專利名稱：：人cd20的人抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對人CD20特異性的人抗體和抗體片段、藥物組合物及其治療方法。相關(guān)
背景技術(shù)：
：⑶20(也稱為人B-淋巴細胞限制性分化抗原或Bp35；B-淋巴細胞表面抗原Bi、Leu-16、BM5和LF5)是在前體B淋巴細胞和成熟B淋巴細胞上表達的分子量為_35kD的疏水跨膜蛋白(Valentine等人，(1989)JBiolChem264:11282；Einfield等人，(1988)EMBOJ7:711-717)。人CD20的氨基酸序列顯示在SEQIDNO1(基因文庫登錄號NP_690605)?？?CD20抗體描述在，例如，US5,736,137,WO2004/056312和US2004/0167319。生產(chǎn)對人的治療有用的抗體的方法包括產(chǎn)生嵌合抗體和人化的抗體(見，例如，US6，949，245)。又見，例如，WO94/02602和US6，596，541描述了產(chǎn)生遺傳修飾的小鼠的方法，該小鼠能夠產(chǎn)生對于人治療有用的抗體。發(fā)明簡述在第一方面，本發(fā)明提供人抗體，優(yōu)選特異性結(jié)合人CD20的重組人抗體。這些抗體特征為特異性結(jié)合人⑶20和介導(dǎo)殺死表達⑶20的B淋巴細胞?？贵w可以是全長的(例如，IgGl或IgG4抗體)或可能僅包含抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab，)2或scFv片段)，且可以被修飾以影響其功能性，例如，消除或增強殘留的效應(yīng)功能(Reddy等人，(2000)J.Immunol.1641925—1933)?？贵w或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合人CD20，能夠在補體存在下誘導(dǎo)表達CD20的細胞的補體依賴細胞毒性(CDC)，其中濃度為約IOnM或更少的抗體在具有補體的5%正常人血清存在下誘導(dǎo)50%的Daudi和RL細胞的裂解。在優(yōu)選的實施方案中，誘導(dǎo)50%裂解的抗體濃度是約5nM或更少；約2nM或更少；或約InM或更少。在一個實施方案中，該抗體或其片段在Daudi細胞中測量的顯示EC5tl為0.2nM或更少，或由RL細胞測量的顯示EC5tl為0.4nM或更少。在多個實施方案中，在人淋巴瘤的小鼠模型中，相對于對照處理的動物，抗體或抗體片段能夠增加無癥狀存活時間約2倍至約9倍或更多。抗體或其片段特異性結(jié)合人CD20且能夠在外周血單核細胞(PBMC)存在下誘導(dǎo)表達CD20的細胞的抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，其中如在Daudi細胞中測量的，抗體呈現(xiàn)EC50約為InM或更少。在優(yōu)選的實施方案中，抗體呈現(xiàn)的EC5tl為約50pM或更少；約20pM或更少；約IOpM或更少。在優(yōu)選的實施方案中，呈現(xiàn)增強的ADCC活性的抗體可能包含減少水平的巖藻糖基化，例如約5%巖藻糖。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體的抗原結(jié)合部分包含重鏈可變區(qū)(HCVR)序列，選自SEQIDNO:3、19、23、27、43、47、51、67、71、75、91、95、99、115、119、123、139、143、147、163、167、171、187、191、195、211、215、219、235、239、243、259、263、267、283、287、291、307、311、315、331、335、339、355、359、363、379、383、387、395和403，或其基本相似的序列。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或片段包含選自SEQIDNO:339、195和243的HCVR序列。在更具體的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段還包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)序列，選自SEQIDNO:11、21、25、35、45、49、59、69、73、83、93、97、107、117、121、131、141、145、155、165、169、179、189、193、203、213、217、227、237、241、251、261、265、275、285、289、299、309、313、323、333、337、347、357、361、371、381和385，或其基本相似的序列。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或片段包含的LCVR選自SEQIDNO:347、203和251。在具體的實施方案中，抗體或其片段包含的HCVR/LCVR序列對選自SEQIDNO:3/11,19/21,23/25,27/35,43/45,47/49,51/59,67/69,71/73,75/83,91/93,95/97,99/107、115/117、119/121、123/131、139/141、143/145、147/155、163/165、167/169、171/179、187/189、191/193、195/203、211/213、215/217、219/227、235/237、239/241、243/251、259/261、263/265、267/275、283/285、287/289、291/299、307/309、311/313、315/323、331/333、335/337、339/347、355/357、359/361、363/371、379/381和383/385。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或其片段包含的HCVR/LCVR序列對選自SEQIDNO=339/347,195/203和243/251。在第二方面，本發(fā)明提供編碼抗體或其片段的分離的核酸分子。在具體的實施方案中，核酸分子編碼HCVR，其中核酸序列選自SEQIDNO:2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、394和402，或其基本相同的序列。在有關(guān)方面，本發(fā)明提供編碼LCVR的分離的核酸分子，其中核苷酸序列選自SEQIDNO:10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380和384，或其基本相同的序列。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或抗體片段分別包含由選自SEQIDNO:338、194和242的核酸分子編碼的HCVR，和由選自SEQIDNO:346、202和250的核酸分子編碼的LCVR。在第三方面，本發(fā)明涉及抗體或其抗原結(jié)合片段包括包含選自SEQIDN0:9、33、57、81、104、129、153、177、201、225、249、273、297、321、345、369、393、401和409的氨基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和包含選自SEQIDNO:17、41、65、89、113、137、161、185、209、233、257、281、305、329、353和377的氨基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或其片段包含的HCDR3和IXDR3序列選自HCDR3/IXDR3序列對SEQIDNO:345/353、201/209和249/257。在更具體的實施方案中，抗體或其片段還包含選自SEQIDNO:5、29、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、397和405的重鏈CDRl(HCDRl)結(jié)構(gòu)域序列；選自SEQIDNO:7、31、55、79、103、127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、399和407的重鏈CDR2(HCDR2)結(jié)構(gòu)域序列；選自SEQIDNO:13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、349和373的輕鏈CDRl(LCDRl)結(jié)構(gòu)域序列；和選自SEQIDNO:15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351和375的輕鏈CDR2(LCDR2)結(jié)構(gòu)域序列。