專利名稱：：利用超聲處理使絲纖蛋白凝膠化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。本方法將絲纖蛋白進(jìn)行處理，所述處理包括超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化。例如在特定條件下，凝膠化發(fā)生在超聲處理的24小時(shí)內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方式還涉及一種控制絲纖蛋白膠凝時(shí)間的方法，所述方法通過將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化。在一個(gè)實(shí)施例中，所述膠凝時(shí)間少于兩個(gè)小時(shí)。另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種在絲纖蛋白中包封藥劑的方法。所述方法包括將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化，并在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實(shí)質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑?；蛘?，可在超聲處理之前，將藥劑加入絲纖蛋白中。所述藥劑可為治療劑(例如藥物)或生物材料(例如細(xì)胞)。例如，在超聲處理之后，將源自人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)成功地結(jié)合到絲纖蛋白水凝膠中，隨后快速凝膠化并保持細(xì)胞功能。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的水凝膠顯示了良好的機(jī)械性能和蛋白水解降解表現(xiàn)。例如，超聲處理4%、8%和12%(w/v)的絲纖蛋白溶液，隨后加入hMSC，在O.5小時(shí)到2小時(shí)內(nèi)發(fā)生凝膠化。所述細(xì)胞在4%的凝膠中生長并增殖超過二十一天。另外，可使用低濃度的ir和低PH來促進(jìn)凝膠化。圖1描述了在各種超聲處理?xiàng)l件下的絲纖蛋白(SF)凝膠化。使用0.5ml水溶液，以20%振幅進(jìn)行超聲處理，并且將超聲處理時(shí)間由5秒變化到30秒。數(shù)值是每組至少N=3個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*各組之間具有顯著性差異(Studentt-檢驗(yàn)，p<0.01)。圖2A-2C描述了在凝膠化過程中，絲P-折疊結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)形成。圖2A顯示在超聲處理120分鐘之后，對超聲處理后的2%(w/v)絲纖蛋白水溶液每8分鐘進(jìn)行波長掃描來進(jìn)行圓二色性(CD)測定。圖2B顯示在217nm處(P-折疊結(jié)構(gòu)的峰值)記錄的橢圓率隨時(shí)間增加的圖。圖2C是絲凝膠化機(jī)理的示意圖。凝膠化過程包含兩個(gè)動(dòng)力學(xué)步驟(a)在短時(shí)間內(nèi)，結(jié)構(gòu)由無規(guī)巻曲變?yōu)榫哂幸恍╂滈g物理交聯(lián)的P-折疊；(b)P-折疊結(jié)構(gòu)延伸，形成大量的鏈間P_折疊交聯(lián)連接，然后在相對長時(shí)間內(nèi)，分子組織成凝膠網(wǎng)狀物。圖3A-3C顯示鹽和pH對絲纖蛋白凝膠化的影響。在超聲處理之前，將K+(圖3A)和Ca2+(圖3B)補(bǔ)充到各種濃度的溶液中至最終濃度20mM至200mM。圖3C顯示在超聲處理之前調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液pH的效果。將所有樣品以20%振幅進(jìn)行超聲處理15秒。數(shù)值為每組至少N=3個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*，^在各組之間存在顯著性差異(Studentt-檢驗(yàn)，p<0.05)。圖4A-4C顯示分析絲纖蛋白水凝膠機(jī)械性能的圖表。上部的兩個(gè)圖表顯示來自未經(jīng)超聲處理的水凝膠公開發(fā)表的結(jié)果，而底部的兩個(gè)圖表顯示根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行超聲處理的水凝膠的表現(xiàn)。左側(cè)兩個(gè)圖表顯示壓縮強(qiáng)度的影響，而右側(cè)兩個(gè)圖表顯示壓縮模量的影響。在各種溫度下操作由絲纖蛋白水溶液制備的水凝膠(兩個(gè)上部的圖表)，在各種超聲處理下操作超聲處理的水凝膠(兩個(gè)底部圖表)。數(shù)值為至少N=3個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5描述了絲纖蛋白水凝膠的酶促降解。通過超聲處理制備4%、8%以及12%(w/v)的水凝膠，并且浸于pH7.4的PBS(對照)或蛋白酶XIV的PBS溶液(5U/ml)中七天。通過在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上將凝膠塊的濕重與原來的濕重進(jìn)行比較來確定剩余量。數(shù)值為至少N=4個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6用圖形描述包封在絲纖蛋白水凝膠中的hMSC的DNA定量結(jié)果。用PicoGreen試驗(yàn)分析每個(gè)凝膠組中的DNA含量，而用每個(gè)凝膠塊的濕重來使結(jié)果歸一化。數(shù)值為至少N=4個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*在各組之間存在顯著性差異(Studentt-檢驗(yàn)，p<0.05)。具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于本文所描述的特定的工藝、方案和試劑等，并且上述這些都可以改變。本文所使用的術(shù)語其目的僅僅在于描述特定的實(shí)施方式，并不意味著對本發(fā)明范圍的限定，而本發(fā)明的范圍僅僅通過權(quán)利要求書進(jìn)行限定。在本文及權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式也包含復(fù)數(shù)的含義，反之亦然，除非文中另行明確指出。除了在操作實(shí)施例中或另外指出的情況以外，本文用以表示組分或反應(yīng)條件的量的所有數(shù)值在一切情況下都應(yīng)理解為由術(shù)語"大約"所限定。出于描述和公開的目的，在此以引用的方式清楚地將本發(fā)明指明的所有專利和其他出版物并入，例如，在此類出版物中描述的、可用于本發(fā)明的方法學(xué)。提供此類出版物僅僅是因?yàn)樗鼈兊墓_早于本申請的申請日。在這點(diǎn)上，不應(yīng)將任何事物視為發(fā)明人無權(quán)根據(jù)在先發(fā)明或因任何其他原因使本發(fā)明的內(nèi)容早于這些公開內(nèi)容的認(rèn)定。所有關(guān)于日期的陳述或關(guān)于此類文件內(nèi)容的表達(dá)均基于申請人可得的信息，不構(gòu)成對此類文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何認(rèn)定。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)際操作或測試中可使用任何已知的方法、裝置和原料，但是在這方面本文仍對所述方法、裝置和原料進(jìn)行了描述。本發(fā)明涉及一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。本方法對絲纖蛋白進(jìn)行處理的方式包括超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化。本方法提供了基于超聲處理的、以暫時(shí)可控的方式加速溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換的方法。根據(jù)使用的超聲處理參數(shù)(能量輸出、持續(xù)時(shí)間等)和生理學(xué)相應(yīng)條件下的絲纖蛋白濃度，可以將膠凝時(shí)間控制在幾分鐘到幾小時(shí)的范圍。在超聲處理之后，對應(yīng)于凝膠化，絲纖蛋白經(jīng)歷了由無規(guī)巻曲到P-折疊的快速結(jié)構(gòu)變化。