專利名稱：固醇修飾的兩親脂質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩親脂質(zhì)化合物以及組合物和用法。背景真核生物膜具有雙層結(jié)構(gòu)，主要由磷脂、鞘脂和膽固醇構(gòu)成。在這些化合物中，膽 固醇或膽固醇樣固醇是真核生物膜中最豐富的單一化學(xué)物質(zhì)。因此，了解膽固醇在生物膜 中的特性和功能以及膽固醇在某些疾病中的作用極其令人感興趣?？蓮牧字手推渌鼉捎H合成脂質(zhì)制備人工囊泡。稱為脂質(zhì)體的這些人工囊泡已 用于多種領(lǐng)域，例如雙層膜的模型和藥物遞送載體。游離膽固醇廣泛用作脂質(zhì)體組合物中的組分。當(dāng)脂質(zhì)混合物中游離膽固醇大于約 30摩爾％時，其有助于脂質(zhì)體雙層穩(wěn)定。這種含游離膽固醇的脂質(zhì)體用于藥物遞送領(lǐng)域、顯 像劑和生物物理研究中。游離膽固醇和合成磷脂的混合物的特性是良好表征的。對于含有 游離膽固醇和磷脂的雙組分混合物，膽固醇的摩爾百分比加上磷脂的摩爾百分比等100摩 爾百分比。發(fā)現(xiàn)可包含在這種脂質(zhì)混合物中的膽固醇的最大摩爾百分比約為50摩爾百分 比。在含有合成磷脂的組合物中包含高摩爾百分比的游離膽固醇(大于30摩爾％ )會除去 二?；字D(zhuǎn)移的可測熱量并消除從合成磷脂形成脂質(zhì)體時觀察到的可檢測相變。含有高 摩爾百分比的游離膽固醇的脂質(zhì)體相比于不含游離膽固醇的那些通常更穩(wěn)定且不易滲漏， 其廣泛用于化療藥物制劑中。然而，當(dāng)游離膽固醇和磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體置于含有其它生物脂質(zhì)和血清的生物流 體中時，游離膽固醇從脂質(zhì)體中快速移出進入生物脂質(zhì)。脂質(zhì)體的這種游離膽固醇喪失通 常導(dǎo)致脂雙層穩(wěn)定性降低，隨后脂質(zhì)體中包封的內(nèi)含物喪失。游離膽固醇從脂質(zhì)體移出到 過量的不含膽固醇的脂質(zhì)的半存留期是約2小時。此外，由于血清脂蛋白對游離膽固醇有 吸附作用，游離膽固醇從脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，因此血清的存在會顯著增加脂質(zhì)體的滲漏。 游離膽固醇與其它兩親脂質(zhì)組分物理混合的常規(guī)脂質(zhì)體制劑未能滿意地解決游離膽固醇 從脂質(zhì)體快速轉(zhuǎn)移至生物膜相關(guān)的該滲漏問題。因此，需要開發(fā)可用于在體外和體內(nèi)形成穩(wěn)定脂質(zhì)體的脂質(zhì)。所需分子不僅應(yīng)能 將足夠量的固醇摻入制劑以提供穩(wěn)定作用，還能在接觸生物流體時將固醇維持在制劑中。使用水溶性固醇衍生物已見諸描述。已將各種親水性基團連接于固醇從而制備水 溶性固醇衍生物，例如固醇_半琥珀酸酯、固醇_磷酸膽堿、固醇-聚乙二醇和固醇_磷酸 酯。由于這些分子只有一個固醇作為疏水性部分并且親水性首基相對較大，它們本身易形成膠束并從脂質(zhì)體雙層快速轉(zhuǎn)移至生物流體。因此，這種水溶性固醇不是穩(wěn)定脂質(zhì)體制劑 的合適組分。疏水性固醇是另一類已知的固醇衍生物，其中脂肪酸酯或烷基醚連接于固醇。雖 這些分子因脂族鏈而有助于將固醇維持在脂質(zhì)體雙層中，但只有少量摩爾百分比(低于 15% )可摻入制劑。當(dāng)游離膽固醇的百分比高于約15摩爾％時，膽固醇酯相分成不摻入雙 層的不同相。因此，這種疏水性固醇不能將足夠摩爾百分比的固醇引入脂質(zhì)組合物以消除 相變并穩(wěn)定脂質(zhì)體雙層。本發(fā)明提供可解決這些問題的化合物，還提供具有所需物理特性的脂質(zhì)體。文獻固醇、脂質(zhì)和遞送制劑通?？偨Y(jié)于Fahy等，J. Lipid Research (2005) 46 839-861 ；Feigner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5 :162_187 ；和Feigner 1993， J. Liposome Res. ,3 :3_16。脂質(zhì)化合物和含有膽固醇的組合物公開于以下文獻，例如=Brockerhoff等， Biochim. Biophys. Acta 1982,691 227-232 ；Demel φ, Biochim. Biophys. Acta 1984, 771142-150 ；Patel 等，Biochim. Biophys. Acta 1984,797 20-26 ；Lai 等，Biochemistry 1985,24 1646-1653 ；Epand 等，Chem. Phys. Lipids 1990,55 49-53 ；Gotoh 等，Chem. Biodivers. 2006,3 198-209 ；Torchilin, V. P. ， Nat. Rev. Drug Discov. 2005,4 145-60 ； Phillips 等，Biochim. Biophys. Acta 1987,906 :223_76 ；Hamilton, J.A. , Curr. Opin. Lipidol. 2003，14 :263-271 ；Kan 等，Biochemistry 1992,31 1866-74 ；Urata 等，Eur. J. Lipid Sci. Tech. 2001，103 :29_39 ；Salunke 等，Curr. Med. Chem. 2006，13 :813_47 ；Guo 等，Acc. Chem. Res. 2003,36 :335_341 ；Bhattacharya 等，Curr. Opin. Chem. Biol. 2005,9 647-55 ；和Huang等，刊于Liposome technology (脂質(zhì)體技術(shù))第3版，Gregoriadis，G.編， Informa Healthcare 紐約，2007，第 1 卷，第 165-196 頁。例如，Bhattacharya 等(Curr. Opin. Chem. Biol. 2005,9 :647_55)總結(jié)了脂質(zhì)設(shè)計和它們在各種生物化學(xué)、物理學(xué)和化學(xué) 領(lǐng)域的應(yīng)用。由于遞送核酸的脂質(zhì)化合物和組合物公開于以下專利文件，例如US4，493，832 ； US 4, 897, 355 ；US 5, 651, 981 ；US 5, 661, 018 ；US 5, 686, 620 ；US5, 688, 958 ；US 5，780，053 ；US 5，855，910 ；US 5，891，714 ；US 6，627，218 ；Lewis 等，美國專利申請公 布號 20030125281 ；MacLachlan PCT 公布號 W0/2003/077829 ；MacLachlan, PCT 公布 號 TO 05/007196 ；Vargeese 等，PCT 公布號 W02005007854 ；McSwiggen 等，PCT 公布 號 W 05/019453、W003/70918、WO 03/74654 和美國專利申請公布號 20050020525 及 20050032733 ；和 Chen 等，PCT 公布號 W0/2007/086883。例如，Chen 等(PCT 公布號 TO/2007/086883)公開了陽離子脂質(zhì)、微粒、納米顆粒和轉(zhuǎn)染或遞送短干擾核酸(siNA)的 轉(zhuǎn)染試劑。概述本發(fā)明總體上涉及固醇修飾的兩親脂質(zhì)化合物。還提供了合成這些化合物的方 法、包含這種化合物的組合物和這種化合物在遞送感興趣藥劑，例如治療劑、疫苗、顯像劑、 超聲領(lǐng)域的造影劑、生物傳感器、營養(yǎng)添加劑、皮膚護理產(chǎn)品和化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)化合物包含親水性首基和兩個或更多個疏水性尾基(tail group)，其中至少一個疏水性尾基包含固醇。本發(fā)明的化合物和組合物可適用于各種藥學(xué)、美容和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及可利用脂質(zhì) 系統(tǒng)的各種工業(yè)和商業(yè)領(lǐng)域。例如，本發(fā)明化合物可用于，例如穩(wěn)定雙層、單層、立方體相 (cubic phase)、六角相(hexagonal phase)、油和水乳液(水包油或油包水乳液)、凝膠、泡 沫、洗液和乳膏。因此，本發(fā)明一方面提供包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的化合物，所述脂質(zhì)具有親水 性首基和兩個或更多個疏水性尾基，其中至少一個疏水性尾基包含固醇。在一個實施方式 中，固醇選自動物固醇和植物固醇。在相關(guān)實施方式中，固醇選自膽固醇、類固醇激素、油菜 固醇、谷固醇、麥角固醇和豆固醇。在還要進一步的實施方式中，親水性首基選自待電荷的、極性的以及帶電荷的和 極性首基的組合。在相關(guān)實施方式中，親水性首基選自磷酸根、磷酸膽堿、磷酸甘油、磷酸 乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰膽堿(ethylphosphosphorylcholine)、聚乙二醇、 聚甘油、三聚氰胺、葡糖胺、三甲胺、多胺、羥基(OH)、羧酸根(C00—)、硫酸根(SO4-)、磺酸根 (SO3O和碳水化合物。在進一步的實施方式中，至少一個親水性尾基包含非固醇。在相關(guān)的實施方式中， 所述非固醇是飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的脂族烴。在進一步的相關(guān)實 施方式中，所述非固醇部分是基于飽和脂族烴鏈，例如含烷基的飽和鏈的取代烴鏈。在進一 步的相關(guān)實施方式中，亞烷基的1、2、3、4或更多個碳原子(通常不超過約10個碳原子)被 選自氧、硅、硫或氮原子的雜原子取代，和/或亞烷基的1、2、3、4或更多個氫原子(通常不 超過氫原子的總數(shù))被氟取代。在進一步的實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)選自單固醇修飾的兩親脂質(zhì)和雙固 醇修飾的兩親脂質(zhì)。在相關(guān)的實施方式中，所述雙固醇修飾的兩親脂質(zhì)包含相同的固醇疏 水性尾部。在進一步的實施方式中，所述固醇修飾的兩親脂質(zhì)選自甘油磷脂、神經(jīng)鞘氨醇磷 脂、肉堿脂質(zhì)、和氨基酸脂質(zhì)。在還要進一步的實施方式中，親水性首基和疏水性尾基通過1，2- 二羥基，3-氨基 丙烷相連。在一個實施方式中，疏水性尾基之一是前藥，例如視黃酸。本發(fā)明在其它方面提供含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物，所述脂質(zhì)具有親水性 首基和兩個或更多個疏水性尾基，其中至少一個疏水性尾基包含固醇。在相關(guān)的實施方式 中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)選自單固醇修飾的兩親脂質(zhì)和雙固醇修飾的兩親脂質(zhì)。在進一步 的實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)選自膽固醇、類固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麥角固醇 和豆固醇。在相關(guān)實施方式中，組合物是乳液。在進一步相關(guān)的實施方式中，組合物是任選包 含有效負(fù)載(payload)的脂質(zhì)體。在脂質(zhì)體包含有效負(fù)載的實施方式中，所述有效負(fù)載包 含治療劑、化妝品和可檢測標(biāo)記物中的至少一種。在進一步的實施方式中，所述脂質(zhì)體包含 非固醇兩親脂質(zhì)。在相關(guān)的實施方式中，所述脂質(zhì)體包含一種或多種賦形劑，可作為藥物制 品或化妝制品提供。在進一步的實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)包含治療劑，所述固醇修飾的兩親 脂質(zhì)可以在脂質(zhì)體中提供。
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在還要進一步的實施方式中，非固醇兩親脂質(zhì)選自飽和或不飽和的、線形或分支 的、取代或未取代的脂族烴。在進一步的實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)和非固醇兩親脂 質(zhì)包含長度大致相同的疏水性尾基。在一些實施方式中，組合物中的固醇修飾的兩親脂質(zhì) 是單固醇修飾的兩親脂質(zhì)。在其它方面，本發(fā)明提供合成固醇修飾的兩親脂質(zhì)的方法，該方法包括將至少一 個固醇尾基經(jīng)分支核心(branching core)偶聯(lián)于親水性首基，從而產(chǎn)生其中親水性首基與 兩個或更多個疏水性尾基相連的固醇修飾的兩親脂質(zhì)，其中至少一個所述疏水性尾基包含
固醇尾基。在其它方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物的方法，該方法 包括將固醇修飾的兩親脂質(zhì)與非固醇兩親脂質(zhì)、治療劑、化妝品、可檢測標(biāo)記物、緩沖劑、溶 劑和賦形劑中的至少一種混合。在相關(guān)的實施方式中，所述方法還包括純化該組合物。在還有其它方面，本發(fā)明提供將包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物給予動物的方 法，該方法包括使所述動物與本發(fā)明的固醇修飾脂質(zhì)組合物接觸。在其它方面，本發(fā)明提供將包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物給予細胞的方法， 該方法包括使所述細胞與本發(fā)明的固醇修飾脂質(zhì)組合物接觸。在還有其它方面，本發(fā)明提供檢測流體中某分析物存在與否的方法，包括使該流 體與本發(fā)明的含固醇修飾脂質(zhì)的組合物接觸，并檢測該脂質(zhì)組合物或流體的可檢測特性的 至少一種改變。在相關(guān)實施方式中，所述流體是生物學(xué)流體。在進一步相關(guān)的實施方式中， 通過評估脂質(zhì)組合物的特性進行檢測。閱讀本文內(nèi)容后不難理解本發(fā)明的其它方面和實施方式。附圖簡述結(jié)合附圖閱讀以下詳述可更好地理解本發(fā)明。附圖包括以下

