專利名稱：魚類分子生物學快速鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類分子生物學鑒別方法。
背景技術(shù)：
保護生物多樣性，就是保護人類自己。由于水體生態(tài)環(huán)境的特殊性和大多數(shù)水產(chǎn)動物一直是人們捕捉的對象，魚類生物多樣性比陸生動物多樣性顯得更為脆弱，承受的壓力更大。保護好魚類種質(zhì)資源，就是保護人類生存所必須的水產(chǎn)動物蛋白的生產(chǎn)源泉。魚類資源是一種可更新的資源，只要利用得當，就可取之不盡，經(jīng)久不衰，但如果酷捕濫捕，也可發(fā)生資源枯竭或個體變小、質(zhì)量降低。捕撈并不是一個消極因素，只要捕撈合理，它可使魚類種群產(chǎn)生最大的生產(chǎn)量，人們可獲得最大持續(xù)量。據(jù)Nelson(1994)報道，全世界共有魚類24618種，占脊椎動物種數(shù)的一半以上，在動物界中僅次于昆蟲。在全世界，水面占地球表面的71％，其中，海洋占地面總水面的97％，而淡水僅占地面總水面的1％，但41％的硬骨魚類正是生活在面積極其有限的淡水水體里(Cohen，1970)。全世界約有10億人以魚類為主要的蛋白質(zhì)來源，但同農(nóng)作物及畜禽類不同的是，目前，人類所消費的魚類數(shù)量的80％以上依然來自天然捕撈產(chǎn)品。在全世界水產(chǎn)動物，如魚類中，只有少數(shù)種類已用于養(yǎng)殖，極大多數(shù)種類的養(yǎng)殖潛力尚待評估。據(jù)初步統(tǒng)計，僅中國，由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展以及生活水平提高后對水產(chǎn)品需求的劇增，水域生態(tài)系統(tǒng)處于持續(xù)增長的壓力之下，處于瀕危狀態(tài)和受到嚴重威脅的魚類有97種(9目，24科，80屬)(陳靈芝，1993)。
由于魚類分布范圍廣泛，地理差異，生態(tài)環(huán)境的不同，使得各個地區(qū)的種類不同。由于人們的生活水平的提高，對魚產(chǎn)品的需求猛增，于是產(chǎn)生了對魚類的過渡捕撈，亂捕亂撈時有發(fā)生，再加上人們?yōu)榱藵M足各種需要而對魚類生態(tài)環(huán)境造成的破壞；使許多魚種瀕臨滅絕。雖然我們采取了一些措施，例如每年設立禁魚期，發(fā)布魚類保護白皮書，但由于沒有強有力的執(zhí)法隊伍，主要是缺乏快速、準確、經(jīng)濟、易于操作的魚類鑒別方法(FAO 2000；Hoelzel2001；Pank etal.2001；Smith and Benson 2001；Shivji etal.2002)，所以遠遠達不到預期目的。國內(nèi)外過去常采用核DNA和線粒體DNA限制性長度多態(tài)性、同工酶電泳、RAPD技術(shù)進行魚類鑒別(Martin 1993；Malik et al.1997；Baker et al.1998；Palumbi and Cipviano 1998；Heist and Gold1999；Diozon et al.2000)，上述現(xiàn)有方法具有繁瑣費時、費力、費錢，不利于操作，可重復性差，誤差大等弊端(Callejas et al.2001；Chapman etal.2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耗費時間少、易于實驗室操作、方便直觀的魚類分子生物學快速鑒別方法。
本發(fā)明方法的基本思路是設計并篩選出一對對魚類某一個目rDNA特異的引物作為這個目的通用引物，利用該通用引物擴增出該目下的各種魚的DNA片段并測序，然后通過對比設計出各種魚的特異引物，通過PCR實驗篩選出對各種魚擴增效果好的特異引物，同時把各種魚的特異引物擴增出的DNA片段作為分型標準物，然后把該目下各種魚的特異引物和通用引物進行混合，利用所得混合引物對需鑒別的魚類DNA樣本進行PCR擴增，并對得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，即可根據(jù)電泳條帶對同一目中的魚進行鑒別分類。
具體來說，本發(fā)明的魚類分子生物學快速鑒別方法是按以下步驟進行(1)、設計并篩選出一對特異針對魚類某一個“目”的核糖體DNA的引物，作為這個“目”的所有魚類通用引物對；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對，對該“目”中的各種魚的DNA樣本分別進行PCR擴增，得出該“目”的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物；(3)、分別對上一步驟所得到的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結(jié)果選出每一種魚的一個與其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為該“目”中的每一種魚分別設計并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的同一“目”魚類通用引物對中的一條引物分別與該“目”中的每一種魚的特異引物配對，構(gòu)成該“目”中的每一種魚的“引物對”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對”，分別對該“目”中的每一種魚的DNA樣本進行PCR擴增；將所得到的該“目”中的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物相混合，作為分型標準物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應體系中對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增；(9)、讓上一步驟所得到的擴增產(chǎn)物和所述分型標準物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標準物的電泳條帶的對比，得到鑒別結(jié)果。
