專利名稱：蛋白質(zhì)反壓過濾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開通常涉及用于蛋白質(zhì)純化的過濾方法。更具體的是，本申請涉及比如在液 體中被傳輸時易受剪切力損害的蛋白質(zhì)(比如對剪切敏感的蛋白質(zhì)、凝血級聯(lián)的蛋白質(zhì)) 的低剪切、反壓滅菌過濾。
背景技術(shù)：
被純化的蛋白質(zhì)混合物可以給藥于病人用于各種治療。被制備的用于向病人輸液 的被純化的蛋白質(zhì)混合物在使用前必須滅菌。用于一些蛋白質(zhì)的合適的滅菌過程包括被純 化的蛋白質(zhì)混合物的膜過濾。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)能通過膜，濾過膜可以尺寸調(diào)整為保留(即從蛋白 質(zhì)混合物中除去)微粒、微生物和一些病毒。然而，一些蛋白質(zhì)不能通過使用常規(guī)方法例如膜過濾來有效地回收成被純化的、 滅菌的蛋白質(zhì)。當(dāng)試圖過濾那些對剪切敏感和/或凝血級聯(lián)部分的蛋白質(zhì)時，這種影響是 最明顯的。這個蛋白質(zhì)的例子是馮威勒布蘭特因子(vWF)，其在血漿中循環(huán)，與因子VIII形 成復(fù)合物并促進生物凝血活性的調(diào)節(jié)。具體地說，vWF蛋白質(zhì)對輸送液體介質(zhì)的速度梯度 所產(chǎn)生的剪切力是敏感的，尤其是當(dāng)vWF蛋白質(zhì)穿過或靠近濾膜(S卩，在濾膜孔附近液流集 聚和迂曲的流路的地方導(dǎo)致尤其大的速度梯度)時。因此，當(dāng)過濾裝置以足夠大的壓力運 轉(zhuǎn)以便理想地產(chǎn)生想要的加工流速時，增加的流速(和伴隨地引起的剪切力的增加)傾向 于降低加工收率，比如通過損害或破壞蛋白質(zhì)、和/或通過隨著時間降低過濾速度。因此，希望能開發(fā)出過濾純化后的vWF混合物的方法，該方法對vWF基本上沒有損 害，而且隨著時間的過去此方法仍然允許適當(dāng)高的加工通量(即過濾速度)。另外，希望開 發(fā)出能通常應(yīng)用于任何蛋白質(zhì)的過濾方法，以致于一般的蛋白質(zhì)可以以高效的速度被過濾 (如滅菌過濾)而蛋白質(zhì)基本上沒有遭受損害/損失。

發(fā)明內(nèi)容
被公開的方法可用于以分批或者連續(xù)的方式過濾液體混合物中的蛋白質(zhì)，基本上 沒有損害或另外限制過濾濾液中蛋白質(zhì)的回收。本方法通常將相反的壓力施加于濾液上， 以便精確地減少和控制橫跨過濾器的壓力差。被公開的方法的優(yōu)勢在于在相對低的壓力 差下可以達到相對高的過濾流速，相比之下，高壓力差實際上降低了蛋白液體混合物的過 濾流速。更進一步地，本方法基本上可以回收最初存在于液體混合物中的所有蛋白質(zhì)。更具體地說，本公開提供了液體蛋白質(zhì)混合物的過濾方法。根據(jù)一種實施方式，本 方法包括在第一個壓力P1下提供液體混合物，在第二個壓力P2下液體混合物穿過過濾層 形成濾液，并施加反壓于濾液上以致于P1-P2的壓力差不大于300mbar。在另一個實施方式中，本方法包括以下步驟在第一個壓力P1下提供液體混合物，在第二個壓力P2下使液體混 合物穿過過濾器形成濾液，并將足以產(chǎn)生至少大約300g/分鐘· m2過濾器表面面積的平均 濾液流速的反壓于施加濾液上。液體混合物包括載體液體、相對于載體液體在第一濃度C1 下的蛋白質(zhì)、以及分散的污染物。濾液包括載體液體和相對于載體液體在第二濃度C2下的 蛋白質(zhì)。過濾器是尺寸調(diào)整為從液體混合物中除去至少一部分分散的污染物。在另一個實施方式中，本方法能夠過濾蛋白質(zhì)水溶液混合物，并且包括以下步驟 在第一個壓力P1下提供水溶液混合物，在第二個壓力P2下使水溶液混合物穿過多孔濾膜過 濾器形成濾液，并施加反壓于濾液上以致于壓力差P1-P2不大于大約90mbar。水溶液混合 物包括水和相對于水在第一濃度C1下的vWF。濾液包括水和相對于水在第二濃度C2下的 vWF。多孔濾膜過濾器包括大小范圍是大約0. 1 μ m至大約0. 