可以在超聲處理之前、期間或之后加入藥劑例如治療劑或生物制劑，并且在凝膠化時(shí)進(jìn)行包封。因此本發(fā)明提供了用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的方法，例如細(xì)胞的包封對時(shí)間敏感的那些應(yīng)用。由于水凝膠具有通常大于30%的高水含量(Park&Lakes,BI0MATS:INTRO.(第2版)，Plenum出版社，紐約，1992年)，其被認(rèn)為是細(xì)胞和生物活性分子包封和遞送的有用支架(scaffolds)，例如用于組織工程和細(xì)胞治療應(yīng)用。用于此類應(yīng)用的水凝膠具有與某些組織和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相似的機(jī)械性能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)，因此可將其植入用于組織修復(fù)或治療因子的局部釋放。為了包封和遞送細(xì)胞，優(yōu)選所形成水凝膠應(yīng)具有下列性質(zhì)不破壞細(xì)胞、對于細(xì)胞和周邊組織無毒、具有生物相容性、具有適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)運(yùn)送能力以允許營養(yǎng)素和代謝物的擴(kuò)散、具有充分的機(jī)械完整性和強(qiáng)度以承受與植入相關(guān)的操作、具有可控制的使用期限、并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)應(yīng)用情況在植入之后的合理時(shí)間內(nèi)保持凝膠的體積(DruryfeMooney,24Biomats.4337-51(2003))。已經(jīng)將各種合成材料，例如聚環(huán)氧乙烷(PE0)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚富馬酸丙二醇酯-乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))以及天然來源的材料，例如瓊脂糖、藻酸鹽/酯、殼聚糖、膠原、纖維蛋白、明膠和透明質(zhì)酸(HA)用于形成水凝膠。當(dāng)聚合物鏈由化學(xué)試劑(例如交聯(lián)劑)或物理剌激(例如pH和/或溫度)引發(fā)，以化學(xué)方式或物理方式交聯(lián)成網(wǎng)狀物時(shí)，則發(fā)生凝膠化。通過利用特定的分子量、嵌段結(jié)構(gòu)(blockstructure)和交聯(lián)模式，由合成的聚合物形成的水凝膠提供了可控且可重現(xiàn)的凝膠化作用和凝膠性質(zhì)的有利效果。天然來源的聚合物由于其大分子特性更接近于細(xì)胞外基質(zhì)并且降解產(chǎn)物無毒，因而傾向于將這些聚合物作為細(xì)胞和生物活性分子的載體用于組織工程和植入式醫(yī)療器械(Lee等人，221，Int，1J.Pharma.1-22(2001);Smidsr0d等人，8TrendsBiotech.71-78(1990))，但通常這些聚合物的凝膠化可控性較低。在天然來源的生物材料中，已經(jīng)對天然蠶纖維中的自組裝結(jié)構(gòu)蛋白——絲纖蛋白進(jìn)行了研究，這是由于其具有優(yōu)良的機(jī)械性能、生物相容性、可控的降解速度并且可導(dǎo)致結(jié)晶P-折疊結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀物的形成(Altman等人，24Biomats.401-16(2003);Jin&Kaplan,424Nature1057-61(2003);Horan等人，26Biomats.3385-93(2005);Kim等人，26Biomats.2775-85(2005);lshida等人，23Macromolecules88-94(1990);Nazarov等人，5Biomacromolecules718-26(2004))。已經(jīng)將絲纖蛋白制成各種用于組織工程和藥物控制釋放應(yīng)用的材料形式，包括薄膜、三維多孔支架、靜電紡絲纖維和微球體(Jin等人，5Biomacromolecules711-7(2004);Jin等人，3Biomacro-molecules，1233-39(2002);Hino等人，266J.ColloidlnterfaceSci.68-73(2003);Wang等人，117J.ControlRelease,360-70(2007))。同時(shí)參見美國專利申請序列號11/020，650;序列號10/541，182;序列號11/407，373;以及序列號11/664，234;PCT/US07/020789;PCT/US08/55072。在自然界中，絲纖蛋白水溶液產(chǎn)生于蠶的腺體后部并儲存在中部直至濃度為30%(w/v)，絲纖蛋白水溶液包含高含量的無規(guī)巻曲或a-螺旋結(jié)構(gòu)。在纖維進(jìn)入空氣中紡絲時(shí)，高剪切力和拉伸流動(dòng)誘導(dǎo)了自組裝和向P-折疊結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)固體纖維的形成(Vollrath&Knight，410Nature，541-48(2001))。在腺體的不同部位中存在的金屬離子和pH的改變影響了這種轉(zhuǎn)變(Chen等人，3Biomacromolecules644-8(2002);Zhou等人，109J.Phys.Chem.B16937-45(2005);Dicko等人，5Biomacromolecules704-10(2004);Terry等人，5Biomacromolecules768-72(2004))。在體外，純化的絲纖蛋白水溶液經(jīng)過自組裝形成e-折疊結(jié)構(gòu)并形成水凝膠。該溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換受到溫度、pH和離子強(qiáng)度的影響(Wang等人，36Int'1J.Biol.Macromol.66-70(2005);Kim等人，5Biomacromolecules786-92(2004);Matsumoto等人，110J.Phys.Chem.B21630-38(2006))。絲水凝膠(silkhydrogel)的壓縮強(qiáng)度和壓縮模量隨著絲纖蛋白濃度和溫度的增加而增加(Kim等人，2004)。絲纖蛋白水凝膠在許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面令人關(guān)注。例如，絲纖蛋白水凝膠被用作骨填充生物材料來治愈兔股骨遠(yuǎn)端臨界尺寸的多孔缺損，其中絲凝膠(silkgel)顯示出比聚(D，L-丙交酯-乙交酯)對照材料具有更好的骨骼治愈效果(Fini等人，26Biomats.3527-36(2005))。就許多基于細(xì)胞的應(yīng)用而言，必須在相對短的時(shí)間內(nèi)(幾小時(shí)內(nèi))在溫和條件下誘導(dǎo)凝膠化。但是，除非在對天然絲纖蛋白沒有化學(xué)修飾的情況下考慮非生理學(xué)處理(例如低pH、高溫、添加劑)，否則膠凝時(shí)間可能會(huì)過長。對于從0.6%到15%(w/v)的絲纖蛋白濃度而言，在室溫或37t:下，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換需要幾天到幾周(Kim等人，2004;Mats咖oto等人，2006;Fini等人，2005)。將鹽加到生理學(xué)水平以上并不會(huì)明顯改變凝膠化動(dòng)力學(xué)(Kim等人，2004)。較低pH(pH<5)或提高溫度(>60°C)可以將膠凝時(shí)間減少到幾個(gè)小時(shí)(Kim等人，2004;Fini等人，2005;Motta等人，15J.Biomater.Sci.Polymer.Edu.851-64(2004))，但是這些條件可能會(huì)潛在地改變細(xì)胞功能并影響細(xì)胞生存能力。在本發(fā)明中，通過超聲處理實(shí)現(xiàn)了用來加速過程并控制絲纖蛋白凝膠化的新方法。更具體地說，本發(fā)明提出了一種基于超聲處理的、以暫時(shí)可控的方式來加速溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換的新方法。該方法以機(jī)械方式通過絲纖蛋白鏈的疏水水合作用的改變誘導(dǎo)P-折疊的物理交聯(lián)。這容許在超聲處理之后添加細(xì)胞，繼之以快速凝膠化?？