圖1是SChcPC和DSPC的混合物的示差掃描量熱法(DSC)熱分析圖。圖2顯示了含各種百分比的膽固醇的固醇修飾兩親脂質(zhì)(“SML”)/ 二?；|(zhì)混 合物的轉(zhuǎn)換溫度和焓。在圖2所示結(jié)果中，SML與相同鏈長的二?；|(zhì)混合。圖3顯示滲透應(yīng)力誘導(dǎo)滲漏的分析結(jié)果。在不同滲透壓力下檢測脂質(zhì)體中釋放 的鈣黃綠素。計算維持在脂質(zhì)體中的鈣黃綠素的分?jǐn)?shù)，并對滲透梯度作圖。數(shù)據(jù)的誤差在 0. 5%以內(nèi)。圖4顯示脂質(zhì)體組合物在磷酸緩沖鹽水配制的30體積％胎牛血清中的滲漏分析 結(jié)果。通過檢測不同溫育時間下熒光強度自起始熒光強度的改變來監(jiān)測37°C，30體積％胎 牛血清中鈣黃綠素從脂質(zhì)體中的釋放。計算維持在脂質(zhì)體中的鈣黃綠素的分?jǐn)?shù)，并對溫育 時間作圖。對照制劑中有40%的膽固醇(DSPC/膽固醇和DMPC/膽固醇)。圖5顯示37°C，膽固醇交換的相對速率的分析結(jié)果。圖6顯示所選固醇修飾的兩親脂質(zhì)對C26結(jié)腸癌細胞的細胞毒性。圖7顯示磷脂酶A2水解固醇修飾的兩親脂質(zhì)的全反式視黃酸。圖8顯示用阿霉素包封SPL脂質(zhì)體的不同制劑治療(15mg/kg，靜脈內(nèi))皮下攜 帶C-26腫瘤的BALB/c小鼠的腫瘤生長曲線，其中Fl是SeChcPC/DSPE_PEG2000/α -生育 酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F2 是 SeChcPC/DSPE_PEG5000/ α -生育酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F3 是 DChcPC/ DSPC/DSPE-PEG2000/ α -生育酚，10. 6/84. 2/5. 0/0. 2 ；F4 是 PChcPC/DSPE_PEG2000/ α -生育酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F5 是 DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α -生育酚，33/61. 8/5. 0/0. 2 ； 和 F6 是 DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/ α -生育酚，94. 8/5. 0/0. 2。圖9顯示用阿霉素包封SPL脂質(zhì)體的不同制劑治療(15mg/kg，靜脈內(nèi))皮下攜 帶C-26腫瘤的BALB/c小鼠的腫瘤生長曲線，其中Fl是SeChcPC/DSPE_PEG2000/α -生育 酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F2 是 SeChcPC/DSPE_PEG5000/ α -生育酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F3 是 DChcPC/ DSPC/DSPE-PEG2000/ α -生育酚，10. 6/84. 2/5. 0/0. 2 ；F4 是 PChcPC/DSPE_PEG2000/ α -生 育酚，94. 8/5. 0/0. 2 ；F5 是 DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α -生育酚，33/61. 8/5. 0/0. 2 ； 和 F6 是 DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/ α -生育酚，94. 8/5. 0/0. 2。圖10是DChcPC/DPPC混合物的示差掃描量熱法(DSC)熱分析圖。圖11顯示利用還原敏感性SML脂質(zhì)順序裝配納米脂顆粒。首先，通過透析方法將 DNA包封入納米大小的陽離子脂質(zhì)體。然后，通過與還原劑HSR’的二硫鍵交換修飾顆粒表 面。最后，通過膠束轉(zhuǎn)移方法或二硫鍵交換將靶向配體摻入顆粒表面上。SML-SSR 在首基 (R)中具有二硫鍵(SS)的陽離子固醇修飾脂質(zhì)；SML-SSR’:首基交換的固醇修飾兩親脂質(zhì)。圖12顯示脂質(zhì)體組合物在HEPES緩沖鹽水配制的30體積％胎牛血清中的滲漏分 析結(jié)果。通過檢測不同溫育時間下熒光強度自起始熒光強度的改變來監(jiān)測37°C，30體積％ 胎牛血清中5-羧基熒光素(CF)從脂質(zhì)體中的釋放。計算28天時從脂質(zhì)體中釋放的CF百 分比，并對脂質(zhì)體制劑中烷基鏈長度作圖。圖13顯示37°C，CF從包含二酰基/SML6b的脂質(zhì)體在HEPES緩沖鹽水配制的30 體積％胎牛血清中釋放的特征。標(biāo)記表示脂質(zhì)體中所用二酰基脂質(zhì)的鏈長度。詳述在描述本發(fā)明的示范性實施方式之前，應(yīng)該知道本發(fā)明不限于所述的具體實施方 式，因為這些實施方式當(dāng)然可以改變。還應(yīng)該知道本文所用的術(shù)語只是出于描述特定實施 方式的目的，不應(yīng)理解成限制性的，因為本發(fā)明的范圍只受隨附權(quán)利要求的限制。應(yīng)該理解，給出數(shù)值范圍時，除非文中另有明確說明，還專門公開了該范圍上下限 之間、以下限單位的十分之一為間隔的各間插數(shù)值。所述范圍的任何所述值或間插值之間 的各較小范圍包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些較小范圍的上下限可獨立地包括或排除在該范圍 中，上下限中任一、無一或均包括在這些較小范圍中的各范圍也屬于本發(fā)明，還可在所述范 圍中專門排除任何限值。所述范圍包含上下限的一個或兩個時，排除那些所包括限值中任 一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。除非另有限定，本文所用的所有科技和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的含義相同。雖然類似或等效于本文所述的任何方法和材料可用于實施或檢驗 本發(fā)明，但現(xiàn)在描述了一些可能的和示范性的方法和材料。本文所述的任何和所有出版物 通過引用納入本文以便連同所引用的出版物公開和描述方法和/或材料。應(yīng)該知道如有沖 突，以本文內(nèi)容替換所納入出版物的任何內(nèi)容。必須注意，本文和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一”、“一種”以及“該”包括 復(fù)數(shù)含義，除非文中明確指定。因此，例如，提到“一種固醇修飾的兩親脂質(zhì)”包括多種這樣 的固醇修飾的兩親脂質(zhì)，提到“該脂質(zhì)體”包括提及一個或多個脂質(zhì)體，依此類推。還應(yīng)注意，權(quán)利要求書可以撰寫成排除任何可選元素。因此，本聲明旨在將諸如 “單獨”、“僅僅”等排除性術(shù)語與權(quán)利要求的引述聯(lián)用，或采用“負(fù)”限制的前提基礎(chǔ)。
提供本文所述出版物僅是因為它們在本申請的申請日之前公開。不應(yīng)理解為承認(rèn) 由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格先于這種出版物。而且，提供的出版日期可能與實際出 版日期不同，可能需要單獨確認(rèn)?！皟捎H脂質(zhì)”指結(jié)構(gòu)上與脂質(zhì)最相似(疏水性)的分子，但其在一端具有急性、帶 電荷或急性和帶電荷(親水性)的組合的區(qū)域。親水性區(qū)域稱為首基，脂質(zhì)部分稱為尾基。 兩親脂質(zhì)的例子包括磷脂、糖脂和鞘脂?！胺治鑫铩敝冈诜治龌蚨繖z測過程中測定的物質(zhì)或化學(xué)成分，例如滴定、免疫測 定、層析、分光光度法、溫度圖表法等。分析物本身通常不能檢測，但能檢測可檢測的特性。 例如，所檢測的典型特性是濃度、光吸收度、分子量、融點、結(jié)合特性、生物學(xué)活性等等。“游離的固醇”指未共價結(jié)合另一化合物的固醇。因此，“游離膽固醇”指未共價結(jié) 合于另一化合物的膽固醇。例如，將游離膽固醇加入脂質(zhì)已用作常規(guī)技術(shù)來增強脂質(zhì)體穩(wěn) 定性。因此，“游離膽固醇”尤其指未共價結(jié)合作為固醇修飾的兩親脂質(zhì)化合物中部分的膽 固醇。“藥物試劑”指可用于檢驗、開發(fā)或用作藥物的試劑，包括營養(yǎng)劑?！岸嗄遗葜|(zhì)體”(MVL)指在各脂質(zhì)體顆粒中含有多個非同心小室的脂質(zhì)體，類似 于“泡沫樣”的基質(zhì)?！岸鄬又|(zhì)體”(也稱為多層囊泡或“MLV”)指在各脂質(zhì)體顆粒中含有雙層構(gòu)成的 多個同心小室的脂質(zhì)體，類似于“洋蔥的諸層”?！皢喂檀夹揎椀膬捎H脂質(zhì)”或“m-SML”指結(jié)構(gòu)中只具有一個固醇的SML。“雙固醇修飾的兩親脂質(zhì)”或“di-SML”指結(jié)構(gòu)中有兩個固醇的SML?！叭檀夹揎椀膬捎H脂質(zhì)”或“tri-SML”指結(jié)構(gòu)中有三個固醇的SML?！八墓檀夹揎椀膬捎H脂質(zhì)”或“tetra-SML”指結(jié)構(gòu)中有四個固醇的SML?！肮檀肌被蝾惞檀贾妇哂杏坞x羥基的類固醇或其衍生物的亞組，例如膽固醇及其衍 生物類別，以及植物固醇及其衍生物類別和真菌固醇及其衍生物所示例和包括的。固醇可 以是天然的或合成的。本文所用的“固醇修飾的兩親脂質(zhì)”通常指具有親水性首基和兩個或更多個疏水 性尾基的兩親脂質(zhì)化合物，其中至少一個尾基是固醇?！肮檀夹揎椀膬捎H磷脂”或"SPd^ 包含含磷酸根部分，例如磷酸膽堿或磷酸甘油的固醇修飾兩親脂質(zhì)?！爸委焺敝缚捎糜跈z驗、開發(fā)或用作治療試劑的藥劑，包括藥物試劑?！帮@像劑”指可用于在動物中定位脂質(zhì)顆粒的位置的試劑，包括光學(xué)試劑、超聲波 造影劑、大質(zhì)量X-射線造影劑(high mass X-ray contrast agent)、放射性顯像劑或核磁 顯像劑。“美容試劑”指可用于檢驗、開發(fā)或用作化妝品的試劑。術(shù)語“治療上可接受的”、“藥學(xué)上可接受的”和“美容上可接受的”指不是在生物 學(xué)上或其它方面不良的物質(zhì)，即，該物質(zhì)具有可接受的質(zhì)量，還指組合物，該組合物可連同 所選活性成分給予個體而不導(dǎo)致任何不良生物學(xué)效應(yīng)或不會以有害方式與該組合物所含 的其它組分相互作用。術(shù)語“乳液”指兩種不可互溶(不能摻混的)物質(zhì)的混合物。
術(shù)語“雙層”指排列成雙分子層的兩親脂質(zhì)分子(常是磷脂)構(gòu)成的“夾心樣”結(jié) 構(gòu)，其中疏水性尾部在內(nèi)部，而極性首基在外表面上。術(shù)語“單層”指由兩親分子的分子層限定的結(jié)構(gòu)，其中富含的首基基本上排列在一 側(cè)，而富含的疏水性基團基本上在相對側(cè)。 本文所用的術(shù)語“賦形劑”指為給定的最終應(yīng)用，例如將感興趣化合物施加于或給 予對象而提供可接受載體的任何合適物質(zhì)。賦形劑的例子包括稱為稀釋劑、添加劑、輔助劑 和運載體的物質(zhì)。例如，“藥學(xué)上可接受的賦形劑”、“藥學(xué)上可接受的稀釋劑”、“藥學(xué)上可接 受的運載體”和“藥學(xué)上可接受的輔助劑”包括可用于制備藥物組合物的賦形劑、稀釋劑、運 載體和輔助劑，這些物質(zhì)通常是安全的、無毒的并且不是生物學(xué)或其它方面不良的，包括獸 醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及人藥用可接受的賦形劑、稀釋劑、運載體和輔助劑，可同時包括一種和多于一 種的此類賦形劑、稀釋劑、運載體和輔助劑。術(shù)語“生理條件”表示包括與活細胞相容的那些條件，例如與活細胞相容的溫度、 PH、鹽度等主要是水性的條件。術(shù)語“治療組合物”、“藥物組合物”、“化妝品組合物”、“治療制品”、“藥物制品”或
“美容制品”表示包括適合施加或給予對象，例如哺乳動物，特別是人的組合物。此類組合物 總體上是安全的，通常是無菌的，優(yōu)選不含能引發(fā)對象的不良反應(yīng)的污染物(例如，組合物 中的一種或多種化合物對于給定的最終應(yīng)用是可接受級別的)?？蓪⒔M合物設(shè)計成通過許 多不同給藥途徑施加于或給予有此需要的對象或患者，所述給藥途徑包括局部、口服、口腔 含化、直腸、胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)、肺部等。在一些實施方式 中，該組合物適于通過經(jīng)皮途徑施加或給予。在其它實施方式中，該組合物適于通過經(jīng)皮給 藥以外的途徑施加或給予。術(shù)語，本發(fā)明化合物的“衍生物”包括其鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、腙、縮酮、原 酸酯、半縮醛、半縮醛、酸、堿、溶劑合物、水合物或前藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知的這種衍 生方法不難制備這類衍生物。術(shù)語，化合物的“鹽”表示具有本發(fā)明化合物的所需活性的鹽。這種鹽包括(1) 酸加成鹽，用無機酸或有機酸形成，所述無機酸例如有鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸 等；所述有機酸例如有乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀 酸、蘋果酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4_羥基苯甲?；?苯甲酸、1， 2，3，4 丁烷四羧酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2_乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺 酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4，4'-亞甲基二 -(3-羥 基-2-烯-1-羧酸)、3_苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、 水楊酸等；或(2)當(dāng)親代化合物中存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子、堿土金屬 離子或銨離子替代；或與有機堿，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡 糖胺、三乙胺等配位而形成的鹽。術(shù)語，本發(fā)明化合物的“溶劑合物或水合物”表示具有親代化合物的所需藥理學(xué)活 性的溶劑合物或水合物絡(luò)合物，包括但不限于本發(fā)明化合物與一個或多個溶劑或水分子， 或1-約100，或1-約10，或1-約2、3或4個溶劑或水分子的絡(luò)合物。術(shù)語“保護基團”表示通過化學(xué)修飾官能團而引入分子的化學(xué)基團以便保護或防 護該官能團免受其正?；瘜W(xué)反應(yīng)活性的影響。保護基團以及它們的加入和除去是熟知的
10(T.W.Greene, P. G. Μ. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (有機合成中的保 護基團)，W-I公司(Wiley-Interscience)，紐約，2005)。除去保護基團產(chǎn)生稱為“未保護 基團”的原始官能團。術(shù)語“前藥”表示但將此類前藥給予哺乳動物對象時能在體內(nèi)釋放活性親代藥物 的任何化合物。通過修飾化合物中存在的官能團來制備前藥，這種方式可在體內(nèi)切割這些 修飾從而釋放親代化合物。前藥包括的化合物中羥基、氨基、羧基或巰基分別結(jié)合于可在體 內(nèi)切割從而產(chǎn)生游離羥基、氨基、羧基或巰基的任何基團。前藥的例子包括但不限于酯、氨 基甲酸酯、腙、二硫化物等。術(shù)語“對象”、“宿主”、“患者”和“個體”在本文可互換使用以指需要診斷或治療的 任何哺乳動物對象，特別是人。其它對象可包括牛、狗、貓、豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、馬、魚等 等。非人動物模型，特別是哺乳動物，例如靈長類、鼠、兔等可用于實驗研究。本文所用的術(shù)語“測定”、“檢測”和“評估”及“檢驗”可互換使用，包括定量和定性 測定。在本文中，用于描述兩親脂質(zhì)化合物的術(shù)語如下所示。首先，固醇化合物使用常 規(guī)名稱，例如膽固醇、豆固醇和谷固醇。為便于描述，按照甘油磷脂通用名的類似規(guī)則縮寫 具有甘油作為骨架的固醇修飾兩親脂質(zhì)。例如，1-膽固醇基羰基-2-棕櫚基_甘油-3-磷 脂酰膽堿縮寫為ChcPePC，其中l(wèi))Sn-l/Sn-2位置的基團在它們?nèi)〈恢玫男蛄兄幸源?寫縮寫表示(例如，“Ch”表示膽固醇，“CHEMS”表示膽固醇基半琥珀酰基(cholesteryl hemiSUCCinyl)，“P”表示棕櫚?；?；2)按照慣例，利用下標(biāo)字母或小寫字母表示連接類 型，例如“C”表示碳酸酯，“e”表示醚，“a”表示氨基甲酸酯，空白(或無小寫或下標(biāo)字母) 表示酯；3)按照慣例命名首基，例如“PC”表示磷酸膽堿，“PG”表示磷酸甘油。1U本發(fā)明提供具有兩個或更多個疏水性尾部的兩親脂質(zhì)化合物(本文稱為“固醇修 飾的兩親脂質(zhì)”，縮寫為“SML”)，疏水性尾部中至少一個是固醇。本發(fā)明還提供制備這種 SML化合物的方法和含有它們的組合物。本發(fā)明還提供利用SML的方法以及包含一種或多 種SML化合物和/或組合物的試劑盒。本發(fā)明的化合物和組合物適用于發(fā)現(xiàn)可利用兩親脂質(zhì)或從中獲益的各種領(lǐng)域，例 如，兩親脂質(zhì)本身可用作治療劑、化妝品和顯像劑，從而有助于遞送治療劑、化妝品、可檢測 標(biāo)記物和其它感興趣的試劑以檢測分析物、生物傳感器等的存在與否。可將SML設(shè)計成穩(wěn) 定水包油或油包水乳液以便用于化妝品或營養(yǎng)產(chǎn)品中。還可將SML設(shè)計成用作藥物或前 藥，例如下文更詳細描述的。本發(fā)明化合物在性質(zhì)上是兩親的，其可單獨或與溶液、乳液中的其它組分形成各 種結(jié)構(gòu)，或作為干粉，因此可用于多種應(yīng)用。例如，SML化合物可形成凝聚物、片層、顆粒、乳 液、有結(jié)構(gòu)的相等，還可為這些目的作微調(diào)。因此，可將這些化合物制備成包含一種或多種 所述結(jié)構(gòu)的組合物，例如制成乳液或脂質(zhì)體組合物，特別是制成治療組合物、藥物組合物、 化妝品組合物和檢測組合物。所述SML化合物和組合物具有獨特特性。一種這樣的特性是與沒有或用游離固醇 作為穩(wěn)定劑的相比，SML能提高各種脂質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。例如，SML在穩(wěn)定脂質(zhì)系統(tǒng)以及相 應(yīng)的游離固醇的同時，從脂質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移出的SML很少，進而提高了脂質(zhì)系統(tǒng)在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性(例如，對通常會限制標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)系統(tǒng)應(yīng)用的各種生理和其它條件下的解離、降解 或滲漏的耐受性提高)。