5 μ m的孔。在上述的任何一個實施方式中，蛋白質(zhì)優(yōu)選是對剪切敏感的蛋白質(zhì)和/或凝血級 聯(lián)的蛋白質(zhì)。更進一步地，在濾液中蛋白質(zhì)被回收，優(yōu)選回收比率CVC1至少是大約0.95， 更優(yōu)選地是至少大約0. 99。另外，壓力差P1-P2優(yōu)選不大于大約90mbar并且第一壓力Pl優(yōu) 選至少是大約200mbar的表壓。上述方法的優(yōu)選實施方式包括其中載體液體是水、并且分 散的污染物包括微生物。蛋白可以包括馮威勒布蘭特因子、因子VIII、因子XIII和它們的 混合物。過濾器優(yōu)選包括多孔濾膜過濾器，孔徑大小范圍是從大約0. 1 μ m至大約0. 5 μ m， 更優(yōu)選孔徑大小是大約0. 2 μ m或大約0. 22 μ m。優(yōu)選地，濾液產(chǎn)物基本上不含分散的污染 物。在反壓的應(yīng)用下，蛋白的過濾允許蛋白以相對高的濃度、相對高的濾液流速被回 收，相反在沒有反壓的情況下不可能達到基本上恒定的濾液流速。這是與過濾理論的一般 應(yīng)用至少在關(guān)于濾液流速方面是相反的，因為理論預(yù)測隨著增加橫跨過濾器的壓力差濾液 流速會增加(即在沒有反壓的情況下)。從下面的詳細說明、連同附圖看來，進一步的方面和優(yōu)勢對于本領(lǐng)域中的技術(shù)人 員是很顯而易見的。此處描述的組合物、膜和組允許各種形式的實施方式，下面的描述中的 特定的實施方式被理解為是用來闡述發(fā)明的，而不是將本發(fā)明限制于此處描述的特定的實 施方式。


此處附加兩個附圖以便于理解本公開。圖1是軸對稱的筒式過濾器的橫截面，用于蛋白質(zhì)的反壓過濾。圖2是使用常規(guī)過濾法與反壓過濾法得到的過濾速度數(shù)據(jù)的比較。
具體實施例方式此處描述的本方法通常可用于液體混合物中蛋白質(zhì)的過濾純化，該方式中基本上 沒有損害或另外限制過濾期間蛋白質(zhì)的回收。除蛋白質(zhì)之外，液體混合物還包括載體液體 和分散的污染物。載體液體是蛋白質(zhì)的懸浮介質(zhì)，通常不受限制。優(yōu)選載體液體是水。類 似地，分散的污染物也不是特別地受限制，可以包括任何分散的固體物質(zhì)，是最終的純化蛋 白濾液中不想要的成分。在滅菌過濾操作的情況下，分散的污染物通常包括可能存在于液 體混合物中的各種微生物(即細菌)的任何一種。
被公開的方法尤其優(yōu)選地應(yīng)用于那些對剪切敏感的蛋白質(zhì)、人凝血級聯(lián)部分的蛋 白質(zhì)、或者兩者(即，一些合適的蛋白質(zhì)比如vWF，既可以分類為對剪切敏感的蛋白質(zhì)又可 以分類為凝血級聯(lián)的蛋白質(zhì))。適用于使用被公開的反壓過濾方法進行純化的對剪切敏感的蛋白質(zhì)包括那些當(dāng) 作為在耐受大剪切力(即相對大的速度梯度)的載體液體中的懸浮液被輸送時易受損害、 破壞、活性損失、和/或過濾速度下降的蛋白質(zhì)。通常，對剪切敏感的蛋白質(zhì)是過濾速度與 超過臨界外加剪切之上的外加剪切(或者外加壓力)之間呈現(xiàn)出反比例關(guān)系的蛋白質(zhì)。在 臨界外加剪切(或者外加壓力)這一點，過濾速度和外加剪切(外加壓力)的正比例關(guān)系 和反比例關(guān)系發(fā)生轉(zhuǎn)換(即轉(zhuǎn)換發(fā)生在過濾速度是最大值時)，臨界外加剪切對于不同的 對剪切敏感的蛋白也許是不同的。例如，臨界的外加剪切可以至少是大約zooos—Y或者至 少大約^oos—1)并不大于大約sooos—Y或不大于uooos—1)。然而，不同的對剪切敏感蛋白 的定性行為被預(yù)期是相似的。對剪切敏感的蛋白包括VWF，雖然被公開的方法不是特別限 制于此。vWF以一系列寡聚/多聚形式存在于血漿，這些形式的分子量范圍基于二聚物為 520kDa是從大約IOOOkDa (千道爾頓)至大約20000kDa，被公開的方法不是必然受限于特 別的分子量范圍。被公開的方法通常也適用于人凝血級聯(lián)的蛋白質(zhì)(即，凝血因子)的純化。