筛鶕?jù)使用的超聲處理參數(shù)(能量輸出和持續(xù)時(shí)間)以及絲纖蛋白濃度，將膠凝時(shí)間控制為幾分鐘到幾小時(shí)。本7方法進(jìn)一步提供了控制PH和鹽濃度對凝膠化的影響；在凝膠化之后絲狀結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)變化以及包封細(xì)胞(例如源自人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC))在絲凝膠中的行為?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用任何種類的絲纖蛋白。由蠶(例如家蠶(Bombyxmori))產(chǎn)生的絲纖蛋白是最普遍的，并表現(xiàn)為環(huán)保的、可更新的來源。有機(jī)的蠶繭可在市面上購得。然而，存在許多可替代使用的不同的絲，包括蜘蛛絲、轉(zhuǎn)基因絲、遺傳工程絲及其變體。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可由蠶繭制備絲纖蛋白水溶液。在例如美國專利申請序列號11/247,358;WO/2005/012606以及PCT/US07/83605中公開了制備絲纖蛋白溶液的適當(dāng)方法。例如，可通過從家蠶(B.mori)的繭中提取絲膠來獲得在絲生物聚合物中使用的絲。實(shí)質(zhì)上的凝膠化通常發(fā)生在超聲處理之后二十四小時(shí)之內(nèi)。例如，在超聲處理之后不足四小時(shí)(例如在超聲處理之后兩小時(shí)之內(nèi))形成絲纖蛋白凝膠。在特定的實(shí)施方式中，絲纖蛋白在超聲處理之后大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生凝膠化。因此，根據(jù)需要，基于溶液制備中使用的超聲處理，膠凝時(shí)間可從幾分鐘到幾小時(shí)。超聲處理在本領(lǐng)域是已知的。就本申請的目的而言，術(shù)語"超聲處理(ultrasonication)"和"超聲(sonication)"可交換使用，并具有相同的含義?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的對絲纖蛋白進(jìn)行超聲處理的任何方式進(jìn)行超聲處理。所述超聲處理可包括將絲纖蛋白進(jìn)行超聲處理一次，或可包括多次分別處理。已經(jīng)在蛋白結(jié)構(gòu)變化的范圍內(nèi)研究了超聲處理(Meinel等人，71J.Biomed.Mater.Res.A25-34(2004);Meinel等人，88Biotechnol.Bioeng.379-91(2004))并已經(jīng)用于產(chǎn)生大的液_氣界面、局部熱效應(yīng)、機(jī)械應(yīng)力/剪切應(yīng)力以及自由基反應(yīng)。相比之下，在關(guān)于肽凝膠化的其它研究中，通過超聲處理將凝膠中已組裝的肽納米纖維碎裂成更小的片段(H皿g等人，32A皿.Biomed.Eng.35.49(2004))。在聚合物溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換方面，一般使用超聲處理打碎凝膠網(wǎng)狀物并重新溶解水凝膠。本發(fā)明提供了將超聲處理用于誘導(dǎo)絲的溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換的新用途。所述超聲處理持續(xù)的時(shí)間應(yīng)足以起始凝膠化過程，但是為了兼顧水凝膠的機(jī)械性能又不應(yīng)持續(xù)太長時(shí)間。根據(jù)使用絲纖蛋白的量、溶液的濃度以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它因素，所述超聲處理一般可持續(xù)大約5秒到大約60秒。例如，所述超聲處理持續(xù)大約15秒到大約45秒。凝膠化一般從超聲處理起始開始，并在處理結(jié)束之后繼續(xù)進(jìn)行。所述超聲處理可包括有助于凝膠化過程的其它處理。例如，所述處理可包括鹽溶液。本領(lǐng)域已知鹽溶液可有助于誘導(dǎo)凝膠化?？墒褂冒洝⑩}、鈉、鎂、銅和/或鋅離子的代表性鹽溶液。在這方面，鉀在鹽溶液中較為有利。所述處理還可包括調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液的pH。如本領(lǐng)域已知的那樣，調(diào)節(jié)水溶液的pH可有助于誘導(dǎo)膠凝化。調(diào)節(jié)pH至更高或更低可以起效。因此，例如，可使用具有大約pH4或更低，或者大約pH7.5或更高的水溶液。特別地，利用低濃度和低pH的鉀鹽溶液常常是有效的。特定的實(shí)施方式是利用鹽濃度小于100mM并且該溶液pH約為4或更低的鉀鹽。本發(fā)明還提供了一種控制絲纖蛋白膠凝時(shí)間的方法，所述方法在使凝膠化發(fā)生于約兩小時(shí)內(nèi)的條件下，通過將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化。超聲處理過程引起絲纖蛋白鏈之間的相互作用。特定的實(shí)施方式提供了一種控制膠凝時(shí)間的方法，以使絲纖蛋白在超聲處理之后在大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)經(jīng)歷凝膠化。另外，各種其它因素可用于控制膠凝時(shí)間。例如，可通過超聲處理的振幅和絲纖蛋白溶液的濃度控制膠凝時(shí)間。例如，振幅的范圍為從大約25%到大約35%功率輸出(通常為7瓦特到10瓦特)，而絲纖蛋白濃度的范圍為從大約10%到大約15%(w/v)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，振幅的范圍為從大約25%到大約55%功率輸出(通常為7瓦特到21瓦特)，而絲纖蛋白濃度的范圍為從大約5%到大約10%(w/v)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本申請有能力改變超聲處理的振幅和絲纖蛋白溶液的濃度來獲得希望的凝膠化水平和希望的發(fā)生凝膠化的時(shí)間范圍。還可通過加入鹽溶液和調(diào)節(jié)絲纖蛋白溶液的濃度以及鹽溶液的濃度來控制膠凝時(shí)間。所述鹽溶液可包含鉀離子，但也可使用其它鹽溶液。在特定的實(shí)施方式中，所述絲纖蛋白的濃度為4%(w/v)或更低，而所述鉀鹽溶液的濃度范圍為20mM到100mM。另外，可通過調(diào)節(jié)鹽溶液的濃度和pH來控制膠凝時(shí)間，特別是當(dāng)鹽溶液包含鉀離子時(shí)更是如此。在特定的實(shí)施方式中，所述鹽溶液為pH大約為4或更低的鉀鹽溶液。例如，所述鉀鹽溶液具有20mM到100mM的濃度。本發(fā)明還涉及一種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法。所述方法包括(a)將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理一段時(shí)間以起始凝膠化；以及(b)在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實(shí)質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑?？稍诔曁幚碇啊⑵陂g或之后將藥劑引入絲纖蛋白溶液。所述藥劑可表示能被包封進(jìn)絲纖蛋白凝膠的任何物質(zhì)。例如，所述藥劑可為治療劑，例如小分子和藥物；或生物材料，例如細(xì)胞(包括干細(xì)胞)、蛋白、肽、核酸(DNA、RNA、siRNA)、肽核酸(PNA)、適配子、抗體、激素、生長因子、細(xì)胞因子或酶。因?yàn)榘猱a(chǎn)物可用于生物醫(yī)學(xué)用途，所以人們希望對治療劑或生物材料進(jìn)行包封。如果治療劑被包封，由于超聲處理對于大多數(shù)治療劑不會(huì)產(chǎn)生不利影響，可在超聲處理之前、期間或之后將治療劑引入絲纖蛋白溶液。另一方面，如果生物材料被包封，由于超聲處理可對所述生物材料產(chǎn)生不利影響，通常直到超聲處理后才將其引入絲纖蛋白溶液。這并非對于所有生物材料都是必需的，但已知超聲處理可損害或破壞活細(xì)胞，所以應(yīng)加以注意。在超聲處理之后引入藥劑的情況下，可調(diào)節(jié)超聲處理的條件以使凝膠化在超聲處理之后一段時(shí)間發(fā)生。如果在超聲處理期間或其后立即發(fā)生凝膠化，則用來將藥劑引入絲纖蛋白溶液的時(shí)間可能會(huì)不足。