因此，與不用穩(wěn)定劑或用游離固醇(例如，游離膽固醇)作為穩(wěn)定 劑的常規(guī)脂質(zhì)系統(tǒng)相比，含有一種或多種SML化合物的脂質(zhì)系統(tǒng)提供的應(yīng)用更有效。下文 進一步討論了 SML的其它優(yōu)點。—種優(yōu)點是SML化合物可單獨用作感興趣的試劑，或者與其它組分聯(lián)用，例如以 遞送感興趣的試劑。例如，SML本身可包含治療劑、美容或可檢測試劑。作為治療性或美容 性SML, SML的親水性首基和/或一個或多個疏水性尾基可包含治療劑或美容劑，例如尾基 包含固醇，包括類固醇激素或其衍生物，和/或首基包含親水性試劑，例如肉堿。作為可檢 測SML，可用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記該化合物，或者如果SML本身形成適合于對比成像應(yīng)用的微 泡，其可用作造影劑。其它優(yōu)點包括與標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)系統(tǒng)相比，可從利用穩(wěn)定的脂質(zhì)系統(tǒng)獲益的各種領(lǐng)域。 例如，當(dāng)與其它組分聯(lián)用以便遞送感興趣試劑時，SML可作為穩(wěn)定的脂質(zhì)制品提供，例如穩(wěn) 定的乳液或脂質(zhì)體制品。特別感興趣的脂質(zhì)系統(tǒng)應(yīng)用的例子包括利用SML和組合物作為毒性藥物，例如阿 霉素、表柔比星、喜樹堿、紫杉醇、多西他奇、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、順鉬、他莫昔芬、伊馬替 尼、依立替康的穩(wěn)定藥物運載體以便胃腸外給予藥物。其它例子包括利用SML和組合物作 為同一運載體中的兩種或更多種藥物的穩(wěn)定藥物運載體。其它例子包括利用SML作為抗 微生物化合物，例如妥布拉霉素的穩(wěn)定藥物運載體以便通過吸入遞送入肺部，作為水溶性 差的藥物，例如兩性霉素B或視黃酸的藥物遞送系統(tǒng)。其它例子包括利用SML作為穩(wěn)定的 囊泡、作為佐劑和/或疫苗運載體。其它例子包括利用SML作為顯像劑，例如磁共振顯像 劑或放射性顯像劑的穩(wěn)定運載體。其它例子包括利用SML作為酶敏感性藥物遞送的脂質(zhì) 體前藥，作為還原反應(yīng)性藥物遞送的脂質(zhì)體組合物，具有鞘氨醇的SML用于脂質(zhì)筏(lipid raft)建模和遞送膜蛋白，具有視黃酸的SML乳液作為皮膚護理產(chǎn)品，和利用SML作為供超 聲診斷中的微泡。還有其它例子包括利用SML和組合物作為遞送生物學(xué)大分子，例如蛋白 質(zhì)、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、修飾的核酸的納米顆粒，或用作穩(wěn)定蛋白質(zhì)的納米顆粒，將 含有谷固醇或豆固醇的SML用在營養(yǎng)產(chǎn)品中以供治療高膽固醇血癥，以及利用SML和組合 物作為生物傳感器。固醇修飾的兩親脂質(zhì)本發(fā)明化合物是具有兩個或更多個疏水性尾部的兩親脂質(zhì)化合物，疏水性尾部中 至少一個是固醇。親水性首基通常連接于兩個或三個疏水性尾基，但可含有更多個，例如基 于具有四個疏水性尾基的雙磷脂酰甘油首基結(jié)構(gòu)(例如心磷脂)的固醇修飾兩親脂質(zhì)。依據(jù)至少兩個通用原則設(shè)計化合物1)固醇共價連接于親水性首基；和2)該化合 物是具有兩個或更多個疏水性尾部的兩親分子。因此，SML化合物的設(shè)計具有顯著的靈活 性并能為給定的最終應(yīng)用微調(diào)各特性，例如1)兩個尾部的總疏水性和首基的親水性之間 的平衡；和2)特定固醇修飾兩親脂質(zhì)的所需功能(例如，與作為前藥或本身作為藥物的功 能相比，用于乳液或脂質(zhì)體中以促進遞送，等等)。所述化合物不僅可有助于將充足的膽固醇摻入脂質(zhì)系統(tǒng)以穩(wěn)定固醇修飾的兩親 脂質(zhì)所存在的系統(tǒng)，還能抑制固醇從該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移，因為固醇與該系統(tǒng)共價相連并強烈結(jié)合。 例如，脂質(zhì)體中固醇修飾的兩親脂質(zhì)可穩(wěn)定脂質(zhì)體并增強生理條件下(例如，37°C，有生物學(xué)流體存在下，例如血清存在下)脂質(zhì)體內(nèi)含物滲漏的耐受性。對于SML化合物的固醇組分，固醇基團通常是基于或衍生自固醇化合物的天然或 合成結(jié)構(gòu)，所述固醇化合物攜帶(經(jīng)修飾以攜帶)用于共價連接SML的親水性首基的官能 團。例如，通常發(fā)現(xiàn)生物來源的固醇是游離固醇、酰化(固醇酯)、烷化(固醇基烷基醚)、 硫酸化(硫酸膽固醇)，或連接于本身可酰化(?；墓檀继擒?的糖苷部分(固醇基糖 苷)(參見，例如通過引用全文納入本文的Fahy等，J. Lipid Research (2005) 46 :839_861)。 例子包括(1)可從動物來源獲得的固醇，本文稱為“動物固醇”，例如動物固醇膽固醇和某 些類固醇激素；和(2)可從植物、真菌和海洋來源獲得的固醇，本文稱為“植物固醇”，例如 植物固醇油菜固醇、谷固醇、豆固醇和麥角固醇。這些固醇通常攜帶至少一個游離羥基，一 般在環(huán)A的3位，另一位置或它們的組合，或者可視需要經(jīng)修飾摻入合適的羥基或其它官能 團。因此，固醇組分可依據(jù)SML構(gòu)建物、組成和/或給定的最終應(yīng)用而在固醇結(jié)構(gòu)的各種位 置連接于SML化合物。特別感興趣的固醇是攜帶獨特官能團以連接SML的首基的簡單固醇。所述獨特官 能團是羥基的簡單固醇尤其感興趣，具體地說，是在環(huán)A的3位具有羥基的簡單固醇(例 如，膽固醇、β -谷固醇、豆固醇、油菜固醇和菜子固醇、麥角固醇等以及它們的衍生物)。在一些實施方式中，SML包含至少一個簡單固醇。在其它實施方式中，SML包含至 少一個在固醇環(huán)A的3位連接于SML首基的簡單固醇。在具體的實施方式中，SML包含至少 一個在固醇環(huán)A的3位連接于SML首基的簡單固醇，其中所述固醇是基于或衍生自環(huán)A的 3位具有一個羥基的簡單固醇(例如，膽固醇、β-谷固醇、豆固醇、油菜固醇和菜子固醇、麥 角固醇等以及它們的衍生物)。在某些實施方式中，SML的固醇組分不是膽酸或膽鹽。在其它實施方式中，SML的 固醇組分不是類固醇。在一些實施方式中，SML的固醇組分不是類固醇偶連物。在某些實 施方式中，SML的固醇組分不是開環(huán)類固醇(secosteroid)。在其它實施方式中，SML化合物可包括膽酸組分。例如，含有特別感興趣的膽酸組 分的一類SML化合物是其中膽酸的羧基連接于以下分子的胺的化合物D-紅-鞘氨醇、鞘 氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸膽堿(溶血鞘磷脂(lysosphingomyelin))、糖基化鞘氨醇、二氫 鞘氨醇、二氫鞘氨醇-ι-磷酸、二氫鞘氨醇磷酸膽堿等，其中疏水性鏈可變。含有感興趣的 膽酸組分的第二類SML化合物是其中膽酸連接于甘油磷酸膽堿的一個或兩個羥基的那些 化合物在還有其它實施方式中，SML化合物可包含經(jīng)合適的連接基團連接于以下分子，或 者在其它實施方式中，連接于其它磷脂基團的類固醇組分、類固醇偶聯(lián)物組分和/或開環(huán) 類固醇組分D-紅-鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸膽堿(溶血鞘磷脂)、糖基化鞘氨 醇、二氫鞘氨醇、二氫鞘氨醇-ι-磷酸、二氫鞘氨醇磷酸膽堿等，其中疏水性鏈可變。特別感興趣的示范性SML如下所示包含取代或未取代的膽固醇的SML ；包含取 代或未取代的β _谷固醇的SML ；包含取代或未取代的豆固醇的SML ；包含取代或未取代的 油菜固醇的SML ；包含取代或未取代的菜子固醇的SML ；和包含取代或未取代的麥角固醇的 SML。特別感興趣的是膽固醇。感興趣的膽固醇類別(包括取代的膽固醇)的代表性 固醇包括，例如以下固醇(參見表1) (1)天然和合成的固醇，例如膽固醇(羊毛)、膽固醇(源自植物的)、2，4-去氫膽固醇、豆固醇、β -谷固醇、硫代膽固醇、丙烯酸3-膽固醇酯； (2) A-環(huán)取代的氧化固醇，例如膽甾烷醇和膽甾烯酮；(3)B-環(huán)取代的氧化固醇，例如7-酮 膽固醇(7-ket0Ch0leSter0l)、5a，6α-環(huán)氧膽甾烷醇、5β，6β-環(huán)氧膽甾烷醇和7_脫氫 膽固醇；(4)D-環(huán)取代的氧化固醇，例如15-酮膽甾烯和15-酮膽甾烯；(5)側(cè)鏈取代的氧化 固醇，例如25-羥基膽固醇、27-羥基膽固醇、24 (R/S)-羥基膽固醇、24 (R/S)，25-環(huán)氧膽固 醇和24(S)，25-環(huán)氧膽固醇；(6)羊毛固醇，例如24-二氫羊毛固醇和羊毛固醇；(7)氟化固 醇，例如F7-膽固醇、F7-5 a ,6a-環(huán)氧膽甾烷醇、F7_5 β，6 β -環(huán)氧膽甾烷醇和F7_7_酮膽 固醇；(8)熒光膽固醇，例如25-NBD膽固醇、脫氫麥角固醇和膽固醇三烯。這些化合物還可 包括氘化和未氘化的形式，這些化合物可市售購得，例如購自阿凡提極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids,Inc)。表1 代表性的膽固醇和衍生化合物表1 代表性的膽固醇和衍生化合物 表1 代表性的膽固醇和衍生化合物 表1 代表性的膽固醇和衍生化合物 提供的SML化合物可以是外消旋或立體純的化合物。在一些實施方式中，SML化合 物是立體化學(xué)純的。其它實施方式提供外消旋SML。例如，可合成包含溶血鞘磷脂和溶PC 的SML以提供一種異構(gòu)體(如果所連接的不是外消旋的)，而其它途徑提供外消旋化合物。 在具有氨基酸分支核心(branching core)作為首基部分的SML的情況中，可存在D或L形 式，或外消旋化合物。因此，提供的SML可以是D或L異構(gòu)體，或外消旋化合物(取決于用于 合成的形式)。尤其可用作分支核心的氨基酸包括賴氨酸、鳥氨酸、二氨基丙氨酸、二氨基 丁酸、二氨基乙酸、氨基乙基甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 組氨酸、羥脯氨酸、S ’，δ ’ -二氨基丙基鳥氨酸、炔丙基甘氨酸和3，5-氨基-苯甲酸。對于含有至少一個非固醇疏水性尾部的SML化合物，該非固醇疏水性尾部包含飽 和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的脂族鏈。特別感興趣的是約2-約40個碳原 子長的非固醇疏水性尾部，可以是飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的。例如， 此例中SML的非固醇部分是飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈，其具有 2-40個碳原子，通常是4-30個碳原子，常見的是4-25個碳原子，更常見的是6_24個碳原子，更常見的是10-20個碳原子。當(dāng)非固醇部分是基于飽和脂族烴鏈的取代脂族烴鏈，例如含烷基的飽和鏈時，亞 烷基的1、2、3、4或更多個碳原子(通常不超過約10個碳原子)可被選自氧、硅、硫或氮原 子的雜原子取代，其中該亞烷基的1、2、3、4或更多個氫原子(通常不超過氫原子的總數(shù)) 可被氟取代。特別感興趣的非固醇鏈?zhǔn)腔诨蜓苌愿鞣N脂質(zhì)的那些，例如脂族酸、甘 油酯、甘油磷脂、鞘脂、孕烯醇脂質(zhì)(prenol lipid)和糖脂，例如Fahy等，J. Lipid Research(2005)46 :839_861 所述的脂質(zhì)。應(yīng)該注意可根據(jù)所需的分子親脂性選擇SML化合物的疏水性尾部烴鏈中的碳數(shù) 目。分子的親脂性與所需鏈長直接相關(guān)。如果固醇修飾的兩親脂質(zhì)用于脂質(zhì)體中，10-24個 碳的分子是尤其感興趣的，因為這樣能提供疏水性適合于形成穩(wěn)定囊泡的分子。用雜原子， 例如氧取代烴鏈中亞烷基的碳原子能對該分子的親脂性施加所需影響。同樣的原理適用于 氟化烴鏈。因此，一個或多個疏水性尾部的理想烴鏈長度可根據(jù)雜原子的取代程度而有所 不同。還應(yīng)注意，取代的脂族烴鏈可包括用一個或多個芳基或雜芳基，例如芳族(如苯基或 取代的苯基)或雜芳族(例如，吡啶或取代的吡啶)取代的那些。SML化合物還包括可通過切割(例如，酶或化學(xué)切割)從親代化合物釋放疏水性 尾基的那些。例如，SML中的一個或多個共價鍵能在預(yù)先選擇的條件下，例如酯鏈接觸酯酶 或堿性PH條件下切割。在另一實例中，SML中存在的二硫鍵可在還原條件下切割。特別感 興趣的是其中至少一個疏水性尾部包含通過可切割鍵連接于SML的疏水性物質(zhì)或藥物的 SML。在某些實施方式中，SML的一個或多個疏水性尾基是可聚合的脂族酸，例如10， 12-二十三碳二炔酸(10，12-tricosadiynoic acid)。在其它實施方式中，SML包含一個或 多個疏水性尾基，所述尾基包含(i)具有6-30個碳原子的聚丙二醇短鏈；(ii)具有3-30個 硅原子的含硅線形或分支鏈；和/或(iii)具有5-40個碳原子的孕烯醇脂質(zhì)。對于親水性首基，SML化合物的該組分包含荷電基團、極性基團或荷電和極性基團 的組合。荷電基團包括陰離子和陽離子部分。陰離子基團的例子(在該情況中，分子的疏 水性尾基和分支核心部分以R表示)包括但不限于硼酸(RBO2H2)、羧酸根(RCO2-)、硫酸根 (RS04_)、磺酸根(RS03_)和磷酸根(RP04H_)、膦酸根(RP03H_)，它們代表了兩親脂質(zhì)首基的常 見荷電官能團。陽離子基團的例子包括但不限于胺(RNH3+)、甲基化的胺、多胺，例如精胺 等，以及含有酸性和堿性基團(因此是兩性的)，作為兩性離子或在某些PH下是陽離子(例 如，組氨酸)存在的兩性電解質(zhì)，它們也代表了兩親脂質(zhì)首基的荷電官能團。極性、不帶電 荷的基團的例子是醇類(-0H)，例如甘油、糖、極性氨基酸(包括兩性離子氨基酸)和寡聚乙 二醇。在某些實施方式中，親水性首基包含其它兩親脂質(zhì)首基的其它額外元素，例如膽堿、 乙醇胺、甘油、核酸、糖、肌醇、疊氮化物、炔丙基和絲氨酸。親水性首基可以是天然或合成的首基，例如氨基酸或衍生物、肽、金屬螯合劑、芳 基或雜芳基衍生物、或連接尾基和攜帶荷電或極性特性的任何合適結(jié)構(gòu)，只要整個首基是 親水性。親水性首基還可以是基于或衍生自兩親脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，該兩親脂質(zhì)攜帶(經(jīng)修飾以 攜帶)一個或多個用于共價連接SML的疏水性尾部的官能團。例如，親水性首基可以基于或 衍生自生物來源的兩親脂質(zhì)，例如甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和糖脂，如來自Fahy等，J. LipidResearch(2005)46 :839_861 所述的脂質(zhì)。感興趣的親水性首基的具體例子包括但不限于包含選自以下的第一分子的首 基硼酸(RBO2H2)、羧酸根(RCO2-)、硫酸根(RSO4-)、磺酸根(RS03_)和磷酸根(RP04H_)、膦酸 根(RP03H_)、胺(RNH3+)、甘油、糖類，例如乳糖或衍生自透明質(zhì)酸，極性氨基酸、聚氧化乙烯 (也稱為聚乙二醇)，例如單甲氧基聚乙二醇、分支聚乙二醇和寡聚乙二醇，任選偶聯(lián)于選 自膽堿、乙醇胺、甘油、核酸、糖、肌醇或絲氨酸的第二分子的殘基。在此，首基依然可含有各 種其它修飾，例如在寡聚乙二醇和聚氧化乙烯(PEG)首基的情況中，這種PEG鏈的末端可含 有甲基或具有遠端官能團以便進一步修飾。特別感興趣的親水性首基的例子包括但不限于磷酸根、磷酸膽堿、磷酸甘油、磷 酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰膽堿、聚乙二醇、聚甘油、三-次氨基三乙酸、三 聚氰胺、葡糖胺、三甲胺、精胺、亞精胺和偶聯(lián)的羧酸根、硫酸根、硼酸、磺酸根、硫酸根和碳 水化合物。首基仍然可含有各種修飾，例如用活化的官能團，例如疊氮化物、馬來酰亞胺、 溴乙?；?、2-吡啶基二硫醇(pyridyldithiol)、烯烴或炔丙基作末端功能化的聚乙二醇首 基。親水性首基還可包含和/或偶聯(lián)于第二分子的殘基，其中磷酸乙醇胺-N-[單甲氧基聚 乙二醇]2000和磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸代表了特別感興趣的一些例子。因此，在某些實施方式中，SML包含含有天然氨基酸的首基和/或分支核心。在其 它實施方式中，SML包含合成氨基酸的首基和/或分支核心。“天然氨基酸”指可從生物來 源獲得的氨基酸，例如天然產(chǎn)生的遺傳學(xué)編碼氨基酸和其它核糖體裝配的氨基酸?！昂铣砂?基酸”指可從生物來源分離的氨基酸以外的氨基酸。