專利名稱：諾孕酯作為trpc3、trpc6和trpc7離子通道選擇性抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及諾孕酯作為TRPC3/6/7離子通道亞家族成員的選擇性抑制劑的用途， 其能夠藥理學(xué)區(qū)分所述亞家族成員和其他TRPC亞家族成員。本發(fā)明還涉及諾孕酯在細(xì)胞 模型、組織或動(dòng)物模型中鑒定、表征和調(diào)節(jié)TRPC離子通道的用途。
背景技術(shù)：
TRPC通道是在人體組織中廣泛表達(dá)的非特異性陽離子通道(MOntell2005)。它 們首次在果蠅(DrOSOphila)TRP的哺乳動(dòng)物同源物中被發(fā)現(xiàn)(Wes等，1995，Zhu等，1995)。 被稱為TRPC1-7的7個(gè)蛋白構(gòu)成典型的(或經(jīng)典的)最接近原型果蠅TRP的TRP亞家族 (30-40% 同一性，Okuhara 等，2007)。基于氨基酸序列同源性、組織分布和功能相似性，TRPC可以細(xì)分成四組(Clapham 等，2001 ；Montell, 2001)。作為TRPC家族中獨(dú)特的部分，TRPCl和TRPC2本身各構(gòu)成一個(gè) 亞家族，而TRPC4和-5則合并，就像TRPC3、-6和-7 —樣。密切相關(guān)的TRPC3、TRPC6和 TRPC7通道有著共同的活化機(jī)制，二酰甘油已被確定為其內(nèi)源性配體(DAG) (Hofmarm等， 1999 ；Okada 等，1999)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，在2005年全球有30%的死亡是由各種心血管疾病引起的。因 此，對(duì)能預(yù)防和治療心血管疾病的新藥物有巨大的醫(yī)療需求。TRPC通道被認(rèn)為是包括心肌 病、血管重塑、高血壓和高內(nèi)皮通透性等一些心血管病變的新藥開發(fā)的重要的藥理學(xué)靶點(diǎn) (Dietrich 等，2007)。但迄今為止，還存在許多關(guān)于其天然組成和活化機(jī)制、生理功能及其在病理生理 和疾病中的作用等懸而未決的問題。由于它們廣泛而且部分重疊的分布、潛在的雜多聚化、 相似的電生理特性、缺乏明確追蹤這些通道的化合物工具，原位鑒定天然TRPC通道是復(fù)雜 的(Moran 等，2004)。已知TRPC有機(jī)抑制劑如2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB) (Xu等，2005)，SKF 96365 (Boulay 等，1997 ；Zhu 等，1998)和 BTP2 (He 等，2005)，以及無機(jī)阻斷劑如 GcT 和 La3+ 都沒有足夠有效性和特異性(Li等，2004)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中的研究已經(jīng)證明對(duì)解開某些TRPC可能的生理學(xué)功能有重要價(jià)值 (Freichel等，2001)。但是這些模型系統(tǒng)不能為7個(gè)哺乳動(dòng)物TRPC通道中的每一個(gè)存在， 到目前為止，其生成和分析是消耗時(shí)間和成本的，并且它們也有局限性，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀资艿?密切相關(guān)通道的補(bǔ)償效應(yīng)(Dietrich等，2005c)。因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種新的藥理學(xué)工具，能夠在TRPC亞家族之間和內(nèi)部 有所區(qū)分。從而能夠闡明在生理和病理生理?xiàng)l件下不同通道的作用。根據(jù)本發(fā)明，這是通過用諾孕酯選擇性抑制TRPC3、TRPC6和TRPC7實(shí)現(xiàn)的。因而， 諾孕酯能夠藥理學(xué)區(qū)分屬于不同TRPC亞家族的通道。此外，諾孕酯不會(huì)干擾在許多細(xì)胞中 介導(dǎo)TRPC通道活化的普通G蛋白偶聯(lián)受體、Gq、磷脂酶Ci3通路。這些特性使得諾孕酯成 為鑒定和調(diào)節(jié)TRPC3、TRPC6和TRPC7的優(yōu)選工具。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)主題是針對(duì)諾孕酯作為TRPC離子通道的選擇性抑制劑的用途。通過諾孕酯被選擇性抑制的TRPC離子通道優(yōu)選為TRPC3、TRPC6或TRPC7。諾孕酯可用于在 體外和體內(nèi)選擇性抑制TRPC離子通道。