變?；虮磉_的確定還可通過檢測PRL-I和PRL-3多肽翻譯后加工或PRL-I和PRL-3核酸轉錄后修飾的變化。例如，可測量PRL-I和PRL-3多肽的差異磷酸化、PRL-I和PRL-3多肽的切割情況，或者PRL-I和PRL-3RNA的可變剪接等。可使用專有的蛋白測定或技術例如2D聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測基因產物例如PRL-I和PRL-3多肽的表達水平以及它們的翻譯后修飾水平。可用于確定來自宿主的樣品中的PRL-I和PRL-3蛋白水平的測定技術是本領域技術人員熟知的。通過本領域中已知的任何方法可測定抗體的免疫特異性結合。可使用的免疫測定包括但不限于使用例如以下技術的競爭性和非競爭性測定體系蛋白質印跡、放射免疫測定、ELISA、夾心免疫測定(sandwichimmunoassays)、免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射性測定、熒光免疫測定和蛋白A免疫測定。這些測定在本領域中是常規(guī)的(例如，見Ausubeletal.,eds,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,Johnffiley&Sons,Inc.，NewYork，該文獻通過引用的方式全文納入本文)。對標本測定多肽/蛋白可通過免疫組織化學染色和免疫細胞化學染色(通常見StitesandTerr，BasicandClinicalImmunology,AppletonandLange，1994)、ELISA、RIA、免疫印跡、蛋白質印跡法、免疫沉淀、功能測定和蛋白截短檢測。其他測定方法包括放射免疫測定、競爭性結合測定、蛋白質印跡分析和ELISA測定。ELISA測定是本領域技術人員熟知的。多克隆抗體和單克隆抗體都可用于所述測定中。如本領域技術人員已知的，只要合適，可以使用其他免疫測定，例如放射免疫測定(RIA)0可用的免疫測定廣泛地記載于專利和科學文獻中。例如，見美國專利3，791，932、3，839，153,3,850，752,3,850，578,3,853，987,3,867，517,3,879，262,3,901，654、3，935，074,3,984，533,3,996，345,4,034，074,4,098，876,4,879，219,5,011，771和5，281，521，以及Sambrooketal，1992。診斷試劑盒本發(fā)明人還提供了用于在個體中檢測癌癥或者在個體中檢測癌癥易感性的診斷試齊U盒。所述診斷試劑盒可包含通過本文中描述的任何方法檢測PRL-I或PRL-3在所述個體中的表達、量或活性的工具。因此，所述診斷試劑盒可包含以下抗體中的一種或多種抗-PRL抗體、能夠結合至與單克隆抗體269、223或318所結合表位相同的表位的抗體、單克隆抗體269、包含抗體269可變區(qū)的抗體或人源化的單克隆抗體269；單克隆抗體223、包含抗體223可變區(qū)的抗體或人源化的單克隆抗體223；單克隆抗體318、包含抗體318可變區(qū)的抗體或人源化的單克隆抗體318。所述診斷試劑盒可包含使用說明書或其他指示物。所述診斷試劑盒還可包含用于治療或預防乳腺癌的工具例如本文中描述的任一組合物，或者本領域中已知用于治療乳腺癌的任何工具。具體而言，所述可包含如所述的抗-PRLl抗體或抗-PRL3抗體(例如通過篩查得到的)。預防和治療方法本發(fā)明人公開了一種治療與過量的PRL-I和PRL-3表達或活性有關的異常病癥例如癌癥的方法。防止癌癥(即預防)的方法也適當地采用相同或相似的方法。通常而言，本發(fā)明人的方法涉及通過調節(jié)(例如下調)細胞中PRL-I和PRL-3的表達、量或活性而操作癌細胞。所述方法可涉及破壞或消除癌細胞。所述癌細胞可包括表達PRL-I和/或PRL-3的癌細胞。所述癌細胞可以是與非癌細胞相比過表達PRL-I和/或PRL-3的細胞。本發(fā)明人的方法可包括將一名患者暴露于抗-PRL抗體，例如抗-PRL-I抗體和/或抗-PRL-3抗體。所述抗-PRL-I抗體可包括人源化的抗-PRL-I抗體；同樣所述抗-PRL-3抗體可包括人源化的抗-PRL-3抗體。所述癌細胞可來自PRL-I和/或PRL-3陽性癌癥患者。因此，本發(fā)明人的方法可包括從PRL-3/-1陽性癌癥患者消除過表達PRL-I和/或PRL-3的癌細胞。因此，本發(fā)明人的方法可包括，使用人源化的RL-3/-1抗體從PRL-3/-1陽性癌癥患者消除過表達PRL-I和/或PRL-3的細胞。在所述操作步驟之前或之后可進行一個步驟，即在細胞中檢測受調節(jié)的PRL-I和PRL-3表達、量或活性。所述檢測步驟可檢測上調的或下調的PRL-I和PRL-3表達、量或活性。如本文別處詳述的，可使用任何調節(jié)或下調PRL-I和PRL-3的方法。具體地，所述方法可包括將所述細胞暴露于能夠特異性地結合至PRL-I或PRL-3的抗-PRL-I抗體或抗-PRL-3抗體?？?PRL抗體及給予它們的方法詳細記載于本文的別處。根據本發(fā)明人的方法，由于所述操作，所述癌細胞變成非癌性的，或者所述侵入或轉移癌細胞變成非侵入的或非轉移的。所述癌癥可具體地包括選自以下的諸如侵入癌或轉移癌等的癌癥結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。由于PRL-I和PRL-3與癌癥的侵襲性和侵入性相關，因此可以在患有癌癥的個體的細胞中、在癌細胞或非癌細胞中檢測PRL-I和PRL-3的水平，并評估所述癌癥的侵襲性。與正常細胞相比高水平的PRL-I和PRL-3的量、表達或活性指示侵襲性癌或侵入性癌，因此需要并可選用更強或更激烈的療法。類似地，低水平可指示一種更低侵襲性或侵入性的療法。本文描述的所述方法可用于任何PRL-I和PRL-3相關疾病的一般性治療。PRL-I和PRL-3相關疾病包括增殖性疾病，特別包括癌癥。例如，PRL-I和PRL-3相關疾病可包括轉移性癌、侵入性癌或侵襲性癌。本文描述的方法和組合物適宜于使得實施治療的個體中的一個可測量的判據與沒有接受所述治療的個體相比得到提高。為此，可指定多種判據，這些判據可反映患者的癌癥的進展或健康。有用的判據可包括腫瘤大小、腫瘤尺寸、腫瘤的最大尺寸、腫瘤數目、腫瘤標記物的存在(例如甲胎蛋白)、轉移的程度或數目等。因此，作為一個實例，所治療的個體可顯示腫瘤大小或數目的減小或減少，這可通過合適的測定或試驗測得。例如，所治療的個體與沒有被治療的個體相比，可顯示在以下方面減小或減少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高具體腫瘤的腫瘤大小和/或腫瘤數目。例如，如果與疾病相關的病癥相對于對照被顯著抑制(即50%或更高)，那么PRL-I和PRL-3相關疾病可被定義為“得到治療”。所述抑制可以是相對于對照至少75%，例如相對于對照90%、95%或100%。所述病癥可包括細胞增殖，或者可包括細胞周期時間、細胞數目、細胞遷移、細胞侵襲力、腫瘤形成、腫瘤轉移、腫瘤擴散等。本發(fā)明人使用術語“治療”是指，還包括預防或緩解癌癥。術語增殖障礙以廣義應用于本文中，包括任何需要控制細胞周期的障礙。具體而言，增殖障礙包括惡性障礙和腫瘤前期障礙。本文描述的方法和組合物涉及治療或診斷諸如以下的腺癌時特別有用小細胞肺癌、腎癌、子宮癌、前列腺癌(prostratecancer)、膀胱癌、卵巢癌、結腸癌和乳腺癌。例如，可治愈的惡性腫瘤包括急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌(bronchogeniccarcinoma)、絨毛膜癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、精原細胞瘤、胚胎癌、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、少突神經膠質瘤、腦脊膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。涉及使用抗-PRL抗體進行治療的抗體方法可與用于治療這樣的障礙的其他方法結合，所述其他方法包括表達抗本文所述PRL-I和PRL-3多核苷酸的反義構建體，并將它們給予腫瘤細胞以抑制基因功能并阻止腫瘤細胞的生長或發(fā)展。反義構建體可用于抑制基因功能，以阻止增殖細胞的生長或發(fā)展。與有義核酸或mRNA互補的反義構建體——即核酸例如RNA構建體——詳細記載于美國專利6，100，090(Moniaetal.)禾口Neckersetal.，1992，CirtRevOncog3(1—2)175—231中，這些文本的教導通過引用的方式具體地納入本文。在一個具體的實例中，可通過完全或部分地降低PRL-I和PRL-3的量、表達或活性(例如通過能夠結合并破壞PRL-I和PRL-3mRNA的siRNA)治療或預防癌癥。RNA干擾(RNAi)是一種由直接引入雙鏈RNA(dsRNA)誘導的轉錄后基因沉默(PTGS)的方法，并且作為在多種生物體中敲除特定基因的表達的有用工具出現。RNAi記載于Fireetal.，Nature391:806_811(1998)。其他PTGS方法是已知的，包括例如導入轉基因或病毒。一般而言，在PTGS中，沉默的基因的轉錄物被合成但不積聚，這是因為它被快速地降解。PTGS方法包括RNAi記載于例如Ambion.com萬維網網站的目錄“/hottopics/”中的在“rnai”文件中。合適的RNAi方法在本文中有描述。一種這樣的方法涉及導入siRNA(小干擾RNA)。現在的模型表明，這些21-23個核苷酸的dsRNA可誘導PTGS。用于設計有效siRNA的方法記載于例如上述的Ambion網站。RNA前體例如短發(fā)夾RNA(shRNA)也可以由全部或部分的所述PRL-I和PRL-3核酸序列編碼。或者，雙鏈(ds)RNA是一種在多種生物中干擾基因表達的有力方式，最近已表明其可應用于哺乳動物(WiannyandZernicka-Goetz,2000,NatCellBiol2:70-75)?？蓪⑴cPRL-I和PRL-3多肽的序列對應的雙鏈RNA導入至候選生物的卵母細胞和細胞或者在這樣的細胞中表達，以干擾PRL-I和PRL-3的活性。調節(jié)PRL-I和PRL-3基因表達的其他方法是本領域技術人員已知的，包括顯性負突變方法。同時，這些方法可與使用抗-PRL抗體的抗體療法結合。因此，另一種方法是使用這樣的本文中PRL-I和PRL-3多肽的無功能變體，即該變體與內源性基因產物競爭，導致功能抑制。PRL-I和PRL-3基因表達還可以通過以下方式調節(jié)引入抑制基因表達或功能活性的肽或小分子。這樣的肽或小分子可與抗-PRL抗體結合給予，用于治療癌癥例如轉移癌。因此，可將通過測定被鑒定為結合至PRL-I和PRL-3多肽或調節(jié)例如下調PRL-I和PRL-3多肽的量、活性或表達的化合物給予腫瘤細胞或增殖細胞，以阻止PRL-I和PRL-3多肽的功能。這種化合物可以這樣的量與一種可藥用的載體同時給藥，即該量可有效下調PRL-I和PRL-3的表達或活性，或者通過激活或下調控制PRL-I和PRL-3的表達、活性或量的第二信號，從而緩解所述異常病癥?；蛘撸虔煼ㄟ€可被應用于控制受試者中相關細胞例如癌細胞的PRL-I和PRL-3的內源性產生。例如，可設計一種編碼PRL-I和PRL-3siRNA或其一部分的多核苷酸，用于在復制缺陷性反轉錄病毒載體中表達，如下文詳述。然后可將所述反轉錄病毒表達構建體分離，并導入至一種轉導有包含編碼抗-PRL-I和PRL-3siRNA的RNA的反轉錄病毒質粒載體的包裝細胞中，使得所述包裝細胞在此時可產生包含所需序列的感染性病毒顆粒?？蓪⑦@些生產細胞給予一名受試者，用于在體內設計細胞，并在體內調節(jié)PRL-I和PRL-3多肽的表達?；虔煼ǖ木C述見HumanMolecularGenetics,TStrachanandAPRead,BIOSScientificPublishersLtd(1996)中第20章GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches(及其中弓|用的參考文獻)。在一些實施方案中，PRL-I和PRL-3的水平在癌細胞中是降低的。而且，在這樣的實施方案中，治療可靶向或者專門針對這樣的癌細胞。PRL-I和PRL-3的表達可僅特異性地在疾病細胞(即那些癌性細胞)中降低，而在其他非疾病細胞中不顯著。在這些方法中，PRL-I和PRL-3的表達在其他細胞(即不是癌細胞的細胞)中不顯著降低。因此，在這樣的實施方案中，PRL-I和PRL-3的水平在處理過程中或之后與非癌細胞中的保持相同或相似。多肽序列應理解本文公開的多肽序列不限于本文中列出的具體序列，而且視情況還包括從任何來源得到的同源序列，例如相關細胞的同系物、來自其他物種的同系物以及它們的變體或衍生物，條件是它們具有抗-PRL抗體的至少一種所述生物活性。本公開內容因此涵蓋了本文列出的氨基酸序列的變體、同系物或衍生物，以及由本文公開的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的變體、同系物或衍生物。這樣的序列統(tǒng)稱為“抗-PRL抗體”序列。生物活性在一些實施方案中，視情況所述序列具有抗-PRL抗體的至少一種生物活性。所述生物活性可包括免疫學活性。所述抗-PRL抗體可具有與抗體269、223或318或者它們的人源化形式相同或相似的免疫學活性。本發(fā)明人以“免疫學活性”指抗-PRL抗體的這樣的能力，即在合適的動物或細胞中與PRL-I或PRL-3抗原結合時誘導特異性免疫反應。所述生物活性可包括抗原結合活性。所述抗-PRL抗體可結合至PRL-I或它的表位。所述抗-PRL抗體可結合至抗體269結合的相同表位。所述抗-PRL抗體可結合至PRL-3或它的表位。所述抗-PRL抗體可結合至抗體223結合的相同表位或抗體318結合的相同表位。所述抗-PRL抗體可以相同、降低或升高的親和力或親合力結合至所述抗原或表位。例如，所述抗-PRL抗體視情況可以與同族抗體(cognateantibody)(例如269、223或318或者它們人源化的對應物)相比以至少10%，例如20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%、90%或更多的親和力或親合力結合至所述抗原或表位。所述活性可包括抑制癌癥活性，這例如通過腫瘤大小或腫瘤數目的減少測量；或者包括抑制轉移活性，例如通過實施例中描述的測定測量。所述減少或抑制可通過以下途徑方便地測定在一個測驗動物中引起腫瘤發(fā)生，將所述抗-PRL抗體給予所述動物并與沒有被治療的相似對照動物比較確定所述抗-PRL抗體的效應。實施例詳細描述了這種測定。所述抗-PRL抗體所具有的腫瘤抑制活性或轉移抑制活性與所述同族抗體的相同，或者較之更低或更高。例如，所述抗-PRL抗體的效果視情況可以為所述同族抗體(例如269、223或318或者它們人源化的對應物)的至少10%，例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。本發(fā)明人以此表示，如果所述同族抗體能夠將腫瘤數目減少90%(見實施例)(與未治療的動物相比)，那么所述抗-PRL抗體能夠將腫瘤數目減少90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%等。還可以使用檢測抗體事件的其他測定來替代本文所述測定，或者除此之外，還可使用檢測抗體事件的其他測定。同系物所公開的抗-PRL抗體多肽包括從任何來源得到的同源序列，所述任何來源例如相關的病毒蛋白/細菌蛋白、細胞同系物和合成多肽，以及它們的變體或衍生物。因此，多肽還包括那些編碼來自其他物種的抗-PRL抗體的同系物的多肽，所述其他物種包括諸如哺乳動物(例如小鼠、大鼠或兔)等的動物，特別是人。在本文的上下文中，同源序列或同系物被認為包括這樣的氨基酸序列，即該氨基酸序列與相關多肽序列例如本文中列出的序列在至少30，例如50、70、90或100個氨基酸的氨基酸水平上是至少60、70、80或90%相同的，例如是至少95或98%相同的。在本文的上下文中，同源序列被認為包括這樣的氨基酸序列，即該氨基酸序列與相關多肽的序列在例如至少15、25、35、50或100，例如200、300、400或500個氨基酸的氨基酸水平上是至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90%相同的，例如是至少95或98%相同的。