如上所述，這種天然和合成氨基酸的例 子包括賴氨酸、鳥氨酸、二氨基丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基乙基甘氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、S ’，δ ’-二氨基丙基鳥 氨酸、炔丙基甘氨酸和3，5-氨基-苯甲酸，其在SML中可作為D或L異構(gòu)體，或作為外消旋 化合物存在(取決于合成所用的形式)。在進一步的實施方式中，SML包含具有配體結(jié)合部分，例如靶向配體的親水性首 基。經(jīng)改造含有靶向配體的SML能與靶分子，例如選擇性結(jié)合特異性表位的抗體或其片段 選擇性形成高親和力結(jié)合配對。在一個實施方式中，靶向配體是金屬螯合劑。金屬螯合劑的 例子包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、次氨基三乙酸(NTA) 和它們的衍生物。例如，三-次氨基三乙酸(tri-NTA)及其各種衍生物描述于Huang等， Bioconj. Chem. 2006,17 :1592_1600。特征性SML包含首基，所述首基包含三-次氨基三乙 酸及其衍生物，例如磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸，該SML對于高親和力結(jié)合 組氨酸標(biāo)記的分子特別有用。特別感興趣的SML如下式所示(R1)(R2)G-XiSl式中R1和R2是疏水性尾基，G是分支核心，和X是親水性首基，其中R1和R2中至 少一個是固醇。式I的X、G、Ri和R2基團各自對式I所示化合物的一種或多種其它特征有貢獻，只 要該化合物包含至少一個首基和至少兩個疏水性尾部，其中至少一個是固醇(例如，參見 式III)。式I所示化合物還可包括具有一個或多個額外分支點、一個或多個額外尾部和/ 或一個或多個首基的化合物，前提依舊是該化合物包含至少一個親水性首基和其中至少一個是固醇的至少兩個疏水性尾部。例子包括式(R1) (R2)G-X-G(Rs) (R4)所示的SML化合物， 其中R3和R4各自可以存在或不存在，例如依據(jù)心磷脂首部/分支核心構(gòu)建物的SML，其中 存在R1、! 2、! 3和R4。特別感興趣的SML是式I所示具有連接的一個首部/分支核心基團和 兩個疏水性尾部的單固醇和二固醇兩親脂質(zhì)。在一個實施方式中，如果式I所示化合物只含有一個固醇部分(即，位于R1或R2 處的固醇)，非固醇部分包含長約2-約40個碳原子的脂族鏈，其可以是飽和或不飽和的、線 形或分支的、取代或未取代的。例如，非固醇部分(相應(yīng)的R1或R2處)是具有2-40個碳原 子、通常是4-30個碳原子、常見的是4-25個碳原子、更常見的是6-24個碳原子、更常見的 是10-20個碳原子的飽和或不飽和、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈，其中R1或R2的亞 烷基的1、2、3、4或更多個碳原子(通常不超過約10個碳原子)可被選自氧、硅、硫或氮原 子的雜原子取代，其中R1或R2的亞烷基的1、2、3、4或更多個氫原子(通常不超過氫原子的 總數(shù))可被氟取代。在此，仍然可依據(jù)分子的所需特性選擇SML化合物的碳數(shù)目和非固醇 疏水性尾部的取代類型及數(shù)量。在一個實施方式中，單固醇兩親脂質(zhì)如式I所示，其中R1或R2之一是包含動物固 醇或支鏈固醇的固醇(例如，膽固醇、類固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麥角固醇和豆固醇)， 其中R1或R2之一是包含具有2-30個碳原子的飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取 代的烴鏈的非固醇部分，G是將R1和R2連接于親水性首基X的分支核心。在另一實施方式中，式I的R1或R2之一是具有2-40個碳原子的飽和或不飽和的、 線形或分支的、取代或未取代的烴鏈。在某些實施方式中，式I的R1或R2之一是具有4-24 個碳原子的飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈。在其它實施方式中，式 I的R1或R2之一是具有6-24個碳原子的飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的 烴鏈。在還要其它實施方式中，式I的R1或R2之一是具有10-20個碳原子的飽和或不飽和 的、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈?？傮w上，當(dāng)式I的R1或R2之一依據(jù)具有一個或多個亞烷基的不飽和、取代的脂族 烴鏈時，額外的R1或R2基團包括其中亞烷基的1、2、3、4或更多個碳原子，但通常是不超過 約10個碳原子可被選自氧、硅、硫或氮原子的雜原子取代的那些。此外，不飽和的R1或R2 脂族烴鏈的亞烷基中1、2、3、4或更多個氫原子(通常不超過氫原子總數(shù))可被氟取代。特別感興趣的非固醇鏈的例子是基于或可衍生自各種脂質(zhì)的那些，例如脂族酸、 甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、孕烯醇脂質(zhì)和糖脂，例如Fahy等，J.Lipid Research(2005)46 839-861所述的脂質(zhì)。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是可通過酶切割從親代化合物 釋放的疏水性藥物。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1、R2和X經(jīng)共價鍵連接 于G，所述共價鍵中至少一個能在預(yù)選擇的條件下，例如二硫鍵接觸還原條件或酯接觸堿性 條件下切割。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是可聚合的脂族酸，例如 10，12- 二十三碳二炔酸。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有6-30 個碳原子的聚丙二醇短鏈。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有3-30 個硅原子的含硅線形或分支鏈。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有 5-40個碳原子的孕烯醇脂質(zhì)。在一個實施方式中，以上式I所示化合物的G是具有至少三個連接點的分支核心，其中一個連接點連接于親水性首基X，兩個連接點各自獨立連接于親水性尾基R1和R2。因 此，在某些實施方式中，G是衍生自具有至少三個用于連接R1、R2和X的官能團的化合物的 分支核心，例如選自以下結(jié)構(gòu)的化合物
O NHNH2
unArCoH H2N-^V0h ΗΟ-^γ^ΟΗ H2N^^NH2 HO-^OH Η^^γ^ΟΗ HO Μ； YJiNH2OHOHOH
O式中η可以是0、1、2或3。在該實施方式中，R1和R2可以在任何位置，其余位置被X 占據(jù)。因此，親水性首基X連接于一個官能團(例如，羧基(-C00H)、胺(-NH2)或醇(-0Η))， 親水性尾基R1和R2連接于其余的官能團(例如，羧基(-C00H)、胺(-NH2)或醇(-0Η))。式I中的X是親水性基團，通常是親水性首基。在具體的實施方式中，親水性基團 包含荷電基團、極性基團或荷電和極性基團的組合。因此，親水性基團x(或G-X)可以是 合成基團，例如氨基酸或衍生物，芳基或雜芳基衍生物，或連接尾基和攜帶荷電或極性特性 的任何合適結(jié)構(gòu)，只要SML的整個首基是親水性的。特別感興趣的芳基或雜芳基衍生物親 水性基團X的例子是色甘酸(chromolyn)和羥乙酸色甘酸(glycolate chromolyn) (G-X)。 親水性基團X(或G-X)還可以是基于或衍生自攜帶(或經(jīng)修飾攜帶)一個或多個用于共價 連接SML的疏水性尾部的官能團的兩親脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如，親水性基團X(或G-X)可以基于 或衍生自生物來源的兩親脂質(zhì)，例如甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和糖脂，例如Fahy等，J. Lipid Research (2005) 46 :839_861所述的脂質(zhì)。X和G-X的示范性基團包括但不一定限于磷酸 根、磷酸膽堿、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰膽堿、聚乙二醇、聚 甘油、三聚氰胺、葡糖胺、透明質(zhì)酸和三甲胺。在一些實施方式中，感興趣的部分提供G-X。例如，如下文詳述的，可由肉堿提供 G-X，進而連接于式I所示的R1和R2。在其它實施方式中，由雙磷脂酰甘油(例如，心磷脂)提供G-X，進而連接于式I所 示的R1和R2基團(至少兩個，最多4個)。特別感興趣的示范性化合物是通式I所示的化合物，其中G是甘油，X是磷酸膽堿。在另一實施方式中，以上式I所示化合物的R1-G選自鞘氨醇和鞘脂 (sphingonine)。在還有另一實施方式中，以上式I所示化合物的G-X是肉堿。特別感興趣的是固醇甘油磷脂，其表示具有甘油核心的脂質(zhì)，其中至少一個固醇 取代脂肪酸尾基。固醇甘油磷脂的例子包括sn-甘油基-3-磷酸的任何衍生物，其含有至 少一個與甘油部分相連的固醇殘基和由，例如含氮堿基、甘油或肌醇單位構(gòu)成的極性首基。 對于單固醇甘油磷脂，固醇連接于甘油部分的一個殘基，該甘油部分的另一殘基是，例如 0-?；?、0-烷基、0-烯-1'-基或0-氨基甲酸酯基。它們可以是相同或不同的固醇和脂 肪酸亞單位。在固醇甘油磷脂的具體示范性實施方式中，化合物如式I所示，其中G是甘油，X是 磷酸膽堿。特別感興趣的化合物如通式II所示或其藥學(xué)上可接受的鹽
9 O ,R1 o^T^cr % ^"N/ 式11
R2O0,、式中R1和R2獨立為疏水性部分，其中R1和R2中至少一個是固醇，當(dāng)R1或R2中只有一個是固醇時，非固醇部分是具有2-40個碳原子、通常是4-25個碳原子、更常見的是6-24 個碳原子、更常見的是10-20個碳原子的飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的 烴鏈，其中R1(或R2)的亞烷基的1、2、3、4或更多個碳原子被選自氧、硫或氮原子的雜原子 取代，其中R1(或R2)的亞烷基中1、2、3、4或更多個氫原子可被氟取代。R1(或R2)的非固 醇部分可以是上述任何非固醇部分。在具體的實施方式中，式II所示化合物具有下表2所示結(jié)構(gòu)式表2 示范性的固醇-修飾磷脂(SPLs)a a 側(cè)接通用結(jié)構(gòu)的通式 II ；b'c'en = 18、16、14 ；d'fn = 17、15、13。gCHEMS 膽固醇基半琥珀酸(cholesterylhemisuccinic acid) ；hStigHS 豆固醇 基半玻拍酸(stigmasterylhemisuccinic acid)；iSitoHS 谷固醇基半琥珀酸。在其它具體實施方式
中，化合物如式III所示或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1、G 和X包含在鞘氨醇磷酸膽堿中(溶血鞘磷脂)和R2是固醇 特別感興趣的式III所示化合物的例子是其中R2是膽固醇半琥珀酸酯或其它固 醇衍生物。如上式I所反映的，本發(fā)明考慮其中R1或R2之一是固醇的化合物，以及R1和R2均 是固醇的化合物。在這種實施方式中，R1和R2獨立選擇，從而它們可以是相同或不同的固 醇。特別有用的類固醇組合的例子是膽固醇和麥角固醇、膽固醇和谷固醇、膽固醇和豆固醇 以及豆固醇和谷固醇。特別感興趣的示范性SML包括基于或可衍生自兩親脂質(zhì)的那些，所述脂質(zhì)選自甘 油磷脂、神經(jīng)鞘氨醇磷脂、肉堿脂質(zhì)和氨基酸脂質(zhì)。例如，氨基酸磷脂是偶聯(lián)于磷酸修飾的 氨基酸親水性首基的脂質(zhì)。例子包括但不限于(1)式II所示的固醇修飾的甘油磷脂是，例如選自以下的化合物SMLla、SMLlb, SMLlc、SML2a、SML2b、SML2c、SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、 SML4d、SML5a、SML5b、SML5c、SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML9a、 SML9b、SML9c、SML 10a, SML 10b, SMLlOc、SMLlOd、SMLlOe、SMLlOf、SML 13a, SML 13b, SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、 SML15g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、SML16d、SML16e、SML16f、 SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML161 禾口 SML16m 以及它們的 行生物；(2)式III所示的固醇修飾的神經(jīng)鞘氨醇磷脂是，例如選自以下的化合物SML8a、 SML8b、SML8c、SML8d、SML8e 和 SML8f 以及它們的衍生物；(3)式I所示的固醇修飾的肉堿脂質(zhì)是，例如選自以下的化合物SMLlla、SMLllb、 SMLllc、SMLlId, SMLlle和SMLllf以及它們的衍生物；(4)式I所示的固醇修飾的氨基酸脂質(zhì)，特別是親水性首基包含氨基酸的那些是， 例如選自以下的化合物SML12a、SML 12b, SML12c、SML12d、SML12e、SML12f、SML13i、SML13 j 和SML13k以及它們的衍生物；和(5)式I所示，具有用活化的部分，例如疊氮化物、馬來酰亞胺、溴乙?；?、2-吡啶 基二硫醇、烯烴和炔丙基作末端功能化的活化親水性首基的固醇修飾兩親脂質(zhì)是，例如選 自以下的化合物SML14a、SML 14b, SML 14c, SML14d、SML 14e和SML14f以及它們的衍生物。因此，特征性實施方式包括選自以下的SML化合物SMLla、SMLlb, SMLlc、SML2a、 SML2b、SML2c、SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、SML4d、SML5a、 SML5b、SML5c、SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML8a、SML8b、SML8c、 SML8d、SML8e、SNL8f、SML9a、SML9b、SML9c、SMLlOa、SMLlOb, SMLlOc、SMLlOd、SMLlOe, SMLlOf、SMLlla、SMLllb、SMLllc、SMLlId、SMLlle、SMLlIf、SML12a、SML12b、SML12c、SML12d、 SML12e、SML12f、SML13a、SML13b、SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML13i、 SML13j、SML13k、SML14a、SML14b、SML14c、SML14d、SML14e、SML14f、SML15a、SML15b、SML15c、 SML15d、SML15e、SML15f、SMJ5g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、 SML16d、SML16e、SML16f、SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML161 禾口 SML16m，這些 化合物如表3所述以及它們的衍生物。表3 表3 固醇修飾的兩親脂質(zhì)的特性可將本發(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)設(shè)計成當(dāng)存在于雙層中，例如脂質(zhì)體中時能顯示 各種物理特性。示范性的此類物理特性是相轉(zhuǎn)變行為、焓和抵抗脂質(zhì)體內(nèi)含物的滲漏。例 如，可通過一個或多個內(nèi)含物滲漏試驗評估含有本發(fā)明SML的脂質(zhì)體在生理條件下滲漏 (例如，37°C，有血清存在)，或接觸滲應(yīng)力時的穩(wěn)定性。還可利用SML對合成的雙?；字?的轉(zhuǎn)換溫度和焓的影響來表征它們。在一個實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)提供在體內(nèi)生理條件(或模擬這種體內(nèi) 生理條件的體外條件)下耐受滲漏的穩(wěn)定脂質(zhì)體，從而在約7天期間檢測到的脂質(zhì)體內(nèi)含 物滲漏少于30%、少于25%、少于20%、少于15%、少于10%或少于5%直至檢測不到。在 進一步的實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)可提供在生理條件下耐受滲漏的脂質(zhì)體，從而 在約14天期間檢測到的脂質(zhì)體內(nèi)含物滲漏少于少于25%、少于20%、少于15%、少于10% 或少于5%或少于直至檢測不到。此外，固醇修飾的兩親脂質(zhì)可提供在耐受滲漏的脂質(zhì) 體，從而在約7天期間，在生理條件下維持約80%、90%或更多的脂質(zhì)體內(nèi)含物；在約14天 期間，在生理條件下維持約60 %、70 %、80 %、90 %或更多的脂質(zhì)體內(nèi)含物；在約21天期間， 在生理條件下維持約40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的脂質(zhì)體內(nèi)含物；和/或在 約28天期間，在生理條件下維持約20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或更多的 脂質(zhì)體內(nèi)含物。