特別的，諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族成員的有效力至少是對(duì)TRPC4/5亞家族成員 的4倍(圖1和2)。諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族成員與對(duì)TRPC4/5亞家族成員相比4倍的 有效力是通過熒光測量、并且基于10 μ M諾孕酯計(jì)算出的抑制作用測定的。這些熒光測量通過全細(xì)胞形態(tài)中膜片鉗記錄的方法進(jìn)行例示性驗(yàn)證(圖3)。作為一種TRPC3，TRPC6和TRPC7的選擇性抑制劑，諾孕酯可用作一種藥理學(xué)工具， 能夠表征屬于不同TRPC亞家族的通道，區(qū)分TRPC3/6/7亞家族成員和其他TRPC離子通道 亞家族成員(圖1，2和3)。作為這樣一種抑制劑，諾孕酯可進(jìn)一步用作一種開發(fā)和驗(yàn)證測定法的工具化合 物，以測量有關(guān)離子通道的活性。這種測定法的一個(gè)實(shí)例如圖1所示。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)在生理和病生理?xiàng)l件下，諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族 成員和TRPC4/5亞家族成員各自進(jìn)行通道功能的示差分析的用途。這個(gè)可以像實(shí)施例中描 述的那樣做到。該分析可以在細(xì)胞、組織或動(dòng)物中進(jìn)行。動(dòng)物可為嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠或 大鼠。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，諾孕酯對(duì)天然TRPC的調(diào)節(jié)能夠使用A7r5細(xì)胞系進(jìn)行研究， 其中A7r5細(xì)胞系是用于研究內(nèi)源性表達(dá)的TRPC離子通道的驗(yàn)證模型系統(tǒng)。實(shí)施例和圖4 中給出了這種優(yōu)選測定系統(tǒng)的進(jìn)一步詳情。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)測定諾孕酯對(duì)TRPC通道活性影響的方法，優(yōu)選TRPC 離子通道為TRPC3，TRPC6和TRPC7。一般來說，表達(dá)TRPC離子通道的細(xì)胞與諾孕酯相接觸，并且測量或檢測諾孕酯對(duì) TRPC離子通道活性的影響。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)鑒定TRPC離子通道調(diào)節(jié)劑的方法，優(yōu)選TRPC離子通 道為 TRPC3、TRPC6 和 TRPC7。一般來說，表達(dá)TRPC離子通道的細(xì)胞與測試化合物相接觸，并且測量或檢測測試 化合物對(duì)TRPC離子通道活性的影響。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述方法中使用的細(xì)胞為熒光細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞為MDCK, HEK 293，HEK 293T, BHK, COS, NIH3T3, Swiss3T3 或CHO細(xì)胞，特別是HEK293細(xì)胞。TRPC通道的活性能夠通過例如膜片鉗技術(shù)、全細(xì)胞電流、放射性標(biāo)記離子流，或特 別是熒光(例如使用電壓敏感染料或離子敏感染料)，測量或檢測離子流特別是Ca2+離子流 的變化來進(jìn)行測量或檢測(Vestergarrd-Bogind 等(1988)，J. Membrane Biol. ,88 :67_75 ； Daniel 等(1991) J. Pharmacol. Meth. 25 185-193 ；Hoevinsky 等(1994) J. Membrane Biol.， 137 59-70 ；Ackerman 等(1997), New Engl.J. Med. ,336 1575-1595 ；Hamil 等(1981)， Pf lugers. Archiv.，391 :185)。TRPC離子通道活性測定的一個(gè)實(shí)例為包含以下步驟的測定法(a)接觸表達(dá)TRPC離子通道的熒光細(xì)胞；