雖然還可以相似性(即具有相似化學性質/功能的氨基酸殘基)考慮同源性，但在本文的上下文中，同源性可以序列同一性表示。例如，序列同一性可針對相關序列的全長即針對相關基因的整個長度的或全長的序列確定。同源性比較可通過肉眼進行，或者更通常借助容易獲得的序列比較程序。這些市售的計算機程序可計算兩個或多個序列之間的同源性百分比?？梢詫B續(xù)序列計算同源性百分比，即將一個序列與另一個序列進行比對，并將一個序列中的每個氨基酸直接與另一個序列的對應氨基酸進行比較，每次比較一個殘基。這稱作“無缺口，，比對。一般，這種無缺口比對只針對相對短數目的殘基(例如少于50個連續(xù)氨基酸)進行。雖然這是非常簡單且可靠的方法，但它沒有考慮到以下問題，例如，在原本相同的一對序列中，一個插入或缺失將使后面的氨基酸殘基被比對出局，從而有可能在整體比對時造成同源性百分比大大降低。因此，大多數序列比較方法被設計來產生這樣的最佳比對，即所述比對考慮到可能的插入和缺失，而不過度處罰整體同源性得分。這一點可通過在序列對比中插入“缺口”使得局部同源性最大化實現。然而，這些更復雜的方法給存在于比對中的每個缺口分配“缺口罰分”，使得對于相同數目的相同氨基酸，具有盡可能少的缺口的序列比對——反映兩個比較序列之間有更高相關性——較具有許多缺口的比對，將獲得更高的分數。通常使用“仿射缺口分值(affinegapcost)”，它對缺口的存在處以相對高的分值，并對該缺口中的每個后續(xù)殘基處以較低的罰分。這是最常用的缺口評分體系。較高的缺口罰分理所當然將產生具有較少缺口的優(yōu)化比對。大多數比對程序允許修改缺口罰分。然而，在利用這種軟件進行序列比較時，可以使用缺省值。例如，在利用GCGWisconsinBestfit軟件包(見下文)時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是一個缺口-12分及每個延伸_4分。對最大同源性百分比的計算因此首先需要在考慮缺口罰分的情況下產生最佳比對。適于實施這種比對的計算機程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(UniversityofWisconsin,U.S.Α.；Devereuxetal.,1984,NucleicAcidsResearch12:387)。能實施序列比較的其他軟件的實例包括但不限于BLAST軟件包(見Ausubeletal.,1999ibid-Chapter18)、FASTA(Atschuletal.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)禾口GENEffORKS的比較工具套件。BLAST和FASTA都能進行脫機和在線搜索(見Ausubeletal.，1999ibid，第7-58至7-60頁)。可使用GCGBestfit程序。雖然最終的同源性百分比可就同一性進行測量，但比對過程本身通常并不是以全或無配對比較為基礎的。實際上，通常使用分級相似性得分矩陣(scaledsimilarityscorematrix)，它基于化學相似性或進化距離給每個成對比較分配得分。這種矩陣的一種常用實例是BL0SUM62矩陣——BLAST程序組的缺省矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公用的缺省值或定制符號比較表(如果有提供)(進一步詳情見用戶手冊)。對于GCG程序包，可使用公用缺省值；而在其他軟件的情況下，可使用缺省矩陣，例如BL0SUM62。一旦該軟件產生了最佳比對，就使得計算同源性百分比例如序列同一性百分比成為可能。該軟件通常將此作為序列比較的一部分，并產生數字化的結果。變體和衍生物術語“變體”或“衍生物”在述及本文所述的氨基酸序列時包括一個(或多個)氨基酸對所述序列的任何置換、變異、修飾、替代，一個(或多個)氨基酸從所述序列的任何缺失或者向所述序列的任何添加。所產生的氨基酸序列可基本保持與未改變序列相同的活性，例如至少具有與顯示于本文例如序列表中的抗-PRL抗體多肽相同的活性。因此，可保持所述序列的關鍵特征——即如別處所述的，結合于PRL多肽的能力或減少腫瘤的活性。具有顯示于實施例中的氨基酸序列的多肽或其片段或同系物可被修飾，用于本文所述的方法和組合物中。一般地，進行修飾而保持所述序列的生物學活性?？蛇M行例如從1、2或3至10、20或30個取代的氨基酸取代，條件是所述修飾的序列保持未改變序列的生物學活性。氨基酸取代可包括非天然類似物的使用，例如是為了提高治療性給予的多肽的血漿半衰期?？?PRL抗體的天然變體可能包含保守的氨基酸置換。保守置換可根據例如下表定義。在第二列同一格中的氨基酸例如在第三列同一行中的氨基酸可以互相置換<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>片段本文公開并用作標記物的多肽還包括上述全長多肽或其變體的片段，包括序列表中所列序列的片段。多肽還包括任何抗-PRL抗體多肽全長序列的片段。片段可包含至少一個表位。鑒定表位的方法是本領域中熟知的。片段一般包含至少6個氨基酸，例如至少10、20、30、50或100，或者更多個氨基酸。所述抗-PRL抗體蛋白及其等位基因變體和物種變體的多肽片段可包含一個或多個(例如5、10、15或20)置換、缺失或插入，包括保守置換。如果發(fā)生置換、缺失和/或插入，那么例如在不同物種中，改變了序列表中顯示的例如至少50%、40%或20%的氨基酸殘基?？赏ㄟ^重組的方式制備抗-PRL抗體及它們的片段、同系物、變體和衍生物。然而，還可以通過使用本領域技術人員熟知技術的合成方式例如固相合成制備它們。所述蛋白還可被產生為融合蛋白，例如是為了幫助提取和純化。融合蛋白配對物的實例包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6XHis、GAL4(DNA結合和/或轉錄激活域)和β-半乳糖苷酶。還可方便地在所述融合蛋白配對物和所需蛋白序列之間包括一個蛋白水解切割位點，以使得融合蛋白序列可被去除。所述融合蛋白可以是這樣的，即它不阻礙所需序列蛋白的功能。蛋白還可以通過純化來自動物細胞的細胞提取物得到。本文公開的抗-PRL抗體多肽、變體、同系物、片段和衍生物可以是基本分離的形式。需理解的是，這樣的多肽可與不干擾所述蛋白的預定目的的載體或稀釋劑混合，并且這樣的多肽仍被認為是基本分離的?？?PRL抗體變體、同系物、片段或衍生物還可以是基本純化的形式，在這種情況下一般將在一個制劑中包含所述蛋白，其中所述制劑中的所述蛋白超過90%例如95%、98%或99%。本公開的抗-PRL抗體多肽、變體、同系物、片段和衍生物可以一種顯示標記物標記。所述顯示標記物可以是可檢測所述多肽等的任何合適的標記物。合適的標記物包括放射性同位素例如1251、抗體、多核苷酸和連接子例如生物素。標記的多肽可用于診斷方法例如免疫測定中，以確定樣品中多肽的量。還可使用標準方案將多肽或標記多肽用于血清或細胞介導的免疫測定中，用于檢測與動物和人中的所述多肽的免疫反應性。本文公開的抗-PRL抗體多肽、變體、同系物、片段和衍生物(任選被標記的)還可被固定于一種固相物，例如免疫測定孔或量桿(dipstick)的表面?？蓪⑦@樣的標記的和/或固定的多肽與合適的試劑、對照物、說明書等包裝于合適容器中的試劑盒中。這樣的多肽和試劑盒可用于通過免疫測定檢測針對所述多肽或它們的等位基因變體或物種變體的抗體的方法中。免疫測定方法是本領域中熟知的，并通常包括(a)提供一種包含可被所述蛋白的抗體結合的表位的多肽；(b)將一個生物樣品與所述多肽在可形成抗體_抗原復合物的條件下與所述多肽孵育；及(c)確定包含所述多肽的抗體-抗原復合物是否形成。本文公開的抗-PRL抗體多肽、變體、同系物、片段和衍生物可用于體外或體內細胞培養(yǎng)體系中，以研究它們對應的基因及其同系物在細胞功能(包括它們在疾病中的功能)中的作用。例如，可將截短的或修飾的多肽導入細胞，以破壞細胞中正常出現的功能?？赏ㄟ^由重組表達載體原位表達所述多肽將所述多肽導入所述細胞(見下文)。所述表達載體任選可攜帶一個可誘導的啟動子，以控制所述多肽的表達。預計使用合適的宿主細胞例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞可提供這樣的翻譯后修飾(例如肉豆蔻?；?、糖基化、截短、脂質化(Iapidation)及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化)，因為這可能是賦予重組表達產物最佳的生物活性所需的。其中表達本文公開的抗-PRL抗體多肽、變體、同系物、片段和衍生物的這樣的細胞培養(yǎng)體系可用于測定體系中，以鑒定干擾或增強所述細胞中的所述多肽的功能的候選物質。多核苷酸序列可變區(qū)、單克隆抗體序列和人源化抗體序列可包括多核苷酸。這些可包括DNA或RNA。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們還可以是其中包含合成核苷酸或修飾核苷酸的多核苷酸。多種不同類型的寡核苷酸修飾在本領域中是已知的。這些可包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架，在該分子的3’端和/或5’端添加吖啶或聚賴氨酸鏈?；诒疚牡哪康?，需要理解可通過本領域中已有的任何方法修飾本文描述的多核苷酸。進行這樣的修飾的目的是增強多核苷酸的體內活性或生命周期。如果所述多核苷酸是雙鏈的，那么所述雙鏈體的兩條鏈、任一條鏈或其結合物可被本文公開的方法和組合物涵蓋。如果所述多核苷酸是單鏈的，需要理解還包括該多核苷酸的互補序列。變體、衍生物和同系物本文使用的術語“變體”、“同系物”或“衍生物”在述及本文描述的核苷酸序列時，包括一個(或多個)核苷酸對所述序列的任何置換、變異、修飾、替代，一個(或多個)核苷酸從所述序列的任何缺失或者像所述序列的任何添加。所產生的序列能夠編碼本文別處描述的具有PRL結合活性的多肽。如上文指出的，就序列同一性而言，“同系物”與一條相關序列具有例如至少5%的同一性、至少10%的同一性、至少15%的同一性、至少20%的同一性、至少25%的同一性、至少30%的同一性、至少35%的同一性、至少40%的同一性、至少45%的同一性、至少50%的同一性、至少55%的同一性、至少60%的同一性、至少65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性或至少95%的同一性?？捎兄辽?5%的同一性，例如至少96%的同一性，例如至少97%的同一性，例如至少98%的同一性，例如至少99%的同一性?？扇缟鲜鲞M行核苷酸同源性比較。諸如上文所述的GCGWisconsinBestfit程序的序列比較程序可基于這一目的使用。在缺省得分矩陣中，每個相同核苷酸的匹配分值為10，每個錯配的分值為-9。對于每個核苷酸而言，缺省缺口形成罰分為-50，缺省缺口延伸罰分為-3。雜交本發(fā)明人還描述了這樣的核苷酸序列，即所述核苷酸序列能夠選擇性雜交本文給出的任一序列例如269、223和318可變區(qū)、抗體和人源化抗體或者它們的任何變體、片段或衍生物，或者能夠選擇性雜交上述任一序列的互補序列。核苷酸序列的長度可為至少15個核苷酸，例如長度為至少20、30、40或50個核苷酸。本文使用的術語“雜交”不僅包括如聚合酶鏈式反應技術中進行的擴增過程外，還包括“核酸鏈通過堿基配對與互補鏈連接的過程”。能夠與本文給出的核苷酸序列或者與它們的互補序列選擇性雜交的多核苷酸通常與本文給出的相應核苷酸序列在至少20，例如至少25或30，如至少40、60或100或者更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)域上是至少70%，例如至少80%或90%且例如至少95%或98%同源的。術語“可選擇性雜交的”是指用作探針的多核苷酸在靶多核苷酸以顯著高于背景的水平與所述探針雜交的條件下使用。背景雜交的出現是由于存在于例如被篩選的cDNA或基因組DNA文庫中的其他多核苷酸。在該事件中，背景是指由所述探針和所述文庫的非特異性DNA成員之間的互相作用產生的信號水平，該水平與用靶DNA出現的特異性相互作用的強度相比小10倍，例如小100倍。例如，可通過用32P放射性標記探針測量相互作用的強度。雜交條件是基于核酸結合復合物的熔解溫度(Tm)，如BergerandKimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology,Vol152,AcademicPress,SanDiegoCA)中所教導，并且賦予如下文說明的一個確定“嚴格度”。最大嚴格度一般出現在約Tm_5°C(比探針的Tm低5°C)；高嚴格度在Tm下約50C-IO0C；中等嚴格度在Tm下約10°C-20V；并且低嚴格度在Tm下約20°C-25°C。如本領域技術人員應理解的，最大嚴格度雜交可用于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而中等(或低)嚴格度雜交可用于鑒定或檢測相似或相關的多核苷酸序列。本發(fā)明人公開了一種在嚴格條件(例如65°C和0.IXSSC{1XSSC=0.15MNaCl,0.015M檸檬酸三鈉，pH7.0})下可雜交核酸或者它的片段、同系物、變體或衍生物的核苷酸序列。如果多核苷酸是雙鏈的，那么所述雙鏈體的兩條鏈、任一條鏈或其結合物被本公開涵蓋。如果所述多核苷酸是單鏈的，需要理解該多核苷酸的互補序列也被公開和涵蓋?？梢远喾N方式得到與本文公開的序列非100%同源但落入本公開范圍內的多核苷酸。本文描述的序列的其他變體可通過例如探測從一組個體例如來自不同人群的個體制備的DNA文庫得到。另外，可得到其他的病毒/細菌或細胞同系物特別是出現于哺乳動物細胞(例如大鼠、小鼠、牛和靈長類細胞)中的細胞同系物，并且這樣的同系物及其片段通常能夠選擇性地與本發(fā)明序列表中所示的序列雜交。這樣的序列的得到可通過探測從其他動物物種制備的cDNA文庫或來自其他動物的基因組DNA文庫，或者在中至高嚴格度下以包含所公開序列的全部或一部分的探針探測這樣的文庫。本文描述的多核苷酸可用于產生一種引物，例如PCR引物、另一擴增反應的引物、通過例如使用放射性或非放射性標記物的常規(guī)方式以顯示標記物標記的探針，或者可將所述多核苷酸克隆至載體中。這樣的引物、探針和其他片段的長度為至少15，例如至少20，例如至少25、30或40個核苷酸，并且也被本文中使用的術語多核苷酸所涵蓋。片段的長度可少于500、200、100、50或20個核苷酸。多核苷酸例如DNA多核苷酸和探針可重組地、合成地或者通過本領域技術人員可用的任何方法產生。還可通過標準的技術克隆它們。引物通常通過合成的方式產生，涉及每次一個核苷酸逐步制造所需的核酸序列。使用自動化技術實現這一點的技術在本領域中是容易獲得的。一般使用重組方法例如使用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術產生較長的多核苷酸。這涉及，制備針對需要克隆的序列側翼區(qū)的一對引物(例如約15-30個核苷酸)；將所述引物與從動物細胞或人細胞得到的mRNA或cDNA接觸；在擴增目標區(qū)域的條件下進行聚合酶鏈式反應；分離擴增片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化所述反應混合物)；以及回收所擴增的DNA?？蓪⒁镌O計成包含合適的限制酶識別位點，使得可將所擴增的DNA克隆至合適的克隆載體中。PRL多肽和核酸如前文段落列出的，可類似地定義PRL-I和PRL-3多肽的同系物、變體、衍生物和片段。如果上下文允許，那么提及PRL-I多肽將認為包括提及PRL-I多肽的同系物、變體、衍生物或片段。類似地，提及PRL-3多肽將認為包括提及PRL-3多肽的同系物、變體、衍生物或片段。類似地，如果上下文允許，那么提及PRL-I核酸將認為包括提及PRL-I核酸的同系物、變體、衍生物或片段。類似地，提及PRL-3核酸將認為包括提及PRL-3核酸的同系物、變體、衍生物或片段。抗-PRL抗體的產生可通過本領域普通技術人員熟知的重組DNA方法或合成肽化學方法產生所述抗-PRL抗體。作為示例，可通過本領域中熟知的技術合成所述抗-PRL抗體，作為示例的有“SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach"E.AthertonandR.C.Sheppard,IRLPress,OxfordEngland。