例如，在超聲處理之后引入藥劑的情況下，在超聲處理之后大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)，使所述絲纖蛋白經(jīng)歷凝膠化。如果在超聲處理之前或期間引入藥劑，則可以在超聲處理期間、其后立即或超聲處理后一段時(shí)間發(fā)生凝膠化。所以，當(dāng)在超聲處理之前或期間引入藥劑時(shí)，可使絲纖蛋白在超聲處理之后大約兩個(gè)小時(shí)內(nèi)經(jīng)歷凝膠化。當(dāng)將治療劑或生物材料引入絲纖蛋白時(shí)，還可隨所述藥劑加入本領(lǐng)域已知的其它材料。例如，可能希望加入的材料具有下列作用促進(jìn)藥劑的生長(就生物材料而言)；在藥劑從包封中釋放之后，促進(jìn)藥劑的功能；或增加藥劑在包封期間存活或保持其功效的能力。促進(jìn)細(xì)胞生長的已知材料包括細(xì)胞生長培養(yǎng)基，例如Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS);非必需氨基酸和抗生素；以及生長因子和形態(tài)發(fā)生因子，例如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF-I)、骨形態(tài)發(fā)生生長因子(BMP)、神經(jīng)生長因子，并且可以使用相關(guān)蛋白。用于通過凝膠遞送的另外的選擇包括DNA、siRNA、反義、質(zhì)粒、脂質(zhì)體和用于遞送遺傳物質(zhì)的相關(guān)體系；激活細(xì)胞信號級聯(lián)的肽和蛋白；促進(jìn)來自細(xì)胞的礦化作用或相關(guān)事件的肽和蛋白；用于改進(jìn)凝膠-組織界面的粘附肽和蛋白；抗菌肽；以及蛋白及相關(guān)化合物。絲纖蛋白包封的治療劑或生物材料適合于生物遞送裝置。使用絲纖蛋白作為生物遞送裝置的技術(shù)見于例如美國專利申請序列號No.10/541，182;No.11/628,930;No.11/664，234;No.11/407，373;PCT/US207/020789;PCT/US08/55072。絲纖蛋白水凝膠結(jié)構(gòu)使生物遞送載體能夠進(jìn)行可控釋放?？煽蒯尫乓钥蒯寗?dòng)力學(xué)使得劑量的給予隨時(shí)間變化。在某些情況下，持續(xù)(例如超過幾個(gè)星期)將治療劑或生物材料遞送到需要處理的部位。隨著時(shí)間的可控釋放(例如超過幾天或幾星期或更久)容許治療劑或生物材料持續(xù)遞送來獲得更好的治療。可控遞送載體是有利的，因?yàn)槠浔Ｗo(hù)了治療劑或生物材料在體液和組織中在體內(nèi)不被例如蛋白酶降解。進(jìn)一步關(guān)于利用超聲處理誘導(dǎo)絲凝膠形成的方法，按下文描述的方式超聲處理0.5mL的1%、2%、6%和20%(w/v)的絲纖蛋白水溶液樣品。當(dāng)功率輸出保持恒定(20%振幅)時(shí)，絲纖蛋白膠凝時(shí)間隨超聲處理時(shí)間增加而縮短(圖l)。對于絲濃度從1%到6%(w/v)的每次增加，膠凝時(shí)間顯著縮短(在圖1的*樣品之間，P<0.01)。20%(w/v)的樣品與6%(w/v)的樣品相比具有類似甚至更長的膠凝時(shí)間(圖l)。20%樣品的這一結(jié)果很可能是由于溶液具有高粘性因而在該溶液中超聲波不能有效地傳播。當(dāng)使用高于30%振幅的功率輸出時(shí)，超聲處理產(chǎn)生稠密的泡沫，絲纖蛋白不能以均相方式膠凝。當(dāng)超聲處理的體積增加到5ml時(shí)，即使在高達(dá)55%振幅的功率水平上也觀察不到該泡沫。然而，當(dāng)在體積超過5ml的情況下，對高濃度進(jìn)行超聲處理時(shí)，會(huì)發(fā)生非均相凝膠化。將小體積的絲溶液(silksolution)(未經(jīng)高壓滅菌)用于超聲處理的優(yōu)化和膠凝的性質(zhì)表征(pH、鹽效應(yīng)和圓二色性測定)，而將高壓滅菌的絲溶液用于機(jī)械性、降解和細(xì)胞包封的研究。有趣的是，與原始溶液相比，高壓滅菌并未顯著地改變所使用的超聲處理參數(shù)和相關(guān)的膠凝時(shí)間，表明絲纖蛋白保持了其原始溶液狀態(tài)結(jié)構(gòu)的重要特征，并在高壓滅菌之后保持了在形成膠凝中將結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镻-折疊狀態(tài)的能力。可進(jìn)一步研究由于高壓滅菌處理產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化，而這方面的研究為藥劑大規(guī)模制備提供了便利。在絲纖蛋白凝膠化期間，通過在圓二色性測定中觀察到的變化，將溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換與P-折疊形成的增加聯(lián)系起來(圖2A)?；跈E圓率在217nm處的增加(圖2B)，觀察到在超聲處理之后P-折疊結(jié)構(gòu)的迅速形成，隨后更為緩慢轉(zhuǎn)換。在該轉(zhuǎn)換點(diǎn)上發(fā)生了絲纖蛋白凝膠化，而P-折疊結(jié)構(gòu)起初的迅速形成則減慢。該轉(zhuǎn)換與以前進(jìn)行的研究(Matsumoto等人，2006)—致，表明可涉及相類似的機(jī)理。P_折疊結(jié)構(gòu)的形成源于改變的疏水相互作用及隨后的物理交聯(lián)。該起始步驟后，在與初始超聲處理誘導(dǎo)的變化相比相對長的時(shí)間內(nèi)，為較緩慢的鏈的組織以及凝膠網(wǎng)狀物的形成。將這一包括兩個(gè)步驟的絲凝膠化機(jī)制示意性地描述于圖2C中。可將所研究的影響凝膠化速率的參數(shù)看作一種概括天然的蠶紡絲過程的方法。關(guān)鍵的處理參數(shù)包括超聲處理效應(yīng)，其作為模擬在蠶的腺體前部經(jīng)歷的剪切力增加；陽離子類型和濃度；以及pH。10人們公認(rèn)在超聲處理中，機(jī)械振動(dòng)導(dǎo)致泡沫的形成和破裂。作為這一空化作用(cavitation)的結(jié)果，培養(yǎng)基可經(jīng)歷極端的局部效應(yīng)高溫(10，000K)、高壓(200bar)和高應(yīng)變率(107s—0(Paulusse&Sijbesma，44J.Polym.Sci.-Polym.Chem.5445-53(2006);Kemmere等人，290Macromo1.Mater.Eng.302-10(2005))。在各種應(yīng)用中已經(jīng)利用了這些物理現(xiàn)象，所述應(yīng)用包括N-異丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的自組裝和凝膠化(Seida等人，90J.A卯l.Polym.Sci.2449-52(2003))、含有金屬化(metalated)肽的有機(jī)流體(Isozaki，119AngewChem.2913-15(2007))以及合成的自組裝肽(Yokoi等人，102ProcNatAcadSciUSA8414-19(2005))。除了肽以外，已經(jīng)利用超聲處理研究了蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白和肌紅蛋白，其中將超聲處理作為表征與疾病狀態(tài)相關(guān)的聚合和自組裝的方法(Stathopulos等人，13ProteinSci.3017-27(2004);Mason&Peters，PRACTICALS0N0CHEM:USES&APPL.ULTRASOUND(第2版，齊切斯特，西薩塞克斯郡，英國(2002))?？紤]到聚合物體系響應(yīng)超聲處理的行為幅度，很可能一些與超聲處理相關(guān)的物理因素(包括局部溫度提高、機(jī)械力/剪切力、以及增加的氣-液界面)影響了絲纖蛋白快速凝膠化的過程。特別地，超聲處理誘導(dǎo)的疏水水合作用方面的變化將引起物理交聯(lián)(例如與P-折疊形成相關(guān)的初始鏈相互作用)的加速形成。在本研究中，在超聲處理期間，溶液溫度在短時(shí)間內(nèi)(5分鐘-6分鐘)從室溫增加到40°C_711:，其表現(xiàn)在局部溫度上瞬時(shí)尖峰。在過去的研究中，當(dāng)本體樣品維持在6(TC且無超聲處理時(shí)，凝膠化需要幾天的時(shí)間(Kim等人，2004)。因此，局部溫度的影響可能有助于增進(jìn)凝膠化動(dòng)力學(xué)，但這不僅僅是造成所觀察到的短時(shí)響應(yīng)的原因。受瞬時(shí)溫度增加的影響，疏水鏈的局部的鏈動(dòng)力學(xué)和水合狀態(tài)上的變化可能是形成疏水性物理交聯(lián)的原因。