在本發(fā)明的步驟(3)中，要求在對由通用引物擴增出的每種魚的DNA片段測序時，要特別準確，否則根據(jù)測序結(jié)果設計出來的特異引物與目標DNA序列不吻合，無法進行特異擴增，導致擴增失敗。
在本發(fā)明的步驟(4)中，各種魚特異引物的設計需要考慮以下幾個方面的要素①、它必須是每種類魚類基因組的特異序列，即它的序列不會與非特異種魚類基因組序列相同或互補。②、選取適當?shù)囊镩L度。大量實驗結(jié)果表明，在設計引物時，引物長度是一個非常關(guān)鍵的參數(shù)，18～24個堿基構(gòu)成的寡核苷酸鏈是比較優(yōu)化的引物長度；引物過短，將會導致特異性的降低；引物過長，擴增退火時被引發(fā)的模板太少，在指數(shù)擴增期，甚至每一步退火步驟的小失誤都將擴大，以致引起擴增產(chǎn)物的明顯減少。③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。較低的Tm值會導致特異性的喪失，若采用太高的退火溫度，擴增的效率將會非常低同時也會產(chǎn)生非特異擴增；如果退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性退火，從而導致非特異性DNA片段的擴增。本發(fā)明推薦在設計引物的Tm值時選擇61℃，因為在該溫度下，復合擴增中絕大多數(shù)的PCR反應都能進行。
本發(fā)明中，每種魚特異引物擴增出來的DNA片段的大小一定要能在瓊脂糖凝膠電泳時能肉眼識別片段大小的差異，所以在設計引物時一定要考慮PCR擴增產(chǎn)物的長度。
在本發(fā)明的步驟(5)中，采用了步驟(1)所得到的“目”的魚類通用引物對中的一條引物分別與該“目”中的各種魚的特異引物配對，進而構(gòu)成該“目”中的各種魚的“引物對”。在實際操作時，可以在通用引物對中任選一條引物與該“目”中的各種魚的特異引物配對。
在本發(fā)明中，特別地采用步驟(6)得到分型標準物，這一點極其重要，這也是本發(fā)明有別于現(xiàn)有技術(shù)的重要區(qū)別特征。這是因為，該分型標準物來自于每種魚的特異引物的擴增產(chǎn)物，它具有唯一性，即與每一種魚的特定DNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)一一對應，從而為魚種的最后鑒別提供了基礎。
在本發(fā)明的步驟(7)中，在將通用引物對和各種魚的一條特異引物相混合而構(gòu)成混合引物時，可以根據(jù)實際需要而采用不同的混合比例。本發(fā)明推薦采用大致為1比1的混合比例，即采用通用引物對中的每條引物與各種魚的一條特異引物等量的混合比例。
在本發(fā)明的上述步驟中，所涉及的PCR擴增、PCR擴增產(chǎn)物測序、特異引物的設計和篩選、瓊脂糖凝膠電泳等具體操作均可以沿用現(xiàn)有技術(shù)得以實現(xiàn)。例如，在步驟(8)中，當在PCR反應體系中對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增時，除了使用步驟(7)所得到的混合引物之外，PCR反應體系中還應當使用其它試劑，如DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、緩沖液和雙蒸水DDH2O等，由于PCR反應體系的構(gòu)成屬于現(xiàn)有技術(shù)，故不再贅述。
在本發(fā)明中，所說的魚的DNA樣本可以按以下常規(guī)方法進行提取a、取魚類新鮮組織，如魚的肌肉、魚鱗、魚鰭、魚卵、魚血、魚類粘液等，置于1.5ml的離心管消化過夜，用酚----氯法提取DNA；b、魚類烘干或曬干制品，魚類罐頭制品，可以直接取樣，同新鮮組織一樣提取DNA；c、對于用95％酒精保存的魚類組織樣本，需用雙蒸水浸泡過夜，再用酚----氯法提取DNA。
與前述現(xiàn)有魚類鑒別方法相比較，本發(fā)明的魚類鑒別方法利用魚類編碼魚類RNA的核DNA序列的保守性和它的轉(zhuǎn)錄間隔子種間的變異，設計出通用引物和種屬特異性引物，從而建立了一種快速、準確、經(jīng)濟、直觀、易于操作的鑒別珍稀魚類的方法。對于魚類形態(tài)學等其它方法無法鑒別的魚類卵子，魚類粘液，魚類的分割樣本，特別是魚類的混合樣本來說，本鑒別方法均能夠有效并快速地加以鑒別。同時，本方法的樣本需要量小，通過一片魚鱗、一個魚卵、一滴粘液或者是粘液斑痕就能確定魚類種屬。本方法的最大優(yōu)點是能夠?qū)旌蠘颖具M行檢測，這種檢測能夠幫助實現(xiàn)對珍稀魚類產(chǎn)卵場準確定位，迅速統(tǒng)計珍稀魚類(特別是瀕危魚類)種群的大小，通過對各種珍稀魚類生物學特性分子水平的了解，了解它們繁殖所需的生態(tài)環(huán)境，準確地掌握它們的繁殖行為和繁殖時的生理生化變化，為我國的珍稀魚類的人工繁殖提供可靠的科學依據(jù)。同時，本方法還為打擊非法捕撈、非法經(jīng)營、非法走私提供了有力的技術(shù)保障。另外，對那些魚類分類不是很擅長的非魚類專業(yè)人員來說，本方法也極具實用價值。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實施例作更進一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例中所涉及的內(nèi)容。


圖1和圖2是采用通用引物對對魚類DNA樣本進行PCR擴增的擴增結(jié)果圖。