類似地，可合成多個片段，然后將它們連接以形成較大的片段。還可以在特定位點對這些合成的肽片段進行氨基酸置換，以在體外和體內測試活性。可在標準的微量化學設備中合成所述抗-PRL抗體，并以HPLC和質譜檢驗純度。肽合成的方法、HPLC純化和質譜是本領域技術人員公知的。所述抗-PRL抗體還可以在體外和體內條件下在這樣的轉化宿主細胞中表達，即在該細胞中納入有本文描述的DNA序列(例如可變區(qū)序列(variablesequence))或其等位基因變體，并且該細胞可用于癌癥相關疾病的預防和/或治療。術語“載體”包括表達載體和轉化載體。術語“表達載體”是指一種能夠在體內或體外表達的構建體。術語“轉化載體”是指一種能夠從一個物種轉移至另一個物種的構建體。可用于表達的載體包括重組病毒載體，尤其是重組反轉錄病毒載體(RRV)例如慢病毒載體、腺病毒載體，包括反轉錄病毒載體的組合。術語“重組反轉錄病毒載體”(RRV)所指的載體具有足夠的反轉錄病毒遺傳信息，以在存在包裝組件的情況下使RNA基因組包裝成能夠感染靶細胞的病毒顆粒。對所述靶細胞的感染包括反轉錄及整合進入所述靶細胞基因組中。RRV可攜帶待通過該載體送遞至所述靶細胞中的非病毒的編碼序列。RRV在終靶細胞中不能獨立復制而產生感染性反轉錄病毒顆粒。RRV通常缺少功能性gagpol和/或erw基因和/或其他復制必需基因?？墒褂玫妮d體包括重組痘病毒載體例如禽痘病毒(FPV)、昆蟲痘病毒、疫苗病毒例如NYVAC、金絲雀痘病毒、MVA或其他非復制病毒載體體系，例如W09530018中所述的那些?？稍O計痘病毒用于重組基因表達及在雙免疫治療方法中用作重組活疫苗。使用減毒活病毒例如作為送遞運載體和/或以載體為基礎的候選疫苗的病毒的基本原理來自它們誘導細胞介導的免疫反應的能力。如上文列出的，所述病毒載體能夠被應用為送遞運載體和以載體為基礎的候選疫苗，這是因為它們的組成性蛋白的免疫原性，所述組成性蛋白可作為佐劑來增強免疫反應，從而使得所需的核苷酸序列(NOI)例如編碼抗-PRL抗體的核苷酸序列有更大免疫原性。痘病毒疫苗接種策略已使用重組技術以將NOI引入痘病毒基因組中。如果NOI整合至病毒DNA中非病毒生命周期必需的位點，那么新產生的重組痘病毒有可能是感染性的，也就是說感染外來細胞，從而表達所整合的Ν0Ι。以該方式制備的重組痘病毒可用作活疫苗，用于預防和/或治療病理性和感染性疾病和/或癌癥。痘病毒載體送遞體系的其他要求包括好的免疫原性和安全性。MVA是一種具有良好的安全記錄的復制受損疫苗株。在大多數細胞類型和正常的人組織中，MVA不復制。有限的MVA復制出現在少量轉化細胞類型例如BHK21細胞中。Carroll等人(1997Vaccine15:387-394)已表明，重組MVA在產生保護性⑶8+T細胞反應方面與傳統(tǒng)的重組疫苗載體同樣好，并且可有效地替代更常使用的可復制性疫苗病毒。源自MVA的疫苗病毒株或者具有使MVA特別適宜用于疫苗中的MVA性質的獨立開發(fā)的毒株同樣適宜用作送遞運載體。所需核苷酸序列和需要其表達的核苷酸序列可被可操作地連接至轉錄單元。本文所述的術語“轉錄單元”是這樣的核酸區(qū)域，即其包含編碼序列及用于實現這些編碼序列獨立于任何其他編碼序列表達的信號。因此，每個轉錄單元通常至少包含一個啟動子、一個任選的增強子和一個多腺苷酸化信號。以本領域的正常含義使用術語“啟動子”，例如RNA聚合酶結合位點。啟動子可包含增強子元件。術語“增強子”包括這樣的DNA序列，即該DNA序列可結合于轉錄起始復合體的其他蛋白組件，并因此有利于它關聯的啟動子所指向轉錄的起始。術語“細胞”包括任何適合的生物。所述細胞可包括哺乳動物細胞，例如人細胞。術語“轉化細胞”是指一種具有修飾的基因結構的細胞。例如，如本文中所述的，在將一種載體例如表達載體導入至一個細胞中時，該細胞具有修飾的基因結構。術語“生物”包括任何適合的生物。所述生物包括哺乳動物，例如人。本文的術語“轉基因生物”是指一種包含修飾的基因結構的生物。例如，在將一種載體例如表達載體導入至一個生物中時，該生物具有修飾的遺傳結構?？贵w表達本發(fā)明人還描述了一種方法，包括以本文描述的一條或多條(aorthe)核苷酸序列轉化一種宿主細胞，所述核苷酸序列例如269、223或318可變區(qū)；抗體序列；或者人源化的抗體序列。本發(fā)明人還提供了一種方法，包括在適合由一條或多條這樣的核苷酸序列編碼的抗-PRL抗體表達的條件下培養(yǎng)一種轉化的宿主細胞——該細胞轉化有所述核苷酸序列。本發(fā)明人還提供了一種方法，包括在適合由一條或多條這樣的核苷酸序列編碼的抗-PRL抗體表達的條件下培養(yǎng)一種轉化的宿主細胞——該細胞轉化有所述核苷酸序列；然后從所述轉化的宿主細胞培養(yǎng)物回收所述抗-PRL抗體。因此，編碼抗-PRL抗體、融合蛋白或其功能性等價物的核苷酸序列可用于產生指導其在合適的宿主細胞中表達的重組DNA分子。作為示例，可在重組的大腸桿菌、酵母或哺乳動物表達體系中產生抗-PRL抗體，并以柱色譜法純化。在某些情況下，使用抗體片段比使用整個抗體有優(yōu)勢。大小較小的片段使得可快速清除，并且可導致腫瘤與非腫瘤比率的改善。Fab、Fv和ScFv抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并從大腸桿菌分泌，因此使得可產生大量這樣的片段。編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列可被可操作地連接至一條能夠在適合的宿主細胞中指導編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列表達的啟動子序列。在插入至所述宿主細胞時，可在適合的條件下培養(yǎng)所述轉化的宿主細胞，直到所述抗-PRL抗體達到足夠的水平，然后可將所述細胞裂解并分離所述抗-PRL抗體?？稍谶m宜由所述細胞培養(yǎng)物表達所述抗-PRL抗體并從此細胞培養(yǎng)物回收所述抗-PRL抗體的的條件下培養(yǎng)以編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列轉化的宿主細胞。依賴于所使用的序列和/或載體，由重組細胞產生的蛋白可以被分泌或者可以被包含在細胞內。如本領域技術人員可理解的，包含的表達載體編碼抗-PRL抗體的核苷酸序列可被設計來具有信號序列，所述信號序列指導編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列分泌通過具體的原核生物或真核生物細胞膜。其他重組構建法可將編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列連接至編碼有助于可溶性蛋白純化的多肽結構域的核苷酸序列(KrollDJetal(1993)DNACellBiol12:441_453，亦見下文對包含融合蛋白的載體的討論)。所述抗-PRL抗體還可表達為一種添加一個或多個另外的多肽域以促進蛋白純化的重組蛋白。這樣的純化促進域包括但不限于金屬螯合肽，例如使得可在固定金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件(PorathJ(1992)ProteinExprPurif3:263_281)、使得可在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A域和在FLAGS延伸/親和純化體系中使用的域(ImmunexCorp,Seattle,WA)。在純化域和所述抗-PRL抗體之間包含可切割連接子序列例如因子XA或腸激酶(Invitrogen，SanDiego,CA)可用于促進純化?？稍O計本文描述的核苷酸序列，以基于多種原因改變一條或者多條編碼抗-PRL抗體的序列，包括但不限于這樣的改變，即修飾所述基因產物的克隆、加工和/或表達。例如，可以使用本領域中熟知的技術例如定點誘變引入突變，以插入新限制性位點、以改變糖基化模式或者以改變密碼子偏好。在另一個實施方案中，可將一條或者多條編碼天然的、修飾的或重組的抗-PRL抗體的核苷酸序列連接至一條異源序列，以編碼一種融合蛋白。作為示例，可產生這樣的融合蛋白，即該融合蛋白包含所述抗-PRL抗體或其酶活性片段或衍生物，其連接有一種親和標簽例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、生物素、His6、ac-myc標簽(見Emrichetal1993BiocemBiophysResCommun197(1):21220)、血凝素(HA)(如Wilsonetal1984Cell37767中所述)或FLAG表位(Fordetall991ProteinExprPurifApr；2(2):95_107)。所述融合的重組蛋白可包含抗原性輔蛋白，例如GST、β-半乳糖苷酶或脂蛋白D(來自流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)，是相對較大的輔蛋白)，它們可增溶(solubilise)并有利于融合蛋白的產生和純化。或者，所述融合蛋白可包含載體蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔戚血藍蛋白(KLH)。在某些實施方案中，所述標記物序列可包含一個6組氨酸肽，這提供在pQE載體(QiagenInc)中并記載于Gentzetal(1989PNAS86:821-824)。這樣的融合蛋白易于在酵母培養(yǎng)物中表達(如Mitchelletal1993Yeast5715-723中所述的)，并可容易地通過親和色譜法純化。還可將融合蛋白設計成包含位于編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列和所述異源蛋白序列之間的切割位點，使得所述抗-PRL抗體可從異源部分切割及純化。在另一個實施方案中，可使用結合的整個融合蛋白進行靶蛋白的測定?；蛘撸瑥奶峁γ庖呦到y(tǒng)的一般性刺激的意義上說，所述輔蛋白可作為一種佐齊U。所述輔蛋白可連接至第一蛋白的氨基端或羧基端。雖然標記基因表達的存在/不存在均可表明抗-PRL抗體的核苷酸序列也存在，但是應確認它的存在和表達。例如，如果將編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列插入至標記基因序列中，那么可通過不存在所述標記基因的功能對包含所述抗-PRL抗體編碼區(qū)的重組細胞進行鑒定。或者，可將標記基因與編碼抗-PRL抗體的核苷酸序列串聯放置，并受控于單個啟動子。標記基因針對誘導或選擇的表達通常還指示所述抗-PRL抗體的表達。定量具體分子表達的其他方法包括放射性標記核苷酸(MelbyPCetal1993JImmunolMethods159:235_44)或生物素標記核苷酸(DuplaaCetal1993AnalBiochem229-36)、對照核酸的共擴增及實驗結果可插入其上的標準曲線。通過以ELISA形式進行測定可加速多個樣品的定量，其中所需的抗-PRL抗體以多個稀釋度呈現，并且光譜光度測量反應或熱測量反應可快速地給出定量值。可以進行或使用的抗-PRL抗體核苷酸序列改變包括不同核苷酸殘基的缺失、插入或置換，結果生成了編碼相同的或功能等價的抗-PRL抗體的核苷酸序列。作為示例，所表達的抗-PRL抗體可具有產生沉默變化并形成功能等價抗-PRL抗體的氨基酸殘基缺失、插入或置換?；跉埢臉O性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性，可謹慎地進行氨基酸置換，條件是所述抗-PRL抗體的結合親和性被保持。例如，負電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；及具有類似親水值且具有不帶電荷極性頭部的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。還可應用藉此可在體內調節(jié)本文所述編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列的基因治療。例如，表達調節(jié)可通過給予這樣的化合物實現，即這些化合物可結合于編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列或者與編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列相關的控制區(qū)或其相應的RNA轉錄物，以改變轉錄或翻譯的速率。作為示例，本文所述的編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列可處于表達調節(jié)元件(通常為啟動子或者啟動子和增強子)的表達控制之下。所述增強子和/或啟動子可優(yōu)先在缺氧、缺血或低葡萄糖環(huán)境下有活性，使得編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列優(yōu)先在具體所需的組織中表達，例如在腫瘤細胞或腫瘤塊的環(huán)境中表達。因此，可減少或消除編碼所述抗-PRL抗體的核苷酸序列對被治療個體的任何顯著生物學效應或有害效應。賦予表達調節(jié)的增強子元件或其他元件可以多拷貝出現。啟動子和/或增強子可有組成性效果，或者它們的活性可以是限制于組織或時間的。限制于組織的合適啟動子/增強子的實例有那些在腫瘤細胞中有高度活性的啟動子/增強子，例如來自MUCl基因、CEA基因或STV抗原基因的啟動子/增強子。限制于時間的啟動子/增強子的實例有那些對缺血和/或缺氧反應的啟動子/增強子，例如缺氧反應元件或agrp78和agrp94基因的啟動子/增強子。甲胎蛋白(AFP)啟動子也是一種腫瘤特異性啟動子。另一個啟動子_增強子組合為人巨細胞病毒(hCMV)主要立即早期(maj0rimmediateearly)(MIE)啟動子/增強子組合。啟動子可以是組織特異的。也就是說，它們可以是能夠在一種組織中驅動編碼抗-PRL抗體的核苷酸序列轉錄，而在其他組織類型中基本保持“沉默”。術語“組織特異的”所指啟動子的活性并不是局限于單一組織類型，而是仍然顯示以下選擇性該啟動子可在一組組織中是有活性的，并且在另一組中是低活性的或沉默的。這樣的啟動子的一個所需特征是，它們在不存在激活的缺氧調節(jié)增強子元件的條件下，乃至在靶組織中也具有相對低的活性。實現這一點的方式是，使用在缺氧情況下抑制所選啟動子活性的“沉默”元件。術語“缺氧”是指這樣的狀態(tài)，即在該狀態(tài)下一個具體的器官或組織接受到不足的氧氣供給。通過操作啟動子區(qū)，可對受具體啟動子控制且一條或多條編碼抗-PRL抗體的核苷酸序列進行表達水平的調節(jié)。例如，啟動子區(qū)中的不同域可具有不同的基因調節(jié)活性。這些不同區(qū)功能的評估一般使用這樣的載體構建體，即這些構建體具有特定區(qū)域缺失的所述啟動子的不同變體(即缺失分析)。例如，該方法可用于鑒定能夠賦予組織特異性的最小區(qū)域或者賦予缺氧敏感性的最小區(qū)域?？墒褂蒙鲜龅脑S多組織特異性啟動子。在大多數情況下，可將這些啟動子分離為適合克隆至選擇載體中的常規(guī)限制消化片段。或者，可使用聚合酶鏈式反應分離啟動子片段?？赏ㄟ^在引物的5'端整合限制位點而促進所擴增片段的克隆。結合治療本文所述的抗-PRL抗體可與用于疾病的治療的其他組合物和步驟結合使用。作為示例，所述抗-PRL抗體還可以與疾病例如癌癥的常規(guī)治療結合使用。例如，可以外科手術、放射或化學療法與一種抗-PRL抗體結合治療腫瘤，或者可在隨后對患者給予一種抗-PRL抗體，以擴大微轉移的休眠并穩(wěn)定任何殘余的原發(fā)腫瘤?？蓪⑺隹?PRL抗體與一種治療有效的制劑同時送遞至相同位置?；蛘?，可將所述抗-PRL抗體與所述治療有效的制劑在不同時刻送遞至不同位置。甚至可將所述抗-PRL抗體和所述治療有效的制劑在相同送遞載體中送遞，用于癌癥的預防和/或治療?？?PRL抗體可與細胞毒性劑結合使用，用于血管發(fā)生和/或癌癥的預防和/或治療。連接至抗-PRL抗體、抗-PRL抗體抗血清、抗-PRL抗體受體激動劑和拮抗劑的細胞毒性劑例如蓖麻毒蛋白可提供一種破壞表達PRL-I或PRL-3的細胞的工具。這些細胞可出現在許多部位，包括但不限于微轉移和原發(fā)腫瘤?？?PRL抗體可在基因治療中與前藥激活酶結合使用。