一種蜈蚣藻多肽液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肽的制備，尤其是一種利用蜈蚣藻制備蜈蚣藻多肽液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我們知道，蜈蚣藻別名:海赤菜、冬家爛、膏菜，為紅藻門蜈蚣藻科蜈蚣藻屬植物，具有清熱解毒和驅(qū)蟲之功效，是中國東南海域常見的大型藻類，其藻體中含有L-杉藻氨酰-L-杉藻氨酸、蜈蚣藻氨酸、?；撬帷偰z、多糖、蛋白質(zhì)及硫酸鹽留化物、磷酸鹽，并含其他微量元素。對蜈蚣藻的研究表明，其成分復(fù)雜，有多種生物活性，具有防治各種心血管病、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗氧化及增強免疫力等作用。近年來，對蜈蚣藻的研究主要集中于多糖類，例如，2006年8月2日公開的CN1810842A中國發(fā)明專利申請說明書中公開的“一種長葉蜈蚣藻多糖提取物、其制備方法及用途”，其公開方法的長葉蜈蚣藻多糖提取物的制備方法是將長葉娛蟻操在pH值5_7，90_100°C條件下熱水浸提，得提取液；提取液采用乙醇醇沉，離心，取沉淀物復(fù)溶于水后再冷凍干燥，得長葉蜈蚣藻多糖提取物。雙如，2011年第4期《食品與機械》公開的“超聲波輔助提取蜈蚣藻多糖的工藝優(yōu)化研究”，在該公開文件中，其采用單因素試驗和L9(33)正交試驗研究溫度、超聲處理時間、提取次數(shù)和超聲波功率對多糖提取率的影響，確定最佳工藝為超聲波提取溫度70°C、超聲處理時間15min、超聲波功率為450W、提取3次；多糖提取率為18.83%，得率為62.75%。
[0003]經(jīng)研究證明，蜈蚣藻含有豐富的蜈蚣藻多肽，它具有降血壓的功效。目前，尚未發(fā)現(xiàn)蜈蚣藻多肽的制備工藝的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種工藝合理、操作簡單、蜈蚣藻多肽提取率及純度高的蜈蚣藻多肽液的制備方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種蜈蚣藻多肽液的制備方法，其特征在于:其經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)原料預(yù)處理:選取新鮮蜈蚣藻為原料，將其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；將蜈蚣藻干粉加入去離子水，其料液比1:10?20，浸泡，使之充分溶脹，再研磨制成蜈蚣藻勻漿；
(2)一次酶解:將步驟(1)中得到的蜈蚣藻勻漿加入蜈蚣藻干粉質(zhì)量1?2%的蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH值3?9，控制溫度35?60°C，酶解2?3h，得一次酶解液；將一次酶解液低溫離心，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解:將步驟(2)中得到的沉淀物按照質(zhì)量體積比1:8?10加入去離子水中，使之重懸，得懸浮液；將得到的懸浮液中加入沉淀物質(zhì)量1?1.5%的蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH值3?9，控制溫度35?60°C，酶解2?3h，得二次酶解液；將二次酶解液低溫離心，得二次酶解清液；
(4)合并:將步驟(2)中得到的一次酶解清液與步驟(3)中得到的二次酶解清液進(jìn)行合并，得酶解清液； (5)滅酶:將步驟(4)中得到的酶解清液在沸水浴中滅酶10?20min，低溫離心，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分離純化:將步驟(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液過s印hadex-GlO凝膠層析柱進(jìn)行凝膠過濾，使用去離子水進(jìn)行洗脫，收集吸收峰，即得純化的蜈蚣藻多肽液。
[0006]所述的步驟(1)中的浸泡是于4°C浸泡過夜。
[0007]所述的步驟(2)、步驟(3)中的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味酶中的一種或者一種以上的組合。
[0008]所述的一次酶解液低溫離心是將一次酶解液采用離心機在4°C條件下，控制轉(zhuǎn)速12000 ?15000g，離心 30 ?45min。
[0009]所述的二次酶解液低溫離心是將二次酶解液采用離心機在4°C條件下，控制轉(zhuǎn)速8000 ?10000g，離心 15 ?30min。