由于在鏈內(nèi)和鏈間相互作用的調(diào)控下水所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，絲纖蛋白鏈中獨(dú)特的疏水性嵌段序列(blocksequence)特征特別適合于這類技術(shù)(Jin等人，2003)。這對于將該技術(shù)延伸到其它生物聚合物體系來測定鏈化學(xué)對鏈組裝的超聲處理調(diào)控過程的影響可能是有用的。已經(jīng)報(bào)道了與超聲處理有關(guān)的膠原降解作為將鏈打碎為片段以促進(jìn)重組裝研究的方法(Giraud-Guille&Besseau，113J.Struct.Biol.99-106(1994))。應(yīng)當(dāng)注意到，由于使用了基于SDS-PAGE分析的短時(shí)間超聲處理過程，本方法不會(huì)導(dǎo)致顯著的鏈降解。在超聲處理之前，向絲纖蛋白水溶液補(bǔ)充K+和Ca2+至各種生理學(xué)相應(yīng)的濃度。如圖3A所示，在低K+濃度(20mM-50mM)下，膠凝時(shí)間隨K+濃度增加而顯著縮短(在*樣品之間，p<0.05)。然而，在高K+濃度(100mM-200mM)下，凝膠化被抑制(圖3A)。絲纖蛋白濃度在0.5%到8%(w/v)的范圍內(nèi)，觀察到了這些結(jié)果。超過8%時(shí)，因?yàn)樵谒袠悠分心z化都很快地發(fā)生(<2分鐘)，所以觀察不到鹽效應(yīng)。與K+相比，具有相同濃度的Ca2+誘導(dǎo)的絲纖蛋白凝膠化要慢一些(比較圖3A和3B)。當(dāng)Ca2+濃度從20mM增加到200mM時(shí)，絲纖蛋白膠凝時(shí)間顯著縮短(在圖3B的A樣品之間，p〈0.05)。相反，在此前的研究成果中，Ca2+促進(jìn)了絲纖蛋白凝膠化而K+則沒有效果(Kim等人，2004)，這是與本方法觀察相比所不同的結(jié)果。在超聲處理之前，為了測定對凝膠化的影響，調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液的pH。降低或升高pH促進(jìn)了凝膠化(在圖3C的承樣品之間，p<0.05)。與此前的研究(Kim等人，2004;Mats咖oto等人，2006)—致，在誘導(dǎo)凝膠化方面，低pH(pH<4)的效果要比高pH(pH>9)更顯著(在圖3C的O樣品之間，p<0.05)。11由機(jī)械測試得到的應(yīng)力_應(yīng)變曲線在平坦區(qū)域之前顯示出線性，表明所述凝膠具有較大(5%_10%應(yīng)變)且可能的粘彈性特征，之后由裂縫形成而誘導(dǎo)永久性損傷。本研究中制備的凝膠與此前的研究成果中研究的凝膠表現(xiàn)相似(Kim等人，2004)，其中，相應(yīng)的絲纖蛋白濃度在屈服強(qiáng)度(圖4A)禾P"傳統(tǒng)的"彈性模量(圖4B)上得到相似的數(shù)值。這兩個(gè)量度看起來都與絲凝膠濃度正相關(guān)。通過檢驗(yàn)，絲纖蛋白濃度(w/v)上的差異是最終水凝膠機(jī)械性能的更重要的決定因素，而非由于超聲處理?xiàng)l件的變化(圖4A和4B)。同樣，平衡模量值看起來與絲凝膠濃度正相關(guān)(圖4C)。當(dāng)與其它可降解的包封有細(xì)胞的水凝膠例如藻酸鹽/酯、瓊脂糖、聚乙二醇交聯(lián)凝膠、纖維蛋白原及其它體系(Almany&Seliktar26(15)Biomats.4023-29(2005);Kong等人，24(22)Biomats.4023-29(2003);Hung等人，2004;Bryant等人，86(7)BiotechnolBioeng747-55(2004);Kang等人，77(2)J.Biomed.Mater.Res.A331-39(2006);Rowley等人，20(l)Biomats.45-53(1999);Broderick等人，72J.Biomed.Mater.Res.B-ApplBiomater.37-42(2004);Zhang等人，15J.Mater.Sci.Mater.Med.865-75(2004))相比時(shí)，高濃度、快速形成的絲水凝膠顯示出了優(yōu)良的機(jī)械性能(表l)?；诩?xì)胞包封和機(jī)械性能試驗(yàn)方案的相似性收集數(shù)據(jù)，其中測定了"傳統(tǒng)"的模量或平衡模量的數(shù)值。表1.由用于細(xì)胞包封的可降解聚合物制得的凝膠體系機(jī)械性能的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a5mm直徑X5mm高度。1.5mm/min的形變速率，模量基于應(yīng)力-應(yīng)變曲線的較低部分的平均斜率。b6mm直徑X2.4mm高度。2mm/min的形變速率，模量基于應(yīng)力-應(yīng)變曲線的初始部分的平均斜率。e5mm直徑X1mm高度。40-100mN/min的負(fù)載控制形變速率。d12.5mm直徑X1.5mm高度。25mN/min的負(fù)載控制形變速率。楊氏模量等于在初始預(yù)加載力0.01N到0.25N之間所獲得的斜率的絕對值。e6mm直徑。0.5mm/min的形變速率，模量基于應(yīng)力_應(yīng)變曲線的較低部分的平均斜率。fl2.7mm直徑X2mm高度。lmm/min的形變速率。彈性模量從應(yīng)力_應(yīng)變曲線的斜率中獲得，其限于第一個(gè)10%的應(yīng)力。g由在10%應(yīng)力的平衡應(yīng)力和初始橫截面積來計(jì)算平衡模量。此前已經(jīng)對絲纖蛋白薄膜、多孔固體支架和絲纖蛋白紗(silkfibroinyarn)的酶(蛋白酶XIV)降解進(jìn)行了研究(Horan等人，2005;Kim等人，2005;Jin等人，2005)。利用相同濃度的蛋白酶(5U/mL)，所有的絲纖蛋白水凝膠都顯示出快速降解，在第一個(gè)四天內(nèi)有大約80%的質(zhì)量損失，然后降解速率變慢很多(圖5)。水凝膠的降解具有絲纖蛋白濃度依賴性。當(dāng)濃度從4%增加到12%(w/v)時(shí)，達(dá)到50%質(zhì)量損失的降解時(shí)間從1.5天增加到3天(圖5)。對照樣品(以PBS代替蛋白酶培養(yǎng)的絲纖蛋白水凝膠)在培養(yǎng)期內(nèi)是穩(wěn)定的(圖5)。由于蛋白水解過程引起的絲水凝膠的快速降解(在幾天之內(nèi))可能適于一些應(yīng)用，例如在傷口愈合的情況或快速藥物遞送中。然而，應(yīng)當(dāng)指出本文所述的蛋白水解降解時(shí)間為體外降解時(shí)間，相比之下，體內(nèi)生存期通常更長，并且所述時(shí)間范圍具有組織特異性。已經(jīng)成功地將hMSC包封于各種水凝膠體系中，例如聚乙二醇、瓊脂糖、膠原和藻酸鹽/酯，因?yàn)檫@些細(xì)胞對于組織修復(fù)或再生以及長期的藥物釋放具有潛力(參見Nuttelman等人，24MatrixBiol.208-18(2005);Nuttelman等人，27Biomats.1377-86(2006);Mauck等人，14Osteoarthr.Cartilage179-89(2006);Lewus&Na咖an，llTissueEng.1015-22(2005);Majumdar等人，185J.CellPhysiol.98-106(2000);Boison，27TrendsPharmacol.Sci.652-58(2006))。少于4%(w/v)蛋白質(zhì)的絲水凝膠由于物理局限性而難以操作。所以，將4%、8%和12%(w/v)絲纖蛋白的水凝膠用于hMSC包封。在上述所有三個(gè)凝膠濃度中，細(xì)胞在第一天保持其原來的圓形并均勻分布。在第六天，在12%的凝膠中，一些細(xì)胞出現(xiàn)缺損，并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。在第二十一天，在4%的凝膠中，細(xì)胞與第一天相比無變化，而在8%和12%的凝膠中，細(xì)胞在很大程度上發(fā)生變形并聚集。組織學(xué)分析顯示，在4%凝膠基質(zhì)內(nèi)的hMSC保持圓形，并且在研究期間未發(fā)生聚集；而那些接近凝膠表面的hMSC從凝膠中長出來，并從第六天開始，形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N狀。所有的hMSC，無論是接近凝膠表面的紡錘狀，還是在凝膠中包封的圓形，在存活-死亡測試(live-deadassay)中的綠色熒光來看都是活細(xì)胞。所以，hMSC在4%絲水凝膠體系中保持其活性和功能至少持續(xù)二十一天。然而，從組織學(xué)圖像中的空穴和存活-死亡測試中幾乎沒有綠色熒光斑點(diǎn)來看，在8%和12X凝膠中，hMSC在很大程度上發(fā)生形態(tài)改變，并且其中很多的細(xì)胞發(fā)生死亡、聚集和/或溶解。