除了在靶組織中選擇性表達之外或者替代在靶組織中選擇性表達，所述抗-PRL抗體(還)可與其他分子結合使用，例如這樣的一種或多種前藥激活酶，即該一種或多種前藥激活酶在所述個體被以所述一種或多種酶所作用的一種或多種前藥治療之前沒有顯著效應或無有害效應。在存在所述前藥激活酶的情況下，以所述合適前藥對個體的有效治療可引起腫瘤生長或存活減少的增加?？蓪⑶八幖せ蠲杆瓦f至腫瘤部位，用于癌癥的治療。在每種情況下，將合適的前藥與所述合適的前藥激活酶結合用于治療患者。將合適的前藥與載體聯合給予。前藥的實例包括磷酸依托泊甙(與堿性磷酸酶，Senteretal1988ProcNatlAcadSci854842-4846)；5_氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶，Mullenetal1994CancerRes541503-1506)；阿霉素-N-對羥基苯氧乙酰胺(與青霉素V酰胺酶，Kerretal1990CancerImmunolImmunother31202-206)；對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(與羧肽酶G2)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與β-內酰胺酶)；SR4233(與Ρ450還原酶)；更昔洛韋(Ganciclovir)(與HSV胸苷激酶，Borrellietal1988ProcNatlAcadSci85:7572-7576)；芥前藥與硝基還原酶(Friedloselal1997JMedChem401270-1275)和環(huán)磷酰胺(與P450，Chenetal1996CancerRes561331-1340)前藥激活酶的實例包括可激活5-氟-脲嘧啶前藥希羅達(capcetabine)和氟鐵龍(furtulon)的胸苷磷酸化酶；來自單純皰疹病毒的可激活更昔洛韋的胸苷激酶；可激活一種前藥例如環(huán)磷酰胺成DNA損傷劑的細胞色素P450；及可激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脫氨酶。可使用一種人來源的酶。其他合適的分子包括那些應用于治療和/或診斷的分子，例如但不限于以下物質的編碼序列細胞因子、趨化因子、激素、抗體、設計的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調節(jié)分子、反義RNA、靶蛋白的反式顯性負突變體、毒素、有條件的毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它們的衍生物(例如與一種相關的報告物組)。當被包括時，這樣的編碼序列一般可以被可操作地連接至例如一個或多個特定細胞類型中的合適的啟動子(它可以是驅動核酶表達的啟動子)，或者一個或多個不同啟動子。所述分子可以是一種從細胞分泌的蛋白?；蛘?，所述分子不被分泌，而在細胞內有活性。在任何一種情況下，所述分子均可被證明為一種旁觀者效應物或一種遠程旁觀者效應物；即在一個細胞中產生所述表達產物會導致具有共同表型的其他相關細胞被殺死，不管鄰近的還是遠距離的(例如轉移的)。在癌癥的治療或預防中使用的合適分子包括這樣的蛋白(或編碼蛋白的核酸)，即它們可破壞靶細胞(例如核糖體毒素)，作為腫瘤抑制劑(例如野生型P53)、抗腫瘤免疫機制的激活劑(例如細胞因子、共刺激分子和免疫球蛋白)、血管發(fā)生的抑制劑；或者它們可提供升高的藥物敏感性(例如前藥激活酶)，通過天然效應細胞間接地刺激靶細胞破壞(例如，刺激免疫系統(tǒng)的強抗原)或將前體物質轉換成可破壞靶細胞的毒性物質(例如前藥激活酶)。編碼的蛋白還可以破壞旁觀者腫瘤細胞(例如與分泌的抗腫瘤抗體-核糖體毒素融合蛋白)，間接地刺激旁觀者腫瘤細胞的破壞(例如刺激免疫系統(tǒng)的細胞因子或引起局部血管阻塞的促凝血蛋白)或者將前體物質轉換成可破壞旁觀者腫瘤細胞的毒性物質(例如一種可將一種前藥活化成分散性藥物的酶)?？蓪⒏蓴_腫瘤持久性細胞基因的表達的反義轉錄物或核酶(例如在伯基特淋巴瘤中抗異常myc的轉錄物，或者在慢性髓細胞樣白血病中抗bcr-abl的轉錄物)送遞，以增強抗-PRL抗體的癌細胞殺傷功能或轉移阻止功能。還考慮到這樣的分子的結合使用?？扇毖跽{節(jié)的治療分子的實例見PCT/GB95/00322(W0-A-9521927)。抗-PRL抗體綴合物以本文所述的抗-PRL抗體靶向表達PRL-I或PRL-3抗原的細胞可有利于開發(fā)調節(jié)表達PRL-I或PRL-3的細胞的活性的藥物。可合成不同的抗-PRL抗體用于多項應用中，所述應用包括但不限于將一種抗-PRL抗體與細胞毒性劑連接用于靶向殺傷可結合抗-PRL抗體的細胞?？墒褂脴藴史椒▽⒈疚乃龅目?PRL抗體與其他分子偶聯?？梢远喾N技術將所述抗-PRL抗體的氨基端和羧基端進行同位素標記和非同位素標記，例如使用常規(guī)技術的放射性標記(酪氨酸殘基_氯胺T.iodogen.乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶聯技術是本領域技術人員熟知的。偶聯技術的選擇是基于氨基酸上可用的功能基團，包括但不限于氨基、巰基(sulfhydral)、羧基、酰胺、酚和咪唑。用于實現這些偶聯的多種制劑包括戊二醛、重氮化聯苯胺、碳二亞胺、對苯醌等?；诙囗棏?，可將所述抗-PRL抗體化學地偶聯至同位素、酶、載體蛋白、細胞毒性劑、熒光分子及其他化合物。使用適合于特異性反應的不同技術可確定偶聯反應的效力。例如，使用高度特異性活性的氯胺T和Na125I可完成以125I對PRL-I多肽或PRL-3多肽進行放射性標記。以偏硫代硫酸鈉(sodiummetabisulfite)終止該反應，并將該混合物在一次性柱上脫鹽。從所述柱洗脫所述標記的抗體，并收集流分。從每個流分取等份樣品，在伽瑪計數儀(gammacounter)中測量放射性。通過這種方式，未反應的Na125I可與所述標記的PRL-I多肽或PRL-3多肽分離。儲存具有最高特異性放射性的肽流分，用于后續(xù)的應用，例如分析與抗-PRL抗體結合的能力。通過如下技術，使用以具有短生命期同位素標記的抗-PRL抗體使得可在體內定量地顯示PRL-I或PRL-3結合部位放射自顯影技術、現代放射顯影技術或其他膜結合技術例如正電子成像術，目的是以抗-PRL抗體結合部位定位腫瘤。該應用可提供重要的診斷和研究工具。在其他實施方案中，可將所述抗-PRL抗體偶聯至閃爍顯像放射性標記物、細胞毒性化合物或放射性同位素、用于將非毒性前藥轉換成細胞毒性藥物的酶、用于為將所形成的綴合物靶向至結腸腫瘤而活化免疫系統(tǒng)的化合物或者細胞刺激性化合物。這樣的綴合物具有一個由抗-PRL抗體組成的“結合部分”和一個由放射性標記物、毒素或酶組成的“功能部分”。另外可單獨使用所述抗體，目的只是阻斷所述PRL-I或PRL-3抗原的活性，尤其是通過物理地干涉它對另一種化合物的結合?？蓪⑺鼍Y合物的結合部分和功能部分(如果也是肽或多肽)通過任何交聯多肽的常規(guī)方式連接在一塊，所述方式例如那些已在0'Sullivanetal(Anal.Biochem1979100,100-108)中大體描述的。例如，一個部分可富含硫醇基團，并且另一個部分與能夠與這些硫醇基團反應的雙功能劑反應，所述雙功能劑例如碘乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)。以例如間馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯得到的酰胺和硫醚鍵在體內一般比二硫鍵更穩(wěn)定?；蛘?，如果所述結合部分包含糖(例如對于抗體或某些抗體片段情況將如此)，那么可使用EP0088695中的連接技術經該糖部分將所述功能部分連接。所述綴合物的功能部分可以是一種用于將非毒性前藥轉換成毒性藥物的酶，例如Bagshawe及其同事的綴合物(Bagshawe(1987)Br.1.Cancer56,531；Bagshaweetal(Br.1.Cancer1988:58,700)；W088/07378)或氰化物釋放體系(W091/11201)。當將所述抗-PRL抗體綴合物用于診斷時，它的功能部分可包含一種用于閃爍顯像研究的放射性原子或者可由這樣的原子組成，例如锝99m(99mTc)或碘-123(123I)，或者一種用于核磁共振(nmr)成像(也被稱為磁共振成像，mri)的自旋標記物，例如碘-123、碘-313、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓錳或鐵。當被用于一種用于選擇性破壞腫瘤的化合物中時，所述抗-PRL抗體可包含一種發(fā)出足夠破壞鄰近細胞的能量的高放射性原子例如碘-131、錸-186、錸-188、釔-90或鉛-212，或者一種細胞毒化合物例如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(長春新堿、長春堿、依托泊苷)、柔紅霉素或其他插入劑。放射性標記物或其他標記物可以已知的方式整合于所述抗-PRL抗體綴合物中。例如，所述肽可以被生物合成，或者可通過使用合適氨基酸前體例如包括氟-19替換氫的化學氨基酸合成法進行合成。標記物例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In可經肽中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可經賴氨酸殘基連接?？捎肐0D0GEN法(Frakeretal(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)-123?！甅onoclonalAntibodiesinImmunoscinigraphy"(Chatal,CRCPressl989)詳細描述了其他方法。可能不需要整個酶都存在于所述綴合物中，但理所當然必須存在催化部分。可使用所謂的“抗體酶(abzyme)”，其中抗-PRL抗體被制成一種參與人們希望催化的反應中的化合物，通常為反應中間體狀態(tài)。然后，所形成的抗體可對所述反應發(fā)揮酶的功能?？赏ㄟ^尺寸排阻色譜法或親和色譜法純化所述綴合物，并測試其雙生物活性。可使用一種采用固定抗原的酶聯免疫吸附測定(ELISA)并在一種活細胞放射免疫測定中測量所述抗原免疫反應性?？墒褂冕槍ζ咸烟擒彰傅拿笢y定，使用吸光度在葡萄糖水解時會變化的底物，例如oNPG(對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，其釋放可在405nm以光譜光度計測量的2-硝基酚。可以通過以下方式測試所述綴合物在體外的穩(wěn)定性先在37°C的血清中孵育，然后進行尺寸排阻FPLC分析。通過在注入所述綴合物后多個時間分析血清，可在小鼠中以相同方式測試在體內的穩(wěn)定性。另外，可以在綴合之前以125I放射性標記所述抗-PRL抗體并以131I放射性標記所述酶，并且可以確定所述綴合物、游離抗-PRL抗體和游離酶在動物例如小鼠中的生物分布?；蛘撸赏ㄟ^重組DNA技術將所述綴合物產生為一種融合化合物，藉此DNA段包含編碼所述綴合物兩部分的各自區(qū)域，這兩個區(qū)域相互毗連或者被編碼不破壞所述綴合物的所需性質的連接子肽的區(qū)域隔開。可預見地，所述化合物的兩個功能部分可全部地或部分地重疊。然后，將該DNA在合適的宿主中以已知的方式表達。診斷試劑盒本發(fā)明人還公開了用于在生物流體和組織中檢測及測量PRL-I或PRL-3以及用于在組織中定位PRL-I或PRL-3的診斷方法和試劑盒。還可將抗-PRL抗體用于診斷方法和試劑盒中，以檢測及定量能夠結合PRL-I或PRL-3的抗體。這些試劑盒使得可檢測PRL-I或PRL-3，PRL-I或PRL-3在某些情況下可指示原位原發(fā)腫瘤的微轉移的擴散。具有這樣的循環(huán)抗-PRL-I抗體或抗-PRL-3抗體的患者更可能形成腫瘤和癌癥，并且更可能在治療后或在緩解期后復發(fā)癌癥。還考慮了用于測量PRL-I或PRL-3的試劑盒。具有高效價和特異性的抗-PRL抗體可用于開發(fā)使用簡單的用于快速、可靠、敏感和特異地測量及定位血漿、尿、組織提取物中及在細胞培養(yǎng)物中的PRL-I或PRL-3的試劑盒。這些測定試劑盒包括但不限于以下技術競爭性及非競爭性測定，放射免疫測定，生物發(fā)光及化學發(fā)光測定，熒光測定，夾心測定，免疫放射測定，斑點印跡，酶聯測定包括ELISA，用于快速監(jiān)測尿或血液的微滴定板、抗體包被的條帶或量桿，以及免疫細胞化學法。對于每個試劑盒，確立測定的范圍、敏感性、精度、可靠性、特異性和再現性。在位移或活性的標準曲線上20%、50%和80%的點處建立測定內差異和測定間差異。在研究中和臨床中通常使用的測定試劑盒的一個實例是放射免疫測定(RIA)試劑盒。在成功進行抗-PRL抗體的放射性碘標記和純化后，將具有最高效價的抗血清以多個稀釋度添加至這樣的試管中，即這些試管包含在合適的緩沖劑體系中相對恒定量的放射性，例如10，OOOcpm0其他試管中包含緩沖劑或免疫前血清，用于確定非特異性結合。在4°C下孵育24小時后，添加蛋白A并將這些試管搖晃，在室溫下孵育90分鐘并在4°C下以大約2000-2500Xg離心，以沉淀抗血清與標記抗-PRL抗體結合的復合物。通過抽吸除去上清并在伽瑪計數儀中對沉淀物的放射性進行計數。將這樣的抗血清稀釋液進一步表征，即在減去非特異性結合后該抗血清稀釋液結合大約10-40%的標記抗-PRL抗體。免疫組織化學試劑盒還可用于在組織和細胞中定位PRL-I或PRL-3。該免疫組織化學試劑盒提供說明書、抗-PRL抗體以及可能的封閉血清和連接至熒光分子例如異硫氰酸熒光素或連接至用于顯示第一抗血清的某一其他試劑的第二抗血清。免疫組織化學技術是本領域技術人員熟知的。該免疫組織化學試劑盒使得可使用光學顯微術和電子顯微術定位組織切片和培養(yǎng)細胞中的PRL-I或PRL-3。這可基于研究目的和臨床目的使用。例如，對腫瘤進行活檢，或者將其收集并以切片機切成組織切片，以檢查產生PRL-I或PRL-3的部位?；谠\斷和可能的治療目的，這些信息可用于癌癥的檢測和治療中。藥物組合物所述抗-PRL抗體可有效地治療癌癥相關疾病。本發(fā)明人公開了一種以有效量的本文所述的抗-PRL抗體治療癌癥相關疾病的方法。使用本領域普通技術人員已知的配制方法，可將所述抗-PRL抗體提供為可藥用的組合物中的分離的和基本上純化的蛋白和蛋白片段。可以藥物組合物的形式給予所述抗-PRL抗體。這樣的藥物組合物可包括治療有效量的抗-PRL抗體和合適的賦形劑、稀釋劑或載體。具體而言，可通過例如注射(經例如靜脈)至患者體內，將所述抗-PRL抗體導入患者的循環(huán)系統(tǒng)中。適宜于非消化道給藥的制劑包括水性的及非水性的無菌注射溶液，所述溶液可包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和使所述制劑與預定受者的血液等滲的溶質；并且所述制劑還包括可包含助懸劑和增稠劑的水性的及非水性的無菌懸浮液。所述制劑可以存在于單劑量或多劑量的包裝體中，例如密封的安瓿和玻璃小瓶中，并且可以被保存于冷凍干燥(凍干的)條件下，僅需要在臨使用前加入無菌的液體載體例如注射用水?？蓮那笆鲱悇e的無菌粉劑、顆粒劑和片劑即興制備注射溶液和懸液?？赏ㄟ^標準途徑給予這些組合物。所述途徑包括但不限于口服、直腸途徑、眼部途徑(包括玻璃體內或前房內)、鼻部途徑、局部途徑(包括含服和舌下途徑)、子宮內途徑、陰道途徑或非消化道途徑(包括皮下途徑、腹膜內途徑、肌內途徑、靜脈內途徑、真皮內途徑、顱內途徑、氣管內途徑和硬腦膜外途徑)、透皮途徑、腹膜內途徑、顱內途徑、腦室內途徑、腦內途徑、陰道內途徑、子宮內途徑或非消化道途徑(例如靜脈內途徑、椎管內途徑、皮下途徑或肌內途徑)。所述抗-PRL抗體制劑可以方便地為以單位劑量形式給出，并可通過常規(guī)的制藥技術制備。這樣的技術包括這樣的步驟，即建立活性成分和一種或多種藥物載體或賦形劑的聯系。通常，所述制劑的制備可通過使活性成分與液體載體和/或固體載體微細粉末建立均一密切的聯系，然后如果需要則將產品定型。另外，可將所述抗-PRL抗體整合至可生物降解的聚合物中，使得可持續(xù)釋放所述化合物，所述聚合物被植入至需要送遞藥物的區(qū)域附近例如腫瘤部位附近，或者所述聚合物被植入使得所述抗-PRL抗體全身性地緩慢釋放。可生物降解的聚合物及其應用詳細記載于例如Bremetal(1.Neurosurg199174:441-446)。