圖3是采用混合引物同時對四川白甲DNA樣本、華鯪DNA樣本、胭脂魚DNA樣本、巖元鯉DNA樣本和重口裂腹魚DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖4是采用混合引物對四川白甲的DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖5是采用混合引物對華鯪的DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖6是采用混合引物對重口裂腹魚的DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖7是采用混合引物對胭脂魚的DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖8是采用混合引物對巖元鯉的DNA樣本進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式
本實施例以鯉形目的鑒定為例，先設計出鯉形目的通用引物，分別對要鑒定的魚的DNA樣本進行擴增，對每種魚DNA樣本的擴增產(chǎn)物測序，設計篩選出每種魚的特異引物，用特異引物對每種魚的DNA樣本進行擴增，擴增產(chǎn)物作為分型標準物(即分子馬克)，再把通用引物和特異引物進行混合，對要鑒定的魚類DNA樣本進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物和分型標準物(即分子馬克)進行電泳，即可通過產(chǎn)物在凝膠中的位置與分型標準物中各種魚PCR擴增產(chǎn)物的位置的比較，清楚地區(qū)分出要鑒定魚的種類。具體步驟如下(1)、設計并篩選出一對特異針對魚類鯉形目的核糖體DNA的引物，作為鯉形目的所有魚類通用引物對；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對，對鯉形目中的各種魚的DNA樣本分別進行PCR擴增，得出鯉形目的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物；(3)、分別對上一步驟所得到的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結(jié)果選出每一種魚的一個與鯉形目下的其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為鯉形目中的每一種魚分別設計并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的鯉形目魚類通用引物對中的一條引物分別與鯉形目中的每一種魚的特異引物配對，構(gòu)成鯉形目中的每一種魚的“引物對”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對”，分別對鯉形目中的每一種魚的DNA樣本進行PCR擴增；將所得到的鯉形目中的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物相混合，作為鯉形目魚類的分型標準物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應體系中對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增；(9)、讓上一步驟所得到的擴增產(chǎn)物和所述分型標準物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標準物的電泳條帶的對比，得到鑒別結(jié)果。
在本實施例的步驟(1)中，先設計并篩選出了一對對魚類的鯉形目的核糖體DNA特異的引物，作為鯉形目的魚類通用引物對，該鯉形目通用引物對為
左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′在本實施例的步驟(2)中，先提取了鯉形目中的四川白甲、華鯪、重口裂腹魚、三角鯉、鯽魚、草魚、巖原鯉、鰱魚、鳙魚、建鯉、豐鯉和胭脂魚的DNA樣本，同時，為了進行驗證，還提取了非鯉形目的雜交大口鯰、班點叉尾鮰、黃顙魚、大口黑鱸的DNA樣本。
在提取上述魚類的DNA時，取每種魚的尾柄肌肉20mg，消化過夜，用酚----氯法提取，酒精沉淀，自然風干，雙蒸水溶解保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 在常規(guī)的PCR擴增體系中，采用通用引物對對魚類DNA樣本進行PCR擴增。
PCR反應體系中的各成份的濃度如下表

擴增過程如下(1)預變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長引物的5′端延著模板的5′→3′方向加入dNTP。
整個復合擴增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預變性 94℃ 6分鐘變性 94℃ 30秒復性 55℃ 60秒延伸 72℃ 60秒循環(huán)次數(shù)34延伸 72℃ 10分鐘在上述PCR擴增時，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
所得擴增結(jié)果如圖1、2所示。
從圖1、2可以看出，用通用引物可以擴增出全部鯉形目的魚類，而其它非鯉形目的魚類不能擴增。
在本實施例的步驟(3)中，分別對上一步驟所得到的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物進行了測序，對于鯉形目中的各種魚，根據(jù)測序結(jié)果而各選出一個與鯉形目下的其它魚種有差異的DNA片段中的區(qū)域。