在具體的實施方式中，穩(wěn)定的脂質(zhì)體組合物包含的固醇修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含 量通常是至少15%、至少20%、至少25%、至少30%，可以是15% _90%、15% -35%、 30% -70%,35% -80%,35% -65%或 40% -70%，還可以存在更高含量，例如 90% -95%, 或者更高的脂質(zhì)體總脂質(zhì)摩爾含量。在特定的實施方式中，固醇修飾兩親脂質(zhì)的固醇 (例如，膽固醇)存在于脂質(zhì)體組合物中，從而能提供的固醇的摩爾含量為至少25%、至 少30%、至少50%、至少60%、至少70%或更高。在具體的實施方式中，脂質(zhì)體組合物包 含摩爾含量為至少30%、至少35%、至少70%、至少85%或更高的單固醇修飾的兩親脂 質(zhì)。在另一特定實施方式中，脂質(zhì)體組合物包含的雙固醇_修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含量是約 15% -35%，可以是至少30%或更高、至少40%、至少45%或更高。_腦、___細■聽?wèi)踅锓？蓪⒈景l(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)設(shè)計成能提供所需特性，例如所需的物理特征 (例如，親脂性)和/或功能活性(例如，作為藥物或前藥的活性)。例如，可將本發(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)設(shè)計成能用作前藥，S卩，可從活性較低的形 式轉(zhuǎn)化成活性較高形式的化合物。因此，在一些實施方式中，以上通式I所示化合物的R1或 R2是可通過酶促切割從親代化合物釋放的疏水性藥物。因此，例如通式I涵蓋了其中R1是 感興趣藥物，而R2是固醇的化合物。將固醇和藥物摻入單固醇修飾的兩親脂質(zhì)優(yōu)于常規(guī)脂 質(zhì)體前藥，因為可單獨通過固醇修飾的兩親脂質(zhì)前藥或與最小互補組分聯(lián)用獲得穩(wěn)定的脂 質(zhì)體，因而能簡化前藥配制。此外，共價相連的固醇可促進脂質(zhì)體前藥在生物流體中的穩(wěn)定 性，從而該脂質(zhì)體可逐漸累積在靶向治療部位，例如與身體的其它部位相比，前藥切割增強 的部位(例如，酶活性升高的部位，或PH較低或高于7. 4，等等)。如果通式I所示化合物是前藥，則Rl和R2中至少一個是固醇，其中Rl和R2中至 少一個是疏水性藥物。示范性疏水性藥物包括固醇(例如類固醇)、類胡蘿卜素、維生素、 脂肪酸、小分子疏水性藥物、分化因子和麻醉劑。疏水性藥物的例子包括但不一定限于視 黃酸(例如，全反式視黃酸；13-順式視黃酸)、類固醇和衍生物(例如，C18類固醇(雌激 素)和衍生物；C19類固醇(雄激素，例如睪酮和雄酮)和衍生物；C21類固醇(糖皮質(zhì)激 素/鹽皮質(zhì)激素、孕激素以及糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素及衍生物)和開環(huán)類固醇及衍生物 (例如，維生素D2和衍生物；維生素D3和衍生物，它們的特征在于核心結(jié)構(gòu)的B環(huán)開環(huán)，因 此有“開環(huán)”這一前綴)。特別感興趣的是式I所示前藥化合物，其中R1是簡單的固醇，R2 是疏水性藥物。在一具體實施方式
中，R1是固醇，R2是視黃酸。當(dāng)G-X是磷酸膽堿時，可由 磷脂酶A2切割sn-2位的酯鍵，從而釋放視黃酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可在所需藥物的 SML脂質(zhì)體前藥的制備中作出許多改變和改進。如果需要提供固醇修飾的兩親脂質(zhì)作為前藥，R1A2和X通過共價鍵連接于式I的 G，從而至少一根共價鍵易于在所需條件下切割。例如，固醇修飾的兩親脂質(zhì)可以在還原條 件下酶促切割，或在低PH下是可切割的。例如，R1、! 2和X可以通過共價鍵連接于式I的G， 共價鍵中至少一根在還原條件下可切割。例如，可將二硫鍵引入R2和X之間，從而可經(jīng)由 還原環(huán)境觸發(fā)切割。本發(fā)明化合物可用于在具有特征性還原環(huán)境的，例如胞內(nèi)環(huán)境，如胞質(zhì) 溶膠中，胞內(nèi)囊泡中(例如，內(nèi)含體、吞噬小泡)等所見的特定部位觸發(fā)藥物釋放。還可將固醇修飾的兩親脂質(zhì)設(shè)計成具有陽離子首基，從而通過非共價電荷_電荷 相互作用而促進帶負(fù)電荷的治療部分的遞送。例如，式I的G-X可以是人體代謝過程必需的分子_肉堿。本發(fā)明化合物可提供有用工具以便將核酸，例如RNA、DNA、寡核苷酸或siRNA 遞送入培養(yǎng)的細胞和體內(nèi)細胞。例如，帶負(fù)電荷的核酸可通過為此目的而設(shè)計的SML的陽 離子首基形成復(fù)合體，進而遞送至靶部位。還可設(shè)計固醇修飾的兩親脂質(zhì)，從而R1和/或R2基團能影響化合物的組裝，例如 在脂質(zhì)體中。例如，在一個實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)可包含可聚合的鏈。例如，以 上式I所示化合物的R1或R2含有可聚合的脂族酸，例如10，12- 二十三碳二炔酸。聚合固 醇修飾的兩親脂質(zhì)的至少一條鏈可賦予該分子諸多特性，例如可用于基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究、 傳感器領(lǐng)域或藥學(xué)領(lǐng)域的相行為。還可選擇R1或R2從而能提供具有所需親脂性的固醇修飾兩親脂質(zhì)。例如，以上式 I所示化合物的R1或R2可以是亞烷基二醇短鏈，例如具有6-30個碳原子的聚丙二醇鏈。在 固醇修飾的兩親脂質(zhì)中引入聚丙二醇短鏈能影響該分子的疏水性并影響固醇修飾兩親脂 質(zhì)的組裝。如果微調(diào)固醇修飾兩親脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可以獲得膽固醇液晶相。還可設(shè)計固醇修飾的兩親脂質(zhì)從而起到“脂質(zhì)筏”的作用。例如，R2可以是固醇 (例如，膽固醇)，式I的R1-G可選自鞘氨醇和和鞘脂。這種化合物可通過，例如鞘氨醇和 膽固醇之間的相互作用形成人工脂質(zhì)筏。人工脂質(zhì)筏可用作研究蛋白質(zhì)-脂質(zhì)筏相互作用 的工具，據(jù)信，該筏在膜蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和病原體進入中起重要作用。這些固醇-修飾的兩親 脂質(zhì)還可用于遞送蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)細胞膜結(jié)構(gòu)域以防止病原體進入。產(chǎn)牛固醇修飾的兩親脂質(zhì)的方法在另一方面，本發(fā)明提供合成本發(fā)明化合物的各種方法。該方法通常包括將至少 一個固醇尾基經(jīng)分支核心偶聯(lián)于親水性首基，從而產(chǎn)生具有通過分支核心相連的親水性首 基和兩個或更多個疏水性尾基的固醇修飾兩親脂質(zhì)，其中至少一個疏水性尾基包含固醇尾基。在具體的實施方式中，該方法包括(i)將分支核心偶聯(lián)于親水性首基，其中所述 分支核心包含至少一個固醇尾基；和(ii)形成具有通過分支核心相連的親水性首基和兩 個或更多個疏水性尾基的固醇修飾兩親脂質(zhì)，其中至少一個疏水性尾基包含固醇尾基。在另一具體實施方式
中，該方法包括(i)將至少一個固醇尾基偶聯(lián)于分支核心， 其中所述分支核心連接于親水性首基；和(ii)形成具有通過分支核心相連的親水性首基 和兩個或更多個疏水性尾基的固醇修飾兩親脂質(zhì)，其中至少一個疏水性尾基包含固醇尾 基。在以上方法中，當(dāng)固醇修飾的兩親脂質(zhì)包含至少一個非固醇尾基時，可在連接固 醇尾基之前、同時或之后將該非固醇尾基連接于分支核心。因此，這些方法包括各種不同的合成方案，從而為最終的所需產(chǎn)物提供多種不同 的途徑。例如，通?？赏ㄟ^以下步驟制備式I所示化合物(i)提供組分(a)-(c)作為用于 偶聯(lián)的不同預(yù)形成組分，其中組分(a)是分支核心G，組分(b)是包含R1和R2的疏水性尾基， 組分(c)是親水性首基X ；然后(ii)偶聯(lián)組分(a)-(c)從而產(chǎn)生式I所示分子。或者，通常 可通過以下步驟制備式I所示化合物(i)提供用于偶聯(lián)的中間組分(d)和(e)，其中組分 (d)是包含疏水性尾基組分R1和R2的一部分或與其相連的分支核心G (即，(R1) (R2)-G')， 組分(e)是親水性首基X;然后(ii)偶聯(lián)組分(d)-(e)，從而產(chǎn)生式I所示分子?？蔀榇祟惸康牟捎脴?biāo)準(zhǔn)的有機合成方法，例如采用化學(xué)選擇性偶聯(lián)方案、正交保護基團和除去，等等。具體合成途徑的長度通常取決于具體靶分子的復(fù)雜性和可得的起始材料。例如， 可利用高于磷酸膽堿作為起始材料一步反應(yīng)合成二固醇磷酸膽堿。然而，合成含醚連接鍵 的脂質(zhì)需要多步。具體地說，甘油磷酸膽堿是制備式II所示固醇修飾兩親脂質(zhì)的有用起始材料，但 其在大多數(shù)反應(yīng)溶劑中的溶解性差。因此，本發(fā)明總體上提供將甘油磷酸膽堿溶解在有機 溶劑中的有效方法，該方法利用硼酸四苯酯作為膽堿的抗衡離子，具體地說是作為有效且 高效合成含磷酸膽堿的兩親脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變催化劑。作為具體的實施方式中，提供合成含磷 酸膽堿的兩親脂質(zhì)的方法，該方法包括(i)將含至少一個官能團的磷酸膽堿與硼酸四苯 酯在有機溶劑中形成復(fù)合體，和(ii)將一個或多個脂質(zhì)與該磷酸膽堿化合物的官能團偶 聯(lián)，其中所述脂質(zhì)含有至少一個能與磷酸膽堿化合物的官能團反應(yīng)并偶聯(lián)的官能團。在本 發(fā)明的該方面，出于與反應(yīng)的相容性選擇有機溶劑、功能化磷酸膽堿化合物和功能化脂質(zhì)。 用于偶聯(lián)的溶劑和其它試劑是標(biāo)準(zhǔn)溶劑和試劑(例如，甲醇、吡啶、4，4_ 二較佳氨基吡唳， 等等)。所述官能團可以是在反應(yīng)中具有化學(xué)選擇性的任何官能團，例如磷酸膽堿化合物官 能團上的羥基和脂質(zhì)的氯甲酸酯。功能化磷酸膽堿的例子包括但不限于甘油磷酸膽堿、氨 基酸功能化磷酸膽堿等。在某些實施方式中，單脂質(zhì)連接方案以及不同脂質(zhì)的正交連接可 采用各種保護基團策略。所述方法還可包括步驟(iii)純化含磷酸膽堿的兩親脂質(zhì)。本發(fā)明還提供制備含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物的方法。該方法包括將固醇修 飾的兩親脂質(zhì)與非固醇兩親脂質(zhì)、治療劑、美容劑、可檢測標(biāo)記物、緩沖劑、溶劑和賦形劑中 的至少一種混合。該方法還可包括純化該組合物。制備含脂質(zhì)的組合物的方法通常是熟知 的，因此，可用于制備本發(fā)明的SML組合物。該方法尤其可用于制備脂質(zhì)體和乳液。因此，在具體實施方式
中，本發(fā)明提供形成包含本發(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)化合 物的脂質(zhì)體的方法。該方法通常包括使得固醇修飾的兩親脂質(zhì)接觸脂質(zhì)體形成條件，從而 形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體形成條件通常是脂質(zhì)體領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件。該方法可任選包括將固 醇修飾的兩親脂質(zhì)與一種或多種其它兩親脂質(zhì)、試劑、緩沖劑、溶劑和/或賦形劑混合，并 使得該混合物接觸脂質(zhì)體形成條件。該方法還可包括通過熟知方法純化脂質(zhì)體的方法，例 如通過層析、相分離、溶劑萃取、凍干、再水合等。在某些實施方式中，本發(fā)明脂質(zhì)體中固醇修飾的兩親脂質(zhì)含量為至少到最高 100%，特別包括其間以分?jǐn)?shù)增加的范圍，例如0. 5%、1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%、3. 5%、 4%、4. 5%和5%增量，例如在固醇修飾兩親脂質(zhì)含量選自5%、10%、15%、20%、25%、 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100% 的情況
中是5%增量。在具體實施方式
中，制備脂質(zhì)體的方法包括在脂質(zhì)體形成條件下混合(i) 一種或 多種兩親脂質(zhì)與(ii) 一種或多種固醇修飾的兩親脂質(zhì)從而形成脂質(zhì)體，其中所述固醇修 飾的兩親脂質(zhì)含有通過分支核心相連的首基和兩個或更多個疏水性尾基，其中至少一個所 述疏水性尾基包含固醇。在具體實施方式
中，兩親脂質(zhì)和固醇修飾的兩親脂質(zhì)混合的摩爾比應(yīng)能提供固醇 修飾兩親脂質(zhì)的摩爾百分比是至少的脂質(zhì)體組合物。因此，在某些實施方式中，兩親脂 質(zhì)和固醇修飾的兩親脂質(zhì)混合的摩爾比應(yīng)能提供固醇修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含量在至少
29到低于100%的脂質(zhì)體組合物，特別包括其間以分?jǐn)?shù)增加的范圍，例如0.5%、1%、1.5%、 2%、2. 5%、3%、3. 5%、4%、4. 5%和5%增量，例如在固醇修飾兩親脂質(zhì)含量選自5%、 10% ,15%,20%,25%,30%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%的情況中是5%增量。本發(fā)明的特征性方面是脂質(zhì)體組合物包含的固醇修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含量通常 是至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%，可以是 15% ~90%A5% -35%,30% -70%, 35% -80%,35% -65%或40% -70%，還可以存在更高含量，例如90% _95%，或者更高的 脂質(zhì)體總脂質(zhì)摩爾含量。在具體實施方式