(b)在熒光細(xì)胞接觸帶有調(diào)節(jié)劑或測試化合物之前、同時(shí)或之后，使用通道活化劑刺激Ca2+內(nèi)流，并且(c)測量或檢測熒光變化。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)描述諾孕酯對(duì)TRPC通道的選擇性的方法，包含評(píng)估 諾孕酯抑制TRPC通道活性的能力，以及比較諾孕酯在不同TRPC亞家族之間和內(nèi)部的抑制 效力。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)諾孕酯在制備治療心血管疾病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬 化、晚期腎衰竭、神經(jīng)疾病、慢性疼痛、急性疼痛或炎性疾病的藥物中的用途。諾孕酯可用使用一種或多種可藥用載體或助劑配制。可藥用載體或助劑為例如生 理緩沖溶液如氯化鈉溶液，脫礦水，穩(wěn)定劑如蛋白酶或核酸酶抑制劑，或螯合劑如EDTA。本發(fā)明的另一個(gè)主題是針對(duì)治療心血管疾病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、晚期腎衰 竭、神經(jīng)疾病、慢性疼痛、急性疼痛或炎性疾病的方法，包括對(duì)患者給藥治療有效量的包含 諾孕酯的組合物。發(fā)明詳述本發(fā)明內(nèi)容中的術(shù)語〃 TRPC離子通道〃或〃 TRPC"是指可通透Ca2+的非選擇 性陽離子通道。它是指下面瞬時(shí)受體電位典型離子通道列表中的任何一個(gè)TRPC1，TRPC2， TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6 和 TRPC7。特別優(yōu)選是 TRPC3，TRPC6 和 / 或 TRPC7。這種TRPC離子通道可以來源于任何脊椎動(dòng)物，并且特別是哺乳動(dòng)物類(例如狗、 馬、牛、小鼠、大鼠、犬、兔、雞、類人猿、人或其他)。TRPC能夠從這種脊椎動(dòng)物生物體的組織 探測劑中分離，或是通過能夠表達(dá)TRPC蛋白質(zhì)的重組生物材料的方法制造。這個(gè)術(shù)語可以指天然多肽、多態(tài)變異體、突變體，以及種間同系物?！爸Z孕酯”也被稱為其化學(xué)名稱D-17i3-乙酰氧基-B-乙基-17 α 乙 ^ - ii -4- M -3- M 月虧(D-17. beta. -acetoxy-B-ethyl-17. alpha. ethinyl-gon-4-en-3-one oxime)。其為一種孕激素，是自然產(chǎn)生的女性性激素孕酮的合成 形式。諾孕酯在現(xiàn)有技術(shù)中用于激素避孕藥的組合物。在本發(fā)明中，諾孕酯用作TRPC3，TRPC6和TRPC7的選擇性抑制劑。本發(fā)明內(nèi)容中的術(shù)語“選擇性抑制劑”是指抑制劑例如諾孕酯在抑制一個(gè)或多個(gè) TRPC家族成員時(shí)比對(duì)一個(gè)或多個(gè)其他成員具有更高效率的效力。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中， 諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族比對(duì)TRPC4/5亞家族更有效。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，諾 孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族的有效力至少是對(duì)TRPC4/5亞家族的4倍。術(shù)語“藥理學(xué)工具”是指其功能特性能夠研究藥物如何與活生物體相互作用、以產(chǎn) 生目的功能的變化的化合物，從而能夠研究新藥物組合物，以及性質(zhì)、相互作用、毒理學(xué)、治 療、醫(yī)療醫(yī)用和抗病能力。而且，該術(shù)語指可用于新藥開發(fā)時(shí)表征潛在靶標(biāo)的化合物，例如 表征它們的天然組分、活化機(jī)制、生理功能以及在病理生理和疾病中的作用。術(shù)語“示差分析”是指在相同的條件下，能夠表征TRPC3/6/7亞家族成員和 TRPC4/5亞家族成員之間的通道功能差異的一種分析。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，分別表達(dá)TRPC6離子通道和TRPC5離子通道的細(xì)胞在兩個(gè) 平行的實(shí)驗(yàn)中與諾孕酯相接觸，并且測量或檢測諾孕酯對(duì)各自TRPC離子通道活性的影響， 能夠在相同的條件下比較各自通道的功能。
術(shù)語"TRPC離子通道調(diào)節(jié)劑"是指TRPC通道的調(diào)節(jié)分子，特別是一種抑制或活 化分子(“抑制劑"或"活化劑")，特別是一種根據(jù)本發(fā)明方法可鑒定的TRPC通道的抑 制劑。抑制劑通常為一種化合物，像上文詳細(xì)優(yōu)選描述的那樣，例如結(jié)合、部分或全部阻 斷活性、降低、防止、延遲活化、滅活、減敏或下調(diào)至少一種TRPC通道的活性或表達(dá)。