在存活-死亡測試中，未包封細(xì)胞的對照絲凝膠顯示出強(qiáng)烈的紅色熒光本底，掩蔽了來自死細(xì)胞的紅色熒光。這些觀察和結(jié)論得到DNA定量試驗(yàn)(PicoGreen分析)的進(jìn)一步支持(圖6)。第一個(gè)6天內(nèi)，細(xì)胞在上述所有三種水凝膠中都得到顯著地增殖(在圖6中的*樣品之間，p<0.05)。就4%的凝膠而言，在六天之后細(xì)胞數(shù)目停止增加，這表明已經(jīng)達(dá)到了細(xì)胞增殖的最大凝膠容量。在其它的水凝膠體系(例如PEG和藻酸鹽/酯)中也觀察到了相似的現(xiàn)13象(Nuttle腿n等人，2006;Ramdi等人，207Exp.CellRes.449-54(1993))。就8%和12%的凝膠而言，在六天之后細(xì)胞數(shù)目減少，這與顯微觀察、組織學(xué)觀察和存活-死亡觀察相一致。在高濃度凝膠中活性的損失可能是由于物質(zhì)運(yùn)送限制，也可能是由于在這些較高凝膠濃度時(shí)施加的機(jī)械限制?？梢耘懦z對于hMSC有毒的可能性，因?yàn)樵?X、8X和12%絲凝膠的頂部生長的hMSC具有與在對照細(xì)胞培養(yǎng)皿上生長的hMSC相似的生長速度，并且在所有組之間細(xì)胞形態(tài)(紡錘形)都是相似的?？赏ㄟ^本文提供的教導(dǎo)探索使較低凝膠濃度(1%和2%)穩(wěn)定的最優(yōu)化條件，并可通過各種濃度的絲凝膠詳細(xì)研究氧和營養(yǎng)物的擴(kuò)散速率。本文提供了一種基于超聲作用的、允許絲纖蛋白水凝膠迅速形成的新方法。凝膠化可在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)得以誘導(dǎo)，這取決于超聲功率輸出和持續(xù)時(shí)間。由于疏水水合作用的變化，凝膠化伴隨著P-折疊結(jié)構(gòu)的形成。低濃度的K+和低pH可加快凝膠化速率，而Ca2+的存在和高濃度的K+則抑制凝膠化。壓縮模量在369-1712kPa范圍內(nèi)時(shí)，絲纖蛋白水凝膠具有優(yōu)于以往報(bào)道的機(jī)械性能。凝膠機(jī)械強(qiáng)度隨絲纖蛋白溶液濃度的增加而增加。4%(w/v)的絲纖蛋白水凝膠適合于封裝hMSC;在靜置培養(yǎng)條件下，細(xì)胞可在幾周內(nèi)保持生存和增殖能力。本發(fā)明進(jìn)一步以下列實(shí)施例為特征，并將其作為實(shí)施方式的示例。實(shí)施例實(shí)施例l.絲纖蛋白溶液如前所述制備絲纖蛋白儲備水溶液(Sofia等人，54J.Biomed.Mater.Res.139-48(2001))。簡要來說，將家蠶(B.mori)的繭在0.02M碳酸鈉水溶液中煮沸40分鐘，然后用純水徹底沖洗。在干燥后，將提取的絲纖蛋白于6(TC在9.3M的LiBr溶液中溶解4小時(shí)，產(chǎn)生20%(w/v)溶液。利用Slide-a-Lyzer透析盒(麗C03，500，Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)將該溶液用蒸餾水透析兩天以除去鹽分。該溶液在透析之后是在光學(xué)上清澈的，然后將其離心以除去在處理過程中形成的少量絲聚集物，所述絲聚集物通常來自于繭上存在的環(huán)境污染物。絲纖蛋白水溶液的終濃度為大約8%(w/v)。該濃度通過對干燥后已知體積溶液的殘留固體進(jìn)行稱重來測量。通過用水稀釋8%的溶液來制備低濃度的絲溶液。為了獲得高濃度的絲溶液，將8%的溶液在室溫下用10%(w/v)PEG(10，000g/mo1)溶液在Slide-a-Lyzer透析盒(麗C03，500，Pierce)中透析至少24小時(shí)(Jin&Kaplan,2003;Kim等人，2004)。用水將體積調(diào)整至所需濃度。在使用前所有溶液都在fC下儲存。實(shí)施例2.具有各種鹽濃度和pH的絲溶液為了測定鹽濃度對于絲凝膠化的作用，將1M的KC1和CaCl2儲備液加入絲溶液至20mM到200mM的最終鹽濃度。為了測定pH對于凝膠化的作用，用1M的HC1或Na0H溶液滴定絲溶液，并用pH計(jì)監(jiān)測pH。實(shí)施例3.篩選絲凝膠化條件為了在各種超聲處理?xiàng)l件下測定絲凝膠化，用Branson450超聲發(fā)生器(Branson超聲波公司(BransonUltrasonicsCo.)，丹伯里，康涅狄格州)在1.5mlE卯endorf管中，對0.5ml絲(水)溶液進(jìn)行超聲處理，所述超聲發(fā)生器由以下部件組成Model450電源、變壓器(部件號101-135-022)、1/2"外螺紋破碎儀探頭(DisrupterHorn)(部件號101-147-037)以及1/8"直徑的錐形微探頭(Microtip)(部件號101-148-062)。功率輸出的變化為10%至50%振幅(3瓦特-21瓦特)，并且超聲處理時(shí)間的變化為5秒至30秒。為了測定鹽和PH對于凝膠化的影響，以20%振幅(7瓦特)對上述制備的0.5ml絲溶液超聲處理15秒。在超聲處理之后于37t:下培養(yǎng)溶液，然后通過翻轉(zhuǎn)管并檢驗(yàn)溶液的不透明度變化來肉眼監(jiān)控溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換(Matsumoto等人)。根據(jù)初步結(jié)果，使用達(dá)到12%(w/v)的絲纖蛋白濃度來保持低粘度，并且12%的溶液比8%和4%的樣品膠凝得更快。這些結(jié)果列于下表2。表2.超聲處理后大體積(5ml-7ml)絲纖蛋白水溶液的膠凝時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注根據(jù)至少兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)來估計(jì)并平均得到膠凝時(shí)間。實(shí)施例4.圓二色件(CD)以20%振幅(7瓦特)超聲處理0.5ml的2%絲(水)溶液30秒，然后立即裝入光路長度0.Olmm的復(fù)合式石英池(sandwichquartzcell)(NovaBiotech,ElCajon，力口州)。用Jasco-720圓二色性分光光度計(jì)(Jasco公司，日本)進(jìn)行圓二色性測定。在37°C下以100nm/min的速率用4秒累積時(shí)間掃描所有樣品，然后由四個(gè)重復(fù)的試驗(yàn)平均得到結(jié)果。對于絲13-折疊結(jié)構(gòu)形成的動(dòng)力學(xué)測定，在2.5小時(shí)中以每10秒采樣一次來監(jiān)控217nm處的橢圓率變化。實(shí)施例5.機(jī)械試驗(yàn)用超聲處理制備大體積的絲凝膠以進(jìn)行機(jī)械測試。在12rC下，在玻璃燒瓶中將4%、8%和12%(w/v)的絲溶液高壓滅菌20分鐘。向高壓滅菌后的溶液中補(bǔ)充無菌Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基粉末(DMEM粉末，Invitrogen，卡爾斯巴德，加州)和碳酸氫鈉(Sigma-Aldrich，圣路易，密蘇里州)分別達(dá)到0.135g/ml和0.037g/ml的濃度。所得到的溶液pH經(jīng)pH計(jì)測定為pH7.4。將7ml等分的溶液加入15ml的Falcon塑料管中，然后以20%、30%、40%振幅(分別為7瓦特、10瓦特、15瓦特)超聲處理30秒。將6ml超聲處理后的溶液加入小培養(yǎng)皿(BDFalcon,No.35-3001，BDBiosciences,PaloAlto，加州)中，在37t:恒溫箱中肉眼監(jiān)控該培養(yǎng)皿以便估計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，直到基于不透明特征和凝膠表面上的凝聚作用達(dá)到完全凝膠化為止。接下來，在膠凝之后，立即將直徑9.525mm的塊(高度2mm-3mm)沖壓出來用于機(jī)械測試。在測試前將凝膠塊在DMEM全溶液(Gibco/Invitrogen)中預(yù)處理超過1小時(shí)。將所有樣品浸在DMEM中儲存，并在24小時(shí)內(nèi)測試。在裝配有無側(cè)限壓縮臺板和IOON載荷傳感器的3366Instron裝置(Norwood,馬薩諸塞州)上進(jìn)行評價(jià)。以lmm/min的拉伸速率來進(jìn)行壓縮拉伸方法?；诎胱詣?dòng)技術(shù)來測定壓縮應(yīng)力和壓縮應(yīng)變并計(jì)算彈性模量。除曲線圖初始的線性部分外，將應(yīng)力-應(yīng)變曲線低于切斷應(yīng)力(cut-offstress)水平下分成八段。