用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物學(xué)活性的細(xì)胞測試系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物學(xué)活性的細(xì)胞測試系統(tǒng)
[0001] 本發(fā)明涉及用于生成神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞的方法，所述方法包括 步驟為：a)在引發(fā)所述腫瘤細(xì)胞神經(jīng)元分化的條件和時間下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠分化為 神經(jīng)元細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞；和b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度，并且包 含（i)B27補(bǔ)充物和/或（ii)N2補(bǔ)充物的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)a)的經(jīng)引發(fā)神經(jīng)元分化的腫 瘤細(xì)胞至少3天，從而獲得神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過本發(fā) 明的方法可獲得的神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞。此外，本發(fā)明涵蓋用于測定神經(jīng) 毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步驟為：a)將通過本發(fā)明的方法可獲得的神經(jīng)毒素 敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞與神經(jīng)毒素多肽相接觸；b)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物學(xué) 活性的條件下培養(yǎng)步驟a)的神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞3至74小時或72小時； 和c)在根據(jù)步驟b)培養(yǎng)后，測定所述細(xì)胞中神經(jīng)毒素多肽的活性。最后，本發(fā)明提供包含 OptiMEM、FBS、B27補(bǔ)充物、和N2補(bǔ)充物的培養(yǎng)基。
[0002] 肉毒梭菌（Clostridium botulinum)和破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani)生產(chǎn) 強(qiáng)力的神經(jīng)毒素，即分別是肉毒梭菌毒素（BoNT)和破傷風(fēng)毒素（TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒 素（CNT)特異性結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞并且破壞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素都作為無活性的未加工 的約150kDa的單鏈蛋白質(zhì)合成。翻譯后加工涉及二硫橋的形成，和細(xì)菌蛋白酶的有限的 蛋白水解作用（切割）。活性神經(jīng)毒素由兩條鏈組成，約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的 重鏈，兩鏈通過二硫鍵連接。CNT結(jié)構(gòu)上和功能上由3個結(jié)構(gòu)域組成，即，催化輕鏈、涵蓋了 易位結(jié)構(gòu)域（N端一半）和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C端一半）的重鏈；參見，例如，Krieglstein 1990,Eur J Biochem 188, 39 ；Krieglstein 1991,Eur J Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49。肉毒梭菌神經(jīng)毒素是作為分子復(fù)合物合成的，所述復(fù)合物包 含150kDa神經(jīng)毒素蛋白和相關(guān)聯(lián)的無毒蛋白。復(fù)合物大小基于梭菌菌株和范圍從300kDa， 至500kDa以上，和900kDa的不同神經(jīng)毒素血清型而不同。這些復(fù)合物中的無毒蛋白使神 經(jīng)毒素穩(wěn)定，并保護(hù)其免受降解；參見Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26。
[0003] 肉毒梭菌分泌命名為肉毒梭菌神經(jīng)毒素（BoNT)的A至G的7種抗原性不同的 血清型。所有的血清型與由破傷風(fēng)梭菌分泌的相關(guān)破傷風(fēng)神經(jīng)毒素（TeNT)都是Zn 2+-內(nèi) 切蛋白酶，其通過切割SNARE蛋白阻斷突觸的胞外分泌；參見Couesnon，2006, Mi crob i ology，152, 759。CNT導(dǎo)致在肉毒中毒和破傷風(fēng)中所見的弛緩性肌肉麻痹；參見Fischer 2007, PNAS 104,10447。
[0004] 不論其毒性效應(yīng)，肉毒梭菌毒素復(fù)合物已在多種疾病中被用作治療劑。肉毒梭菌 毒素 A血清型于1989年在美國被批準(zhǔn)用于人用途，用于治療斜視、瞼痙攣和其他病癥。它 作為肉毒梭菌毒素 A(BoNT/A)蛋白制備物是可商購的，例如商標(biāo)名BOTOX (Allergan Inc) 或商標(biāo)名DYSP0RT/REL0XIN(IpSen Ltd)。改良的、不含復(fù)合物的肉毒梭菌毒素 A制備物是 可商購的，商標(biāo)名為XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治療應(yīng)用，將制備物直接 注射入待治療的肌肉中。在生理PH下，毒素從蛋白質(zhì)復(fù)合物中釋放并且產(chǎn)生所需的藥理學(xué) 作用。肉毒梭菌毒素的效應(yīng)只是暫時的，這是為何維持治療效果需要重復(fù)施用肉毒梭菌毒 素的原因。