比如， 凝血因子II (分子量大約37kDa) ,VII (大約50kDa) ,VIII :C (大約260kDa)、IX (大約55kDa 至大約70kDa)、X(大約IOOkDa)、XIII (大約350kDa)、vWF(如上所述)，以及它們的組合 物，它們中的一些也是對剪切敏感的，可以通過使用反壓被有效地過濾和回收。一些特別優(yōu)選的純化蛋白包括單一的蛋白例如因子XIII或vWF、和多蛋白組合物 例如因子VIII :C/vWF復(fù)合物。優(yōu)選不是特別對剪切敏感的蛋白組合物，但是通過使用反壓 仍然順利地被過濾，該蛋白組合物是FEIBA VH混合物(“(蒸汽加熱的)因子八抑制劑旁 通道活性因子”，來自于巴克斯特，Deerf ield，伊利諾斯州)，可用于控制自發(fā)性出血和/或 治療血友病A/B病人。FEIBA VH混合物包括因子II、IX和X(主要是未被活化的)、因子 VIII (主要是被活化的)以及因子VIII :C(大約1至6個單位/ml)。FEIBA VH混合物受 益于反壓的使用，因為當(dāng)反壓被應(yīng)用時，蛋白混合物可以以比較高的過濾速度被過濾，而蛋 白活性損失很少或沒有損失。包含蛋白和分散的污染物的液體混合物然后通過過濾器被純化。根據(jù)被公開的方 法，適合采用的過濾器并不受特別的限制，可以包括表面過濾器比如終端過濾器(即液體 是垂直地通過過濾器表面而被過濾)和錯流過濾器(即液體是平行于過濾器表面移動而被 過濾)。參見比如Kirk-Othmer，《化學(xué)工藝學(xué)?？迫珪罚?0卷，第788-853頁(“過濾”) (1993年第4版)。關(guān)于它們的分級大小(即，此大小之上的分散物質(zhì)在過濾器上被保留， 并且此大小之下的分散物質(zhì)進入了濾液)，過濾器同樣沒有受特別的限制。一旦過濾分級大 小被選中用于特定的應(yīng)用中(即，待保留的分散物質(zhì)相對于進入濾液的分散物質(zhì))，運轉(zhuǎn)過 濾器時應(yīng)當(dāng)考慮流過過濾器的載體液體產(chǎn)生的剪切量相對于被過濾的特定蛋白質(zhì)的剪切 敏感性。優(yōu)選的過濾介質(zhì)是多孔濾膜，通常有不同的大小(即，過濾器表面面積；比如范圍 從0.001m2至大約5m2)和構(gòu)造(即，濾片、濾芯)。多孔濾膜可以由下述材料形成例如硝 酸纖維素、醋酸纖維素、乙烯基聚合物、聚酰胺、碳氟化合物和聚醚砜。多孔濾膜包括的孔通
6常具有高度均一的大小，這取決于要從液體混合物中被排除出去的分散污染物的大小。比 如，在滅菌過濾的操作中想要除去微生物(同時允許蛋白通過過濾器進入濾液)，孔徑優(yōu) 選的大小范圍是大約0. 1 μ m至大約0. 5 μ m，或者大約0. 15 μ m至大約0. 25 μ m,例如大約 0. 2 μ m或大約0. 22 μ m。合適的多孔濾膜過濾器也可以包括0. 2 μ m/0. 22 μ m過濾器和粗 預(yù)過濾器(例如，大約0. 45 μ m)，以便提高通量并限制濾餅積聚在0. 2 μ m/0. 22 μ m的過濾 器表面上。用于含有蛋白質(zhì)的液體混合物滅菌過濾的合適的商用多孔濾膜過濾器的例子包 括SART0BRAN P 0. 2 μ m醋酸纖維膜(包括0. 2 μ m濾孔并具有0. 45 μ m濾孔的預(yù)過濾器 膜，購自Sartorius AG, G6ttingen，德國)和SUPOR EKV 0. 2 μ m聚醚砜膜(購自Pall公司， East Hills，紐約)。圖1顯示了液體混合物流過過濾器100比如具有多孔濾膜的筒式過濾器的情況。 正如所顯示的那樣，液體混合物通過入口 Iio進入密封的過濾器100的進水室120。進水室 120的液體被加壓，具有的第一個壓力P1通常高于環(huán)境壓力(即，大約Ibar絕對大氣壓)。 進水室120中的第一個壓力P1驅(qū)使液體混合物中的載體液體和蛋白穿過多孔濾膜130。穿 過濾膜130的物質(zhì)形成濾液，在濾液室140中的濾液包括載體液體和蛋白質(zhì)。濾液室140 中的液體也被加壓，具有比第一壓力P1小的第二壓力P2,但是通常也高于環(huán)境壓力。然后 被純化的濾液通過出口 150從過濾器流出。