在優(yōu)選的實施方案中，抗體或其片段包含重鏈和輕鏈CDR序列，分別選自SEQIDNO:341、343、345、349、351和353；197、199、201、205、207和209；以及245、247、249、253、255和257。在第四方面，本發(fā)明特征為編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的分離的核酸分子，其中編碼HCDR3結(jié)構(gòu)域和IXDR3結(jié)構(gòu)域的核酸分子分別選自SEQIDNO9和16；33和41；57和65；81和89；104和113；129和137；153和161；177和185；201和209；225和233；249和257；273和281；297和305；321和329；345和353；以及369和377。在第五方面，本發(fā)明特征為包含HCDR3結(jié)構(gòu)域和IXDR3結(jié)構(gòu)域的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該HCDR3結(jié)構(gòu)域包含式Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQIDNO412)的氨基酸序列，其中X1=A、V或T;X2=K;X3=D;X4=P、F或G；X5=S或H;X6=Y;X7=G;X8=S或H;X9=G或F；X10=S或Y；X11=Y、N或S；X12=Y、G或H；X13=G、L或S；X14=Y、M或D；X15=Y、D或V；X16=G、V或缺失；X17=M或缺失；X18=D或缺失；X19=V或缺失；LCDR3結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO415)的氨基酸序列，其中X1=Q;X2=Q;X3=R或S;X4=N，Y或F；X5=N，D，或Y；X6=W;X7=P；X8=L;X9=Τ。在更具體的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段還包含重鏈和輕鏈⑶Rl和⑶R2結(jié)構(gòu)域，其中HCDRl結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQIDNO410)的氨基酸序列，其中X1=G;X2=F或I;X3=T;X4=F;Χ5=H、R或Y;X6=D;X7=Y;X8=T或A；HCDR2結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQIDNO411)的氨基酸序列，其中X1=I;X2=S;X3=W;X4=N;X5=S;X6=G或D;X7=S、Y或T;X8=I或L；LCDRl結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQIDNO413)的氨基酸序列，其中X1=Q;X2=S;X3=V或I;X4=S；X5=S或R;X6=Y或N；和LCDR2結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3(SEQIDNO414)的氨基酸序列，其中X1=E、G或V;X2=A;X3=S。在第六方面，本發(fā)明提供帶有本發(fā)明的核酸分子的重組表達載體，和其中這類載體已經(jīng)被引入的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞獲得的本發(fā)明的抗體或其片段的制備方法。該宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，優(yōu)選宿主細胞是大腸桿菌細胞或哺乳動物細胞，例如CHO細胞。在優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生的抗體可以具有不同量的巖藻糖基化。例如，可以選擇CHO細胞系以產(chǎn)生具有巖藻糖基化范圍從最小約5%至最大約95%的抗體或抗體片段。在第七方面，本發(fā)明特征為包含抗人⑶20抗體或其片段和可藥用載體的藥物組合物。在第八方面，本發(fā)明特征為能夠與人CD20結(jié)合的全人抗體或抗體片段，具有如通過細胞結(jié)合實驗測量的(描述如下)少于約IOnM的EC5tlt5在優(yōu)選的實施方案中，當通過結(jié)合至細胞表面存在的抗原測量時，本發(fā)明的抗體呈現(xiàn)的EC5tl為約10_8至約10_12M或更高，例如，至少1(Γ8Μ、至少1(Γ9Μ、至少1(T1QM、至少1(Γ"Μ、或至少1(Γ12Μ。本發(fā)明包括具有修飾的糖基化模式的抗CD20抗體。在一些應(yīng)用中，移去不期望的糖基化位點的修飾可能是有用的，或，例如，在寡糖鏈上存在缺少巖藻糖部分的抗體以增加抗體依賴的細胞毒性(ADCC)功能(見Shield等人，(2002)JBC277:26733)。在其它應(yīng)用中，可以進行半乳糖苷化的修飾以修飾補體依賴的細胞毒性(CDC)。在第九方面，本發(fā)明特征為用于在人中消弱或抑制CD20介導(dǎo)的疾病或病癥的如上所述抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。在優(yōu)選的實施方案中，治療的疾病或病癥是非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性回腸炎、慢性淋巴細胞白血病、和炎性疾病。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明包括減弱或抑制人中CD20介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，包括施用治療有效量的如上所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段在制備用于在人中減弱或抑制CD20介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物制備中的用途。其它目標和優(yōu)點通過以下的詳述是顯而易見的。附圖簡述圖1.無癥狀存活曲線。顯示人Fc對照、對照抗體I和II，和抗體8G6-5、9D4_7、10F2-13和7E1-13的結(jié)果。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法和實驗條件，因為這些方法和條件可以改變。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語目的僅在于說明具體的實施方案，而非限制性的，因為本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求書限定。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同。盡管在對本發(fā)明的實施或測試中，可以使用與本文所描述的相似或等同的任何方法和材料，現(xiàn)仍對優(yōu)選方法和材料加以說明。定義術(shù)語“⑶20”包括由細胞天然表達的人⑶20的變體和同工型。本發(fā)明的抗體與CD20抗原的結(jié)合介導(dǎo)殺死表達CD20的細胞(例如，腫瘤細胞)?？梢砸远喾N方式產(chǎn)生殺死表達⑶20的細胞，包括表達⑶20細胞的補體依賴的細胞毒性(⑶C)、表達⑶20細胞的凋亡、表達CD20細胞的效應(yīng)細胞吞噬作用、或表達CD20細胞的效應(yīng)細胞抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。本文中使用的術(shù)語“抗體”，旨在指免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈用二硫鍵互聯(lián)的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域(CL1)。