活化劑通常為一種化合物，像上文詳細(xì)優(yōu)選描述的那樣，例如增加、打開、活化、促 進(jìn)、增強(qiáng)活化、敏化、激動(dòng)或上調(diào)至少一種TRPC通道的活性或表達(dá)。這種調(diào)節(jié)劑包括TRPC通道的基因改造版本，優(yōu)選TRPC通道的失活突變體，以及自 然存在或合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、肽類、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、核酶、有機(jī)小分子寸。TRPC活化劑的例子為二酰甘油，特別是1-油酰基_2乙?；?sn-甘油(OAG) ；Gq 偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑，例如苯腎上腺素，特別是胰蛋白酶；刺激受體酪氨酸激酶的激動(dòng)劑例如 表皮生長因子(EGF)；或二酰甘油生成酶例如磷脂酶或其活化劑。存在測試化合物時(shí)對(duì)TRPC離子通道活性調(diào)節(jié)的測量的實(shí)例如下一般情況下，提供表達(dá)TRPC通道的細(xì)胞。這種細(xì)胞能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知 的基因方法產(chǎn)生。在進(jìn)行TRPC通道的誘導(dǎo)表達(dá)之后，通常將細(xì)胞放入例如微孔板之中并生 長。通常細(xì)胞在多孔板底部生長并固定。然后，常規(guī)清洗這些細(xì)胞并加入適合的加樣緩沖 液中的染料，優(yōu)選熒光染料例如fluo4am。在移除加樣緩沖液之后，將細(xì)胞與測試化合物或 調(diào)節(jié)劑(特別是上述生物化學(xué)的或化學(xué)的測試化合物，例如以化學(xué)化合物庫的形式)一同 孵育。Ca2+測量能夠通過使用例如熒光成像讀板儀(FLIPR)進(jìn)行。為了刺激通過TRPC通 道的Ca2+內(nèi)流，通常應(yīng)用通道活化劑例如0AG。抑制劑的預(yù)期影響是例如熒光增加的減少?；罨瘎┦菚?huì)導(dǎo)致例如活化劑誘發(fā)熒光 的進(jìn)一步增加，或誘導(dǎo)例如不依賴活化劑的熒光增強(qiáng)。此后，適合的調(diào)節(jié)劑，特別是抑制劑能夠被分析和/或分離。優(yōu)選使用技術(shù)人員所 知或可商用的高通量分析進(jìn)行化學(xué)化合物庫的篩選。術(shù)語“表達(dá)TRPC的細(xì)胞”是指內(nèi)源表達(dá)目的離子通道的細(xì)胞或重組細(xì)胞。該細(xì)胞通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、中國倉鼠細(xì)胞等。 已發(fā)現(xiàn)方便使用的細(xì)胞包括 MDCK，HEK 293，HEK 293T, BHK, COS, NIH3T3, Swiss3T3 和 CHO 細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞。這里所用的術(shù)語“組織”，是指組織制品的任何類型，或組織或器官的一部分(例 如腦、肝、脾、腎、心臟、血管、肌肉、皮膚等，也指任何類型的體液例如血液、唾液、淋巴液、滑 液等)，優(yōu)選如果來源于脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選來源于哺乳動(dòng)物例如人。組織樣品能夠通過公知 的技術(shù)獲得，例如取血、組織穿刺或外科技術(shù)。用于測量中染料的例子為Di-4-ANEPPS (吡啶4_ (2 (6_ ( 二丁基氨基)_2_萘 基)乙烯基)-1-(3_磺丙基)氫氧化物)，CC-2-DMPE(l，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油 基-3-磷酸乙醇胺三乙銨)，DiSBAC2(雙-(1，2_ 二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛爾)， DisBAC3((雙-(1，3_ 二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛爾)，SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4， 4' -[1，4，10_三氧雜-7，13-二氮雜環(huán)十五烷-7，13-雙(5-甲氧基_6，12-苯并呋喃 