通過出口 150的流速(和第二壓力P2)通過反 壓調(diào)節(jié)器160被調(diào)節(jié)。濾膜130的孔徑尺寸調(diào)整為除去液體混合物中含有的至少一部分分散的污染物， 被去除的分散的污染物被保留在濾膜130的入口一側(cè)(即，在進水室120中)。優(yōu)選地，濾 膜130尺寸調(diào)整為基本上去除最初存在于入口液體混合物中的所有分散污染物；因此，濾 液基本上不含(或者不含)分散的污染物。具體地說，濾液應(yīng)當(dāng)不含有一定數(shù)量的分散的 污染物，該數(shù)量的污染物會不利地影響被過濾和被純化的蛋白混合物作為治療組合物的應(yīng) 用。比如，當(dāng)分散的污染物包括微生物時，濾膜130應(yīng)當(dāng)能夠去除至少大約IO7個菌落形成 單位每cm2過濾面積。入口液體混合物的第一壓力P1可以通過任何合適的來源比如重力、壓縮氣體(如 壓縮空氣)或者泵(如低剪切泵)被施加。優(yōu)選地，第一壓力P1至少是大約200mbar表壓， 或者范圍是大約200mbar至大約IOOOmbar表壓(即大約Ibar表壓)，比如300mbar表壓。 反壓(或者背壓)也可以通過任何合適的來源比如常規(guī)閥(圖1中顯示的反壓調(diào)節(jié)器160) 被施加，以便得到出口濾液的第二壓力P2。另外，反壓同樣可以通過沿著出口 150通路的流 動集聚、阻塞等被施加。作為第一和第二壓力P1和P2的結(jié)果，被施加的反壓產(chǎn)生(正的) 壓力差P1-P2，驅(qū)使載體液體和蛋白穿過過濾器進入濾液中。壓力差是較低的，合適的最大 壓力差取決于各種因素，比如被過濾的特定的蛋白和使用的特定的過濾器。尤其是，壓力差 優(yōu)選不大于大約300mbar、200mbar、150mbar或者120mbar，更加優(yōu)選不大于大約90mbar或 者50mbar，甚至更加優(yōu)選不大于大約20mbar或者lOmbar，比如不大于5mbar或者不大于 3mbar。在這種壓差下，穿過過濾器的流速是足夠低的，以便能產(chǎn)生低剪切的環(huán)境，此剪切 環(huán)境基本上對蛋白的活性沒有損害、破壞或者減小。低剪切環(huán)境進一步基本上不限制過濾 過程的收率。具體地說，可以看到低壓力差可以獲得比較高的和基本上恒定的過濾速度。尤其是，低的壓力差可以被用于獲得至少大約300g/分鐘· m2的平均過濾流速，比如大約300g/ 分鐘· m2至大約IOOOg/分鐘· m2或者大約400g/分鐘· m2至大約800g/分鐘· m2，此處單 位是每單位時間(即分鐘)獲得的濾液質(zhì)量(即載體液體和蛋白結(jié)合的克數(shù))，并被歸一化 為過濾器的每單位表面面積(即m2)。由反壓的應(yīng)用導(dǎo)致的低壓力差還可以產(chǎn)生基本上恒 定的過濾速度，尤其是在瞬時啟動完成后，這樣提高了過濾器的凈容量。與在低壓力差下看 到的過濾速度相比(這與一般的過濾理論相反，理論意味著過濾速度與橫跨過濾器的壓力 差成正比)，較高的壓力差(比如超過大約IOOmbar)趨向于降低過濾速度。因此，常規(guī)的過 濾法，施加的壓力差至少是大約IOOmbar至大約300mbar，不能達到在本公開的方法中看到 的平均流速。更進一步地，可以看到低壓力差可以獲得比較高的蛋白回收率。具體地說，最初存 在于液體混合物中的基本上所有蛋白質(zhì)都被優(yōu)選地回收在濾液中。比如，當(dāng)?shù)谝粷舛菴1指 的是在初始液體混合物中相對于載體液體的蛋白濃度，第二濃度C2指的是在最終濾液中相 對于載體液體的蛋白濃度，那么被公開的過濾法的回收率C2ZiC1優(yōu)選至少是大約0. 95，并且 更加優(yōu)選至少是大約0. 99。當(dāng)被公開的反壓過濾方法被應(yīng)用于蛋白質(zhì)時是有用的，因為該方法提供了過濾流 速的精確控制。被用于驅(qū)使液體混合物穿過過濾器的壓力源，通常提供了過高的壓力，導(dǎo)致 高剪切速度，其反過來回導(dǎo)致過濾器堵塞和蛋白的損害。如果不是不可能，通常很難調(diào)節(jié)相 對于環(huán)境壓力的單個壓力源，以致于得到的壓力差足夠低并且足夠恒定，從而導(dǎo)致通過過 濾器的平均流量足夠低，以免損害蛋白和基本上恒定。