VH和VL區(qū)還可以再細分為高度可變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，分散在更保守的、稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域中。各VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，從氨基端到羧基端以下列順序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡單的“抗體部分”或“抗體片段”)，指保留了與抗原(例如hCD20)特異性結(jié)合能力的抗體的一個或多個片段。已證實抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段完成。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，為由VL、VH、CLl和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，為包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個F(ab)’片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature241:544_546)，由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分離的基因編碼，可以用重組方法將它們連接起來，使用合成接頭可以將它們制成單個連續(xù)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；見例如，Bird等人，(1988)Science242:423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85=5879-5883)。這樣的單鏈抗體也旨在涵蓋于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。單鏈抗體的其它形式，如雙抗體，也涵蓋于其中(見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444_6448)?！癈DR”或互補決定區(qū)為分散在更保守的、稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域中的高度可變區(qū)。在本發(fā)明的抗hCD20抗體或片段的不同實施方案中，F(xiàn)R可以與人種系序列相同，或可以經(jīng)過天然或人工修飾。本文中使用的術(shù)語“表面等離振子共振”指這樣的光學(xué)現(xiàn)象，其允許例如使用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB)，通過檢測生物傳感器基質(zhì)中的蛋白質(zhì)濃度變化來分析蛋白質(zhì)的實時相互作用。術(shù)語“表位”為抗原決定簇，其與抗體分子可變區(qū)中稱為互補位的特定抗原結(jié)合位點相互作用。單個抗原可以有不止一個表位。表位可以是構(gòu)象表位或線性表位。構(gòu)象表位由來自一個或多個線性多肽鏈的不同區(qū)段的空間上并列的氨基酸產(chǎn)生。線性表位由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產(chǎn)生的表位。在某些情況下，表位可以包括其他部分，如抗原上的糖類、磷酰基或磺?；?。當指核酸或其片段時，術(shù)語“實質(zhì)同一性”或“實質(zhì)上同一”表明，當以適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?，與另一核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，用任何眾所周知的序列同一性算法，如下文討論的FASTA，BLAST或Gap測定，核苷酸堿基的核苷酸序列同一性為至少約95%，更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或99%。當用在多肽上時，術(shù)語“實質(zhì)相似性”或“實質(zhì)上相似”指當兩個肽序列用如GAP或BESTFIT程序使用默認空位權(quán)重進行最佳比對時，具有至少95%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少98%或99%的序列同一性。優(yōu)選不相同的殘基位置的差別是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”指氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團)的另一氨基酸殘基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不會實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或多個氨基酸序列與彼此的差別在于保守取代的情況下，百分比或相似性程度可以由于取代的保守性而向上校正。做此調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307_331。側(cè)鏈具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸組的例子包括(1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)脂肪族羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；(3)含酰胺的側(cè)鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸_異亮氨酸，苯丙氨酸_酪氨酸，賴氨酸_精氨酸，丙氨酸_纈氨酸，谷氨酸_天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺?？蛇x地，保守替換為在Gormet等人，(1992)Science256:144345中公開的PAM250對數(shù)似然性矩陣具有正值的任何改變?！斑m度保守性”替換為在PAM250對數(shù)似然矩陣中具有非負值的任何改變。多肽的序列相似性通常用序列分析軟件進行測定。蛋白質(zhì)分析軟件使用對包括保守氨基酸取代的多種取代、缺失和其它修飾賦值的相似性測量方法來匹配相似序列。例如，GCG軟件包含程序如Gap和Bestfit，可用于以缺省參數(shù)測定密切相關(guān)的多肽之間的序列同源性或序列同一性，所述多肽如來自不同物種生物的同源多肽，或野生型蛋白和其突變蛋白。見例如GCG版本6.1。還可用FASTA以缺省或推薦的參數(shù)比較多肽序列，GCG版本6.1.中的程序FASTA(例如，F(xiàn)ASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同前)。當用本發(fā)明的序列與包含大量來自不同生物序列的數(shù)據(jù)庫相比較時，另一優(yōu)選算法是計算機程序BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN，使用缺省參數(shù)。見例如Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403_410和Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。術(shù)語“有效量”是其導(dǎo)致獲得特定說明的目的的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的濃度或量?？笴D20抗體或其抗體的抗原結(jié)合片段的“有效量”可以被經(jīng)驗性的確定。此外，“治療有效量”是有效獲得說明的治療效果的抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段的濃度或量。這一量也可以被經(jīng)驗性的確定。