還可將滲透性微泵用于控制高濃度的抗-PRL抗體從插管送遞至所需部位，例如直接至轉移生長部位或至供給該腫瘤血液的血管。所述抗-PRL抗體可與這樣的細胞毒性劑連接，即這些細胞毒性劑以被設計成最大送遞的方式注入至所需部位。例如，連接蓖麻毒蛋白的高親和性抗-PRL抗體被從插管送遞至供給靶部位血液的血管或直接至靶位。這樣的制劑還可以通過偶聯于注入插管的滲透泵的受控方式被送遞。優(yōu)選的單位劑量制劑包含被給予成分的每日劑量或單位、每日亞劑量(如本文上文所述)或其一個合適部分。應理解除了所述成分(尤其上文提及的)外，本文所述的制劑還可包含在本領域中常規(guī)的考慮到所關注制劑類型的其他制劑?？梢匀魏魏线m的方式給予所述抗-PRL抗體綴合物，通常在標準的稀釋劑和載體的無菌、無熱源制劑例如等滲鹽水(在靜脈注射時)中以非消化道途徑給予，例如以靜脈內或腹膜內途徑給予。一旦所述抗-PRL抗體綴合物已結合至靶細胞并且(根據需要)被從血流中清除(這通常會花一天左右)，給予前藥(通常以單注入劑量)，或者對腫瘤進行成像。如果需要，因為所述抗-PRL抗體綴合物可能是免疫原性的，所以可加入環(huán)孢菌素或其他免疫抑制藥，以為治療提供更長的時間，但通常情況下不需要這樣做。本文所述的抗-PRL抗體的劑量將依賴于疾病狀態(tài)或者正在治療的病癥和其他臨床因素，例如人或動物的體重和狀況以及給予所述化合物的途徑。依賴于所述抗-PRL抗體在具體動物或人中的半衰期，可以在一日數次至一周一次之間給予所述抗-PRL抗體。需要理解本文所述的方法和組合物可人用和獸用。本文所述的方法考慮單次給藥，以及同時的或經延長時間的多次給藥?？梢猿Ｒ?guī)的方式優(yōu)化給予所述抗-PRL抗體綴合物和前藥的時機，這是因為綴合物的腫瘤/正常組織比值(至少在靜脈內送遞后)在約4-6天后最高，然而在此時結合于腫瘤的綴合物的絕對量(以注入劑量每克的百分數表示)低于前期。因此，給予所述抗-PRL抗體綴合物和前藥之間的最佳間隔將是酶的腫瘤濃度峰值與腫瘤和正常組織之間最大分布比之間的折中值。所述抗-PRL抗體綴合物的劑量可由醫(yī)生根據通常的標準選擇。至少在應用靶向的酶例如葡萄糖苷酶及靜脈內苦杏仁苷作為毒性前藥的方法的情況下，每平方米體表面積1-50次0.1-10.0克的日劑量，優(yōu)選1.0-5.Og/m2可能是合適的。對于口服治療，每日3次0.05-10.Og,優(yōu)選1.0-5.Og的劑量進行1-50天可能是合適的?？梢勒照５臉藴暑愃频剡x擇所述抗-PRL抗體綴合物的劑量，尤其是參考腫瘤的類型、階段和部位，以及患者體重。治療的持續(xù)時間將部分地依賴于任何對所述抗-PRL抗體綴合物的免疫反應的速度和范圍。疾病例如以藥物組合物形式的本文描述的抗-PRL抗體可用于癌癥的治療。對于本文而言，術語“癌癥”可包含以下的任何一種或多種急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、腎上腺皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血癌、骨癌、腦腫瘤、乳腺癌、女性生殖系統(tǒng)的癌癥、男性生殖系統(tǒng)的癌癥、中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤、宮頸癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童肉瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性髓細胞樣白血病(CML)、結腸直腸癌、結腸癌、子宮內膜癌、子宮內膜肉瘤、食道癌、眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、毛細胞性白血病、頭頸癌、肝細胞癌、何杰金病(Hodgkin’sdisease)、喉咽癌、卡波氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、腎癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、惡性纖維組織細胞瘤、惡性胸腺瘤、黑色素瘤、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經系統(tǒng)癌癥、神經母細胞瘤、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細胞腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、呼吸系統(tǒng)癌、視網膜母細胞瘤、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、泌尿系統(tǒng)癌癥、子宮肉瘤、陰道癌、血管系統(tǒng)癌、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’smacroglobulinemia)禾口腎母細胞瘤(Wilms，tumor)。例如以藥物組合物形式的本文描述的抗-PRL抗體可用于癌癥相關障礙的治療。這樣的障礙包括但不限于實體瘤；血液生腫瘤例如白血??；腫瘤轉移；良性腫瘤例如血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和化膿性肉芽腫；類風濕關節(jié)炎；銀屑病；眼部血管發(fā)生疾病例如糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、黃斑變性、角膜移植排斥反應、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生、虹膜紅變；奧斯勒-韋伯綜合征(Osier-WeberSyndrome)；心肌血管發(fā)生；斑塊新生血管形成；毛細血管擴張癥；血友病關節(jié)病變(hemophiliacjoint)；血管纖維瘤；傷口肉芽形成；冠狀動脈側枝；腦部側支動靜脈畸形；缺血性肢血管發(fā)生；新生血管性青光眼；晶狀體后纖維組織增生；糖尿病新生血管形成；螺桿菌相關疾病；骨折；血管發(fā)生；造血作用；排卵；月經；以及胎盤形成。實施例實施例1.細胞系CH0-K1、A2780和CT26CH0-K1細胞、A2780人卵巢癌細胞和CT26小鼠結腸癌細胞購自ATCC(Manassas，VA)。實施例2.穩(wěn)定表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO細胞混合池的生成穩(wěn)定表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO細胞混合池的生成如以前的研究中的描述8。簡而言之，將細胞在補充10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在lmg/mlG418中選擇20-30天。然后將細胞(IO6個細胞/ml)通過FACSVantage,SEmode(BectonDickinson)進行EGFP分揀，并在培養(yǎng)物中再培養(yǎng)以建立穩(wěn)定的細胞混合池。實施例3.穩(wěn)定表達EGFP-PRL-3的AT-3細胞或穩(wěn)定表達EGFP-PRL-I的AT-I細胞的生成為了得到EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1腫瘤，將每只8周齡裸鼠(JacksonLabs,USA)經尾靜脈注入表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的細胞(5XIO5)。在尾靜脈注入3周后將小鼠處死。取出攜帶EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I腫瘤的肺。在熒光顯微鏡(Zeiss，M2BioQuad)下將各個EGFP-PRL腫瘤切開。為了生成源自這些腫瘤的細胞系，在無菌條件下將每個EGFP-PRL腫瘤在PBS中洗滌2次。將腫瘤切成小塊并在37°C和5%CO2下培養(yǎng)于RPMI1640,10%FBS和抗生素(Sigma)中。AT-3腫瘤細胞系源自EGFP-PRL-3腫瘤；而AT-I腫瘤細胞系源自EGFP-PRL-I腫瘤。將細胞進行胰蛋白酶處理并以13的比例分至新的培養(yǎng)皿中。通過間接免疫熒光法確認同質表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的腫瘤細胞系。實施例4.特異性PRL-3mAb克隆223、318和PRL-ImAb克隆269的生成這些抗體的生成如下(亦見參考文獻19)使用來自StemcellTechnologies，Inc.(Vancouver,BritishColumbia,Canada)的ClonaCel1-HY克隆試劑盒生成雜交瘤。步驟依照廠商的說明書。簡而言之，進行以下步驟(a)分別以GST-小鼠全PRL-I或PRL-3融合蛋白免疫BALB/c小鼠；(b)培養(yǎng)BALB/c親代骨髓瘤細胞SP2/0；(c)從免疫的小鼠制備BALB/c小鼠脾細胞；(d)融合脾細胞與SP2/0細胞；及(e)選擇并表征雜交瘤克隆。兩個對照腹水1.來自抗人血型糖蛋白A的雜交瘤6A7M的腹水(獲自ATCC)。2.抗GS28高爾基復合體標記物的腹水。實施例5.實驗性轉移測定參考了參考文獻20。所有動物研究都得到了新加坡分子和細胞生物學研究所審查委員會(ReviewBoardoftheInstituteofMolecularandCellBiology,Singapore)的批準。本發(fā)明人遵照AnimalFacilityCenterofTheAgencyforScience,TechnologyandResearch(A*STAR)，Singapore的方針5’8’19。在第1天通過其尾靜脈以1百萬個癌細胞注射裸鼠。處理小鼠每周2次經尾靜脈給予PRL-mAb。實施例6.蛋白質印跡分析詳細步驟記載于參考文獻19中。實施例7.表達EGFP-PRL-3的癌細胞的共聚焦顯微鏡成像和分析將AT-3、AT-1或親代CHO細胞在蓋玻片上培養(yǎng)并以PBSCM(包含ImMMgCl2和ImMCaCl2的PBS)洗滌一次。然后在室溫下(RT，24°C)將細胞在2.7%低聚甲醛中固定20分鐘。在以PBSCM洗滌2次后，將細胞以PBSCM中的0.12%皂苷透化15分鐘(對于非透性化細胞省略該步驟)，并與PRL-3mAb孵育。將細胞以PBSCM輕輕洗滌3次，并在RT下以與得克薩斯紅(TexasRed)(Sigma)綴合的抗-小鼠IgG抗體孵育4小時。以熒光顯微鏡直接觀察AT-3或AT-I細胞為綠色。為了檢查攝入活的親代CHO細胞中的抗體，首先在4°C下將細胞與小鼠抗-GS28抗體孵育2小時。將細胞以PBSCM輕輕洗滌3次，然后在室溫下(RT，240C)在0.6%低聚甲醛中固定20分鐘。將所述細胞在RT下以與FITC(Sigma)綴合的抗小鼠IgG抗體孵育4小時。將To-pro-3碘化物用于將每個親代CHO細胞的DNA染色成藍色。以ZeissLSM510imageBrowser進行共聚焦成像。實施例8.免疫組織化學法(IHC)本發(fā)明人使用單克隆的小鼠抗-PRL-3抗體(克隆223或318)或小鼠抗_PRL_1抗體(克隆269)(1300的稀釋度)和VECTASTAINABC試劑盒-過氧化物酶兔IgGPK-4001(OrtonSouthgate,Peterborough,England)進行IHC實驗，研究了來自Cybrdi(Frederick,Maryland)的人結腸癌標本和乳腺癌標本中的PRL-3和PRL-I蛋白表達。人低密度和高密度多惡性腫瘤陣列(TS42040704)和(TS43040303)購自BioGenex(SanRam0n，CA)。將福爾馬林固定、石蠟包埋的切片在54°C下烘烤10分鐘，然后在新鮮二甲苯中除蠟5分鐘(2X)。將切片依次用100%、95%、80%和75%乙醇、PBS(每次變化維持2分鐘)再水化，然后于0.OlM檸檬酸鈉(pH6.0)緩沖物中處理，之后由抗原提取2100-RetrieverPickCellLaboratories(Amsterdam,NorthHolland，1098SM，NL)處理15分鐘。將切片在冷卻器中冷卻4個小時。以PBS洗滌切片3次(每次5分鐘)，轉移至0.6%H2O2的PBS中避光20分鐘。將切片以PBS洗滌數次，并在24°C下在PBS-0.2%吐溫20中處理20分鐘。依照廠商的說明書進行封閉步驟和抗體孵育。實施例9.可使侵襲性轉移性肺腫瘤快速形成的動物模型本實施例描述了小鼠中過表達PRL的腫瘤的生成，并提供了用于后續(xù)PRL癌癥治療的動物模型。參照圖1。首先，將裸鼠用作體內“細胞分選器”以選擇具有高轉移活性的細胞。將IXlO6個表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的CHO細胞經尾靜脈注入至裸鼠的循環(huán)系統(tǒng)。在注入后3周在每只裸鼠的肺中形成了數十個轉移瘤或病灶。第二，然后將單個的這種肺轉移EGFP-PRL腫瘤切下并在培養(yǎng)皿中切碎，以建立更富有侵襲性和更同質的表達EGFP-PRL-3的轉移細胞系(被稱作AT-3)或表達EGFP-PRL-I的腫瘤細胞系(被稱作AT-1)。第三，將IXIO6個AT3或ATl細胞經尾靜脈再次注入至裸鼠中。第四，本發(fā)明人將小鼠分為非治療組或治療組，在接種所述腫瘤細胞后第3、6和9天經尾靜脈注射給予不同的抗體。設計這樣的一種動物模型，即其中過表達PRL-3或PRL-I的細胞快速地形成轉移瘤。以這樣的侵襲性轉移瘤作為背景，如果以抗-PRL-mAb的治療有效，那么能夠觀察到對致腫瘤性的任何抑制。本發(fā)明人的動物模型再現了表達PRL的細胞的侵襲性轉移活性，并可用于剖析在侵入或內滲后出現的轉移事件。實施例10.PRL-3mAb或PRL-ImAb在小鼠中可以約90%的效力阻斷EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I轉移性肺腫瘤的形成在注入細胞后第15天，4組對照小鼠(圖2A，a，未處理的；b，PBS-處理的；c&d，兩種無關抗體)在它們的肺中顯示了大量廣泛分布的EGFP-PRL-3轉移瘤(約140-150個部位)。顯著地，接受以來自雜交瘤克隆223(圖2Ae和g)或克隆318(圖2Af和h)的純化IgG或未純化腹水形式的3個劑量PRL-3mAb的其他4組小鼠在其肺中顯示了顯著減少的表達EGFP-PRL-3的腫瘤(約15-20部位)。類似地，PRL-ImAb顯著降低了源自接種表達EGFP_PRL_1的AT-I細胞的轉移瘤形成(圖2B，第9道)。總的來說，以PRL單克隆抗體處理的小鼠(n=40)與對照小鼠(η=40)相比出現轉移性肺腫瘤被抑制約90%。已在心臟中檢測到了PRL-3mRNA(但非蛋白)5。就這一點而言，有必要強調的是，以PRL_3mAb處理的動物沒有表現出明顯的心臟毒性或其他不良副作用。實施例11.PRL-ImAb可特異性地阻斷PRL-I(但非PRL-3)轉移瘤的形成，而PRL-3mAb可特異性地阻斷PRL-3(但非PRL-1)轉移瘤的形成該實施例證明了所述抗體效應是特異性的。參考圖3。本發(fā)明人表明，表達PRL-I和PRL-3的細胞的肺轉移瘤形成不被模擬品PBS處理阻斷(a、e)，但可被兔PRL抗體有效地阻斷(b、f)，這是由于所述兔抗體可與所有3種PRL(PRL-UPRL-2和PRL-3)反應。本發(fā)明人表明，PRL-ImAb可阻斷其中過表達PRL-I(c)但非過表達PRL-3(g)的肺轉移瘤形成。類似地，PRL-3mAb可抑制(減少腫瘤數目)其中過表達PRL_3(h)但非過表達PRL-I(d)的肺轉移瘤形成。實施例12.PRL-3mAb可有效抑制表達內源性PRL-3的A2780細胞但非不表達內源性PRL-3的CT26細胞的轉移瘤形成到目前為止，PRL-mAb治療的顯著有效性依賴于靶向具有高水平EGFP-PRL蛋白表達的細胞。然后，本發(fā)明進行關鍵的實驗，以評估所述抗體是否能夠阻斷天然表達PRL-3蛋白的癌細胞的轉移。理想的用于本實驗中的候選癌細胞系應具有兩個性質1.天然表達的PRL-3蛋白；2.能夠在小鼠中快速地導致轉移瘤形成。本發(fā)明人發(fā)現A2780人卵巢癌細胞系具有這兩個性質，并確認了A2780細胞天然地表達PRL-3蛋白(圖4A，第2道)，這在以前被報道過9。