然而，通過將反壓施加于處理液體的 濾液一側(cè)，相對較高的壓力源(比如第一壓力P1)可以被精確地反向平衡(即，施加第二壓 力P2)，從而獲得低的和基本上恒定的壓力差(即P1-P2)。實施例下面的實施例用來說明本發(fā)明，并不是想限制本發(fā)明的范圍。實施例1-8對剪切敏感、凝血級聯(lián)的蛋白vWF的水溶液混合物被滅菌過濾，以便確定壓力(和 反壓)及其他過程變量(比如過濾器大小和類型)對過濾有效性的影響，比如基于濾液中 vWF被回收的活性、濾液的平均流量和放大加工的能力。重組體vWF的水溶液混合物(“rVWF:Rco”)具有125IU/ml的活性并且濃度是 1159yg/ml (二喹啉甲酸(“BCA”)實驗)，此混合物被制備用于下面的實施例1_8中的 每一個實施例中。添加低分子量鹽以便分別調(diào)節(jié)混合物的PH至7. 3和滲透壓度至大約 400m0Smol/l (毫克滲透壓/升)的值。因為實施例1_8是用來孤立過濾器附近的蛋白上的 流體動力學(xué)作用(比如剪切)，所以沒有其他的分散污染物或材料(比如細菌、其他微生物 或其他蛋白)被添加到混合物中。水溶液混合物的成分概括在表1中。表1.實施例1-8的液體混合物成分 然后水溶液液體混合物以下述方式被檢測。至少大約500ml測試量的混合物被添 加至耐壓的不銹鋼容器中。容器的出口通過第一節(jié)硅膠管被連接至滅菌過濾器(蒸汽滅 菌)的入口。大約IOcm長的第二節(jié)硅膠管被連接于滅菌過濾室的出口。來自于滅菌過濾 的濾液流出物被收集在放置在天平上的燒杯中，以便監(jiān)測過濾速度。天平與計算機對接，以 便每隔一段時間記錄被收集的濾液的總量作為時間的函數(shù)。在實施例1-7中，使用了 SART0BRAN P 0. 2 μ m的醋酸纖維膜過濾器(包括 0.4511111預(yù)過濾器)。在實施例8中，使用了 SUPOR EKV 0. 2 μ m聚醚砜薄膜過濾器。實施 例1-3使用了圓盤薄膜過濾器，而實施例4-8使用了筒式薄膜過濾器。每個過濾器的過濾 器表面面積提供在表2中。對于實施例1-8，測試量的水溶液混合物在恒壓下被過濾。在實施例1中，根據(jù) 從不銹鋼容器進入滅菌過濾器的柱子的高度，進入滅菌過濾器的水溶液的外加壓力是大約 IOOmbar表壓(即大約1. Ibar絕對大氣壓)。在實施例2_8中，干凈的壓縮空氣被用于提 供水溶液進入滅菌過濾器的壓力，壓力范圍從150mbar至300mbar，如表2中所示。在實施 例1-4中，沒有進行反壓過濾(即，當(dāng)濾液注入收集燒瓶中時，滅菌過濾器的出口管放空)， 因此驅(qū)動過濾的壓力差基本上是進入滅菌過濾器的水溶液的壓力。對于實施例5-8，通過 將夾鉗連在并夾緊在滅菌過濾器的出口管上，反壓被施加于濾液上。根據(jù)過濾期間測定的 平均濾液流速和已知被使用的商用的過濾器的壓差-流速特性來推算實施例5-8的壓力差 (在表2中被顯示)。通常，在每個實施例中，在制備好測試量的水溶液混合物之后就很快將混合物過 濾。然而，在實施例5中，混合物在延遲了 8小時后才被過濾，以便檢查儲存對被公開方法 的任何潛在的影響。表2概括了實施例1-8中每一個實施例的試驗參數(shù)。表2.用于實施例1-8的過濾試驗參數(shù) 過濾試驗的結(jié)果被概括在表3中。在表3中，“濾液量”指的是單個試驗期間獲得 的濾液質(zhì)量(即，包括水和任何被回收的vWF)。對于實施例1-4，進行過濾實驗直到過濾器 被堵塞并且不再能得到基本數(shù)量的濾液。對于實施例5-8，進行過濾實驗直至獲得數(shù)百克 的濾液并且實驗結(jié)束時過濾器沒有被堵塞仍然可以進一步過濾。表3中的“過濾能力”輸 入項指的是被歸一化的每單位面積過濾器表面的濾液數(shù)量。實施例5-8中的符號“>”指 的是，過濾能力是實際能力的較低的推定值，因為過濾器在實驗期間并沒有被堵塞。表3中 的“平均流速”輸入項指的是試驗期間被平均并且被歸一化為每單位面積過濾器表面的濾 液數(shù)量。表3.實施例1-8的過濾結(jié)果 從表3中可明顯看出，蛋白的反壓過濾增加了過濾能力和流速。甚至在適當(dāng)?shù)偷?外加壓力(范圍是從IOOmbar至300mbar)用于vWF和被使用的過濾器(在此被使用的濾 芯可以承受最高壓力的范圍是從大約2bar至大約5. 5bar)時，實施例1_4顯示過濾能力是 低的并且隨著壓力的增加而急劇減小。與之相反，當(dāng)反壓應(yīng)用于濾液以便減少壓力差時，實 施例5-8呈現(xiàn)了大得多的過濾能力和流速。觀察到的現(xiàn)象出乎意料，因為過濾器通常的特 征是過濾流速和壓力差之間呈正比關(guān)系