中，固醇修飾兩親脂質(zhì)的固醇(例如，膽固醇)存 在于脂質(zhì)體組合物中，從而提供的固醇的摩爾含量為至少25%、至少30%、至少50%、至少 60%、至少70%或更高。在具體的實施方式中，脂質(zhì)體組合物包含摩爾含量為至少30%、至 少35%、至少70%、至少85%或更高的單固醇修飾的兩親脂質(zhì)。在另一特定實施方式中，脂 質(zhì)體組合物包含的雙固醇-修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含量是約15% -35%，可以是至少30%或 更高、至少40%、至少45%或更高。在另一實施方式中，本發(fā)明提供形成包含本發(fā)明固醇修飾的兩親脂質(zhì)化合物的乳 液的方法。該方法通常包括使得固醇修飾的兩親脂質(zhì)接觸乳液形成條件，從而形成乳液。 可采用該方法制備水包油型SML乳液，或油包水型SML乳液等。例如，可采用所述方法構(gòu)建 SML膠束(例如，水包油體系)以及反相或倒裝SML膠束(例如，油包水體系)。乳液形成條件通常是乳液領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件。例如，乳液形成條件包括將SML 分散在連續(xù)水相中，從而產(chǎn)生SML的油包水乳液。或者，乳液形成條件包括將水相分散在連 續(xù)的SML相中，從而產(chǎn)生SML的水包油乳液。乳液形成方法可任選包括混合固醇修飾的兩親脂質(zhì)與一種或多種其它兩親脂質(zhì)。 試劑、緩沖劑、溶劑和/或賦形劑，并使得該混合物接觸乳液形成條件。該方法還可包括通 過各種熟知方法純化該乳液的步驟?？梢曅枰ㄟ^振蕩、攪拌、勻漿或噴霧方法促進乳化，從而形成乳液。SML可用作其 它乳液中的表面活性劑或乳化劑，例如從而能穩(wěn)定乳液以供儲存，特別是用于制備含治療 劑。化妝品和藥物的乳液(例如，制劑、乳膏和洗液)。乳液是轉(zhuǎn)換成油包水乳液還是水包油乳液取決于兩相的體積分?jǐn)?shù)和乳化劑的類 型。通常適用斑克羅夫特規(guī)則(Bancroft rule)乳化劑和乳化顆粒傾向于促進它們不能 良好溶解于其中的相分散。某些實施方式提供納米乳液(nanoemulsion)，其中分散相中顆粒的大小小于 1000納米。包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物本發(fā)明包括各種含有本發(fā)明的固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物。就固醇修飾兩親脂質(zhì) 化合物而言，這種組合物可以是均勻的，或者可包含本文公開的一種或多種不同的固醇修 飾兩親脂質(zhì)化合物。具有不同的固醇修飾兩親脂質(zhì)，例如不同的固醇修飾兩親磷脂的混合 物的組合物可微調(diào)組合物的物理特性，特別是組合物是脂質(zhì)體的情況下。例如，可改變兩親脂質(zhì)和固醇修飾兩親脂質(zhì)的相對量(例如，單固醇修飾兩親脂 質(zhì)(或“m-SML”)、雙固醇修飾兩親脂質(zhì)(或“d-SML”)或二者的組合)以提供所需的物理 特性，例如相轉(zhuǎn)變溫度、脂質(zhì)體生理條件下對滲漏的耐受性、在所需時期(例如，至少一周、至少一個月、至少一年，等等)的儲存穩(wěn)定性(例如，在約4°C)，等等?！胺€(wěn)定的脂質(zhì)”通常 是在限定時期內(nèi)保留所包封內(nèi)含物約90%的制劑。因此，在某些實施方式中，含脂質(zhì)組合物(例如，脂質(zhì)體或乳液)的固醇修飾兩 親脂質(zhì)含量可以是至少到最低100%，特別包括其間以分?jǐn)?shù)增加的范圍，例如0.5%、 1%>1. 5%,2%,2. 5%,3%,3. 5%,4%,4. 5%和5%增量，例如在固醇修飾兩親脂質(zhì)含量選 自 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%和100%的情況中是5%增量。在示范性實施方式中，含脂質(zhì)的組合物中含 有的固醇修飾兩親脂質(zhì)的摩爾含量通常是至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %，可以 是 15% ~90%Λ5% -35%,30% -70%,35% -80%,35% -65%或 40% -70%，還可以存在 更高含量，例如90% _95%，或者更高的脂質(zhì)體總脂質(zhì)摩爾含量。在具體實施方式
中，固醇 修飾兩親脂質(zhì)的固醇(例如，膽固醇)存在于脂質(zhì)體組合物中，從而提供的固醇的摩爾含量 為至少25%、至少30%、至少50%、至少60%、至少70%或更高。在具體的實施方式中，脂 質(zhì)體組合物包含摩爾含量為至少30%、至少35%、至少70%、至少85%或更高的單固醇修 飾的兩親脂質(zhì)。在另一特定實施方式中，脂質(zhì)體組合物包含的雙固醇_修飾兩親脂質(zhì)的摩 爾含量是約15% -35%，可以是至少30%或更高、至少40%、至少45%或更高。考慮的含脂質(zhì)組合物還包括具有一定摩爾比的非固醇修飾兩親脂質(zhì)和固醇修飾 兩親脂質(zhì)的那些，從而提供的含脂質(zhì)組合物具有至少的固醇修飾兩親脂質(zhì)含量。因此在 某些實施方式中，例如在脂質(zhì)體中，含脂質(zhì)組合物中非固醇修飾兩親脂質(zhì)和固醇修飾兩親 脂質(zhì)以一定摩爾比混合存在，從而提供的脂質(zhì)組合物的固醇修飾兩親脂質(zhì)含量是至少 到少于100 %，特別包括其間以分?jǐn)?shù)增加的范圍，例如0. 5 %、1 %、1. 5 %、2 %、2. 5 %、3 %、 3. 5%、4%、4. 5%和5%增量，例如在固醇修飾兩親脂質(zhì)含量選自5%、10%、15%、20%、 25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的情況中 是5%增量。在含SML的組合物中，非固醇兩親脂質(zhì)可以是任何合適的兩親脂質(zhì)(包括任何各 種常規(guī)脂質(zhì)，包括市售可得的脂質(zhì))，例如具有飽和或不飽和的、線形或分支的和/或取代 或未取代的脂族烴鏈的非固醇修飾兩親脂質(zhì)。當(dāng)SML是單固醇修飾兩親脂質(zhì)時，在組合物 中選擇m-SML和非固醇兩親脂質(zhì)可能是理想的，從而非固醇兩親脂質(zhì)和m-SML的疏水性尾 基在性質(zhì)上相似，例如非固醇兩親脂質(zhì)和m-SML的疏水性尾基長度大致相同、作類似取代，寸寸。非固醇兩親脂質(zhì)的脂族烴鏈可以是任何各種不同鏈長度，例如2-約40個碳原子 的長度，可以是飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈。例如，該情況中非 固醇部分是飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的烴鏈，其具有2-40個碳原子， 通常是4-30個碳原子，常見的是4-25個碳原子，更常見的是6-24個碳原子，更常見的是 10-20個碳原子。當(dāng)非固醇部分是基于飽和脂族烴鏈的脂族烴鏈，例如含烯基的飽和鏈時， 亞烷基的1、2、3、4或更多個碳原子(通常不超過約10個碳原子)可被選自氧、硫或氮原子 的雜原子取代的那些，其中亞烷基中1、2、3、4或更多個氫原子(通常不超過氫原子總數(shù)) 可被氟取代。如果要將組合物給予對象，該組合物通常優(yōu)選無菌，并且可儲存在無菌容器(例 如，無菌小瓶)中?？蓪⒔M合物配制成用于各種不同給藥途徑，包括胃腸外、腸道、鼻部和肺部給藥，并可包含一種或多種賦形劑。示范性制劑包括局部、可注射、氣溶膠和口服制劑，可 配制成藥物制品、美容制品、營養(yǎng)制品，等等?？梢詫⒑泄檀夹揎梼捎H脂質(zhì)的組合物凍干， 作為干粉儲存，或者可以儲存在溶液中。包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒本發(fā)明的含SML組合物可提供各種不同形式，本文通常稱為脂質(zhì)顆粒。本文所用 的“脂質(zhì)顆?！北硎景ńY(jié)構(gòu)確定或不定的含SML顆粒。由于兩親分子由親水性和疏水性區(qū) 段構(gòu)成，在水性環(huán)境中時，SML首基面對水，而它們的疏水性尾基彼此相互作用而產(chǎn)生片狀 雙層，以及少量的其它凝聚結(jié)構(gòu)(取決于脂質(zhì)組成和條件)。因此，SML化合物根據(jù)脂質(zhì)和 水含量及溫度可形成各種不同形狀，包括球形(囊泡)、棒狀(管狀)和片狀(平板)。這 些形狀代表相互作用以形成兩維和三維晶格基質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位，所述結(jié)構(gòu)分類為片狀相 (例如，雙層平板、封閉球形)、六角形相(例如，棒狀)或立方體相(例如，經(jīng)溶劑通道相連 的球形、棒狀或片狀)。當(dāng)分子分散在溶劑中時，組織諸區(qū)段最有利的方法是形成疏水性和親水性部分分 隔入不同結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)域和有組織的結(jié)構(gòu)域形成的結(jié)構(gòu)稱為溶劑誘導(dǎo)的液晶 相。這些相的例子是膠束、片狀、六角形、立方體和海綿相。諸相可以是正常和顛倒的。在前 一情況中，界面向油彎曲，在顛倒情況中，界面向水彎曲。相的類型取決于全局參數(shù)(global parameter)，例如混合物的水油比和兩親分子更多的特性。在六角形相中，兩親分子凝聚成 長度不定的圓柱形結(jié)構(gòu)，這些圓柱形凝聚物沉積在六角形晶格上，從而得到相遠程定向等 Wi (phase long-range orientational order) ^^i^f^tM^^iLT^W^0 Μ^ΜΜ ^ψ. 重要的相是膠束、立方體和片狀。本文所述的兩親分子宜是或構(gòu)成這些相中的一種或多種。示范性質(zhì)粒顆粒包括脂質(zhì)體(例如，多_囊泡、多_片層脂質(zhì)體、少_片層脂質(zhì)體、 單_片層脂質(zhì)體，等等)、乳液(包括油和水乳液，例如水包油乳液、油包水乳液，等等，其中 所述油可以是，例如甘油三酯)、固體核心乳液、脂質(zhì)凝聚物(例如，六角形、立方體相)、脂 質(zhì)單層(例如，可以存在于表面上)、脂質(zhì)泡沫，等等。特別感興趣的是含固醇修飾兩親脂質(zhì)的脂質(zhì)體和乳液，其還可任選包含感興趣的 試劑作為有效負(fù)載。術(shù)語“脂質(zhì)體”包括脂雙層體系所包封的任何區(qū)室?！爸|(zhì)體”也稱為 脂質(zhì)囊泡，其表示包括各種形式的脂質(zhì)體，例如多層脂質(zhì)體(平均直徑通常是0. 5-10微米， 由與水相層交替的兩種到上百個同心脂雙層構(gòu)成)、單層囊泡(通常由單脂質(zhì)層構(gòu)成，平均 直徑大致約20-約400納米(nm)、約50-約300nm、約300-約400nm、約100-約200nm)、和 其它囊泡形式，例如少_片層囊泡或多囊泡脂質(zhì)體。m^^mmmmm^mm^m^本發(fā)明還提供制備包含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物的方法。此類方法通常包括混 合固醇修飾的兩親脂質(zhì)與至少一種非固醇兩親脂質(zhì)，和任選的用有效負(fù)載加載該組合物， 所述有效負(fù)載可以是，例如治療劑(例如，藥物試劑、營養(yǎng)劑)、美容試劑、可檢測試劑(例 如，顯像劑)?？稍谟芯彌_劑、溶劑和賦形劑中的一種或多種存在下混合組合物。該方法還 包括篩分脂質(zhì)體的步驟，該步驟可在用有效負(fù)載加載脂質(zhì)體之前或之后進行。這些方法任 選可包括通過各種熟知的方法純化脂質(zhì)體，例如通過層析、相分離、溶劑萃取、凍干、再水合 等?？杉兓@些方法制備的組合物，從而組合物至少60%不含、通常是至少75%不含、最常 見是至少90%不含雜質(zhì)。
這些方法包括產(chǎn)生兩親脂質(zhì)和固醇修飾兩親脂質(zhì)具有一定摩爾比的含脂質(zhì)組合 物，從而提供組合物中固醇修飾兩親脂質(zhì)含量如上所述的含脂質(zhì)組合物。不難通過可用的技術(shù)形成含有一種或多種固醇修飾兩親脂質(zhì)顆粒的組合物。例 如，將包含固醇修飾兩親脂質(zhì)的脂質(zhì)置于水性溶液中，并攪拌該溶液數(shù)秒到數(shù)小時的時間 不難形成這種組合物。該簡單的過程自發(fā)形成直徑約1-10微米的、大的多片層脂質(zhì)體或囊 泡。這些脂質(zhì)體由與存在脂質(zhì)的水相層交替的兩個到上百個同心脂雙層構(gòu)成。制備脂質(zhì)體 的進一步示范性方法如下所示。如果需要提供含有包封了有效負(fù)載(例如，包封試劑、治療劑、顯像劑等)的脂質(zhì) 體的組合物，這些試劑可與包封量的一種或多種固醇修飾兩親脂質(zhì)，例如一種或多種固醇 修飾兩親磷脂一起包含在水相內(nèi)?；蛘?，如果感興趣試劑是疏水性的，因而不易溶于水的 話，這些試劑可包含在脂雙層內(nèi)。術(shù)語“包封量”指包封感興趣試劑和形成所需大小脂質(zhì)體 需要的脂質(zhì)用量。平均脂質(zhì)體大小通常是直徑小于10，00011111，更常見的是小于5，00011111，還 要更常見的是約20-600nm。包封量取決于特定化合物和所選的工藝條件，但通常是約2 1 到約1 100的化合物脂質(zhì)，通常是約1 1到約1 20?；蛘?，可采用遙控加載方法將 有效負(fù)載引入脂質(zhì)體。與上述加載方法相比，遠端加載包括首先產(chǎn)生脂質(zhì)體，然后通過離子 梯度將有效負(fù)載引入該脂質(zhì)體。有效負(fù)載的摻入含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物可包含有效負(fù)載以便隨脂質(zhì)顆粒轉(zhuǎn)運(例如用 脂質(zhì)體)。“有效負(fù)載”指含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物中隨含SML的組合物轉(zhuǎn)運并由其 遞送的組分。代表性有效負(fù)載包括包含在脂質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)中(例如，脂質(zhì)體內(nèi))，存在于脂質(zhì) 顆粒雙層或單層中，作為SML脂質(zhì)本身的一部分(例如，SML前藥)或連接于脂質(zhì)顆粒表面 (例如，通過共價或非共價鍵)的組分。因此，“有效負(fù)載”可包含脂質(zhì)顆粒所包封的組分 (例如，藥劑、營養(yǎng)劑、美容試劑、顯像劑(例如，氣體，包括空氣)、放射性藥物、核磁共振造 影劑等)。在某些實施方式中，包封的有效負(fù)載通常作為晶體、作為粉末或它們的組合而處 于溶液中。在一些實施方式中，有效負(fù)載是固醇修飾兩親脂質(zhì)的組分，其可通過切割該化合 物中存在的可切割鍵而釋放(例如，固醇修飾兩親脂質(zhì)用作前藥的情況中)。在一些實施 方式中，有效負(fù)載可以是病毒(例如，滅活或減毒的病毒)或細菌(例如，滅活或減毒的細 菌)或核酸。制備含藥物脂質(zhì)體懸液的方法通常遵循常規(guī)脂質(zhì)體制備方法。在一個示范性方法 中，將固醇修飾兩親脂質(zhì)溶解于合適的有機溶劑或溶劑體系中，真空或在惰性氣氛中干燥 成脂質(zhì)薄膜?？蓪⒏信d趣的親脂性物質(zhì)包含在形成薄膜的脂質(zhì)中?？梢栽谥|(zhì)溶液中提供 要包封在脂質(zhì)顆粒中和/或脂質(zhì)顆粒雙層內(nèi)的有效負(fù)載(例如，脂質(zhì)體中摩爾過量的最終 最高所需濃度的物質(zhì))，從而有助于盡可能增強包埋?；蛘撸绻信d趣的物質(zhì)是水溶性的 (例如，更具親水性)，該物質(zhì)可包含在水性介質(zhì)中以和脂質(zhì)形成水合物?；蛘撸墒紫犬a(chǎn)生 脂質(zhì)顆粒(例如，脂質(zhì)體)，再通過遠程加載方法，例如提供有助于感興趣物質(zhì)進入脂質(zhì)體 的離子梯度(例如，硫酸銨梯度)將有效負(fù)載引入這些顆粒。可通過，例如共價連接于脂質(zhì)顆粒的固醇修飾兩親脂質(zhì)的遠端官能團而將有效 負(fù)載連接于脂質(zhì)顆粒的表面(實施例14)。適用于或可經(jīng)改造用于連接有效負(fù)載的各種 方法描述于，例如Liposomes :2nd edition (脂質(zhì)體第二版)，牛津大學(xué)出版社，2003，V. Torchilin 禾口 V. Weissig.編。篩分可篩分脂質(zhì)體懸液以獲得具有所需尺寸分布的囊泡，尺寸范圍小于約1微米，通 常是約0. 05-0. 5微米，最常見是約0. 05-0. 2微米。利用篩分排除較大的脂質(zhì)體并產(chǎn)生具 有最佳藥代動力學(xué)特性的確定尺寸?？刹捎脦追N技術(shù)降低脂質(zhì)體的尺寸和尺寸異質(zhì)性。通過水浴或探針超聲處理 (probe sonication)來超聲處理脂質(zhì)體懸液使得尺寸逐漸降低至尺寸小于約0. 05微米的 小單層囊泡(SUV)。勻漿是依賴于剪切力使大脂質(zhì)體破碎成較小脂質(zhì)體的另一種方法。在 典型的勻漿過程中，MLV通過標(biāo)準(zhǔn)乳液勻漿器再循環(huán)直至觀察到所選的脂質(zhì)體尺寸，通常是 約0. 1-0. 5微米。有硬球形珠存在下，在置于雙重不對稱離心機中的小瓶中加工脂質(zhì)分散 體可將脂質(zhì)體顆粒直徑降低至0. 04-0. 3微米。在這三種方法中，可通過常規(guī)的激光束粒度 區(qū)分監(jiān)測粒度分布。脂質(zhì)體經(jīng)小孔聚碳酸酯膜擠出是將脂質(zhì)體尺寸降低至相對良好確定的尺寸分布 的有效方法，根據(jù)膜的孔徑，該尺寸的平均值是0. 05-8微米。懸液通常通過該膜循環(huán)數(shù)次 直至獲得所需脂質(zhì)體尺寸分布。脂質(zhì)體可經(jīng)連續(xù)較小孔膜擠出，從而逐漸降低脂質(zhì)體的尺 寸。離心和分子篩層析是可用于產(chǎn)生粒度低于所選閾值，即小于1微米的脂質(zhì)體懸液 的其它方法。這兩種方法均涉及除去較大的脂質(zhì)體，而不是將大顆粒轉(zhuǎn)化成較小的顆粒。脂 質(zhì)體產(chǎn)率相應(yīng)降低。除去游離的有效負(fù)載材料可以除去未摻入的有效負(fù)載或“游離”有效負(fù)載，例如以增加組合物中脂質(zhì)體包埋 的有效負(fù)載的比例?？蓪⑺龀ピO(shè)計成能將游離物質(zhì)的最終濃度降低至小于組合物中存 在的總有效負(fù)載(例如，總藥物)的約20%，通常是小于約10%?？刹捎脦追N方法除去脂質(zhì)體懸液中的游離有效負(fù)載?？赏ㄟ^高速離心沉淀篩分的 脂質(zhì)體懸液，游離的有效負(fù)載和非常小的脂質(zhì)體維持在上清液中。另一種方法包括通過超 濾濃縮該懸液；然后將濃縮的脂質(zhì)體重懸在無試劑的替代介質(zhì)中?；蛘?，可采用凝膠過濾分 離較大的脂質(zhì)體顆粒與溶質(zhì)分子。除去游離有效負(fù)載的一種示范性方法利用能結(jié)合游離而非脂質(zhì)體結(jié)合形式的物 質(zhì)的離子交換樹脂。可依據(jù)在，例如中性PH下游離物質(zhì)的電荷選擇陽離子交換或陰離子交 換樹脂。含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物的有效負(fù)載可利用含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物來促進遞送與該組合物結(jié)合的有效負(fù)載。如 上所示，有效負(fù)載指含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物中由該含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物轉(zhuǎn) 運的組分，因此，可包括，例如包含在脂質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)中(例如，脂質(zhì)體內(nèi))，存在于脂質(zhì)顆粒 雙層中，或連接于脂質(zhì)顆粒表面(例如，通過共價或非共價鍵)的組分。因此，有效負(fù)載可以是各種不同的物質(zhì)，它們可適用于各種不同應(yīng)用，包括但不限 于藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、美容學(xué)和診斷領(lǐng)域。示范性物質(zhì)包括但不限于二膦酸鹽、碳鉬、順鉬、奧 沙利鉬(oxaloplatin)、卡莫司汀、喜樹堿、環(huán)丙沙星、氯甲烷、環(huán)磷酰胺、環(huán)杷明、阿糖胞苷、 達卡巴嗪、視黃酸、去氧氟尿苷、氟代乳清酸(fluoroortic acid)、格爾德霉素、吉西他濱、