利用最小二乘法擬合，將這八段中的最高斜率定義為樣品的壓縮模量。利用偏置屈服(offset-yield)的方法測定壓縮強(qiáng)度。作出與模量線平行的線，但偏移樣品標(biāo)距(gaugelength)的0.5%。將應(yīng)力-應(yīng)變曲線與偏置線交叉處對應(yīng)的應(yīng)力值定義為所述支架的壓縮強(qiáng)度。根據(jù)基于ASTM方法F451-95的改進(jìn)進(jìn)行該測試。進(jìn)行兩個(gè)無側(cè)限壓縮試驗(yàn)方案來評價(jià)超聲處理?xiàng)l件對于機(jī)械性能的影響。首先，將斷裂應(yīng)變測試(strain-to-failuretest)用于獲得傳統(tǒng)材料的勁度性質(zhì)，并觀察到斷裂響應(yīng)(Almany&Seliktar26(15)Biomats.2467-77(2005);Kong等人，24(22)Biomats.4023-29(2003))。其次，根據(jù)Hung等人的試驗(yàn)參數(shù)，將應(yīng)力松弛測試(stressrelaxationtest)用于評價(jià)平衡模量特性(32Ann.Biomed.Eng.35-49(2004))。這些測定共同為針對用于細(xì)胞包封的其它可降解水凝膠的已公開特性提供了寬泛的比較。對于記錄的每個(gè)組評價(jià)N=4的樣品，并在裝配有無側(cè)限壓縮臺板和100N載荷傳感器的3366Instron裝置(Norwood,麻省)上進(jìn)行測試，利用Bluehill軟件2.0版導(dǎo)出樣品數(shù)據(jù)。對于斷裂應(yīng)變測試，以lmm/min的拉伸控制速率將每個(gè)樣品壓縮，在達(dá)到額定自重負(fù)載(nominaltareload)并記錄樣品高度后開始測試。通過樣品幾何學(xué)的歸一化來測定壓縮應(yīng)力和壓縮應(yīng)變，并且以在每個(gè)應(yīng)力-應(yīng)變曲線的5%應(yīng)變部分上建立的切線的斜率來計(jì)算"傳統(tǒng)的"彈性模量。通過將2%應(yīng)變的切線的平行線進(jìn)行偏移來測定屈服強(qiáng)度；將應(yīng)力/應(yīng)變響應(yīng)與偏置線的交點(diǎn)定義為屈服強(qiáng)度(其與斷裂起始相一致)。就應(yīng)力松弛測試而言，將樣品浸在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并在額定自重負(fù)載下保留200秒。此后，將樣品以lmm/s進(jìn)行壓縮直至10%應(yīng)變?yōu)橹?，保?0分鐘。通過將10%應(yīng)變下的松弛應(yīng)力歸一化來計(jì)算平衡模量。實(shí)施例6.絲凝膠的體外酶促降解如上所述制備的4%、8%、12%(w/v)的絲凝膠塊(直徑=4mm;高度=2mm-3mm)，然后在24孔板中將其浸于lmL蛋白酶XIV(Sigma-Aldrich)溶液。通過將酶粉溶解于PBS中達(dá)到5U/mL的濃度來制備新鮮的蛋白酶溶液，并每24小時(shí)用新配制的溶液進(jìn)行替換。將對照塊浸于lmL的PBS，也每24小時(shí)進(jìn)行更新。在37。C下培養(yǎng)所有樣品。在第1、2、3、4和7天，用水沖洗四個(gè)塊，用棉紙擦拭以除去凝膠表面上的多余水分并稱重。實(shí)施例7.在絲凝膠中的hMSC接種和培養(yǎng)如前所述，從來自獲準(zhǔn)的(consenting)供體(Clonetic-Poietics，Walkersville，MD)的新鮮全骨髓吸出物中分離hMSC(Meinel等人，71J.Biomed.Mater.Res.A25-34(2004);Meinel等人，88Biotechnol.Bioeng.379-91(2004))，并在包含90%的DMEM、10%胎牛血清(FBS)、0.lmM非必需氨基酸、100U/mL青霉素、1000U/mL鏈霉素、0.2%兩性霉素B抗真菌劑(fungizoneantimycotic)和lng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的生長培養(yǎng)基中擴(kuò)展培養(yǎng)。在使用前，從培養(yǎng)瓶中將通道3-4細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化，并重懸于匿EM中獲得5Xl(f細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。將15mL的4%、8%和12%(w/v)的絲溶液進(jìn)行蒸汽滅菌(高壓滅菌)，并用上述的DMEM粉和碳酸氫鈉進(jìn)行補(bǔ)充。將5mL的等分加入15-mLFalcon塑料管中，并對于每個(gè)絲濃度共制備兩個(gè)管(對照和所接種的細(xì)胞)。在層流凈化罩中以50%振幅超聲處理4%(w/v)絲溶液(5mL)30秒，并在30分鐘培16養(yǎng)后在同樣條件下再次超聲處理。在第二次超聲處理后，在5分鐘-10分鐘內(nèi)將溶液冷卻至室溫，然后加入50mL細(xì)胞懸浮液，并與超聲處理過的絲溶液混合至5X105細(xì)胞/mL的終濃度。除了在超聲處理之后加入50mL的DMEM代替細(xì)胞懸浮液，以同樣的方式超聲處理對照樣品。將1.5mL混合物的等分快速移液至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其對于每個(gè)樣品組共準(zhǔn)備三個(gè)孔。以40%和30%振幅分別將8%和12%(w/v)溶液用30秒的時(shí)間超聲處理一次。加入50ml等分的hMSC懸浮液，并如上所述將混合物鋪板。然后在37t:和5%的C02下培養(yǎng)所有培養(yǎng)板。當(dāng)所述培養(yǎng)板中的絲在0.5小時(shí)-2小時(shí)內(nèi)發(fā)生凝膠時(shí)，從凝膠上沖壓出小塊(直徑=4咖；高度=2-3mm)，并置于新的24孔板的孔中。然后在37"和5%的C02下，將小塊在包含90%的DMEM、10X的FBS、0.lmM非必需氨基酸、100U/mL青霉素、1000U/mL鏈霉素、0.2X兩性霉素B抗真菌劑的lmL生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。就顯微圖像而言，在24孔板中制備具有體積為0.5mL的包封有hMSC的絲凝膠，并在lmL相同生長培養(yǎng)基和與上述相同的條件下培養(yǎng)，并且在需要的時(shí)間點(diǎn)拍攝圖像。實(shí)施例8.包封于絲凝膠中的hMSC的分析相差顯微技術(shù)_在培養(yǎng)的第2、6、14和21天，通過裝配有索尼ExwaveHAD3CCD彩色攝像機(jī)的相差光學(xué)顯微鏡(CarlZeiss，耶拿，德國)監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞增殖-用DNA測試對細(xì)胞增殖進(jìn)行評價(jià)。簡言之，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，將每組的4個(gè)凝膠塊用pH7.4的PBS沖洗并稱重(濕重)，然后在冰中用顯微手術(shù)剪來切碎。按照制造商的說明書，利用PicoGreen試驗(yàn)(MolecularProbes,Eugene,OR)測定DNA含量(N=4)。以480nm的激發(fā)波長和528nm的發(fā)射波長利用熒光測定法測定樣品。根據(jù)在相同試驗(yàn)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA含量，并進(jìn)一步用每個(gè)凝膠塊的濕重來進(jìn)行歸一化。細(xì)胞生存能力用存活_死亡測試(MolecularProbes,Eugene,OR)檢驗(yàn)hMSC在凝膠塊中的生存能力。簡言之，在培養(yǎng)末期，用PBS沖洗接種有hMSC的每組凝膠塊，切成兩個(gè)等分，并在37t:下于處于PBS中的2mM鈣黃綠素AM(染色活細(xì)胞)和4mM乙錠均二聚體(EthD-l，染色死細(xì)胞)內(nèi)培養(yǎng)30分鐘。用帶有Lasersharp2000軟件(激發(fā)/發(fā)射495nm/515nm)的共焦點(diǎn)顯微鏡(Bio-RadMRC1024，Hercules,CA)對所切凝膠的橫截面進(jìn)行拍照。從一系列水平斷面中獲得深度投影顯微照片，其根據(jù)清晰的細(xì)胞群的總高度在彼此不同的距離上拍照(1Pm-10ym增量)。獲取各種深度的靜止圖像，并且隨后將一系列顯微照片組合成"Z軸疊加(z-stacked)"編輯的圖像。