公式(1)在公式(1)中，Q是過濾流速(每單位時間的體積或者質(zhì)量)，A是過濾器的表面 面積，Δρ是橫跨過濾器的壓力差，μ是被過濾的流體的粘度，以及R是過濾介質(zhì)的實驗阻力。實施例5-8的結(jié)果之間的相似性進一步表明，反壓過濾的優(yōu)勢可以通過使用各種過濾 介質(zhì)和/或過濾器大小而被獲得。實施例4和6的時間依賴性的過濾數(shù)據(jù)(S卩，被收集的濾液作為時間的函數(shù))在圖 2中被顯示。從圖2中可明顯看出，實施例4的高壓力差導(dǎo)致了過濾試驗的起初的10-15分 鐘的比較高的過濾速度。然而，實施例4中的高壓方差同樣導(dǎo)致了過濾器的更加急劇的堵 塞。與之相反，實施例6中反壓的使用降低了壓力差和起始過濾速度。具體地說，在最初的 短暫的大約10分鐘至大約15分鐘的期間，低壓差產(chǎn)生了低剪切過濾環(huán)境，防止了過濾器被 vWF堵塞，因此提高了整個過濾器使用期限中的過濾能力和過濾流速，并進一步導(dǎo)致了基本 上恒定的過濾流速。正如表4中所概括的，實施例1-3和5中每一個實施例的濾液同樣被分析，以便測 定濾液中重組體vWF的水平，從而確定過濾過程是否相反地影響了存在于初始水溶液混合 物中的重組體vWF的濃度。在沒有反壓存在的情況下，實施例1-3顯示，過濾期間甚至適當(dāng) 較低的壓力差也可能損害或者破壞蛋白質(zhì)，過濾期間在壓力差是200mbar和300mbar時，損 失最多可達大約重組體vWF的一半。通過使用反壓可以避免這種過濾損失，正如實施例5中 所示，在實施例5中rVWF:RC0濃度沒有出現(xiàn)可測量的降低，測定的蛋白(BCA)含量僅有4% 的減少。因此，最初存在于水溶液混合物中的基本上所有蛋白質(zhì)都可以被回收在濾液中。表4.濾液中vWF的回收 實施例9-20含有因子VIII的水溶液在帶有SART0CLEAN預(yù)過濾器的SARTOBRAN 過濾器上 被試驗，以便測定反壓對過濾有效性的影響，比如基于所需要的過濾器表面面積。在實施例 9-13中，沒有進行反壓過濾；初始的外加壓力是IOOmbar至500mbar。在實施例14-16中， 壓力差是200mbar，并且在實施例17-20中，壓力差被減少至小于150mbar。每個過濾器的 表面面積都是1. 2m2。表5包含了每個實驗中過濾前后因子VIII活性。表5.濾液中FVIII的回收 先前的數(shù)據(jù)證明，當(dāng)將反壓過濾用于相同量的活性物質(zhì)時，所必需的過濾面積少 得多。反壓過濾使過濾穩(wěn)定化，并且當(dāng)壓力差被優(yōu)化時，提高了平均活性收率。實施例21-25含有因子XIII的溶液在PALL POSIDYNE N66聚酰胺過濾器上被實驗，以便 檢測反壓對過濾有效性的影響，比如基于濾液中因子XIII被回收的活性和蛋白濃度。每個 過濾器的面積是0. 82m2。在實施例21-23中，沒有進行反壓過濾；用于這些實施例的外加壓 力是600mbar。在實施例24_26中，壓力差大約是IOOmbar。表6包含了每個實驗的過濾前 后的蛋白濃度和活性以及收率。表6.濾液中FXIII的回收 正如表6中所顯示，通過使用反壓，過濾期間的活性收率和蛋白收率得到了相當(dāng) 大的提高。