34棉酚、異磷酰胺、羥基他莫昔芬、伊立替康(inrinotecan)、植酸、蛋白激酶抑制劑、紫杉醇、 白藜蘆醇、紫杉烷、甲基硒代-半胱氨酸、氨甲蝶呤、6-硫鳥嘌呤、酪氨酸磷酸化抑制劑、漢 黃芩(黃)素、依托泊苷、反義寡核苷酸、siRNA、化學(xué)修飾的RNA、檸檬酸鹽、1、2、3、4 丁烷 四羧酸、八硫酸蔗糖(octasulfate sucrose)、多磷酸鹽、環(huán)丙沙星(ciprofloxicin)、嗎啡、 羥嗎啡酮、丁丙諾啡和美沙酮。這些試劑可以單獨包封或與另一試劑包封在同一脂質(zhì)體中 (例如，一種或多種試劑。兩種或更多種試劑)，從而提供協(xié)同作用。特別感興趣的有效負(fù)載包括但不限于抗癌癥化療劑(例如，阿霉素、柔紅霉素 (danorubicin)、喜樹堿、順鉬等)、抗生素(例如，抗細菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗寄生蟲 劑等)、鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、抗痤瘡劑、生物分子(例如，核酸(例如，RNA、DNA、siRNA等)、多肽 (例如，肽，包括重組多肽和肽，包括天然或化學(xué)修飾的多肽和肽(例如，PEG化的多肽))、 抗體等)、抗原性物質(zhì)(例如，可以是疫苗的組分)、抗-血液凝結(jié)劑、治療神經(jīng)再生性疾 病(neurogenerative disease)的化合物、麻醉劑，例如苯佐卡因、氯普魯卡因、可卡因、普 魯卡因、丁卡因、布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、芬太尼和三甲卡因，鎮(zhèn)痛劑，例如雙氯芬酸 和能將離子梯度加載入脂質(zhì)體的分子，例如硫酸銨、硫酸三乙胺、八硫酸蔗糖的三乙胺鹽、 三乙胺多磷酸鹽、植酸的銨鹽、乙酸的鈉、三乙胺或銨鹽、草酸的鈉、三乙胺或銨鹽、丙酸的 鈉、三乙胺或銨鹽、琥珀酸的鈉、三乙胺或銨鹽、1，2，3，4 丁烷四羧酸的鈉、三乙胺或銨鹽、吡 啶_2，3，5，6四羧酸的鈉、三乙胺或銨鹽、1，2，4，5_苯四羧酸的鈉、三乙胺或銨鹽、1，2，4， 5-環(huán)己烷四羧酸的鈉、三乙胺或銨鹽、1，3，5_苯三羧酸的鈉、三乙胺或銨鹽、多胺，例如精 胺、亞精胺、三氨基乙胺等的乙酸鹽。還可利用美容劑(例如，黃酮類化合物、抗氧化劑，例如Y-亞麻酸、β胡蘿卜素、 花青素、谷固醇)和飲食添加劑(例如，維生素)作為本發(fā)明脂質(zhì)組合物中的有效負(fù)載?？捎米鞅景l(fā)明組合物的有效負(fù)載的示范性美容劑可包括水合試劑(hydrating agent)、蛋白質(zhì)(例如，膠原)、維生素、植物化學(xué)品、酶、抗氧化劑、精油、UV保護劑(例如， 羥苯甲酮)、清潔劑、色素、芳香劑等(例如，可用于美容品、化妝品、芳香劑、香料、皮膚護理 產(chǎn)品和美容助劑)。視黃酸特別有用，特別是用于皮膚護理產(chǎn)品的含視黃酸的固醇修飾兩親 脂質(zhì)的乳液。診斷劑包括可檢測標(biāo)記物，其可以是放射性標(biāo)記物、熒光團、發(fā)光團、核磁共振造 影劑，例如釓、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)標(biāo)記物等。在一些實施方式中，脂質(zhì)體本身可用作診 斷劑，例如在超聲診斷中用作微泡。特別感興趣的是可用作毒性藥物(例如，各種癌癥化療劑，阿霉素、柔紅霉素、喜 樹堿等)和/或水溶性差的藥物(例如，兩性霉素B、視黃酸等)的藥物運載體的含固醇修 飾兩親脂質(zhì)的組合物。用作疫苗運載體的含固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物也是特別感興趣 的，特別是顯示儲存穩(wěn)定性的那些(例如，環(huán)境溫度下和/或4°C )。作為活性試劑或前藥的固醇修飾的兩親脂質(zhì)在一些實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)或該化合物的組分用作有效負(fù)載。例如， 固醇修飾的兩親脂質(zhì)本身可以是藥物或前藥。例如，固醇修飾的兩親脂質(zhì)的固醇可以是當(dāng) 存在于該固醇修飾的兩親脂質(zhì)中和/或切割可切割接頭后從該固醇修飾的兩親脂質(zhì)釋放 時能提供有益作用的物質(zhì)。在一示范性實施方式中，固醇修飾的兩親脂質(zhì)的固醇是谷 固醇，其可用于高膽固醇血癥治療。或者或此外，固醇修飾的兩親脂質(zhì)的非固醇疏水性尾部可以是當(dāng)存在于該固醇修飾的兩親脂質(zhì)中和/或切割可切割接頭后從該化合物釋放時能 提供有益作用的物質(zhì)。例如，固醇修飾的兩親脂質(zhì)的非固醇疏水性尾部可以是視黃酸。其它組分除有效負(fù)載外，含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物可包含其它活性或惰性物質(zhì)。 例如，脂質(zhì)體組合物可包含降低要用該組合物遞送的藥物毒性和/或降低脂質(zhì)體組分的毒 性的藥物保護性化合物。例如，這種額外的物質(zhì)可包括親脂性自由基捕捉劑，例如α-生育 酚，或其藥學(xué)上可接受的類似物或酯，例如α-生育酚琥珀酸酯。其它合適的自由基猝滅劑 包括丁羥甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(奧古斯汀(Augustin))和它們在藥理學(xué)上可接受的 鹽。還可使用對于人給藥可接受的其它親脂性自由基猝滅劑。可通過，例如包封或膜結(jié)合 將此類額外試劑與感興趣的試劑共同包埋。含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物還可包含一種 或多種顯像劑，從而能在體內(nèi)確定和/或追蹤加載藥物的脂質(zhì)體的位置。本發(fā)明脂質(zhì)體的水性懸液優(yōu)選包含增強該脂質(zhì)體耐受性的物質(zhì)從而減少脂質(zhì)體 脂質(zhì)的氧化降解。水溶性離子特異性螯合劑，例如除鐵靈(高鐵氧胺)是該類物質(zhì)的示例。制劑可將組合物配制成用于各種不同給藥途徑，包括胃腸外、腸道、鼻部和肺部給藥， 并可包含一種或多種賦形劑。示范性制劑包括局部、經(jīng)皮、可注射(例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下)、氣溶膠和口服制劑，可配制成藥物制品、美容制品、營養(yǎng)制品，等等?？梢詫⒑泄檀?修飾兩親脂質(zhì)的組合物凍干，或可儲存在溶液中。因此，含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物包括含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)和可接受 的運載體或載體的制劑。該制劑的可接受劑型包括但不限于水性溶液、懸液、分散液、潤膚 露、洗液、乳膏、藥膏、香膏和軟膏。還可借助片劑或膠囊(例如，溶解于消化道中)以及栓劑 給予固體形式的固醇修飾兩親脂質(zhì)組合物。還可在器件，例如貼片、繃帶等中提供組合物。除了固醇修飾的兩親脂質(zhì)和所需的有效負(fù)載外，局部制劑可包含適合施加于動物 的皮膚或粘膜的藥學(xué)上可接受的局部運載體。可用各種合適的劑型提供局部制劑，包括但 不一定限于洗液、凝膠、藥膏、乳膏、香膏、軟膏等。這些組合物可以是水性溶液或乳液的形 式，例如油和水乳液(例如，水包油乳液或油包水乳液)。如果需要，局部制劑可包含滲透增 強劑或幫助經(jīng)皮膚遞送的其它試劑。通?？衫蒙砩峡山邮艿倪\載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等配制本文考慮的劑型，這些 劑型可以是緩釋或定時釋放劑型。治療應(yīng)用的可接受的運載體、賦形劑和稀釋劑是藥學(xué) 領(lǐng)域熟知的，描述于，例如Remington' s Pharmaceutical Science (雷明頓藥物科學(xué)) (A. R. Gennaro編，馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，1985)。這些物質(zhì)在所用劑量和濃 度下對于接受者是無毒的，其包含緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其它有機酸鹽; 抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量(低于約10個殘基)肽，例如聚精氨酸；蛋白質(zhì)，例如血 清白蛋白、明膠和免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，例如甘氨 酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸；單糖；二糖和其它碳水化合物，包括纖維素及其衍生物，葡 萄糖、甘露糖和糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；在局部制劑中包含陽 離子型和非離子型表面活性劑，例如吐溫、普朗尼克(PLUR0NICS)和PEG。用于治療給藥的制劑必須無菌。經(jīng)無菌膜過濾，或通過其它常規(guī)方法，例如輻射或 用氣體、加熱或高壓處理不難實現(xiàn)無菌。本發(fā)明制劑的PH通常是3-11，更優(yōu)選5-9?？山o予需要用本發(fā)明制劑治療的對象(通常是哺乳動物)將提供最佳療效的劑量。給藥的劑量 和方法可依對象而有所不同，取決于諸如所治療宿主的類型等因素，以動物為例，包括其性 別、體重、飲食、目前的治療、總體臨床情況、所用的特定疏水性化合物、這些化合物的具體 用途和本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能測定有效劑量水平，即，獲得所 需結(jié)果的劑量水平?？蓪⒅苿┲苽涑赡茉谶m于保留任何有效負(fù)載的活性以及維持固醇修飾兩親脂質(zhì) 和可能存在的其它脂質(zhì)的完整性的條件下儲存。如實施例所示，含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的 脂質(zhì)體在4°C穩(wěn)定1年或更長時間，因此4°C儲存適于長期維持本文所述的固醇修飾的兩親 脂質(zhì)組合物。固醇修飾的兩親脂質(zhì)的使用方法含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物可用于各種不同的藥學(xué)、美容、診斷和生物醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域。示范性的應(yīng)用如下所示。例如，藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和美容應(yīng)用通常包括將含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物給 予動物對象。通?？山?jīng)由任何合適的途徑(例如，胃腸外、腸道、鼻部、肺部等)使得動物與 組合物接觸來實現(xiàn)給藥。就這些應(yīng)用而言，所述動物是需要治療的對象，因為該對象需要治 療或可從這種治療獲益。就治療方法而言，本文所用的“動物對象”通常指需要治療的對象， 和/或就診斷方法而言，指懷疑患有可通過該診斷方法檢測的疾病的對象。對象包括動物， 包括哺乳動物，例如人、牲畜、寵物等。本文通常利用術(shù)語“治療”等表示獲得所需藥理學(xué)和/或生理學(xué)作用。就完全或部 分防止疾病或其癥狀而言，該作用可以是預(yù)防性的，和/或就部位或完全穩(wěn)定或治愈某疾 病和/或逆轉(zhuǎn)該疾病所致不利作用而言，該作用可以是治療性的。本文所用的“治療”涵蓋 哺乳動物，特別是人中疾病的任何治療，包括(a)防止傾向于產(chǎn)生疾病或癥狀但尚未診斷 到具有疾病或癥狀的對象中疾病或癥狀的發(fā)生；(b)抑制疾病癥狀，即，使其發(fā)展停滯；或 (c)緩解疾病癥狀，即，導(dǎo)致疾病或癥狀消退?？筛鶕?jù)待治療的對象和病癥以及需要給藥帶來的益處來選擇含有固醇修飾的兩 親脂質(zhì)的組合物及其有效負(fù)載。含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物還可用于診斷方法。此類方法包括通過檢測動 物對象的生物學(xué)樣品中的分析物來診斷病癥。本文所用的“診斷”通常包括測定對象對疾病或病癥的敏感性，測定目前對象是否 收疾病或病癥影響，預(yù)后受疾病或病癥影響的對象，和治療劑的使用(例如，監(jiān)測對象的情 況以提供給予治療作用或效力的信息)。術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括從生物體獲得的各種樣品 類型，其可用于診斷或監(jiān)測試驗。該術(shù)語包括生物來源的血液和其它液體樣品、實體組織樣 品，例如活檢樣本或組織培養(yǎng)物或源于其的細胞及其后代。該術(shù)語包括獲得后以各種方式 操作的樣品，例如用試劑處理、溶解或富集某些組分。該術(shù)語包括臨床樣品，還包括細胞培 養(yǎng)物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解液、血清、血漿、生物流體和組織樣品。利用含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物的診斷方法通常包括檢測流體中分析物存 在與否，該方法包括使得該液體與含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物接觸，檢測脂質(zhì)組合物 中的變化，其中脂質(zhì)組合物中的變化表示分析物的存在與否。脂質(zhì)組合物中的變化可以是， 例如顏色改變(例如，由于所包封熒光團的發(fā)射波長改變)，由于含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物中存在的可聚合固醇修飾兩親脂質(zhì)的聚合程度增加或降低，含有固醇修飾兩親脂質(zhì) 的脂質(zhì)體的尺寸或完整性變化，等等。因此，可通過評估脂質(zhì)組合物的特性，例如光學(xué)特性 (如，反射率)、相轉(zhuǎn)變等來檢測脂質(zhì)組合物中的變化。其它應(yīng)用含有固醇修飾兩親脂質(zhì)的組合物在與治療或診斷不直接相關(guān)的領(lǐng)域中也有各種 應(yīng)用。例如，利用含有固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物有助于將有效負(fù)載(例如，核酸、多肽) 體外遞送至細胞。在該方法中，培養(yǎng)的動物細胞(例如，培養(yǎng)的哺乳動物細胞，如人細胞) 與含有感興趣的有效負(fù)載的固醇修飾兩親脂質(zhì)組合物接觸，從而有助于將該有效負(fù)載遞送 至該細胞?？刹捎么祟惙椒ㄒ氩灰状┻^動物細胞膜的核酸、多肽或其它化合物。在另一實例中，具有鞘氨醇的固醇修飾兩親脂質(zhì)可用于脂質(zhì)筏建模以及遞送膜蛋 白。固醇修飾的兩親脂質(zhì)還可用作人工雙層，因此可用于諸如生物傳感器等設(shè)置中。 涉及利用人工雙層的生物傳感器是本領(lǐng)域熟知的。它們尤其適用于脂質(zhì)表面與血液、血漿、 血清或含細胞、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的其它體液直接接觸的情況。試劑盒與系統(tǒng)提供的試劑盒和系統(tǒng)可促進本文所述組合物的產(chǎn)生和/或利用。本文考慮的試劑 盒可包含一種或多種固醇修飾的兩親脂質(zhì)，要遞送的感興趣試劑，它們可以在不同容器中 提供，或者通常在無菌容器中以單一組合物提供。此外，試劑盒可裝有利用試劑盒諸組分，特別是裝在試劑盒中的本發(fā)明組合物的 使用說明書。