人抗體的制備產(chǎn)生人抗體的方法包括例如Veloclmmune(RegeneronPharmaceuticals)、XenoMouse技術(shù)(Green等人，(1994)NatureGenetics7:13_21；Abgenix公司)、“微小基因座(minilocus)”方法和噬菌體展示(見，例如，US5,545,807,US6,787,637)。Veloclmmime技術(shù)(US6，596，541)包含產(chǎn)生針對選定抗原的高特異性完全人抗體的方法。這一方法涉及建立轉(zhuǎn)基因小鼠，其基因組包含人重鏈和輕鏈可變區(qū)，其與小鼠內(nèi)源性恒定區(qū)基因座有效連接，從而小鼠響應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。分離編碼抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA，與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效連接。而后DNA在能夠表達完整人抗體的細胞中表達。在具體實施方案中，細胞為CHO細胞?？贵w可在治療上用于阻斷配體-受體相互作用或抑制受體組分相互作用，而不是通過補體結(jié)合(CDC)和參與抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)殺死細胞?？贵w的恒定區(qū)對抗體結(jié)合補體和介導(dǎo)細胞依賴性細胞毒作用的能力十分重要。因此，可依據(jù)是否期望抗體介導(dǎo)細胞毒作用而選擇抗體的同種型。人免疫球蛋白可以以與鉸鏈區(qū)異質(zhì)性相關(guān)的兩種形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含約150-160kDa的穩(wěn)定的四條鏈結(jié)構(gòu)，其中二聚體通過鏈間的重鏈二硫鍵結(jié)合在一起。在第二種形式中，二聚體不通過鏈間的二硫鍵連接，并且形成約75-80kDa的分子，其包含共價偶聯(lián)的輕鏈和重鏈(半抗體)。即使在親和純化之后，也極其難以分離這些形式。第二種形式在多種完整IgG同種型中出現(xiàn)的頻率是由于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。事實上，人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)中單個氨基酸取代可顯著減少第二種形式的出現(xiàn)(Angal等人，(1993)MolecularImmunology30:105)，減少至使用人IgGl鉸鏈時通常觀察到的水平。本發(fā)明包含在鉸鏈、CH2或CH3區(qū)具有一個或多個突變的抗體，其在例如制備中可期望提高期望抗體形式的產(chǎn)量。本發(fā)明的抗體優(yōu)選用Veloclmmime技術(shù)制備。用目的抗原攻擊這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠其中內(nèi)源免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)被替換為相應(yīng)的人可變區(qū)，從表達抗體的小鼠中回收淋巴細胞(如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞系融合以制備永生的雜交瘤細胞系，篩選和選擇這樣的雜交瘤細胞系，以鑒定生產(chǎn)特異于目的抗原的抗體的雜交瘤細胞系?？煞蛛x重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼DNA，與重鏈和輕鏈的期望的同種型恒定區(qū)相連?？稍诩毎校鏑HO中制備這樣的抗體蛋白。備選地，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA可直接從抗原特異性淋巴細胞中分離。通常，當通過結(jié)合至細胞表面呈現(xiàn)的抗原測量時，本發(fā)明的抗體具有高度親和力，通常具有從約10_8至約IO-12M或更高，例如，至少10_8M、至少10_9M、至少ΙΟ,Μ、至少IiT11M或至少ICT12M的Kd或EC5tl。最初，分離具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的高親和力嵌合抗體。如下所述，表征和選擇具有包括親和力、選擇性、表位等期望特征的抗體。用期望的人恒定區(qū)替代小鼠恒定區(qū)以產(chǎn)生本發(fā)明的全人抗體，例如野生型或修飾的IgGl或IgG4(例如，SEQIDNO:416、417、418)。盡管選擇的恒定區(qū)可以根據(jù)具體用途而改變，但高親和性抗原結(jié)合和靶標特異性特征存在于可變區(qū)中。表位作圖和相關(guān)技術(shù)為篩選與特定表位結(jié)合的抗體，可使用常規(guī)交叉封閉測定法(cross-blockingassay),如在Antibodies:ALaboratoryManual1988ColdSpringHarborLaboratory(Harlow和Lane編著)中描述的方法。其它方法包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443_63)、或肽切割分析，如下文實施例所述。此夕卜，可使用諸如表位切除、表位提取和抗原的化學(xué)修飾(Tomer(2000)ProteinScience9487-496)等方法。為了確定抗體的結(jié)合特征，構(gòu)建由選擇的氨基酸替代組成的突變體CD20蛋白質(zhì)。突變體CD20蛋白質(zhì)含有相應(yīng)于用在小鼠蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的氨基酸對在人蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的某些氨基酸的替代。這一方法幫助確保突變體CD20蛋白質(zhì)保持其三級結(jié)構(gòu)并假定保持其任何構(gòu)象表位。通過FACS測量，將測試抗體對這些突變體⑶20蛋白質(zhì)的結(jié)合與對照(已知的)CD20抗體的結(jié)合進行比較。本發(fā)明的抗體都不呈現(xiàn)與任意對照抗體相同的結(jié)合譜(就每個突變體而言)。免疫綴合物本發(fā)明包括綴合于治療部分，例如，細胞毒素、化學(xué)治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素的人抗CD20單克隆抗體(“免疫綴合物”)。細胞毒素劑包括對細胞有害的任何物質(zhì)。形成免疫綴合物的適合的細胞毒性劑和化學(xué)治療劑的實例是本領(lǐng)域公知的，見例如，WO05/103081。雙特異性本發(fā)明的抗體可以是單一特異性的、雙特異性的或多特異性的。多特異性抗體可以是對一個靶標多肽的不同表位特異性的或可能含有對超過一個靶標多肽特異性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。見，例如，Tutt等人，(1991)J.Immunol.147:60-69。人抗⑶20抗體可以與另一功能分子連接或共表達，例如，另一肽或蛋白質(zhì)。例如，抗體或其片段可以被功能的連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其它)于一個或多個其它的分子實體，例如另一抗體或抗體片段，以產(chǎn)生具有第二結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性抗體。本發(fā)明的多特異性抗體可以特異性結(jié)合表達CD20的細胞和表達多肽，例如人Fc受體，和/或T細胞受體復(fù)合物的組分的人效應(yīng)細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體包含CD20結(jié)合部分和細胞因子。治療用途本發(fā)明的人抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、免疫綴合物和雙特異性分子在治療人疾病的治療方法中是有用的，所述疾病通過抑制表達CD20細胞的生長和/或殺死表達CD20的細胞而被抑制或減輕。