上述給出的描述是為了清晰地理解本發(fā)明，應(yīng)理解沒有不必要的限制，本發(fā)明在 范圍內(nèi)的修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很顯而易見的。說明書自始至終，其中組合物被描述為包括成分或者物質(zhì)，可以預(yù)期組合物也可 以基本由、或者由所列舉的成分或者物質(zhì)的組合所組成，除非另有描述。此處被公開的方法的操作以及它的單個步驟，可以手動進行和/或借助于電子設(shè) 備進行。雖然根據(jù)具體的實施方式已經(jīng)描述了過程，但是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理 解可以使用與本方法相關(guān)聯(lián)的其他方法。比如，在不偏離本方法的范圍和精神的情況下可 以改變各個步驟的順序，除非另有描述。此外，一些單個步驟可以被組合、省略或者進一步 的被細分為另外的步驟。
權(quán)利要求
一種過濾液體蛋白混合物的方法，該方法包括在第一壓力(P1)下提供液體混合物，該液體混合物包含載體液體、與所述載體液體相對的第一濃度(C1)下的蛋白質(zhì)、以及分散的污染物；在第二壓力下(P2)使所述液體混合物經(jīng)過過濾器以形成濾液，所述濾液包括載體液體和與所述載體液體相對的第二濃度(C2)下的蛋白，其中所述過濾器尺寸調(diào)整為從所述液體混合物中除去至少一部分分散的污染物；并且向所述濾液施加反壓，以便保證第一壓力和第二壓力之間的壓力差(P1 P2)不大于大約300mbar。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括對剪切敏感的蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括凝血級聯(lián)的蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述壓力差不大于大約90mbar。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約95% 的所述蛋白被回收于濾液中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約99% 的所述蛋白被回收于濾液中。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反壓足以給過濾器表面區(qū)域產(chǎn)生至少 大約300g/分鐘· m2的平均濾液流速。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一壓力(P1)至少是大約200mbar表壓。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體液體包括水。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白選自由馮威勒布蘭特因子(vWF)、 因子VIII、因子XIII和它們的混合物所組成的組。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分散的污染物包括微生物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述濾液基本上不含分散的污染物。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述過濾器包括多孔濾膜，該多孔濾膜包 含的孔徑大小是從大約0. 1 μ m至大約0. 5 μ m。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述孔徑大小是大約0.2 μ m或者大約 0. 22 μ m。
15.一種過濾液體蛋白混合物的方法，該方法包括在第一壓力(P1)下提供液體混合物，該液體混合物包含載體液體、與所述載體液體相 對的第一濃度(C1)下的蛋白質(zhì)、以及分散的污染物；在第二壓力(P2)下使所述液體混合物經(jīng)過過濾器以形成濾液，所述濾液包含載體液體 和與所述載體液體相對的第二濃度(C2)下的蛋白，其中過濾器尺寸調(diào)整為從所述液體混合 物中除去至少一部分分散的污染物；并且，向所述濾液施加足以給過濾器表面區(qū)域產(chǎn)生至少大約300g/分鐘·πι2的平均濾液流速 的反壓。