在本實施例的步驟(4)中，根據(jù)對擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果設計出特異引物，再用特異引物擴增所對應的魚類DNA樣本，篩選出好的特異引物。以鯉形目中的胭脂魚、巖元鯉、四川白甲、華鯪、重口裂腹魚為例，篩選結(jié)果為胭脂魚的特異引物 5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪的特異引物 5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉的特異引物 5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚的特異引物 5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲的特異引物 5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′在本實施例的步驟(5)中，用步驟(1)所得到的鯉形目的魚類通用引物對中的一條引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′分別與該鯉形目中的上述魚的特異引物配對，進而構(gòu)成鯉形目中的各種魚的“引物對”胭脂魚 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′在本實施例的步驟(6)中，使用上述各種魚的“引物對”，分別對鯉形目中的各種魚的DNA樣本進行PCR擴增；將所得到的鯉形目中的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物相混合，作為分型標準物。
PCR反應體系中的各成份的濃度如下表

擴增過程如下(1)預變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長引物的5′端延著模板的5′-3′方向加入dNTP。
整個復合擴增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預變性 94℃ 6分鐘變性94℃ 30秒復性55℃ 60秒延伸72℃ 60秒循環(huán)次數(shù)34延伸72℃ 10分鐘在上述PCR擴增時，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
在本實施例的步驟(7)中，將步驟(1)中所得的該鯉形目通用引物對左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′和步驟(4)中得到的各種魚的一條特異引物胭脂魚的特異引物5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪的特異引物 5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉的特異引物5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚的特異引物5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲的特異引物 5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′相混合而構(gòu)成混合引物。在本實施例中，通用引物對中的每條引物與各種魚的特異引物以1比1的比例等量混合。
在本實施例的步驟(8)中，采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應體系中對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增。本實施例在進行PCR擴增反應時，按照PCR擴增的方法加入各種試劑、引物和需鑒別魚類的樣本。PCR反應體系中的成份主要有模板DNA(待鑒別的魚類DNA樣本)、所述混合引物、高GC耐熱DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、1×Buffer(緩沖液)和雙蒸水DDH2O。其中，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
PCR反應體系中的各成份的濃度如下表

擴增過程如下(1)預變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長引物的5′端延著模板的5′→3′方向加入dNTP。
整個復合擴增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預變性 94℃6分鐘變性94℃30秒復性55℃60秒延伸72℃60秒循環(huán)次數(shù)34延伸72℃10分鐘在本實施例的步驟(9)中，鑒于擴增產(chǎn)物的分子量大小、片段長短不同，特別地利用電泳檢測法對其進行分離檢測，以便檢驗擴增結(jié)果。進行分離檢測時，先將上一步驟所得到的擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液以一定的比例混勻，加入電泳槽中的瓊脂糖凝膠(凝膠中已加入溴乙淀)孔中，在其兩端加以電壓進行電泳。由于各擴增產(chǎn)物的分子大小不同，在相同電場力的作用下，其在單位時間內(nèi)在相同的介質(zhì)中所運行的距離也不等。因此，在電泳儀中處理一段時間之后，各擴增產(chǎn)物的差距逐漸拉開，此后取出凝膠，在紫外線燈下觀察，根據(jù)電泳條帶的位置，與分型標準物進行比較，最后即能直觀地看到鑒別結(jié)果。
所采用的電泳檢測原料、設備及條件如下瓊脂糖凝膠成份1、1.5％瓊脂糖凝膠溶液10ml2、每100ml瓊脂糖凝膠溶液中加入10ul1‰的溴乙淀電泳儀pharmacia1000型多功能電泳儀電泳條件1、上樣量樣本3μl 凝膠載樣緩沖液2μl電極緩沖液0.5×TBE溶液2、采用恒流方式電泳電流40mA時間30～40分鐘另外，由步驟(6)得到的分型標準物也上樣2.0ul，電泳30～40分鐘。