本發(fā)明的治療方法的作用機制通過以下實現(xiàn)，包括在效應(yīng)細胞存在下殺死表達⑶20的細胞，例如，通過⑶C、凋亡、ADCC、吞噬作用，或通過兩個或多個這些機制的組合。實現(xiàn)本發(fā)明分子的治療效果的機制可能導(dǎo)致直接殺死或抑制表達CD20的細胞，或間接的通過抑制不表達CD20，例如表達結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞表面抗原(即，與相關(guān)的但是功能不同的細胞表面抗原沒有交叉反應(yīng)性)的細胞。可以使用本發(fā)明的人抗體抑制或殺死的表達⑶20的細胞包括，例如，致瘤B細胞。能夠用抗CD20抗體及其片段治療或減輕的疾病和病癥的實例包括，但不限于，致瘤疾病，例如B細胞淋巴瘤(NHL、前體B細胞成淋巴細胞白血病/淋巴瘤、成熟B細胞瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、B細胞早幼淋巴細胞性白血病、淋巴質(zhì)漿細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤、皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、多毛細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性障礙、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、和退行發(fā)育大細胞淋巴瘤)；免疫疾病，例如自身免疫疾病(銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、皮炎、系統(tǒng)性硬皮病和硬化、炎性腸病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征、腦膜炎、腦炎、眼色素層炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈粥樣硬化、白血病粘附缺陷、多發(fā)性硬化、雷諾綜合征、干燥綜合征、青少年糖尿病、賴特爾病、貝切特病、免疫復(fù)合物腎炎、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病)；免疫介導(dǎo)的血小板減少癥、急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、重癥肌無力、狼瘡腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、天庖瘡、格雷夫斯病、喬本氏甲狀腺炎、Wegener’s氏肉芽腫、Omerm’s綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV、和皰疹病毒相關(guān)的疾?。粐乐丶毙院粑狡染C合征和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎；由病毒，例如愛潑斯坦_巴爾病毒感染B細胞產(chǎn)生的疾病和紊亂。在具體的實施方案中，被施用抗體的受試者用化療劑、放射、或調(diào)節(jié)(增強或抑制)Fc受體的表達或活性的物質(zhì)，例如細胞因子額外的處理。通常，在治療期間施用的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素Y(IFN-γ)、和腫瘤壞死因子(TNF)。其中，典型的治療劑包括抗腫瘤物質(zhì)，例如，多柔比星、順鉬、博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、和環(huán)磷酰胺。治療施用和制劑本發(fā)明提高包含本發(fā)明的人抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的治療組合物應(yīng)該與合適的載體、賦形劑和被摻入制劑以提供改良的轉(zhuǎn)移、遞送、耐藥性等的其它物質(zhì)一起施用。通常，載體、賦形劑或其它物質(zhì)可以包括，例如，油(例如，蕓苔、棉籽、花生、紅花、芝麻、大豆)、脂肪酸及其鹽和酯(例如，油酸、硬脂酸、棕櫚酸)、醇(例如，乙醇、苯甲醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇，例如，PEG3350)、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、明膠、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、鹽(例如，氯化鈉)、琥珀酸及其鹽(例如，琥珀酸鈉)、氨基酸及其鹽(例如，丙氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、賴氨酸)、乙酸及其鹽或酯(例如，乙酸鈉、乙酸銨)、檸檬酸及其鹽(例如，檸檬酸鈉)、苯甲酸及其鹽、磷酸及其鹽(例如，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)、乳酸及其鹽、聚乳酸、谷氨酸及其鹽(例如，谷氨酸鈉)、鈣及其鹽(例如，氯化鈣、醋酸鈣)、苯酚、糖(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖)、赤蘚醇、阿糖醇、異麥芽酮糖醇(isomalt)、拉克替醇、麥芽糖醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、非離子型表面活性劑(例如，吐溫20、吐溫80)、離子型表面活性劑(例如，十二烷硫酸鈉)、三氯叔丁醇、DMS0、氫氧化鈉、甘油、間-甲酚、咪唑、魚精蛋白、鋅及其鹽(例如，硫酸鋅)、硫柳汞、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、羧甲基纖維素、三氯叔丁醇、和肝素。其它非治療物質(zhì)被描述于US7，001，892，特別在表A中。多種合適的配方可以在全部藥劑師公知的處方中找到=Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPubklishingCompany,Easton,Pa)。這些劑型包括，例如，粉劑、糊劑、膏劑、膠凍劑、臘類、油類、脂類、含脂(陽離子或陰離子)的囊泡(如Lip0fectinTM)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油乳劑和油包水乳劑、碳蠟(多種分子量的聚乙二醇)乳化劑、半固體凝膠劑、和含碳蠟的半固體混合物。只要制劑中的活性成份不由于配制失活，且制劑對于給藥路徑是生理相容和耐受的，任何上述混合物均可適合根據(jù)本發(fā)明的治療和療法。關(guān)于藥劑師所熟知的賦形劑和載體的額外信息，也見Powell等人，PDA(1998)JPharmSciTechnol.52:238_311和其中引述的文獻。治療組合物的劑量可以依賴于被施用的受試者的年齡和身材、靶標疾病、病癥、施用途徑等而改變。當在成人患者中使用本發(fā)明的抗體治療與CD20活性有關(guān)的多種病癥和疾病(包括非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性回腸炎、慢性淋巴細胞白血病、炎性疾病等)時，通常以單個劑量為約0.01至約20mg/kg體重，優(yōu)選約0.1至約10mg/kg體重，和更優(yōu)選約0.1至約5mg/kg體重，靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體是有利的。由病癥或疾病的嚴重性決定，可以調(diào)節(jié)治療的頻率和持續(xù)時間。在其它胃腸道外施用和口服施用中，可以以根據(jù)以上給出的劑量施用抗體。多種遞送系統(tǒng)是公知的，可以被用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如，包封在脂質(zhì)體中、微粒、微膠囊、能夠表達突變體病毒的重組細胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(見，例如，Wu等人，(1987)J.Biol.Chem.262=4429-4432)0引入的方法包括，但不限于，真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑?？