組織學(xué)將接種過細(xì)胞的絲凝膠用PBS進(jìn)行沖洗，并在組織學(xué)分析之前于10%中性緩沖福爾馬林中固定2天。通過一系列梯度的乙醇將樣品脫水并包埋在石蠟中，然后以5mm厚度切片。對于組織學(xué)評價(jià)，將切片除去石蠟，通過一系列梯度的乙醇再水化，然后用蘇木精和曙紅(服E)進(jìn)行染色。實(shí)施例9.統(tǒng)計(jì)利用Studentt_檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)卯O.05時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異；當(dāng)ppO.01時(shí)，認(rèn)為具有高度顯著性差異。權(quán)利要求一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法，所述方法包括將絲纖蛋白進(jìn)行處理，所述處理包括超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化，其中，在所述超聲處理后不超過24小時(shí)形成實(shí)質(zhì)上的絲纖蛋白凝膠化。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述超聲處理后不超過兩個(gè)小時(shí)形成所述絲纖蛋白凝膠化。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述超聲處理后大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，所述絲纖蛋白經(jīng)歷凝膠化。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述處理進(jìn)一步包含鹽溶液。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述鹽溶液包含選自于由鉀離子、鈣離子、鈉離子、鎂離子、銅離子、鋅離子及其組合所組成的組的離子。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述絲纖蛋白處于大約pH4或更低的水溶液形式或者大約pH7.5或更高的水溶液形式。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述的鹽為鉀鹽，所述鹽濃度低于lOOmM，并且所述鹽濃度的pH為大約pH4或更低。8.—種控制絲纖蛋白膠凝時(shí)間的方法，所述方法通過將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理足夠長的一段時(shí)間以起始凝膠化，其中，在大約兩個(gè)小時(shí)內(nèi)，所述絲纖蛋白經(jīng)歷實(shí)質(zhì)上的凝膠化。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在所述超聲處理后大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，所述絲纖蛋白經(jīng)歷凝膠化。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，通過所述超聲處理的振幅和所述絲纖蛋白溶液的濃度來控制所述膠凝時(shí)間。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述處理進(jìn)一步包含鹽溶液。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，通過所述絲纖蛋白溶液的濃度和所述鹽溶液的濃度來控制所述膠凝時(shí)間。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述絲纖蛋白的濃度是4wt^或更低，所述鹽溶液包含鉀離子，并且所述鉀鹽溶液的濃度范圍為20mM至100mM。14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，通過所述鹽溶液的濃度和pH控制所述膠凝時(shí)間。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述鹽溶液包含鉀離子，所述鉀鹽溶液的濃度范圍為20mM至100mM，并且所述溶液的pH為pH4或更低。16.—種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法，所述方法包括將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理一段時(shí)間以起始凝膠化；以及在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實(shí)質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述藥劑為治療劑或生物材料或以上兩者。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述藥劑為選自于由細(xì)胞、蛋白、肽、核酸、PNA、適配子、抗體、激素、生長因子、細(xì)胞因子、酶、抗生素化合物及其組合所組成的組中的至少一種生物材料。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述細(xì)胞為干細(xì)胞。20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，將細(xì)胞生長培養(yǎng)基隨所述生物材料引入絲纖蛋白。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述藥劑為治療劑，所述治療劑選自于由小分子、藥物及其組合所組成的組。22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述的絲纖蛋白包封的生物材料適用于生物遞送裝置。23.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，實(shí)質(zhì)上的凝膠化發(fā)生在大約2小時(shí)內(nèi)。24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，實(shí)質(zhì)上的凝膠化發(fā)生在大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)。25.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述處理進(jìn)一步包含鹽溶液。26.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述絲纖蛋白處于大約pH4或更低的水溶液形式或者大約pH7.5或更高的水溶液形式。27.—種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法，所述方法包括將所述藥劑引入絲纖蛋白溶液；以及將絲纖蛋白溶液進(jìn)行超聲處理一段時(shí)間以起始凝膠化，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述藥劑為治療劑，所述治療劑選自于由小分子、藥物及其組合所組成的組。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，實(shí)質(zhì)上的凝膠化發(fā)生在大約2小時(shí)內(nèi)。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，實(shí)質(zhì)上的凝膠化發(fā)生在大約五分鐘到大約兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)。全文摘要本發(fā)明提供了一種通過超聲處理快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。在適當(dāng)?shù)臈l件下，在超聲處理之后兩個(gè)小時(shí)內(nèi)控制凝膠化發(fā)生。可將包括活細(xì)胞在內(nèi)的生物材料或治療劑包封于本方法所制備的水凝膠中，并用作遞送載體。文檔編號A61K35/24GK101772348SQ200880100926公開日2010年7月7日申請日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者喬恩·克盧格,加里·G·萊斯克,戴維·L·卡普蘭,王曉沁申請人:塔夫茨大學(xué)信托人