基)]雙_(四-[(乙酰氧基)甲基]酯))，flu03am(l-[2-胺-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-夾氧雜蒽基)苯氧基]-2-(2 ‘-胺-5<1>-甲基苯氧基)乙基-N，N， N' , N'-四乙酸)，fluo4am(l-[2-氨-5-(2，7-二氯-6-羥基-4-氧-9-夾氧雜蒽 基)苯氧基]-2-(2'-氨-5'-甲基苯氧基)乙基-N，N，N'，N'-四乙酸)，或 fura2am(l-t2-(5'-羧基噁唑基_2'-基)_6_氨苯并呋喃-5-氧)-2-(2‘-氨-5<1>-甲 基-苯氧基)-乙基-N，N，N' ,N'-四乙酸)。術(shù)語“描述”是指通過功能和結(jié)構(gòu)的分類、效力、特異性、選擇性和作用機(jī)制，對(duì)化 合物例如諾孕酯的表征。在本發(fā)明中，其特別是指諾孕酯對(duì)TRPC離子通道抑制作用的選擇 性研究。術(shù)語“藥物”是指包含治療有效量諾孕酯和一種或多種可藥用載體或助劑的組合 物。該藥物能以任何傳統(tǒng)方式全身或局部給藥。這可以例如通過口服劑型例如片劑或 膠囊的方法，通過粘膜例如鼻腔或口腔的方法，皮膚下植入的儲(chǔ)庫式制劑，通過包含根據(jù)本 發(fā)明藥物的注射、輸注或凝膠的方法。如果適當(dāng)，為了治療上述某種特殊疾病，還可以脂質(zhì) 體復(fù)合物的形式局部(topically and locally)給藥。該藥物也可以注射劑或輸液的形式給藥。如果只是相對(duì)少量的溶液或懸浮液，例 如大約1至20ml，一般使用注射液對(duì)身體給藥。如果是較大量的溶液或懸浮液，例如1升或 更多，一般使用輸液給藥。但是，在相對(duì)大量的給藥時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的配方應(yīng)該在臨近給藥 前稀釋到獲得至少大約等滲溶液的濃度。等滲溶液的一個(gè)例子是0.9%強(qiáng)度的氯化鈉溶液。 在輸液的情況下，稀釋可通過例如使用無菌水進(jìn)行，而給藥可通過例如所謂的旁路進(jìn)行。
下圖和實(shí)施例能夠解釋本發(fā)明，但不限制發(fā)明范圍。
實(shí)施例LFLIPR 測量TRPC3/6TRPC3和TRPC6被油?；鵢2_乙?；?sn-甘油(OAG)( 一種膜滲透二酰甘油類似 物)直接活化。在使用30 μ M諾孕酯預(yù)孵育的細(xì)胞中，TRPC3-和TRPC6-介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流 在應(yīng)用30 μ MOAG后大幅降低了(圖1Α，C)。諾孕酯對(duì)TRPC3的IC5。是2. 8士 0. 4 μ Μ(η = 2，圖IB)。諾孕酯對(duì)TRPC6有相似的活性，IC50為5. 2士0. 4μ M(n = 4，圖ID)。TRPC4/5在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒有已知的TRPC4和TRPC5的直接生理刺激物。因此，兩個(gè)通 道都必須間接刺激，例如通過應(yīng)用胰蛋白酶，一種蛋白酶激活受體(PAR)刺激蛋白酶。胰蛋 白酶可以活化所有已知的4個(gè)PAR亞型，并且其中三個(gè)亞型(PAR1,PAR2和PAR3)的mRNA被 證明是HEK293細(xì)胞內(nèi)源性的(Kawabata等，1999)。PAR是G蛋白偶聯(lián)的，它們的活化導(dǎo)致 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的鈣存儲(chǔ)被消耗。這個(gè)所謂磷脂酰肌醇(PI)反應(yīng)獨(dú)立于通道的存在，但是 因此導(dǎo)致了存儲(chǔ)控制型通道例如TRPC4和TRPC5的活化。測量諾孕酯在這種情況下對(duì)兩個(gè)通道的作用的基本前提是排除PAR對(duì)這種潛在 通道抑制劑的拮抗作用。所以，將從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放出的鈣與未誘導(dǎo)的用30μΜ諾孕酯或僅 緩沖液預(yù)孵育( 10分鐘)的TRPC5HEK293FITR細(xì)胞相比較。在用30 μ M諾孕酯處理過的細(xì) 胞中，鈣庫釋放的動(dòng)力學(xué)和數(shù)量與未處理的細(xì)胞相比沒有改變。因此，諾孕酯不是PAR拮抗齊U，并且通過PAR刺激的TRPC4和TRPC5活化是適合測量諾孕酯的通道抑制性的。30 μ M諾孕酯對(duì)TRPC4和TRPC5只有小的抑制作用(圖2Α，C)。在TRPC4 (η = 2， 圖 2Β)和 TRPC5 (η = 4，圖 2D)上都測得 IC50 > 30 μ Μ。