梢酝ㄟ^任何方便的途徑施用組合物，例如通過輸注或團注，通過上皮或皮膚粘膜襯料(lining)吸收(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)和可以與其它生物活性物質(zhì)一起被施用。施用可以優(yōu)選是全身的或局部的。也可以以囊泡，特別是脂質(zhì)體遞送藥物組合物(見Langer(1990)Science2491527-1533)。在某些情況下，可以以控制釋放系統(tǒng)遞送藥物組合物。在一個實施方案中，可以使用泵(見Langer，同上；Sefton(1987)CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一實施方案中，可以使用聚合材料(見MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer禾口Wise(編輯)，CRCPres.，BocaRaton,Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance，Smolen禾口Ball(編，ffiley，NewYork(1984)在另一實施方案中，控制釋放系統(tǒng)可以被置于組合物靶標的鄰近，因此僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease,同上，卷2，115-138頁，1984)。可注射制劑可以包括靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射點滴輸注等劑型。可以通過公知的方法制備這些可注射的制劑。例如，可以例如通過在常規(guī)用于注射的無菌水介質(zhì)或油介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化以上抗體或其鹽來制備可注射的制劑。作為注射的水介質(zhì)，有例如生理鹽水、含有葡萄糖和其它輔劑的等滲溶液等，其可以與合適的增溶劑例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨醇80、HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩爾)加合物))等組合使用。作為油介質(zhì)，使用例如，芝麻油、大豆油等，其可以與增溶劑例如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。如此制備的注射劑優(yōu)選裝在合適的安瓿瓶中。有利的，以適合活性成分劑量的單位劑量形式制備以上所述口服或胃腸道外使用的藥物組合物。在單位劑量的這類劑量形式包括，例如，片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。含有的上述抗體的量通常是在單位劑量中每劑型約5至500mg；尤其是在注射劑形式中，優(yōu)選含有上述抗體約5至lOOmg，對于其它劑型在約10至250mg。實施例下列實施例意在為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物的完整公開和說明，而不是限制發(fā)明人所認為的本發(fā)明的范圍。就使用的數(shù)字(例如，量、溫度等)而言，已盡力確保精確，但應(yīng)說明有一定實驗誤差和偏差。除非另有說明，份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓力等于或接近大氣壓。實施例1.產(chǎn)生人⑶20的人抗體可以用領(lǐng)域內(nèi)任何公知的方法進行嚙齒類的免疫(見，例如，Harlow&Lane，編輯(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,NewYork;Malik禾口Li1Iehoj,Antibodytechniques:AcademicPress,1994,SanDiego)。在一個實施方案中，將表達CD20的細胞直接施用于小鼠，該小鼠具有編碼人Ig重鏈可變區(qū)和κ輕鏈可變區(qū)的DNA基因座(Veloclmmune，RegeneronPharmaceuticals,Inc.；US6,596，541)，與佐劑一同施用以刺激免疫應(yīng)答。這類佐劑可以包括完全的和不完全的弗氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(tǒng)(Sigma)、gRIBI(IfiH酉先■二月太)(B0'Hagan,VaccineAdjuvant,byHumanPress,2000，Totawa,NJ)。為了獲得細胞表面人⑶20的高表達水平，用編碼人⑶20的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠細胞系MG87和/或NS/0細胞，使用FACS技術(shù)富集表達高水平⑶20的細胞。在一個實施方案中，以含有⑶20基因的DNA質(zhì)粒間接施用⑶20，使用宿主蛋白質(zhì)表達體系表達⑶20體內(nèi)產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)。在兩種方法中，為了獲得最佳抗體免疫應(yīng)答，每34周給予小鼠加強注射。通過如下所述基于細胞的免疫測定監(jiān)測免疫應(yīng)答，其中免疫測定以1至3倍系列稀釋的血清樣品。血清滴定被定義為產(chǎn)生超過背景2倍測定信號的血清樣品的稀釋。當動物到達其最大免疫應(yīng)答時，收獲表達抗體的B細胞，與小鼠骨髓瘤融合以形成雜交瘤。實施例2.篩選抗原特異性雜交瘤在初步篩選中，用人⑶20基因轉(zhuǎn)染NS/0細胞(ATCC)，匯集高表達細胞(NS/0-hCD20細胞)，培養(yǎng)在用于篩選雜交瘤的條件培養(yǎng)基中，通常至融合之后約11至14天。將在具有10%胎牛血清的RPMI中的NS/0-h⑶20細胞以每孔50，000細胞密度鋪于96孔聚D-賴氨酸平板中。將雜交瘤條件培養(yǎng)基稀釋5倍和允許結(jié)合細胞30分鐘。然后用加入等體積的8%甲醛將細胞固定于平板20分鐘，繼之以四次連續(xù)的PBST洗滌。用5%BSA在室溫(RT)孵育平板2小時。洗滌之后，用HRP-綴合的山羊抗小鼠IgGFcy-特異性多克隆抗體孵育平板結(jié)合的抗體30分鐘，和在最后洗滌之后使用3.3’，5.5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(BDPharmigen)顯影平板。用等體積的IM磷酸終止HRP反應(yīng)。通過在450nm光密度測量抗體結(jié)合信號。使用不具有可檢測的CD20表達的NS/0親本細胞作為背景對照以排除具有非特異性細胞表面結(jié)合的雜交瘤上清液。對于NS/0親本細胞和表達CD20的細胞的均為陽性的孔被排除。實施例3.抗⑶20的人抗體的測序在測序之前，抗原特異性的雜交瘤細胞使用MOFLOtm流式細胞計進行單細胞亞克隆的。通過標準方法進行可變輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)的測序(見例如，US2004/0167319A1)。使用RNEASYtm試劑盒(Qiagen)從各個雜交瘤細胞系制備總RNA。使用SMARTRACEtmcDNA擴增試劑盒(Clonetech)制備cDNA。