同時，本發(fā)明人鑒定了一個不表達PRL-3蛋白的小鼠結腸癌細胞系CT26(圖4A，第1道)。CT26癌細胞系被選為本實驗的陰性對照，這是因為在接種所述癌細胞后2周它在裸鼠肺中具有強的轉移活性(圖4B)?？深A計地，在接受CT26細胞的小鼠的處理組(圖4B，a)和未處理組(圖4B，b)不會有差異，都顯示體重減輕的病理表觀。與來自未處理小鼠的肺(圖4B，下圖b)相比，CT26細胞的侵襲性肺轉移瘤的快速形成不受PRL-3mAb的抑制(圖4B，下圖a)，這表明PRL-mAb不抑制其中不天然表達PRL-3磷酸酶的肺轉移瘤的形成。相反，在接種表達內源性PRL-3蛋白的A2780人癌細胞后1個月，在處理的和未處理的小鼠之間出現了顯著差異。病理表觀(不健康及極瘦)以及A2780PRL-3陽性細胞形成的多個腫瘤僅出現在未處理的小鼠中(圖4C，右側)，而不出現在處理的小鼠中(圖4C，左側)。所述處理的小鼠在更長的時間里保持健康。這些結果表明，PRL-3mAb能夠阻斷天然表達PRL-3的癌細胞的轉移瘤形成，而對不表達內源性PRL-3的癌細胞沒有效應。實施例13.攝取各自的PRL-抗體的表達PRL-3或PRL-I的細胞需要進一步研究抗-PRL抗體通過什么精確機制抑制腫瘤形成。為了確定腫瘤細胞是否攝取PRLmAb，本發(fā)明人使用間接免疫熒光法在過表達EGFP-PRL-3的非透化AT-3細胞中檢查了PRL-3mAb染色。一些非透化AT-3細胞表現出被PRL_3mAb完全染色(圖5A，圖b&e中白色箭頭指出)。40%的這些細胞被部分地染色為紅色，但>50%的所述細胞完全未被標記(圖5A，b、e)，不同于透化AT-3細胞100%呈現被抗-PRL_3mAb染色為紅色(圖5A、h)。這些數據表明，大的PRLmAb仍能夠部分地或完全地穿透至非透化癌細胞中。使用PRL-ImAb(克隆#269)和過表達EGFP_PRL_1的CHO細胞得到類似的結果(數據未顯示)。為了進一步確認所述抗體能夠進入細胞內，本發(fā)明人選擇高爾基器標記物(GS28)的抗體，并表明GS28mAb可穿透至培養(yǎng)物中的CHO活細胞中(圖5B，a-c)。再者，血清饑餓過夜的多數活細胞(60-70%)顯示通過未知機制攝取小鼠抗-GS28抗體攝取的更高效力(圖5Bd-f中綠色所示)。為了研究所述抗體的攝取是否是普遍的細胞現象，在2個其他細胞系上試驗了3種PRL-無關抗體。這些試驗是小鼠抗-GS28抗體和兔抗-PTEN抗體在非透性化人乳房上皮細胞(MCF-10A)上的試驗；以及小鼠抗-GS28抗體和兔抗-p53抗體在人乳腺癌細胞(MCF-7)上的試驗。同時，本發(fā)明人發(fā)現不管所述抗體來源是兔還是小鼠，都有一部分非透化細胞(約10%)顯示兩種抗體在同一細胞中的有效攝取(圖6A、B)。如果MCF-7細胞是血清饑餓過夜的，那么所述非透化MCF-7細胞能夠高效地攝取GS28抗體和p53抗體(圖6C)。間接免疫熒光雙染色可顯示在正常細胞和癌細胞中的抗體攝取是普遍現象?？贵w可被非透化細胞攝取，并且這一點可以被細胞的血清饑餓加強。這些結果表明，使用單克隆抗體療法也可以靶向細胞內蛋白。實施例14.PRL-3和PRL-I的過表達與多種轉移癌有關為了評價PRL-mAb作為抗PRL-3或PRL-I相關癌癥的潛在藥物的臨床重要性及預后重要性，本發(fā)明人嘗試另外評估已知PRL介導的癌癥的譜，所述癌癥包括結腸癌、乳腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、黑色素瘤和胃癌3_12’19。本發(fā)明人使用PRL_3mAb在人多種癌癥組織陣列上進行免疫組織化學測定，發(fā)現PRL-3蛋白在15%(26/158例)的結腸癌中上調，在16.5%(19/96例)的乳腺癌中上調，并在15%(2/13例)的食道癌中上調。PRL-3的過表達與肺中的鱗狀細胞癌、陰莖癌和宮頸癌緊密相關。選擇的樣品顯示于圖7A中。PRL-I蛋白在6.2%(8/128例)的結腸癌中、在20%(5/20例)的腦癌中及在7.6%(1/13例)的食道癌中過表達(圖7B)。在這些癌癥樣品中，PRL-陽性信號主要位于質膜和細胞質。實施例15.討論(實施例1-實施例14)轉移是癌癥最為可怕的特征。本發(fā)明人和其他人已發(fā)現PRL-3和PRL-I的過量表達與人多種癌癥相關3_12’19。在本研究中，本發(fā)明人進一步證明了PRL-3蛋白在結腸癌、乳腺癌和食道癌中是上調的。PRL-3的過表達與肺中的鱗狀細胞癌、陰莖癌和宮頸癌緊密相關。PRL-I蛋白也在結腸癌、腦癌和食道癌中過表達。通過外源性試劑靶向過表達細胞內PRL的癌細胞以防止癌癥轉移是一項富有挑戰(zhàn)性的工作。單克隆抗體(mAb)構成了一類發(fā)展最為快速的人類療法，并且被證明是用于識別及破壞惡性細胞的制劑。為了阻斷PRL介導的癌癥轉移，本發(fā)明人需要消除表達PRL的癌細胞以阻止它們的進一步擴散。本發(fā)明人嘗試在小鼠中用單克隆抗體治療實現這個富有挑戰(zhàn)性的目標。將培養(yǎng)的PRL-腫瘤細胞經小鼠尾直接導入至每只小鼠中，本發(fā)明人使用這樣的實驗性轉移測定在體內檢查了癌細胞的生長和腫瘤形成。癌癥轉移的過程有4個主要的步驟。第一，癌細胞必須增強遷移能力，以脫離原發(fā)腫瘤并與其分離。第二，癌細胞需要進入血液循環(huán)(內滲)并在其中存活。第三，癌細胞應該從血管中出來(外滲)，以到達新的器官。第四，癌細胞(種子)需要在所述遠端器官(土壤)中存活，以成長為轉移瘤。本發(fā)明人通過將一百萬個EGFP-PRL-癌細胞經尾靜脈直接注入至血管中，在所述內滲步驟開始我們的轉移測定(圖1)。癌癥轉移過程是一漫長而艱難的進程；據估計僅約0.01%的癌細胞(約100個腫瘤來自IXIO6個癌細胞)可成功地到達其最終目的地。在該實驗結束之前，本發(fā)明人在未處理小鼠中觀察到約100-150個轉移性肺腫瘤(圖2A，a-d)，在以PRL特異性mAb處理的小鼠中觀察到約10-15個轉移性肺腫瘤(圖2A，e-h)。本發(fā)明人的研究代表了通過使用抗各自磷酸酶(盡管它們定位于細胞內)的mAb在小鼠中有效阻斷(約90%)實驗性轉移的首批例證。本發(fā)明人另外表明，PRL-mAb對其自己的抗原是特異性的。PRL-ImAb可特異性地阻斷PRL-I但非PRL-3轉移瘤的形成；PRL_3mAb可特異性地阻斷PRL-3但非PRL-I轉移瘤的形成(圖3)。此外，本發(fā)明人證明，PRL_3mAb不阻斷其中不表達內源性PRL-3磷酸酶的CT26小鼠結腸癌細胞的腫瘤形成(圖4A、B)。有意義的是，本發(fā)明人表明，PRL-3mAb可有效地阻斷表達內源性PRL-3蛋白的人卵巢癌細胞系A2780的轉移瘤形成。有效抑制PRL-3陽性的天然人癌細胞的轉移瘤形成是重要的，這是因為這表明PRL-3mAb或其人源化的抗體可為治療與PRL-3過表達相關的人癌癥的候選物。雖然比較PRL-3抗體對A2780人卵巢癌細胞的抑制效應與其對小鼠CT26結腸癌細胞的無抑制效應可表明所述抗體可靶向內源表達PRL-3的癌細胞，但是需要應用僅PRL-3表達水平不同的同基因癌細胞的后續(xù)研究，以令人信服地證明這一點。有多種可能的機制可造成實驗性轉移測定中PRL-3抗體介導的腫瘤形成的抑制。第一，所述抗體有可能進入表達PRL-3的細胞，以靶向細胞內PRL-3并中和其功能。培養(yǎng)物中部分表達PRL-3的癌細胞對抗-PRL-3抗體的攝取及在血清饑餓時的抗體攝取增加似乎可支持這種作用模式。第二，少部分的PRL-3可能被外部化并呈現于所述表達PRL-3的細胞表面?？贵w結合于暴露于表面的PRL-3可觸發(fā)免疫反應例如補體介導的細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDCC)，以破壞癌細胞。第三，細胞內PRL-3可能被水解處理，并且抗原片段可能通過I類主要組織相容性抗原呈現于細胞表面，使得所述癌細胞變成細胞毒性T細胞的靶標。為了了解這些PRL-mAb怎樣抑制由它們各自的細胞內抗原驅動的癌癥轉移的第一種可能性，本發(fā)明人提供了這樣的證據，即表達PRL-3或PRL-I的細胞對它們各自的PRL抗體的攝取可能是一個普遍現象，原因是本發(fā)明人還發(fā)現PRL無關的高爾基標記物GS28的抗體可穿透至培養(yǎng)物的活CHO細胞中，并且所述抗體的攝取可被所述細胞的血清饑餓增強(圖5B)。一個重要的問題是，所述抗體穿透是否特異性地出現在癌細胞中，或者還出現在未轉化的細胞類型中，以及其他類型的抗體是否也能進入細胞。在2個另外的細胞系上試驗了三種PRL無關抗體。這些試驗是小鼠抗-GS28抗體和兔抗-PTEN抗體在非透化人乳房上皮細胞(MCF-10A)上的試驗；以及小鼠抗-GS28抗體和兔抗-p53抗體在人乳腺癌細胞(MCF-7)上的試驗。同時，本發(fā)明人發(fā)現不管所述抗體來源是兔還是小鼠，都有一部分非透化細胞(約10%)顯示兩種抗體在相同細胞中的有效攝取(圖6A、B)。如果MCF-7細胞是血清饑餓過夜的，那么所述非透化MCF-7細胞能夠高效地攝取GS28抗體和p53抗體(約70%，圖6C)。血清饑餓可用于將細胞阻止在Gl期和GO期21?？赡艿那闆r是具體的細胞周期階段可加強細胞攝取抗體的能力。在體內，癌細胞處于缺氧應激和血清饑餓下，這些條件可能增強癌細胞攝取抗體的能力。這些結果表明了一個至今尚未認識的普遍現象，即細胞能夠攝取抗體以中和細胞內抗原。具體而言，本發(fā)明人已證明，在這些動物中PRL-3和PRL-I抗體能夠特異性地靶向它們各自的細胞內蛋白，并且在無可察覺副作用的情況下消除腫瘤形成。雖然在實驗性轉移測定中PRL-3抗體抑制腫瘤形成的具體步驟仍需要后續(xù)研究來確定，但是本發(fā)明人的結果表明，撒播于肺或其他二級組織的單細胞(或由細胞簇組成的微轉移)可能是PRL-3抗體的靶，這一點可由顯著減少的腫瘤團數目反映。由于癌細胞撒播于二級組織中及從微轉移發(fā)展成宏轉移是癌癥擴散中的主要限制步驟，所以以PRL-3抗體靶向這些階段在臨床上可能與防止癌癥轉移關聯。在本文中，本發(fā)明人提供證據證明，PRL-3mAb可正確地靶向有內源性PRL-3表達的腫瘤。最后，本發(fā)明人的數據表明，細胞內蛋白也可以使用單克隆抗體治療進行靶向，以消除轉移瘤形成。本發(fā)明人建議癌癥研究人員可考慮將大量的細胞內癌蛋白作為抗癌癥治療中HlAb可能的靶標來再次進行評價。實施例16.特異性PRL-3和PRL-1小鼠/人嵌合mAb(克隆#318、269)的生成對于PRL-3嵌合mAb，使用RNeasyMiniKit(QIAGEN,cat#74104)從6XIO6個雜交瘤細胞(克隆#318)提取總RNA。在RNA提取過程中使用DNAse。然后使用SuperscriptIIRNaseH(Invitrogen,Cat18064-014)將RNA反轉錄成cDNA。將所產生的總cDNA用作模板使用Ig-PrimeKits(Novagen,cat#69831-3)進行30個循環(huán)的PCR(95°C，54°C，72°C)，以生成“通用可變區(qū)”。以TA克隆試劑盒(Invitrogen，part#45-0640)將PCR片段克隆至PCRII-TOPO-Vector中。將PCR片段以MfeI和XhoI切割，然后插入至人IgGl恒定區(qū)表達載體-pCMV-人IgGl的各自位點中(18)，以將小鼠重鏈可變區(qū)(克隆#318)與人IgGl恒定區(qū)連接起來。對于小鼠輕鏈可變區(qū)進行類似的PCR過程，以包含ApaLI和PstI限制位點，用于PCR小鼠可變輕鏈(克隆#318)。將PCR片段以ApaLI和PstI切割，然后插入至包含克隆#318重鏈可變區(qū)的人IgGl恒定區(qū)表達載體的各自位點中。將該完全構建體短暫地轉染至以超低IgGFBS(Gibco，16250-078)培養(yǎng)的293T細胞中。從所述培養(yǎng)上清液中收獲所述嵌合mAb，并以離心過濾裝置(MillipOre，cat#UFC900596)濃縮最高達40倍。通過間接免疫熒光法(IF)和蛋白質印跡分析試驗嵌合mAb的特異性。類似地，為了生成PRL-I(克隆#269)輕鏈可變區(qū)的PCR片段，從雜交瘤細胞#269提取mRNA，然后將所述mRNA反轉錄成用于回收重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列的cDNA。為了生成PRL-I輕鏈可變區(qū)的PCR片段，進行如上述的類似步驟。實施例17.DLD-1-EGFP-PRL-3腫瘤細胞系的生成DLD-I結腸癌細胞來自ATCCCCL-221(Mannassas，VA)。使用Invitrogen(Carlsbad,CA)的Lipofectamine2000將EGFP-PRL-3表達構建體轉染至DLD-I細胞中。為了得到EGFP-PRL-3腫瘤，將每只8周齡裸鼠(JacksonLabs,USA)在裸鼠臀部注射以形成外植的腫瘤。在癌細胞接種后3周將小鼠處死。取出腫瘤并在熒光顯微鏡(zeiss，M2BioQuad)下檢查。為了生成DLD-1_EGFP-PRL_3腫瘤細胞系，將EGFP-腫瘤在無菌條件下在PBS中洗滌2次；切成小塊并在37°C和5%CO2下培養(yǎng)于RPMI1640,10%FBS和抗生素(Sigma)中。將細胞進行胰蛋白酶處理并以13的比例分至新的培養(yǎng)皿中。通過間接免疫熒光法確認同質表達EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-I的腫瘤細胞系。實施例18.細胞系HCTl16(CCL-247)、DLD-I(CCL-221)、B16F0(CRL-6475)、B16F10(CRL-6322)和A2780HCTl16(CCL-247)為人結腸直腸癌細胞系。DLD-1(CCL-221)為人結腸直腸腺癌細胞系。B16F0(CRL-6475)和B16F10(CRL-6322)為兩個小鼠黑色素瘤細胞系。所有四個細胞系都購自ATCC。A2780為人卵巢癌細胞系，購自ECACC(Cat#93112519UK)。實施例19.實驗動物參照文獻A19。所有動物研究經本發(fā)明人研究所審查委員會批準。本發(fā)明人遵照AnimalFacilityCenterofTheAgencyforScience,TechnologyandResearch(A*STAR),Singapore的方針。使用8周的裸鼠(JacksonLabs,USA)。在第1天通過尾靜脈以1XIO6個癌細胞注入裸鼠的循環(huán)系統(tǒng)中。在第3天將嵌合mAb給予處理小鼠尾靜脈中，或者將PBS給予非處理小鼠尾靜脈中。實施例20.特異性PRL-3小鼠/人嵌合mAb(克隆#318)的生成本發(fā)明人受到這樣的事實鼓勵，即PRL-I和PRL-3的小鼠mAb可特異性地靶向它們各自的細胞內PRL磷酸酶，并抑制實驗動物中的癌癥轉移(參考文獻A16)。在將實驗室工作應用于臨床的嘗試中，本發(fā)明人設計了一種抗PRL-3的小鼠/人嵌合mAb，以降低小鼠mAb在人中可能的抗原性。成功地開發(fā)了所述PRL-3嵌合mAb，其中通過以重組DNA技術進行的對免疫球蛋白基因的轉基因融合(圖8A)，將人IgG分子的恒定區(qū)(參考文獻A18)與小鼠PRL-3mAb克隆#318的可變區(qū)(重鏈和輕鏈)結合。將該表達構建體轉染至表達猴病毒40T抗原的人胚胎腎細胞(293T)細胞中，以產生嵌合的PRL-3mAb，然后從培養(yǎng)基中收獲所述PRL-3mAb并進一步濃縮40倍。實施例21.特異性PRL-I小鼠-人嵌合mAb(克隆#269)的生成本發(fā)明人以類似策略生成小鼠PRL-I的重鏈和輕鏈可變區(qū)，然后分別插入至人IgG表達載體的恒定區(qū)中(參考A18)，以生成嵌合的PRL-lmAb。實施例22.PRL-3和PRL-I嵌合mAb可特異性地靶向它們的抗原通過進行間接免疫熒光(IF)(圖8B)和蛋白質印跡分析(圖8C和圖8D)，確認所述PRL-3和PRL-I嵌合mAb對其抗原的特異性。這些數據表明，PRL-3嵌合mAb僅識別PRL-3蛋白，但不識別PRL-I蛋白和PRL-2蛋白；而PRL-I嵌合mAb僅結合PRL-I蛋白，但不識別PRL-2蛋白和PRL-3蛋白。實施例23.PRL-3嵌合抗體可有效抑制表達內源性PRL-3的A2780細胞和HCT116但不抑制不表達內源性PRL-3的DLD-I細胞的轉移瘤形成進行決定性實驗以評估PRL-3嵌合mAb是否能靶向并阻斷源自天然表達PRL-3蛋白的癌細胞的轉移瘤形成。