[0010]本發(fā)明是以新鮮蜈蚣藻為原料，經(jīng)過烘干、粉碎、加水浸泡、研磨處理，得到蜈蚣藻勻漿；將蜈蚣藻勻漿加入一定量的蛋白酶，控制酶解條件進(jìn)行兩次酶解，得到酶解液；酶解液經(jīng)滅酶、離心處理后采用凝膠層析柱分離純化，即純化的蜈蚣藻多肽原液。在本發(fā)明的方法中，將蜈蚣藻烘干后進(jìn)行粉粹、研磨，使蜈蚣藻細(xì)胞充分破碎，有利于內(nèi)容物充分釋放出來；利用蛋白酶進(jìn)行兩次酶解，克服一次酶解產(chǎn)物抑制效應(yīng)，使得蜈蚣藻沉淀物中殘留的蛋白質(zhì)被進(jìn)一步得以分解利用，縮短反應(yīng)時間，并大大提高了蜈蚣藻多肽的提取率。通過GB50095-2010中的第一法凱氏定氮法測定蜈蚣藻多肽液中蛋白質(zhì)含量，以評估蜈蚣藻多肽的提取率。經(jīng)測定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白質(zhì)含量為1?2%，提取率為65?85%。采用凝膠層析柱分離純化，能夠去除溶液中的離子成分，使獲得的多肽產(chǎn)物純度高達(dá)90%以上。本發(fā)明的制備方法，其工藝合理，操作簡單，蜈蚣藻多肽提取率及純度高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0011 ] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0012]實施例1
一種蜈蚣藻多肽液的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)原料預(yù)處理:選取新鮮蜈蚣藻為原料，在50°c下將其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；將蜈蚣藻干粉加入去離子水，其料液比1:15，于4°C浸泡過夜，使之充分溶脹，再用研磨機控制轉(zhuǎn)速2000r/min，研磨80min，制成蜈蟻藻勾楽；
(2)一次酶解:定量稱取步驟(1)中得到的蜈蚣藻勻漿加入蜈蚣藻干粉質(zhì)量1.5%的胰蛋白酶，酶活力> 15000ul/g，混合均勻；用lmol/1的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值8，控制溫度37°C，酶解3h，得一次酶解液；將一次酶解液采用離心機在4°C條件下，控制轉(zhuǎn)速15000g，離心40min，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解:將步驟(2)中得到的沉淀物按照質(zhì)量體積比1:8加入去離子水中，使之重懸，得懸浮液；將得到的懸浮液中加入沉淀物質(zhì)量1.2%的堿性蛋白酶，其中該堿性蛋白酶由地衣芽孢桿菌常規(guī)發(fā)酵而得，用lmol/1的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值8，控制溫度50°C，酶解2h，得二次酶解液；將二次酶解液采用離心機在4°C條件下，控制轉(zhuǎn)速8000g，離心30min，得二次酶解清液；
(4)合并:將步驟(2)中得到的一次酶解清液與步驟(3)中得到的二次酶解清液進(jìn)行合并，得酶解清液；
(5)滅酶:將步驟(4)中得到的酶解清液在沸水浴中滅酶15min，采用離心機在4°C條件下，控制轉(zhuǎn)速8000g，離心30min，收集上清液，得蜈蟻藻多肽原液；
(6)分離純化:將步驟(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液過s印hadex-GlO凝膠層析柱進(jìn)行凝膠過濾，使用去離子水進(jìn)行洗脫，收集吸收峰，即得純化的蜈蚣藻多肽液。
[0013]本實施例所提供的蜈蚣藻多肽的制備方法，其工藝合理，操作簡單，其采用兩次酶解法，克服一次酶解產(chǎn)物抑制效應(yīng)，使得蜈蚣藻沉淀物中殘留的蛋白質(zhì)被進(jìn)一步得以分解利用，縮短反應(yīng)時間，大大提高了蜈蚣藻多肽的提取率；采用凝膠層析柱進(jìn)行分離純化，提高了蜈蚣藻多肽的純度高。經(jīng)測定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白質(zhì)含量為1.16%，提取率為71.
[0014]實施例2
一種蜈蚣藻多肽液的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)原料預(yù)處理:選取新鮮蜈蚣藻為原