測序HCVR和LCVR的DNA序列，為選擇的抗體提供HCVR和LCVR的預(yù)測的氨基酸序列，所述選擇的抗體為(HCVR/LCVRSEQIDNO):3B9_10N(3/11)；3B9-10GSP(19/21)；3B9-10FGL(23/25)；9Cll-14N(27/35)；9C11-14GSP(43/45)；9C11-14FGL(47/49)；2B7-7N(51/59)；2B7-7GSP(67/69)；2B7-7FGL(71/73)；2C11-4N(75/83)；2C11-4GSP(91/93)；2Cll-4FGL(95/97)；3H7-6N(99/107)；3H7-6GSP(115/117)；3H7-6FGL(119/121)；5H2-17N(123/131)；5H2-17GSP(139/141)；5H2-17FGL(143/145)；6B9-4N(147/155)；6B9-4GSP(163/165)；6B9-4FGL(167/169)；6F6_1N(171/179)；6F6-1GSP(187/189)；6F6-1FGL(191/193)；8G6-5N(“8G6-5，，)(195/203)；8G6-5GSP(211/213)；8G6-5FGL(215/217)；9C3-8N(219/227)；9C3-8GSP(235/237)；9C3-8FGL(239/241)；9D4-7N(“9D4-7，，)(243/251)；9D4-7GSP(259/261)；9D4-7FGL(263/265)；9E4-20N(267/275)；9E4-20GSP(283/285)；9E4-20FGL(287/289)；9H4-12N(291/299)；9H4-12GSP(307/309)；9H4-12FGL(311/313)；10E3-17N(315/323)；10E3-17GSP(331/333)；10E3-17FGL(335/337)；10F2_13N(“10F2-13，，)(339/347)；10F2-13GSP(355/357)；10F2-13FGL(359/361)；7E1-13N(363/371)；7E1-13GSP(379/381)；7E1-13FGL(383/385)。實施例4.抗⑶20抗體的抗原結(jié)合特異性嵌合抗體被轉(zhuǎn)化為全人IgG之后，除了使用HRP綴合的山羊抗-hlgGFcγ-特異性多克隆作為檢測抗體和使用Daudi細胞系(其表達內(nèi)源CD20)作為抗原來源之外，使用與以上描述操作相似的ELISA操作確定特異性抗原結(jié)合特性。全部測試抗體以范圍從約0.4ηΜ至約20ηΜ的EC5tl值特異性結(jié)合于Daudi細胞。使用以下描述的流式細胞計用人⑶20轉(zhuǎn)染的MG87細胞檢驗全人抗⑶20抗體的抗原結(jié)合特異性。簡言之，用15個人抗體和兩個對照抗體各在4°C孵育親本MG87和人CD20-轉(zhuǎn)染的MG87細胞30分鐘，繼之與PE-綴合的抗人IgG抗體孵育。通過流式細胞計評估結(jié)合。同與親本細胞系和對照同種型配對樣本的結(jié)合比較熒光強度。結(jié)果總結(jié)在表1中。全部抗體結(jié)合于人⑶20-轉(zhuǎn)染的MG87細胞，而觀察到?jīng)]有結(jié)合至親本MG87細胞，說明該抗體是⑶20-特異性的。對照I嵌合(鼠/人)抗-⑶20mAb、利妥昔單抗、(RITUXAN，IDECPharmaceuticalsCorp.)；對照II人抗_CD20mAb，2F2，描述于WO2005/103081)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例5.人抗-⑶20抗體結(jié)合于人⑶20突變體使用Strategene誘變試劑盒通過用相應(yīng)小鼠氨基酸替代人⑶20氨基酸序列產(chǎn)生人⑶20突變體(表2)。然后將包含人⑶20突變體、CMV啟動子和潮霉素抗性基因-IRES-GFP標記的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染進入MG87細胞。對于各個人⑶20突變體，收集呈現(xiàn)高GFP表達的潮霉素抗性細胞集合，產(chǎn)生用于抗體結(jié)合測定的穩(wěn)定系。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>簡言之，從各表達人Cl)20突變體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系收集約IxIO6個細胞，用10μg/ml的各個抗人抗體在冰上孵育1小時，繼之用ομg/ml的APC-綴合的山羊抗人IgG(JacksonImmunolabs)在冰上孵育45分鐘。對于各個抗體，通過細胞流式計評估至各個人CD20突變體的結(jié)合。當門控呈現(xiàn)中間水平GFP表達的細胞的小群體(約20%)以最小化由于各個細胞系內(nèi)可變的CD20突變體表達水平產(chǎn)生的影響，評估平均熒光強度水平。對于各個CD20突變體，指定呈現(xiàn)最高平均熒光強度的抗體為100%結(jié)合。表3顯示各個抗CD20抗體與各個人CD20突變體的結(jié)合百分數(shù)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例6.補體依賴的細胞毒性(⑶C)潛能使用人淋巴瘤細胞系Daudi和RL作為靶標細胞系檢測抗人CD20人抗體促進補體依賴的細胞毒性(CDC)的能力?？贵w被系列稀釋(終濃度范圍50nM至0.85pM加緩沖液對照)至培養(yǎng)基中，加入到接種在96孔平板的靶標細胞。將具有補體成分(Quidel)的人血清加入各個孔以給出5%的終血清濃度。將細胞與檢測抗體和具有補體成分的人血清在37°C孵育2小時，然后通過ALAMARBLLETM檢測細胞存活。使用激發(fā)波長560nm和發(fā)射波長590nm測量熒光(表4).表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例7.人抗CD20抗體的功能解離率(Off-Rate)在⑶C測定中分析抗⑶20mAb的解離率。以分開的3組執(zhí)行該實驗。在每組內(nèi)，在時間0、1和6小時確定5個抗體相對于對照I和II的細胞裂解的百分數(shù)。通過將2μg的各個抗體與IO6Daudi細胞孵育45分鐘(RT)使抗體結(jié)合于細胞。在零時間點，洗滌細胞并立即在含有20%正常人血清補體的100μ1培養(yǎng)基中重懸，然后在37°C，5%CO2孵育45分鐘。對于1和6小時時間點，在抗體結(jié)合之后洗滌IO6細胞，重懸在15mlFalcon管內(nèi)的12ml新鮮培養(yǎng)基中，分別在機械倒相器(inverter)中孵育1和6小時。細胞在選擇的時間點結(jié)束時被洗滌，在含有20%正常人血清補體的培養(yǎng)基中孵育，孵育45分鐘。血清孵育之后，將7-氨基-放線菌素D(7AAD)加入各個樣品在室溫孵育15分鐘以評估細胞存活力。通過設(shè)定區(qū)域為相對于代表7AAD陽性和陰性細胞的7AAD二維散射圖的前向散射，碎片排除在兩個區(qū)域外，在各個時間點確定細胞毒性百分數(shù)。繪制各個時間點的細胞毒性百分數(shù)為100減7AAD-陰性細胞百分數(shù)(表5-7)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例8.人抗⑶20抗體的生化解離率確定選擇的檢測抗CD20抗體的生化解離率并與對照抗體I和II進行比較。將兩個選擇的人抗體，對照I或II(各自2μg/ml)與106/ml的表達⑶20的Raji細胞在室溫孵育2小時。然后洗滌細胞，除去多余的抗體，在含有血清的培養(yǎng)基中重懸，在37°C孵育。在0、15、30、45、60、90、120和180分鐘的時間，移取Iml等分試樣的細胞，洗滌，用PE標記的抗hFc抗體染色，進行FACS分析。使用平均熒光強度(MFI)作為結(jié)合于細胞表面的抗體量的指示。通過設(shè)定時間零的結(jié)合百分數(shù)為100%，計算生化解離率。另外重復(fù)實驗5次，確定12個檢測抗體的生化解離率并與對照I和II比較(表8-13)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表11<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表12<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表13<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例9.抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)測定使用Daudi細胞(細胞來自內(nèi)源表達⑶20的人淋巴瘤細胞系)評估由選擇的人抗⑶20抗體誘導(dǎo)的ADCC。簡言之，將Daudi細胞(在50μ1中10，OOO細胞/孔)先與等體積的系列稀釋的人抗⑶20抗體混合，產(chǎn)生終抗體濃度范圍從0.169ρΜ至ΙΟηΜ，在96孔平板在室溫孵育10分鐘(對照=沒有抗體的孔)。單獨的，按照常規(guī)蔗聚糖_泛影葡胺梯度離心富集操作制備人外周血單核細胞(PBMC，效應(yīng)細胞)。富集的PBMC被收集、洗滌和鋪板在含有10%熱滅活的FBS、2mM谷氨酰胺和50ηΜβ-巰基乙醇的RPMI1640中。