通過蛋白質印跡分析就PRL-3的表達對數十種癌細胞進行了篩查。理想的用于本實驗中的候選癌細胞系應具有兩個性質1.天然表達的PRL-3蛋白；2.能夠快速地導致轉移瘤形成。本發(fā)明人發(fā)現A2780人卵巢癌細胞系和HCTl16人結腸直腸癌細胞系具有這兩個性質，并確認了A2780細胞和HCT116細胞天然地表達PRL-3蛋白(圖9A，第1、2道)。A2780細胞以前被報道為PRL-3陽性細胞系(參考文獻A4)。值得注意的，在接種HCT116(η=5)或Α2780(η=8)細胞后1個月，在PRL-3嵌合mAb處理的和未處理的小鼠之間出現了顯著差異。病理表觀(不健康及極瘦)僅出現在未處理的小鼠中(圖9B和圖9C，左側)，而不出現在處理的小鼠中(圖9B和圖9C，右側)。所述處理的小鼠在更長的時間里保持健康。這些結果表明，PRL-3嵌合mAb能夠阻斷天然表達PRL-3的癌細胞的轉移瘤形成。相反，本發(fā)明人鑒定了一個不表達PRL-3蛋白的人結腸癌細胞系DLD-I(圖9A，第3道)。DLD-I細胞被作為本實驗的陰性對照?？梢灶A計，在接受DLD-I細胞的小鼠的處理組(圖9D，左側)和未處理組(圖9D，右側)之間不會有差異，在接種DLD-I細胞后3.5個月都顯示健康表觀。明顯地，被設計來過表達EGFP-PRL-3的DLD-I細胞在接種所述細胞后2個月能在小鼠中導致病理表型。多個微轉移瘤出現于攜帶這些表達外源性PRL-3的癌細胞的裸鼠的肺中。EGFP-PRL-3陽性細胞在此時還出現在未處理小鼠的血液涂片中(圖10A，η=5)；表明PRL-3能延長血流中的細胞存活。相反，接受PRL-3嵌合mAb治療的小鼠在延長的時間中顯示了顯著不同的大小和健康表觀。微轉移瘤未出現在攜帶這些表達外源性PRL-3的癌細胞的處理裸鼠的肺中。EGFP-PRL-3陽性細胞很少出現在所述處理小鼠的血液涂片(圖10B，η=5)。這些結果表明，PRL-3嵌合mAb能夠阻斷天然表達內源性PRL-3或者表達外源設計的PRL-3的癌細胞的轉移瘤形成。重要地，所述抗體對不表達內源性PRL-3的癌細胞無效應。實施例24.PRL-3嵌合抗體可有效地抑制表達內源性PRL-3的B16F0細胞但不抑制不表達內源性PRL-3的B16F10細胞的轉移瘤形成本發(fā)明人已證明，所述抗體能阻斷人癌細胞形成的轉移瘤。現在本發(fā)明人使用兩個小鼠黑色素瘤細胞系B16F0和B16F10，以進行另外的mAb處理。兩個細胞系在小鼠中都可快速地形成多個轉移瘤。對于攜帶表達內源性PRL-3蛋白的B16F0癌細胞的未處理小鼠(圖11A)，轉移瘤出現于腎上腺(箭頭指示)、肝、骨和腹部(圖11B，右側)。同時，本發(fā)明人表明，所述嵌合mAb能在處理小鼠的多個組織中有效消除轉移瘤形成(圖11B，左側)。在平行對照實驗中，數十個轉移瘤出現于攜帶不表達內源性PRL-3蛋白的B16F10癌細胞的未處理或處理的小鼠肺中(圖11A)，如可觀察到的，處理小鼠(圖11上圖)和未處理小鼠(下圖)之間的肺轉移瘤數目無顯著差異。到目前為止，從PRL-3嵌合mAb對數個PRL-3陽性及陰性癌細胞系治療得到的結果可表明，該治療有效性與所述轉移瘤形成是否由PRL-3過表達導致是高度相關的。如果癌細胞的轉移性質不是由于PRL-3過表達引起(B16F10細胞)，給予PRL-3嵌合mAb對阻斷腫瘤形成無效應(圖11C)。實施例25.討論(實施例15-24)大多數癌癥患者死于轉移，而非死于其原發(fā)疾病。癌癥轉移是一種多步驟過程。癌癥轉移的第一個重要步驟涉及新生上皮細胞失去細胞_細胞粘附并獲得運動性，這些可驅動癌細胞從腫瘤的原發(fā)位點脫離，并侵入至鄰近組織。第二個步驟需要癌細胞獲得進入宿主血液循環(huán)(內滲)的能力。這兩個最初的步驟可能會花很長時間來醞釀和完成。在這里，本發(fā)明人使用實驗性轉移測定(參考文獻A19)并以這樣的內滲步驟開始我們的實驗，即將1百萬個癌細胞通過小鼠尾靜脈直接注射至血液循環(huán)中(在第1天)，這可模擬剩余的轉移步驟。在第3天本發(fā)明人以PRL-3嵌合mAb處理所述動物，然后每周兩次給予該mAb。綜合以前的(參考文獻A16)和現在的抗體治療的結果，本發(fā)明人的發(fā)現表明1.癌癥轉移過程是一個漫長而艱難的進程；以1百萬個癌細胞(種子)起始；在實驗結束時，本發(fā)明人在未處理小鼠中觀察到約100個轉移性肺腫瘤，在以PRL特異性mAb處理的小鼠中觀察到約10-15個轉移性肺腫瘤(參考文獻A16)，這些數據反映出，估計僅約0.01%的癌細胞可成功地到達其最終目的地。2.同時在該研究中，與未處理小鼠的肺切片相比，本發(fā)明人發(fā)現來自處理小鼠的肺切片中的微腫瘤數量更少(圖10A)；表明所述mAb能起到減少腫瘤數目但非大小的作用。3.治療有效性還與本發(fā)明人什么時間開始引入所述嵌合mAb高度相關。如果處理不足夠早地開始，而是在接種癌細胞后延后1周，那么效果不如早處理(第3天)；這些結果暗示出，當所述PRL-3癌細胞仍在循環(huán)系統(tǒng)中移動和流動時，PRL-3mAb可能起到將之中和并清除的作用。延遲的治療可使癌細胞有機會通過血管(外滲)并達到遠端器官進行撒播；所述HiAb可能有很少的機會阻止PRL-3陽性癌細胞外滲和撒播。這種假設被以下現象支持DLD-l-EGFP-PRL-3細胞更長時間地存在于未處理小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，以及這些細胞在接受mAb處理的小鼠中的明顯減少。4.最重要地，PRL-3嵌合抗體僅能有效地阻斷源自表達內源性PRL-3的癌細胞但不阻斷不表達內源性PRL-3的癌細胞的轉移瘤形成。因此，本發(fā)明人的PRL-3mAb處理對其自己的抗原是非常特異的。值得注意的，所述mAb較好地通過血流、但不通過局部反應發(fā)揮功能，本發(fā)明人通過在裸鼠臀部區(qū)域局部地注入1百萬個PRL-3癌細胞生成外植腫瘤，然后從第3天開始每周2次在類似區(qū)域注入mAb，本發(fā)明人發(fā)現所述mAb無減小局部外植腫瘤大小的效應(數據未顯示)。PRL-3mAb在實驗性轉移測定中抑制PRL-3介導的轉移瘤形成的詳細細胞和分子機制現在是未知的，需要以后的研究來確定。PRL-3嵌合mAb在小鼠中能消除表達PRL-3的癌細胞的轉移瘤，這些結果是令人興奮的，并且提出一個在臨床中針對其他細胞內靶標的概念。本發(fā)明人的研究可能開啟使用抗細胞內癌基因產物的mAb來治療多種癌癥和癌癥轉移的抗體治療的巨大的新機會。由于PRL-l、PRL-2和PRL-3在多種癌中是過表達的，因此本發(fā)明人預計會廣泛需要可能作為對抗多種PRL細胞內磷酸酶相關腫瘤的新型醫(yī)藥先驅的PRL嵌合mAb。本發(fā)明人能夠選擇并治療在最先診斷出原發(fā)癌癥時將在短時間內復發(fā)-再現的一些類型的癌癥患者(例如患胰腺癌的患者)。處理組和未處理組的患者之間的差異能夠揭示所述嵌合mAb在短時間內是否具有效應。實施例26.抗-PRL3抗體318可結合細胞內PRL3多肽及外化或分泌PRL3多肽一個實驗以如下進行1.在IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)A2780、HCT116、B16F0、B16F10細胞，每皿均至80%的匯合；2.PBS洗滌數次；3.將培養(yǎng)基(8ml)變成無FBS過夜；4.*第二天，收獲培養(yǎng)基并3K離心，棄沉淀，14K再次離心并保留上清液(*裂解來自所述皿的細胞，檢測每個細胞系的PRL-3表達，圖12A)；5.使用GAPDH作為細胞裂解物的蛋白上樣對照(圖12B)；6.在顯微鏡下檢測所述培養(yǎng)基，以確證沒有細胞在培養(yǎng)基中；7.濃縮培養(yǎng)基并對培養(yǎng)基中的分泌或外化PRL-3跑SDS凝膠(圖12C)。結果顯示于圖12中。圖12A.蛋白質印跡證明，A2780、HCTl16和B16F0為3個表達內源性PRL-3蛋白的癌細胞系，而B16F10為不表達PRL-3的癌細胞。圖12B.GAPDH被用作蛋白上樣對照物。圖12C.對從4個癌細胞系收獲的4種培養(yǎng)基的蛋白質印跡分析。PRL-3磷酸酶被發(fā)現從B16F0細胞分泌至培養(yǎng)基中，而沒有發(fā)現PRL-3磷酸酶從剩下的3種細胞中分泌出，這表明PRL-3磷酸酶的分泌可能相關于細胞類型特異的現象。這些數據表明，PRL-3在癌癥患者體內可分泌于血流中。磷酸酶分泌在本發(fā)明人的文獻中從沒有被報道。實施例27.抗-PRLl抗體和抗-PRL3抗體的表位作圖對針對所述每種抗-PRL抗體269和318的表位進行如下的作圖。第一，本發(fā)明人排除在所有3種PRL都相同的大多數氨基酸。第二，本發(fā)明人選擇在3種PRL中不同的氨基酸序列。第三，針對這些特異性區(qū)域專門設計28條肽，這些肽之間因它們各自的抗體可結合于其自己的特異性抗原而可以彼此區(qū)分。本發(fā)明人專門設計28個PRL-I、PRL-2和PRL-3特異性多肽斑點，并從GenemedSynthesis,Inc.(www.genemedsyn.com)訂購。所述28個肽斑點如以下表El排列，該表El還顯示將這些斑點對應于圖13A和13B的每條多肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表EL就對抗-PRLl抗體和抗-PRL3抗體的表位結合情況測試的28條肽。該表顯示的圖譜代表每個斑點的排布。顯示了與圖13Α和圖13Β中斑點對應的多肽序列。PVDF斑點印跡膜的步驟封閉膜1)以100%甲醇將膜預濕數秒鐘，直至它完全濕透時從不透明白色變成均勻半透明灰色。2)將所述膜在水中孵育45分鐘，以洗脫甲醇。3)在4°C下于3%BSA中搖晃封閉過夜。免疫染代1)在4°C下與PRL-I抗體(圖13A中#269)或者與PRL-3抗體(圖13B中#318)搖晃孵育過夜。2)以PBS吐溫-20洗滌4次，每次10分鐘。3)在室溫下與11000的抗小鼠HRP抗體搖晃孵育2小時。4)以PBS吐溫-20洗滌4次，每次10分鐘。ECL顯像1)在室溫下與檢測劑孵育5分鐘。2)排空剩余的緩沖物，置于塑料/絲龍的套中。3)在暗室中顯像。結果結果顯示于圖13A和圖13B中。圖13A顯示了對PRL-I(克隆#269)mAb進行表位作譜的蛋白質印跡分析結果。兩個陽性斑點表明PRL-ImAb優(yōu)先結合于兩條多肽(la，TYKNMR5Ib,TLNKFI)。圖13B顯示了對PRL_3(克隆#318)mAb進行表位作譜的蛋白質印跡分析結果。兩個陽性斑點表明PRL-3mAb優(yōu)先結合于兩條多肽(4f，KAKFYN；5d,HTHKTR)。這些結果表明PRL-ImAb(克隆#269)和PRL_3mAb(克隆#318)可結合于由非線性序列形成的表位。參考t獻1.DiamondRH,CressmanDE,LazTM,etal.PRL-1，auniquenuclearproteintyrosinephosphatase，affectscellgrowth.MolCellBiol.1994；143752-62.2.WangJ，KirbyCE，HerbstR.ThetyrosinephosphatasePRL-Ilocalizestotheendoplasmicreticulumandthemitoticspindleandisrequiredfornormalmitosis.JBiolChem.2002；27746659-68.3.RouleauC，RoyA，MartinTS.etal.ProteintyrosinephosphatasePRL-3inmalignantcellsandendothelialcells!expressionandfunction.MolCancerTher.2006；5219-29.4.WangQ，HolmsDIR，PowellSM，LuQL，WaxmanJ.Analysisofstromal-epitheIialinteractionsinprostatecanceridentifiesPTPCAAX2asapotentialoncogene.CancerLetters2001；17563-9.5.GuoK，LiJ，WangHH,etal.2006.PRL-3initiatestumourangiogenesisbyrecruitingendothelialcellsinvitroandinvivo.CancerRes.2006；669625-35.6.SahaS，BardelliA，BuckhaultsP，etal.Aphosphataseassociatedwithmetastasisofcolorectalcancer.Science2001；2941343-6.7.BardelliA，SahaS，SagerJA,etal.PRL-3expressioninmetastaticcancer.ClinCancerRes2003；9:5607_15.8.ZengQ,DongJM,GuoK，etal.PRL-3andPRL-Ipromotecellmigration,invasion,andmetastasis.CancerRes2003；63:2716_22·9.PolatoF，CodegoniA，FruscioR，etal.PRL-3phosphatasesisimplicatedinovariancancergrowth.ClinCancerRes2005；11:6835_9·10.RadkeLGotteMiKerstingCiMattssonBiKieselL,Wulfing,P.ExpressionandprognosticimpactoftheproteintyrosinephosphatasesPRL-I,PRL—2，andPRL-3inbreastcancer.BrJCancer2006；95:347_54·11.ParkerBS,ArganiP，CookBP，etal.Alterationsinvasculargeneexpressionininvasivebreastcarcinoma.CancerRes2004；64:7857_66·12.MiskadUA，SembaSiKatoH，YokozakiH.ExpressionofPRL-3phosphataseinhumangastriccarcinomas:closecorrelationwithinvasionandmetastasis.Pathobiology2004；71176-84.13.WangHH,QuahSYiDongJMiManserEiTangJPiZengQ.PRL-3Down_regulatesPTENExpressionandSignalsthroughPI3KtoPromoteEpithelial-MesenchymalTransition.CancerRes2007；672922-6.14.ImaiKiTakaokaA.Comparingantibodyandsmall-moleculetherapiesforcancer.NatRevCancer2006；6:714_27·15.BakerΜ.Uppingtheanteonantibodies.NatureTech.2005231065-72.16.SiX，ZengQ,NgCH,HongW，PallenCJ.InteractionoffarnesylatedPRL—2，aprotein-tyrosinephosphatase，withthebeta—subunitofgeranylgerany!transferaseII.JBiolChem.2001；27632875-82.17.WangJ，KirbyCE,HerbstR.ThetyrosinephosphatasePRL-Ilocalizestotheendoplasmicreticulumandthemitoticspindleandisrequiredfornormalmitosis.JBiolChem.2002；27746659-68.18.ZengQ,SiX，HorstmannH，XuY，HongW，PallenCJ.Prenylation-dependentassociationofprotein-tyrosinephosphatasesPRL-I,—2，-3withtheplasmamembraneandtheearlyendosome.JBiolChem.2000；27521444-52.19.LiJ，GuoK，KohVWC.etal.GenerationofPRL_3andPRL-Ispecificmonoclonalantibodiesaspotentialdiagnosticmarkersforcancermetastases.ClinCancerRes2005；11:2195_20420.BrittaW,JohannesLP，LauraJV.Breastcancermetastasis:markersandmodels.NatureReviewCancer2005;5:591-602.21.CooperS.Reappraisalofserumstarvation,therestrictionpoint，G0，andGlphasearrestpoints.FASEB2003；17333-40.Al.DarrellC.Bessette&DexinQiu&CatherineJ.PallenPRLPTPsmediatorsandmarkersofcancerprogressionCancerMetastasisRevDOI10.1007/sl0555-008-9121-3A2.RouleauC，RoyA，MartinTS.etal.ProteintyrosinephosphatasePRL-3inmalignantcellsandendothelialcells!expressionandfunction.MolCancerTher.2006；5219-29.A3.SahaS，BardelliA，BuckhaultsP，etal.Aphosphataseassociatedwithmetastasisofcolorectalcancer.Science2001；2941343-6.A4.PolatoFiCodegoniAiFruscioR，etal.PRL-3phosphatasesisimplicatedinovariancancergrowth.ClinCancerRes2005;11:6835-9·A5.RadkeIiGotteMiKerstingCiMattssonBiKieselL，Wulfing，P.ExpressionandprognosticimpactoftheproteintyrosinephosphatasesPRL-I,PRL—2，andPRL-3inbreastcancer.BrJCancer2006；95:347_54·6.Peng,L.