[0005] 梭菌神經(jīng)毒素弱化主動肌肉強(qiáng)度并且是斜視、局限性肌張力障礙（包括頸肌張力 障礙和良性自發(fā)性瞼痙攣）的有效療法。其還表現(xiàn)出緩解偏側(cè)面肌痙攣和局部痙攣，并且 對廣泛的其他適應(yīng)證有效，例如胃腸道病癥、多汗癥和美容皺紋校正；見Jost 2007, Drugs 67, 669。
[0006] 在生產(chǎn)梭菌神經(jīng)毒素的過程中，所述神經(jīng)毒素的定性和定量測定以及生物學(xué)活性 的神經(jīng)毒素多肽的質(zhì)量控制是特別重要的。此外，政府機(jī)構(gòu)僅接受簡單、可靠和經(jīng)驗證的肉 毒梭菌毒素活性測定法。目前，小鼠 LD5tl生物測定法，一種致死性測試，依然是藥物生產(chǎn)商 用于分析其制備物的效能的"金標(biāo)準(zhǔn)";見Arnon等人（2001) ,JAMA 285,1059-1070。然而， 在近些年，已經(jīng)進(jìn)行了相當(dāng)多的努力以尋找備選的方法以減輕對動物測試的需要和與此類 型的基于動物的測定法相關(guān)的全部缺點(diǎn)、成本和倫理學(xué)顧慮。此外，管理機(jī)構(gòu)要求制藥公司 對肉毒梭菌神經(jīng)毒素的效能測試應(yīng)用3 "R"原則："降低（Reduce)，精煉（Refine)，替代 (Replace) ";見 Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006)，34, 305-313。因此，已經(jīng)開發(fā)了基于 細(xì)胞的測試系統(tǒng)以提供使用活動物的方法的合理的備選方法。然而，迄今僅有3個已顯示 對神經(jīng)毒素多肽足夠敏感的細(xì)胞測試系統(tǒng)對于測定神經(jīng)毒素生物學(xué)活性是可用的。這些基 于細(xì)胞的測試系統(tǒng)包括使用從嚙齒類動物胚胎分離的在體外分化的原代神經(jīng)元（Pellett 等人（2011)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392)，神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)的多能干 細(xì)胞（Whitemarsh 等人（2012) ,Toxicol. Sci. 126, 426-35)，和 SiMa 細(xì)胞系的亞克隆（W0 2010/105234A1)。
[0007] 然而，分離原代神經(jīng)元需要?dú)⑺绖游锊⑶沂琴M(fèi)力費(fèi)時的。此外，使用不同原代神經(jīng) 元的測試系統(tǒng)顯示了大的變異性。類似地，生成神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞是困難的 并且費(fèi)時的。此外，此類細(xì)胞的貯藏是非常麻煩的。使用腫瘤細(xì)胞系的測定法通常對BoNT 不夠敏感。并且，所述腫瘤細(xì)胞系需要復(fù)雜的分化方案，這導(dǎo)致使用所述細(xì)胞系的測定法的 大的變異性和/或高失敗率。
[0008] 有鑒于上述，可被政府機(jī)構(gòu)接受并且提供基于動物的測試系統(tǒng)的備選方法的用于 測定神經(jīng)毒素多肽活性的其他測試系統(tǒng)是高度渴求的。
[0009] 因此，本發(fā)明的技術(shù)問題可以看作為提供符合前述需求的工具和方法。此技術(shù)問 題由在權(quán)利要求書和下文中所表征的實施方式解決。
[0010] 在第一個方面，本發(fā)明涉及生成神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞的方法，所述 方法包括步驟為：
[0011] a)在引發(fā)所述腫瘤細(xì)胞神經(jīng)元分化的條件和時間下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠分化為 神經(jīng)元細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞；和
[0012] b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度，并且包含（i)B27補(bǔ)充物和 /或（ii) N2補(bǔ)充物的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)a)的經(jīng)引發(fā)神經(jīng)元分化的腫瘤細(xì)胞至少3天，從而 獲得神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明的方法中，在引發(fā)所述腫瘤細(xì)胞神經(jīng)元分化的條件和時間下，首先在細(xì) 胞培養(yǎng)基中生長能夠分化成神經(jīng)元細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。之后，將如此經(jīng)引發(fā)神經(jīng)元分化的腫 瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的分化培養(yǎng)基中。此外，此分 化培養(yǎng)基至少包含（i)B27補(bǔ)充物和/或（ii)N2補(bǔ)充物。備選地，分化培養(yǎng)基可以包含NS21 補(bǔ)充物，代替B27補(bǔ)充物和/或N2補(bǔ)充物。在所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)進(jìn)行至少3天。從 而獲得神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞。優(yōu)選地，分化培養(yǎng)基包含neurobasal培養(yǎng)基。 [0014] 本發(fā)明的此新型分化方法或方案的結(jié)果是獲得神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì) 胞，其表現(xiàn)出顯著改善的對神經(jīng)毒素多肽的敏感性，如以下實施例中詳細(xì)所示。