然后用5ng/ml人IL-2刺激細胞三天，在培養(yǎng)基中洗滌一次，然后直接用于ADCC測定中。將大約300,000PBMC加入抗體和靶標細胞的各個混合物中以給出效應(yīng)子比靶標細胞大約301的最終比率。然后孵育96孔平板4小時，在250xg離心。采集上清液，使用CYT0T0X96非放射細胞毒性測定系統(tǒng)(Promega)測定乳酸脫氫酶(LDH)活性(表14)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例10.使用人淋巴瘤異種移植小鼠模型研究抗CD20抗體的治療活性。使用人非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤異種移植小鼠模型對選擇的抗CD20抗體進行體內(nèi)效率研究。購買6周齡的雌性嚴重聯(lián)合型免疫缺陷(SCID)小鼠。適應(yīng)一周之后，將2.5百萬新鮮采集的Raji細胞(細胞來自人非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤細胞系)靜脈內(nèi)注射進入各個小鼠。然后在移植物植入3、6和9天之后通過側(cè)尾靜脈內(nèi)注射，用各自為10mg/kg的人FC(hFC)、對照I、對照II、8G6-5、9D4-7、10F2-13或7E1-13處理各個Raji細胞移入的小鼠。監(jiān)測小鼠時間長達180天。通過CO2窒息對呈現(xiàn)包括后肢癱瘓、惡病質(zhì)和偶然性巨大局部腫瘤物質(zhì)的疾病病征的小鼠進行安樂死。使用Kaplan-Meier方法構(gòu)建無癥狀存活曲線(圖1)。結(jié)果用作為無癥狀存活時間的函數(shù)的存活百分數(shù)表達。這些結(jié)果顯示，抗體10F2-13在動物模型中顯著增加存活時間，從約20天(hFc對照處理的動物)至約180天(存活率增長超過9倍)(50%的處理動物存活約20天(hFc對照)、約40天(對照I)、約85天(對照II)，和超過180天(10F2-13))。這些增加的存活時間是至少大2倍(相對于對照II)，大約4.5倍(相對于對照I)，或相對于hFc-處理的動物至少大約9倍或更多。權(quán)利要求人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合人CD20，能夠用約5nM或更少的抗體濃度誘導(dǎo)補體依賴細胞毒性(CDC)，能在人淋巴瘤的小鼠模型中相對對照處理的動物增加無癥狀存活時間約2倍至約9倍或更多，其中該抗體或抗體片段包含重鏈互補決定區(qū)3(HCDR3)和輕鏈CDR3(LCDR3)，其中HCDR3和LCDR3選自SEQIDNO345和353；201和209；以及249和257。2.人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合人CD20，能夠用約5nM或更少的抗體濃度誘導(dǎo)補體依賴細胞毒性(CDC)，其中抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)序列和輕鏈可變區(qū)(LCVR)序列，其中該HCVR禾口LCVR序列選自SEQIDNO339和347；195和203；以及243和251。3.權(quán)利要求1或2的人抗體或抗原結(jié)合片段，其中誘導(dǎo)CDC需要的抗體濃度是InM或更少。4.根據(jù)權(quán)利要求3的人抗體或抗原結(jié)合片段，特征還在于在Daudi細胞中測量呈現(xiàn)EC50為0.2nM或更少，或通過RL細胞測量EC5tl為0.4nM或更少。5.人抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人CD20，用RL或Daudi細胞測量，能夠用約5nM或更少的抗體濃度誘導(dǎo)補體依賴細胞毒性(CDC)，其包含重鏈互補決定區(qū)3(HCDR3)結(jié)構(gòu)域和輕鏈⑶R3(IXDR3)結(jié)構(gòu)域，其中該HCDR3結(jié)構(gòu)域包含式Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQIDNO412)的氨基酸序列，其中X1=A、V或T;X2=K;X3=D;X4=P、F或G；X5=S或H;X6=Y;X7=G;X8=S或H;X9=G或F；X10=S或Y；X11=Y、N或S；X12=Y、G或H；X13=G、L或S；X14=Y、M或D；X15=Y、D或V；X16=G、V或缺乏；X17=M或缺乏；X18=D或缺乏；X19=V或缺乏；和該LCDR3結(jié)構(gòu)域包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO415)的氨基酸序列，其中X1=Q;X2=Q;X3=R或S;X4=N、Y或F;X5=N、D或Y;X6=W;X7=P；X8=L;X9=Τ。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項的人抗體或抗原結(jié)合片段，當通過結(jié)合于細胞表面呈現(xiàn)的抗原測量時，其表征為呈現(xiàn)Kd或EC5tl為至少10_"Μ。7.核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求6的人抗體或抗體片段。8.表達載體，包含根據(jù)權(quán)利要求7的核酸分子。9.產(chǎn)生抗人CD20抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求8的表達載體引入分離的宿主細胞、在允許產(chǎn)生抗體和抗體片段的條件下生長細胞、和回收這樣產(chǎn)生的抗體或抗體片段的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該宿主細胞是大腸桿菌細胞、CHO細胞、或COS細胞。11.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段。12.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其用于消弱或抑制在人中的CD20介導(dǎo)的疾病或病癥。13.根據(jù)權(quán)利要求12的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其中治療的疾病或病癥選自非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性回腸炎、慢性淋巴細胞白血病和炎性疾病。14.消弱或抑制在人中CD20介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，包括施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。15.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，所述藥物用于在人中減弱或抑制CD20介導(dǎo)的疾病或病癥。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中治療的疾病或病癥是非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性回腸炎、慢性淋巴細胞白血病和炎性疾病。全文摘要特異性結(jié)合人CD20的人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，能夠誘導(dǎo)補體依賴的細胞毒性(CDC)，在人淋巴瘤的小鼠模型中相對于對照處理的動物能夠增加無癥狀存活時間在約2倍至約9倍或更多?？贵w或其抗原結(jié)合片段在處理CD20介導(dǎo)的疾病或病癥的治療方法中是有用的，所述疾病或病癥例如非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性回腸炎、慢性淋巴細胞白血病和炎性疾病。文檔編號A61K39/395GK101809037SQ200880109581公開日2010年8月18日申請日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者E·M·阿利松,J·H·馬丁,L-H·王,S·史蒂文斯申請人:瑞澤恩制藥公司