就步驟(8)和步驟(9)來說，在采用混合引物同時對四川白甲DNA樣本、華鯪DNA樣本、胭脂魚DNA樣本、巖元鯉DNA樣本和重口裂腹魚DNA樣本進行PCR復合擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖3所示。
在采用混合引物對四川白甲的DNA樣本進行PCR擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖4所示。
在采用混合引物對華鯪的DNA樣本進行PCR擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖5所示。
在采用混合引物對重口裂腹魚的DNA樣本進行PCR擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖6所示。
在采用混合引物對胭脂魚的DNA樣本進行PCR擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖7所示。
在采用混合引物對巖元鯉的DNA樣本進行PCR擴增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴增結(jié)果如圖8所示。
在圖1～8中，所標注的第一原始分型標準物M1、第二原始分型標準物M2是指市售的用于測量DNA片段大小的基準標準物。
從圖3、4、5、6、7、8我們可以看出，每種魚的特異引物只對該種魚的特異位點進行擴增，該種魚的擴增產(chǎn)物電泳后有兩條帶；其它魚的樣本，不是同一目的樣本不能進行擴增，因此無擴增產(chǎn)物，電泳時無條帶；同一目的只有通用引物擴增的產(chǎn)物，電泳只產(chǎn)生一條帶，通過與分型標準物的電泳條帶相對比，就可以鑒別各種魚。
需要說明的是在本實施例的上述步驟(8)和步驟(9)中，是在已知的魚類DNA樣本下進行擴增和觀測、驗證的(即已經(jīng)事先知道所擴增和觀測的魚類DNA樣本屬于哪一種魚)，這主要是為了測定本發(fā)明方法用于鑒別魚類時的可行性及可靠性。而在實際操作中使用本方法時，事先并不知道需要鑒別的魚的種類，因此步驟(9)的實際做法是依據(jù)觀察到的擴增結(jié)果并與分型標準物的電泳條帶相對比，推知步驟(8)所擴增的魚類DNA樣本屬于哪一種魚，進而判別待鑒別魚的種類。
當然，就本發(fā)明的方法來說，除能夠?qū)︴幮文恐械纳鲜鲭僦~、巖元鯉、四川白甲、華鯪、重口裂腹魚進行鑒別外，還可以對鯉形目中的其它魚類進行鑒別。同時，本發(fā)明的方法還可以對除鯉形目之外的其它目的魚類進行鑒別。在對其它目的魚類進行鑒別時，除設計并篩選出的通用引物及各種魚的特異引物有所不同之外，其鑒別步驟及原理均與本實施例相同，故不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種魚類分子生物學快速鑒別方法，其特征是按以下步驟進行(1)、設計并篩選出一對特異針對魚類某一個“目”的核糖體DNA的引物，作為這個“目”的所有魚類通用引物對；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對，對該“目”中的各種魚的DNA樣本分別進行PCR擴增，得出該“目”的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物；(3)、分別對上一步驟所得到的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結(jié)果選出每一種魚的一個與其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為該“目”中的每一種魚分別設計并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的同一“目”魚類通用引物對中的一條引物分別與該“目”中的每一種魚的特異引物配對，構(gòu)成該“目”中的每一種魚的“引物對”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對”，分別對該“目”中的每一種魚的DNA樣本進行PCR擴增；將所得到的該“目”中的各種魚的PCR擴增產(chǎn)物相混合，作為分型標準物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應體系中對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增；(9)、讓上一步驟所得到的擴增產(chǎn)物和所述分型標準物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標準物的電泳條帶的對比，得到鑒別結(jié)果。
全文摘要
一種魚類分子生物學快速鑒別方法，其特征是按以下步驟進行(1)設計“目”的所有魚類通用引物對；(2)采用通用引物對，對該“目”中的各種魚的DNA樣本進行擴增；(3)選出每一種魚的與其它魚種有差異的DNA片段；(4)為每一種魚分別設計并篩選出一條特異引物；(5)用通用引物對中的一條引物分別與每一種魚的特異引物配對，構(gòu)成每一種魚的“引物對”；(6)分別對每一種魚的DNA樣本進行PCR擴增；將所得到的擴增產(chǎn)物相混合，作為分型標準物；(7)將通用引物對和每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)采用混合引物，對需要鑒別的魚類DNA樣本進行擴增；(9)根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶的對比，得到鑒別結(jié)果。
文檔編號G01N27/447GK1789974SQ20051002232
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者侯一平, 袁萬安, 李英碧, 吳謹, 顏靜, 張 申請人:四川大學