總之，這些FLira測量顯示，當(dāng)使用微摩爾級(jí)的濃度時(shí)，諾孕酯既抑制TRPC3/6/7 亞家族也抑制TRPC4/5亞家族的通道。諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族比對(duì)TRPC4/5亞家族更 有效。因此，選擇諾孕酯進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以測定其區(qū)分能力。2.膜片鉗記錄2. 1.諾孕酯對(duì)重組同聚TRPC5和TRPC6通道的示差作用驗(yàn)證在細(xì)胞群的熒光測量實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測的諾孕酯對(duì)TRPC6-和TRPC5-介導(dǎo)的 Ca2+-內(nèi)流的抑制作用，并將其與單個(gè)細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗記錄比較。使用同樣的刺激物 間接刺激通道，以更好地比較諾孕酯的作用。通過膜片吸液管在細(xì)胞內(nèi)施用的四氟化鋁 (AlF4O 通過模仿 GTP 活化G-蛋白(Sternweis & Gilman，1982 ；Bigay 等，1985)。隨后 TRPC 通道被刺激并且介導(dǎo)非特異性陽離子電流(圖3A，B)。將10 μ M諾孕酯應(yīng)用到活化的TRPC6通道時(shí)，測量到的靜息膜電位的89. 9士3. 1% (η = 15)電流被阻斷。這種抑制作用是可逆的，因?yàn)樵谙慈ブZ孕酯后電流幅度增加(圖 3Α)。ΙΟμΜ鑭(La3+)的相鄰阻斷完全并且可逆，因而用于背景(泄漏)計(jì)算。相比之下，應(yīng)用10 μ M諾孕酯刺激TRPC5通道對(duì)電流有較小的影響，25. 9 士 5. 7% (η = 20)被阻斷。既然這些通道能夠用微摩爾濃度的La3+加強(qiáng)，(Jimg等，2003)，轉(zhuǎn)而使用 表征為TRPC5阻斷劑的2-氨基乙氧二苯基硼酸(2-APB) (Xu等，2005)。背景通過應(yīng)用能完 全并且可逆阻斷通道的10 μ Μ2-ΑΡΒ計(jì)算。到目前為止，所有的諾孕酯的影響都是對(duì)ΗΕΚ293細(xì)胞異源表達(dá)的同聚體通道進(jìn) 行的。眾所周知，TRPC通道在生理?xiàng)l件下是雜多聚化(Schaefer的綜述，2005)?？紤]到這 些雜多聚體有眾多可能的化學(xué)計(jì)量組成，通常開始對(duì)TRPC通道的藥理學(xué)檢查是在人工模 型中。但是更有趣的是測試諾孕酯是否也抑制天然的TRPC通道。2. 2諾孕酯對(duì)天然異聚體TRPC6/7通道的作用A7r5細(xì)胞系(來源于大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)是一個(gè)用來研究內(nèi)源性TRPC 通道的模型系統(tǒng)(Jung等，2002 ;S0b0l0ff等，2005)。這些通道能夠間接的被Arg8-加 壓素(AVP)所刺激，AVP是一種血管收縮肽，在這些細(xì)胞內(nèi)活化內(nèi)源性加壓素VlA受體 (Thibormier等，1991)。在進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄之前，鈣顯像實(shí)驗(yàn)中顯示諾孕酯一般不抑 制Vl受體(圖4)。使用IOOnM AVP刺激的非選擇性陽離子電流灌流A7r5細(xì)胞，該電流具有TRPC通 道生物物理標(biāo)志(圖5)。經(jīng)雙矯正的I-V關(guān)系和那些外源表達(dá)TRPC6同聚體所顯示的是 相似的(圖3A)。當(dāng)將ΙΟμΜ諾孕酯用于AVP刺激的A7r5細(xì)胞時(shí)，測量到的靜息膜電位的 89. 9士3. 1% (η = 15)電流被阻斷，并且這種作用是可逆的(圖5)。