[0015] 梭茵神經(jīng)毒素的特征在于其特異性地抑制神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前神經(jīng)末梢分泌。對周 圍神經(jīng)元的選擇性是通過兩個不同受體SV2和GTlb的識別來介導(dǎo)的。神經(jīng)毒素的生理學(xué) 作用基于受體結(jié)合和神經(jīng)毒素的輕鏈易位后的所謂的SNARE復(fù)合物的蛋白質(zhì)的切割。BoNT 生物學(xué)活性的測定是所述神經(jīng)毒素蛋白的表征中重要的方面并且尤其為管理機(jī)構(gòu)所要求 用于含有BoNT的產(chǎn)品的許可。因此，用于BoNT的生物學(xué)活性的測量的可靠的測試是研宄、 開發(fā)和銷售含有BoNT的產(chǎn)品的基礎(chǔ)。此外，出于倫理學(xué)原因，基于細(xì)胞的測試系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)代 替迄今主要的動物測試。為了建立此類基于細(xì)胞的測試系統(tǒng)，對于肉毒梭菌神經(jīng)毒素有足 夠高敏感性的神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞系是必要的。然而，為了獲得此類高敏感性，迄今需要費(fèi)力 的神經(jīng)元細(xì)胞系的分化方法。結(jié)果是僅幾個基于細(xì)胞的測試系統(tǒng)是可用的。為了測定藥 物產(chǎn)品中肉毒梭菌毒素的生物學(xué)活性，神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞系應(yīng)當(dāng)具有以下性質(zhì)：首先，細(xì)胞 應(yīng)當(dāng)是人、神經(jīng)元來源的以與靶，即人類患者盡可能相似。其次，細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)對終產(chǎn)品中 的賦形劑是強(qiáng)健的并且優(yōu)選地，對生產(chǎn)過程的中間步驟中的雜質(zhì)也是強(qiáng)健的（過程控制）。 第三，基于細(xì)胞的測試系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出動態(tài)的測量范圍，其允許準(zhǔn)確測定小管中BoNT (例 如，50U BoNT/A)的生物學(xué)活性?？紤]到技術(shù)因素諸如賦形劑的溶解性，細(xì)胞培養(yǎng)基的體積 等，必須準(zhǔn)確地測量低于IpM的BoNT濃度。根據(jù)本發(fā)明人最大所知，迄今僅有三個基于細(xì) 胞的測試系統(tǒng)是可用的，其顯示對BoNT的足夠高的敏感性。這些包括來自嚙齒類動物的胚 胎的原代神經(jīng)元、神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞和SiMa細(xì)胞系的亞克隆，如本文別處已 經(jīng)提及的。然而，已報道所述細(xì)胞系僅在頻繁與大的變異性相關(guān)聯(lián)的復(fù)雜的并且費(fèi)力的分 化方案后才表現(xiàn)出足夠高的敏感性。相比之下，本發(fā)明提供了用于測量肉毒梭菌神經(jīng)毒素 (BoNT)的生物學(xué)活性的簡單、可靠并且強(qiáng)健的基于細(xì)胞的測試系統(tǒng)，其滿足了上述要求并 且較之本領(lǐng)域中描述的細(xì)胞測試系統(tǒng)進(jìn)一步改善。
[0016] 更具體而言，首先如本領(lǐng)域所述培養(yǎng)SiMa(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤）和P19(鼠胚胎性 癌）腫瘤細(xì)胞，然后在多孔板上接種并引發(fā)神經(jīng)元分化，如本文別處和以下實施例所述。在 隨后的、新的分化步驟中，用包含具有低重量摩爾滲透壓濃度，諸如100至270m0sm/kg的重 量摩爾滲透壓濃度的培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)基。此類具有低重量摩爾滲透壓濃 度的培養(yǎng)基的一個實例是neurobasal培養(yǎng)基。在分化一段時間后（例如，3至7天）（在 這段時間中用新鮮培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基），如果適用，將神經(jīng)毒素多肽添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。此 外，在本發(fā)明的方法中使用GTlb作為對BoNT的敏感性增強(qiáng)劑。例如，在用神經(jīng)毒素多肽使 細(xì)胞中毒時和/或之前，將50 μ M GTlb添加至neurobasal培養(yǎng)基。在用神經(jīng)毒素多肽再 孵育72h后，終止細(xì)胞并分析神經(jīng)毒素多肽的生物學(xué)活性。結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)了所述細(xì)胞對BoNT 的敏感性顯著增加。
[0017] 本發(fā)明人已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，分化培養(yǎng)基的低重量摩爾滲透壓濃度是由本發(fā)明 的方法生產(chǎn)的神經(jīng)毒素敏感的、神經(jīng)元分化的細(xì)胞對BoNT的增加的敏感性的原因，如以下 實施例所證明。此發(fā)現(xiàn)并非微不足道的任務(wù)，如最終以本發(fā)明的方法結(jié)束的實驗歷史所證 明的：開始時，發(fā)明人使用本領(lǐng)域中描述的分化培養(yǎng)基，其包含MEM+N2補(bǔ)充物+B27補(bǔ)充物； 見分化培養(yǎng)基2,實施例中。能夠由此分化培養(yǎng)基實