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括對剪切敏感的蛋白。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括凝血級聯(lián)的蛋白。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約.95 %的蛋白被回收于濾液中。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約 99%的所述蛋白被回收于濾液中。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述載體液體包括水。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述蛋白選自由馮威勒布蘭特因子 (vWF)、因子VIII、因子XIII和它們的混合物所組成的組。
22.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述分散的污染物包括微生物。
23.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述濾液基本上不含分散的污染物。
24.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述過濾器包括多孔濾膜，該多孔濾膜包 含的孔徑大小是從大約0. 1 μ m至大約0. 5 μ m。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述孔徑大小是大約0.2 μ m或者大約 0. 22 μ m。
26.一種過濾蛋白水溶液混合物的方法，該方法包括在第一壓力(P1)下提供水溶液混合物，所述水溶液混合物包含水和與水相對的第一濃 度(C1)下的馮威勒布蘭特因子(vWF)；在第二壓力下(P2)使所述水溶液混合物經(jīng)過多孔濾膜過濾器以形成濾液，所述濾液 包含水和與水相對的第二濃度(C2)下的vWF，其中所述多孔濾膜過濾器包括尺寸從大約 0. 1 μ m至大約0. 5 μ m的孔；并且，向濾液施加反壓，以便保證第一壓力和第二壓力之間的壓力差(P1-P2)不大于大約 9Ombarο
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約 95%的所述vWF被回收于濾液中。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，存在于所述液體混合物中的至少大約 99%的所述vWF被回收于濾液中。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述孔徑大小在大約0.2 μ m或者大約 0. 22 μ m。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述水溶液混合物進一步包含微生物種 群，其中至少一部分種群通過多孔濾膜過濾器被從所述水溶液混合物中除去。
全文摘要
公開了一種用于過濾液體混合物中蛋白質(zhì)的方法，該方法基本上沒有損害或另外限制過濾濾液中蛋白質(zhì)的回收。本方法通常包括將包含蛋白的液體混合物(比如vWF水溶液混合物)通過過濾器，同時將反壓施加于液體混合物濾液上以便精確地減小和控制橫跨過濾器的壓力差。公開的方法的優(yōu)勢在于在相對低的壓力差下可以達到相對高的過濾流速，相比之下，高壓力差實際上降低了蛋白液體混合物的過濾流速。更進一步地，本方法基本上可以回收最初存在于液體混合物中的所有蛋白質(zhì)。
文檔編號A61K9/08GK101909599SQ200880123991
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者克勞斯·蔡徹蔡科維斯基, 奈博伊沙·尼科利奇, 巴巴拉·瑞格勒, 托馬斯·簡西克, 沃夫?qū)じ窭撞┟芬? 科特·施內(nèi)克, 米謝拉·弗雷, 阿爾瑪·卡薩波維奇, 馬蒂亞斯·弗里德 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司