圖 1 (Α, C)在加入 f luo-4 誘導(dǎo)的 TRPC3HEK293 細(xì)胞(A)和 TRPC6HEK293 細(xì)胞(C)中，細(xì) 胞內(nèi)Ca2+濃度隨時(shí)間的變化([Ca2+]》。在使用30 μ M諾孕酯(NG)預(yù)孵育的細(xì)胞中，TRPC-介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流在應(yīng)用30 μ M OAG后大幅降低。測量在96 孔板中使用 FLIPR(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)進(jìn)行。(B, D)諾孕酯對(duì)TRPC3 (B)和TRPC6 (D)的IC50值的測定。數(shù)據(jù)以每孔45，000個(gè)細(xì)胞的2孔⑶和4孔⑶的平均值表示。圖 2 在加入fluo-4誘導(dǎo)的TRPC4 HEK293細(xì)胞(A)和TRPC5 HEK293細(xì)胞(C)中，細(xì)胞 內(nèi)Ca2+濃度隨時(shí)間的變化([CaU。在使用30μΜ諾孕酯(NG)預(yù)孵育的細(xì)胞中，TRPC-介 導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流在應(yīng)用200ηΜ胰蛋白酶后輕微降低。測量在96 孔板中使用 FLIPR(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)進(jìn)行。(B, D)諾孕酯對(duì)TRPC4 (B)和TRPC5 (D)的IC50值的測定。數(shù)據(jù)以每孔47，000個(gè) 細(xì)胞的2孔⑶和4孔⑶的平均值表示。圖 3 10 μ M諾孕酯(NG)對(duì)全細(xì)胞電流的作用，其中全細(xì)胞電流由A1F4_灌注至誘導(dǎo)的 TRPC6-(A)和TRPC5HEK 293(B)細(xì)胞中誘發(fā)。全細(xì)胞電流在_70mV(左圖)時(shí)記錄，并且 顯示相應(yīng)的電流-電壓(I-V)關(guān)系(右圖)。為了背景校正，通道使用ΙΟμΜ La3+㈧或 10μΜ2-ΑΡΒ(Β)完全阻斷。在電壓從-100到+80mV的上升過程中獲得曲線。(C)諾孕酯對(duì)TRPC5-和TRPC6-介導(dǎo)電流的影響的統(tǒng)計(jì)分析。10 μ M諾孕酯抑 制 TRPC5 介導(dǎo)電流的 25. 9士5. 7% (η = 20)，TRPC6 介導(dǎo)電流的 89. 9士3. (η = 15) (P < 0. 001，Wilcoxon 檢驗(yàn)，雙側(cè))·圖 4 負(fù)載fura-2的A7r5細(xì)胞的[Ca2+] i隨時(shí)間的變化。在應(yīng)用IOOnM AVP刺激Vl受體 之前，細(xì)胞在無鈣標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外溶液(ImM EGTA)中使用或不使用(對(duì)照)10 μ M諾孕酯(NG) 預(yù)孵育5分鐘。數(shù)據(jù)以33細(xì)胞(對(duì)照)和36細(xì)胞(10 μ M諾孕酯)的平均值表示。測量使用標(biāo)準(zhǔn)成像裝置(TILLPhotonics, Graf e 1 f 1 ng, Germany)進(jìn)行。圖 5 ΙΟμΜ諾孕酯(NG)對(duì)全細(xì)胞電流的作用，其中全細(xì)胞電流在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外溶液 (200 μ M[Ca2+J0)中，由A7r5細(xì)胞上的IOOnM AVP誘發(fā)。全細(xì)胞電流在_60mV(左圖)時(shí)記 錄，并且顯示相應(yīng)的I-V關(guān)系(右圖)。在電壓從-100到+SOmV的上升過程中獲得曲線。 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，L-型電壓門控Ca2+通道被5μ M尼莫地平(ND)阻斷。
權(quán)利要求
諾孕酯在抑制TRPC離子通道中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的諾孕酯的用途，其中TRPC離子通道選自TRPC3、TRPC6和TRPC7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2的任一項(xiàng)的諾孕酯的用途，其中諾孕酯對(duì)TRPC3/6/7亞家族成員 的效力至少是對(duì)TRPC4/5亞家族成員的4倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2的任一項(xiàng)的諾孕酯的用途，其中諾孕酯用作一種能夠表征屬于不 同TRPC亞家族通道的藥理學(xué)工具。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的諾孕酯的用途，其在體外進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的諾孕酯的用途，其在非人動(dòng)物的體內(nèi)進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的諾孕酯的用途，其中諾孕酯用于在生理和病理生理?xiàng)l件下，對(duì) TRPC3/6/7亞家族成員和TRPC4/5亞家族成員各自進(jìn)行通道功能的示差分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的諾孕酯的用途，其中分析在細(xì)胞中進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的諾孕酯的用途，其中分析在組織中進(jìn)行