，Ning,J.，Meng,L.，&Shou，C.(2004).TheassociationoftheexpressionlevelofproteintyrosinephosphatasePRL-3proteinwithlivermetastasisandprognosisofpatientswithcolorectalcancer.JournalofCancerResearchandClinicalOncology,130,521-526.A7.Miskad,U.A.，Semba，S.，Kato,H.，Matsukawa，Y.，Kodama，Y.，Mizuuchi，Ε·，etal.(2007).HighPRL-3expressioninhumangastriccancerisamarkerofmetastasisandgradesofmalignancies:Aninsituhybridizationstudy.VirchowsArchiv，450，303-310.A8.SagerJA，BenvenutiS，BardelliA.PRL-3,Aphosphataseformetastasis？CancerBiology&Therapy2004；3:952_3·A9.ZengQ，DongJM，GuoK，etal.PRL-3andPRL-Ipromotecellmigration，invasion,andmetastasis.CancerRes2003；63:2716_22·A10.WuXP,ZengH，ZhangXM,etal.Phosphataseofregeneratingliver-3promotesmotilityandmetastasisofmousemelanomacells.AmJofPathol2004；164:2039-54.All.WangHH，QuahSY，DongJM，ManserE，TangJP，ZengQ.PRL-3Down-regulatesPTENExpressionandSignalsthroughPI3KtoPromoteEpitheIial-MesenchymalTransition.CancerRes2007;67:2922-6.A12.GuoK，LiJ，WangHH，etal.PRL-3initiatestumourangiogenesisbyrecruitingendotheIialcellsinvitroandinvivo.CancerRes2006；66199625-35.A13.ImaiK，TakaokaA.Comparingantibodyandsmall-moleculetherapiesforcancer.NatRevCancer2006；6:714_27·A14.BakerΜ.Uppingtheanteonantibodies.NatureTech.2005；231065-72.A15.ZengQ，SiX，HorstmannH，XuY，HongW,PallenCJ.Prenylation-dependentassociationofprotein-tyrosinephosphatasesPRL-I,—2，-3withtheplasmamembraneandtheearlyendosome.JBiolChem.2000；27521444-52.A16.KeGuo*,JieLi*,JingPingTang*，ChengPeowBobbyTan，HaiheWangandQiZenglMonoclonalantibodiestargetintracellularPRLphosphatasestoinhibitcancermetastasesinmice.CB&TinpressA17.LiJ,GuoK，KohVWC.etal.GenerationofPRL_3andPRL-Ispecificmonoclonalantibodiesaspotentialdiagnosticmarkersforcancermetastases.ClinCancerRes2005；11:2195_204A18.BrendonJHiAdrianusCMiAngelinePC,etal.PassiveimmunoprophylaxisandtherapywithhumanizedmonoclonalantibodyspecificforinfluenzaAH5hemagglutinininmice.RespiratoryResearch2006；7126-36.A19.BrittaW,JohannesLP，LauraJV.Breastcancermetastasis:markersandmodels.NatureReviewCancer2005；5:591_602·本文件中提及的每件申請和專利(包括處于申請和審查過程中的每件申請和專利)，上述每件申請和專利中引用或參考的每個文件(“申請引用文件”)，以及在每件申請和專利中以及在任何申請引用文件中引用或提及的任何產品的任何廠商說明書或目錄，均通過引用納入本文。再者，本文中引用的所有文件，本文引用的文件中引用或參考的所有文件，以及本文引用或提及的任何產品的任何廠商說明書或目錄，通過引用納入本文。只要不偏離本發(fā)明的范圍和主旨，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的多種修改和變化對本領域技術人員來說將是顯而易見的。雖然本發(fā)明是結合具體優(yōu)選的實施方案來描述的，但應理解所要求保護的發(fā)明不應被不適當地局限于這些具體的實施方案。事實上，對所述用于實現本發(fā)明的模式的多種這樣的修改意欲被包括在權利要求的范圍內，即所述修改對分子生物學或相關領域的技術人員來說顯而易見的。權利要求一種能夠結合至PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗體，其中所述抗體能夠結合與抗體269、抗體223或抗體318或者它們的變體、同系物、衍生物或片段結合的表位。2.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體能夠結合至與抗體269結合的PRL-I多肽上的表位。3.根據權利要求1或2的抗體，其中所述抗體包括能夠結合至表位TYKNMR和/或TLNKFI的抗-PRLl抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。4.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體能夠結合至與抗體223或抗體318結合的PRL-3多肽上的表位。5.根據權利要求1或4的抗體，其中所述抗體包括能夠結合至表位KAKFYN和/或HTHKTR的抗-PRL3抗體，或者它的變體、同系物、衍生物或片段。6.根據前述權利要求任一項的抗體，其中所述抗體包含單克隆抗體269的可變區(qū)(SEQIDN0:2、SEQIDNO:4)、單克隆抗體223的可變區(qū)(SEQIDNO:6、SEQIDNO8)或單克隆抗體318的可變區(qū)(SEQIDNO10,SEQIDN0:12)。7.一種抗體，包含單克隆抗體269(SEQIDNO:2、SEQIDNO4)的可變區(qū)或它的能夠結合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。8.一種抗體，包含單克隆抗體223(SEQIDNO:6、SEQIDNO8)的可變區(qū)或它的能夠結合PRL-I的變體、同系物、衍生物或片段。9.一種抗體，包含單克隆抗體318(SEQIDNO10、SEQIDNO12)的可變區(qū)或它的能夠結合PRL-3的變體、同系物、衍生物或片段。10.根據前述權利要求任一項的抗體，所述抗體能夠結合至細胞內PRL-I多肽或PRL-3多肽，優(yōu)選能夠通過細胞質膜。11.根據前述權利要求任一項的抗體，其中所述抗體能夠結合并抑制PRL-I或PRL-3的生物學活性，優(yōu)選蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。12.根據前述權利要求任一項的抗體，其中所述抗體能夠防止癌癥轉移，所述癌癥優(yōu)選結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。13.根據權利要求12的抗體，其中所述癌癥為表達PRL-I或PRL-3的癌癥。14.根據前述權利要求任一項的抗體，所述抗體為單克隆抗體或人源化單克隆抗體。15.一種結合物，包含均根據前述權利要求任一項的抗-PRL-I抗體和抗-PRL-3抗體。16.一種藥物組合物，包含根據前述權利要求任一項的抗體或結合物，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。17.—種能夠結合至PRL-I或PRL-3的抗體，優(yōu)選根據權利要求1_14任一項的抗體、根據權利要求15的結合物或根據權利要求16的藥物組合物，用于癌癥或癌癥轉移的治療方法或預防方法中。18.根據權利要求17的抗體、結合物或組合物用于其所指定用途，其中所述方法包括將癌細胞暴露于所述抗體或結合物。19.根據權利要求17或18的抗體、結合物或組合物用于其所指定用途，其中所述方法包括將治療有效量的所述抗體、結合物或組合物給予患有或疑似患有癌癥的個體。20.根據權利要求17、18或19的抗體、結合物或組合物用于其所指定用途，其中所述癌癥為轉移癌，優(yōu)選表達PRL-I或PRL-3的癌癥。21.根據權利要求17-20任一項的抗體或結合物用于其所指定用途，其中所述癌癥包括結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、陰莖癌、子宮癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、卵巢淋巴瘤和皮膚黑色素瘤。22.根據權利要求17-21任一項的抗體或結合物用于其所指定用途，其中治療個體中的轉移瘤數目與未治療個體相比減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。23.根據權利要求1-14任一項的抗體、根據權利要求15的結合物或根據權利要求16的藥物組合物，用于癌癥或癌癥轉移的診斷方法中。24.一種診斷試劑盒，包含根據權利要求1-14任一項的抗體、根據權利要求15的結合物或根據權利要求16的藥物組合物，以及在癌癥或癌癥轉移的診斷中使用的說明書。25.一種多肽，包含選自以下序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10或SEQIDNO:12，或者它們能夠結合PRL的變體、同系物、衍生物或片段。26.一種核酸，包含能夠編碼根據權利要求1-14任一項的分子的序列，優(yōu)選選自以下序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9禾口SEQIDNO11，或者它們能夠編碼具有PRL結合活性的多肽的變體、同系物、衍生物或片段。27.一種包含或轉化有根據權利要求26的核酸序列的細胞，或者這樣的細胞的后代。28.—種產生根據權利要求1-14任一項的抗體的方法，所述方法包括提供根據權利要求27的細胞并從所述細胞表達所述抗體。29.一種在個體中診斷癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括將來自所述個體的生物樣品暴露于根據權利要求1-14任一項的抗體，并檢測所述抗體和PRL-I多肽或PRL-3多肽的結合情況。30.一種在患有或疑似患有癌癥的個體中治療或預防癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括將治療有效量的根據權利要求1-14任一項的抗體、根據權利要求15的結合物或根據權利要求16的藥物組合物給予所述個體。31.一種根據權利要求29或30的方法，所述方法包括權利要求1-14和18-22任一項中列出的特征。32.—種在患有或疑似患有癌癥的個體中治療或預防癌癥例如轉移癌的方法，所述方法包括通過根據權利要求29或31的方法在所述個體中診斷癌癥，并通過根據權利要求30或31的方法治療所述個體。33.一種檢測轉移細胞的方法，所述方法包括將候選細胞暴露于根據權利要求1-14任一項的抗體，并檢測所述細胞的PRL-I多肽或PRL-3多肽表達情況。34.一種產生轉移瘤動物模型的方法，所述方法包括(a)將多個轉移癌細胞例如表達PRL-I或PRL-3的癌細胞給予第一動物；(b)使所述細胞在所述第一動物中發(fā)展成轉移瘤；(c)從所述第一動物提取轉移瘤并從所述轉移瘤獲得細胞系；并(d)將所述細胞系的多個細胞給予第二動物。35.一個可通過根據權利要求34的方法獲得的動物模型。36.根據權利要求34的方法產生的動物模型或者如權利要求35中要求的動物模型作為轉移瘤模型的用途。37.一種包括以下步驟的方法提供根據權利要求1-14任一項的抗體，并使所述抗體結合至PRL-I多肽或PRL-3多肽。38.根據權利要求37的方法，其中使所述抗體結合至表達PRL-I多肽或PRL-3多肽的細胞。39.根據權利要求37或38的方法，其中所述PRL-I包括細胞內PRL-I多肽，或者其中所述PRL-3多肽包括細胞內PRL-3多肽。40.參考附圖1-11及如附圖1-11中顯示的上述抗體、結合物、藥物組合物、診斷試劑盒、核酸、細胞、方法或用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種能夠結合至細胞內PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗體，其中所述抗體能夠結合至與抗體269、抗體223或抗體318結合的表位。這樣的抗-PRL抗體能夠結合至細胞內PRL-1或PRL-3。它們可以適合被用作抗癌癥或癌癥轉移的治療劑，或者在臨床診斷中來鑒定PRL-3或PRL-1陽性的患者。文檔編號A61K39/395GK101820910SQ200880023052公開日2010年9月1日申請日期2008年5月3日優(yōu)先權日2007年5月3日發(fā)明者曾琦申請人:新加坡科技研究局