10.根據(jù)權(quán)利要求7的諾孕酯的用途，其中分析在非人動(dòng)物中進(jìn)行。
11.一種選擇性抑制TRPC離子通道的方法，其包含將表達(dá)TRPC離子通道的細(xì)胞與諾孕 酯相接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中TRPC離子通道選自TRPC3、TRPC6和TRPC7。
13.根據(jù)權(quán)利要11-12中的任一項(xiàng)的方法，其在體外進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-12中的任一項(xiàng)的方法，其在非人動(dòng)物的體內(nèi)進(jìn)行。
15.一種測定諾孕酯對(duì)TRPC離子通道活性影響的方法，包含a)接觸表達(dá)TRPC離子通道的細(xì)胞，b)在細(xì)胞與諾孕酯接觸之前、同時(shí)或之后，使用通道活化劑刺激Ca2+內(nèi)流，和c)測量或檢測TRPC離子通道活性的變化。
16.一種鑒定TRPC離子通道調(diào)節(jié)劑的方法，包含a)接觸表達(dá)TRPC離子通道的細(xì)胞，b)在細(xì)胞接觸測試化合物的之前、同時(shí)或之后，使用通道活化劑刺激Ca2+內(nèi)流，并且c)測量或檢測TRPC離子通道活性的變化。
17.根據(jù)權(quán)利要求15-16中的任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞為熒光細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中的任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞選自MDCK，HEK293，HEK293T， BHK, COS, NIH 3T3, Swiss3T3 或 CHO 細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中的任一項(xiàng)的方法，其中TRPC離子通道活性通過使用膜片鉗 技術(shù)、全細(xì)胞電流、放射性標(biāo)記離子流，或使用電壓敏感染料或離子敏感染料的熒光，測量 或檢測Ca2+流出的變化來進(jìn)行測量或檢測。
20.根據(jù)權(quán)利要求6和10的用途，以及根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中動(dòng)物為小鼠或大鼠。
21.一種描述諾孕酯對(duì)TRPC離子通道選擇性的方法，其包含評(píng)估諾孕酯抑制TRPC通道 活性的能力，以及比較諾孕酯在不同TRPC亞家族之間和內(nèi)部的抑制效力。
22.諾孕酯在制備治療心血管疾病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、晚期腎衰竭、神經(jīng)疾病、慢 性疼痛、急性疼痛或炎性疾病的藥物中的用途。
23.治療心血管疾病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、晚期腎衰竭、神經(jīng)疾病、慢性疼痛、急性疼痛或炎性疾病的方法，包括對(duì)患者 給藥治療有效量的包含諾孕酯的組合物。
全文摘要
TRPC離子通道是在人體組織中廣泛表達(dá)的非選擇性通道。這些通道參與許多生理學(xué)功能，并且是被公認(rèn)的用于新藥研發(fā)的推定目標(biāo)。有需要對(duì)細(xì)胞及以外的TRPC離子通道獲得更好的理解。本發(fā)明提供一種由于對(duì)TRPC亞家族的差異抑制，能夠研究TRPC離子通道的藥理學(xué)工具化合物。在本發(fā)明中，諾孕酯顯示選擇性抑制TRPC3，TRPC6和TRPC7。
文檔編號(hào)A61K31/57GK101848717SQ200880113256
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者C·斯特魯冰, H-W·克勒曼, S·米厄 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬特股份有限公司