實施例列出以下實施例是為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整地公開和描述如何制備和使用本 發(fā)明，而非試圖限制發(fā)明人所認(rèn)為的發(fā)明范圍，也不是想要表示以下實驗是所進行的全部 或唯一的實驗。已努力確保所用數(shù)值(例如，含量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)考慮到一些實 驗誤差和偏差。除非另有表示，部分是重量部分，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，而壓 力是或接近大氣壓。方法與材料以下是以下實施例所用的通用材料和方法。試劑甘油硫酸膽堿購自加利福尼亞州托蘭斯的巴開姆公司(BACHEM，Torrance, CA)。溶血磷脂購自阿拉巴馬州阿拉巴斯特的阿凡提極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)。其它試劑購自威斯康星州密爾沃基的阿爾德里奇公司(Aldrich， Milwaukee, WI)。溶劑可直接使用，或在使用前根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法純化或干燥。技術(shù).采用各種展開系統(tǒng)，利用0. 25-mm硅膠F254平板進行TLC分析(A) CHCl3/ Me0H/NH40H (65/25/4) ； (B) CHCl3/Me0H/NH40H (65/35/5) ； (C) CHCl3/Me0H/H20 (65/25/4)； (D)己烷 /EtOAc (2/1) ； (E)己烷 /EtOAc (10/1) ； (F)己烷 /EtOAc (5/1) ； (G)甲苯 / 醚 (9/1) ； (H)甲苯/醚(1/1)。利用弗吉尼亞州夏洛茨維爾的拜爾泰格公司(Biotage, Charlottesville, VA)的配有預(yù)裝填硅膠柱(60人,40-63 μ m)的 Horizon HPFC 系統(tǒng) 進行高效快速層析(HPFC)。除非另有注釋，描述溶劑混合物的組成的比例表示相對體積。用Varian 400MHz儀器或Bruker 300mHz儀器獲得1H NMR圖譜。利用四甲基硅烷作為內(nèi) 標(biāo)，化學(xué)位移表示為百萬分之一。J值以赫茲計。在加利福尼亞州大學(xué)舊金山分校的質(zhì)譜 中心(Mass Spectrometry Facility, University of California San Francisco)獲得 MALDI-TOF 質(zhì)譜。合成方法.合成所用的通用方法如下所述。保護1-取代甘油的3-羥基50°C,無水條件下，將1-取代甘油和三苯基氯(1. 5 當(dāng)量)的混合物在無水吡啶中加熱18小時。冷卻至室溫(r.t.，約23°C)后，將混合物倒 入冰冷卻的水中，用3份己烷萃取。過濾除去未溶解的三苯基甲醇用水洗滌濾液三遍，無水 硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，將殘留物溶解于最少量的己烷中。4°C靜置過夜將額外的三苯基甲 醇從溶液中沉淀下來。濾出固體，將濾液蒸發(fā)至干。高真空干燥殘留物，直接用于下一反應(yīng) 步驟。通過TLC監(jiān)測反應(yīng)，產(chǎn)率通常為80-90%。除去1,2-取代的-3-三苯甲基甘油的三苯甲基0°C,用三氟化硼二乙基醚合物 (boron trif luoride diethyl etherate) (4 當(dāng)量)處理 1，2_ 取代的-3-三苯甲基甘油 3 小時。用水/氯仿/甲醇(2:2:1)洗滌溶液。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。干燥殘留 物，直接用于下一反應(yīng)步驟。通過TLC監(jiān)測反應(yīng)，產(chǎn)率高于90%。磷酸化1, 2-取代-甘油0°C ,將1，2-取代甘油和無水吡啶(2當(dāng)量)的無水四氫 呋喃基(THF)溶液滴加入THF配制的新鮮蒸餾磷酰氯(1. 1當(dāng)量)中，并攪拌。0°C，繼續(xù)攪 拌2-3小時。然后加入10%碳酸氫鈉(約5當(dāng)量)，0°C攪拌該混合物15分鐘。然后將溶液 倒入冰水，用HCl (pH約為2)酸化并用乙醚萃取。將丙酮加入水以沉淀水層中的產(chǎn)物。將沉 淀物與醚萃取的產(chǎn)物合并，與甲苯共沸干燥，直接用于下一反應(yīng)步驟。產(chǎn)率通常高于90%。1，2-取代-甘油-硫酸膽堿將1，2-取代-甘油磷酸、膽堿四苯基硼酸酯(2當(dāng) 量)和2，4，6_三異丙基(triisoproyl)苯磺酰氯(TPS) (2. 5當(dāng)量)溶解于無水吡啶中并 簡單加熱，然后在70°C攪拌1小時，再于室溫攪拌3小時。加入水后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶 劑。用乙醚萃取殘留物兩次。合并萃取物并蒸發(fā)。通過HPLC純化粗產(chǎn)物。該步驟的產(chǎn)率 通常是80-90%。實施例1 制備脂質(zhì)SML1A、SMLB和SMLC合成本文稱為SMLla、SMLlb和SMLlc (統(tǒng)稱為SMLla-SMLlc)的脂質(zhì)的合成方案如 流程1所示。以下合成脂質(zhì)SMLla-c的詳述示例了該流程。流程1.合成 aSMLla-C
ea_cSMLta: R = CisH37; SML1b: R = C16H33 ； SML1C R = C14H29 a試劑和條件.(A)三苯甲基氯(1.03當(dāng)量)、ZnCl2 (0.95當(dāng)量)、DMF，4°C，10小 時；(B)異氰酸烷基酯(1. 0當(dāng)量)、DMS0，IOO0C，24小時；(C) CHCl3配制的TFA(16. 7% )，室
39溫下，4小時；(D)氯甲酸膽固醇酯(5當(dāng)量),DIPEA (5. 2當(dāng)量)、CHCl3,室溫，16小時。"Tr" 表示三苯甲基?！癈hol-OH”=膽固醇。1-0-三苯甲基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(6)將氯化鋅粉末(無水，25g，175mmol) 加入甘油磷酸膽堿(50g，185mmol)的無水DMF (500mL)懸液中。室溫下，將混合物攪拌30分 鐘，4°C，加入三苯甲基氯(53g，190mmol)。將反應(yīng)體系維持于4°C，10小時。然后加入IL乙醚 使粗產(chǎn)物沉淀。將油性產(chǎn)物溶解于IL氯仿/異丁醇(2 1)，用300ml4%氨水洗滌，無水硫 酸鈉干燥。蒸發(fā)揮發(fā)物后，用甲苯共沸干燥粗產(chǎn)物。室溫下，用乙腈研磨殘留物5小時。然后 收集白色沉淀物，高真空干燥。產(chǎn)量45. 2g(49重量％甘油磷酸膽堿)。TLC =Rf = 0. 08 (洗 脫劑 A)。1H 匪 R (MeOH-d4)，δ 3. 12(m,2H) ;3.15(s，9H) ； 3. 56 (m, 2H) ； 3. 90 (m, 2H) ； 4.01 (m， 1H) ；4.20(m，2H) ；7.27(m，9H) ；7.42(m，6H)。為 C27H35NO6P+計算的 MALDI_MS[M+H]+500. 22， 實測 500. 31。1-0-三苯甲基-2-硬脂酰基氨甲?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(7a)向6 (lg， 2mmol)的二甲基亞砜(無水，IOmL)溶液中加入異氰酸十八烷酯(0. 6g，2mmol)。100°C，在N2 下攪拌反應(yīng)混合物24小時。蒸發(fā)溶劑后，用甲醇提取殘留物。濾出白色固體，將濾液蒸發(fā)至 干。粗產(chǎn)物經(jīng) HPFC 純化(CHCl3/Me0H/H20, 35/13/2)。產(chǎn)量450mg(28. 3 重量％ 6) · TLC :Rf =0. 25 (洗脫劑 A)。1H 匪R(CDCl3)，δ 0. 89 (t, J = 6. 4，3H) ；1. 25-1. 31(m，30H) ；1. 47 (m, 2H) ；3. 01 (m,2H) ； 3.20(s，9H) ；3.27(m，2H) ；3.72(m，2H) ；4. 03-4. 12(m，3H) ；4. 24 (m, 2H)； 5. 07 (br, 1H) ；7. 20 (m,9H) ；7. 41(m，6H)。為 C46H72N2O7P+計算的 MALDI_MS[M+H]+795. 51，實 測 795. 52。1-0-三苯甲基-2-棕櫚基氨甲?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(7b)按照7a相同 的方法合成該化合物，直接用于下一反應(yīng)步驟。1-0-三苯甲基-2-肉豆蔻基氨甲?；?sn-甘油式-3-磷酸膽堿(7c)按照7a相 同的方法合成該化合物，直接用于下一反應(yīng)步驟。1-羥基-2-硬脂?；奔柞；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(8a)室溫下，在氯仿 (5mL)中用三氟乙酸(TFA, ImL)處理化合物7a(420mg，0. 52mmol)，4小時。蒸發(fā)揮發(fā)物， 殘留物經(jīng) HPFC 純化(CHCl3/Me0H/H20,10/5/1)。產(chǎn)量:320mg(99 重量 % 7a)。TLC =Rf =
0.05(洗脫劑 B)/H NMR(CDCl3), δ 0. 88 (t，J = 6. 4，3H) ； 1. 21—1. 31 (br，30H) ； 1. 47 (m, 2H)； 3. 03(m，lH) ；3. ll(m，lH) ；3. 29(s，9H) ；3. 66(m，2H) ；3. 76(m，2H) ；3. 99(m，2H) ；4.30 (m， 2H) ；4. 78 (m, 1H) ；6. 51 (br, 1H)。為 C27H58N2O7P+計算的 MALDI_MS[M+H]+553. 40，實測 553. 38。1-羥基-2-棕櫚基氨甲?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(8b)按照8a相同的方 法合成該化合物。TLC:Rf = 0. 05(洗脫劑 B)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 89 (t，J = 6. 4，3H)；
1.21-1. 31 (br,26H) ； 1. 48 (m, 2H) ；3. 03 (m, 1H) ；3. 11 (m, 1H) ；3.30(s，9H) ；3. 66-3. 76 (m， 4H) ；4. 0(m，2H) ；4. 30(m，2H) ；4. 79(m，lH) ；6. 52 (br，1H)。 為 C25H54N2O7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+525. 37，實測 525. 28。1-羥基-2-肉豆蔻基氨甲?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(8c)按照8a相同的 方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 05 (洗脫劑 B)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 89 (t，J = 6. 4，3H)； 1. 21-1. 31 (m，22H) ； 1. 47 (m, 2H) ；3. 03 (m, 1H) ；3. 11 (m, 1H) ；3.29(s，9H) ；3. 66-3. 76 (m， 4H) ；3. 99 (m, 2H) ；4. 30 (m, 2H) ；4. 78 (m, 1H) ；6. 52 (br, 1H)。 為 C23H5ON2O7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+497. 34，實測 497. 36。
1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-硬脂?；奔柞；?sn-甘油基-3-磷酸膽 堿(SMLla, ChcSaPC)室溫下，向 8a (0. 3g，0. 54mmol)和 二異丙基乙胺(DIPEA,0. 5mL, 2. 8mmol)的干燥無乙醇氯仿(IOmL)溶液中滴加無乙醇氯仿(5mL)配制的氯甲酸膽固醇酯 (1. 21g，2. 7mmol)。室溫下反應(yīng)16小時后，蒸發(fā)揮發(fā)物，殘留物經(jīng)HPFC純化(CHCl3/MeOH/ H20,40/18/3) ο 產(chǎn)量438mg(84 重量％ 8a)。TLC :Rf = 0. 28 (洗脫劑 A)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m, 68H) ； 1. 78-2. 01 (m，5H) ；2. 38(m，2H) ；3. 03(m，lH) ；3.17 (m， 1H) ；3. 38(s,9H) ；3. 88 (m, 2H) ；4. 0 (m, 2H) ；4. 25 (m, 1H) ；4. 36 (m, 4H) ；5. 08 (m, 1H)； 5. 39 (1H, d, J = 4. 4) ；6. 02 (br, 1H)。為 C55H102N2O9P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+965. 73，實測 965. 68。 1-膽固醇基羰基(carbonoyl) _2_棕櫚基氨甲?；鵢sn-甘油基_3_磷酸 膽堿(SNKlb，ChcPaPC)按照SMLla相同的方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.23(洗脫 劑 Α) ο 1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，64H) ； 1. 78-2. 01 (m，5H) ；2.37 (m， 2H) ；3. 0 (m, 1H) ；3. 16 (m, 1H) ；3. 37 (s,9H) ；3. 88 (m, 2H) ；3. 98 (m, 2H) ；4. 24 (m, 1H)；
4.36(m，4H) ；5. 07 (m, 1H) ；5. 39 (1H, d, J = 4. 4) ；6. 17 (br, 1H)。為 C53H98N2O9P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+937. 70，實測 937. 69。1-膽固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基氨甲?；鵢sn-甘油基_3_磷酸膽堿 (SMLlc, ChcMaPC)按照SMLla相同的方法合成該化合物。TLC :Rf = 0. 25 (洗脫劑A)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，60H) ； 1· 78-2. 06 (m，5H) ；2. 38 (m,2H) ；3. 03 (m, 1H) ；3. 17 (m, 1H) ；3.38(s，9H) ；3.88(m，2H) ；4. 0 (m, 2H) ；4. 25 (m, 1H) ；4. 36 (m, 4H)；
5.08 (m, 1H) ；5. 40 (1H, d, J = 4. 4) ；6. 02 (br, 1H)。為 C51H94N2O9P+ 計算的 MALDI-MS [M+H] + 909. 67，實測 909. 70。實施例2 制備脂質(zhì) SML2A、SML2B、SML2C 和 SML2D合成脂質(zhì)SML2a、SML2b、SML2c和SML2d (統(tǒng)稱為SML2a_SML2d)的合成方案如流程 2所示。以下合成脂質(zhì)SML2a-c的詳述示例了該流程。流程2.合成 aSML2a、SML2b、SML2c 和 SML2d a試劑和條件.(A) l)NaH(1.2當(dāng)量)、甲苯，室溫下，30分鐘；2)碘烷(1.25當(dāng)量)， 回流，過夜； )!1(1(濃)，1^!1(10%)配制，回流，5小時；(C)氯甲酸膽固醇酯(1.05當(dāng) 量)、DIPEA (1. 4當(dāng)量)、DMAP (0. 5當(dāng)量)、CHCl3, 0°C，0. 5小時，然后在室溫下，過夜；(D) POCl3(1. 1當(dāng)量)、吡啶(2當(dāng)量)、1~冊，01，2-3小時； )膽堿四苯基硼酸酯(2當(dāng)量)、 TPS (2. 5當(dāng)量)、吡啶，70°C，1小時，然后在室溫下，3小時?！癈hol-OH"=膽固醇。
1，3-苯亞甲基-2-硬脂?；?甘油(9a)室溫下，將1，3_苯亞甲基甘油(7. 2g， 40mmol)的甲苯(IOOmL)溶液加入NaH(60 %，礦物油配制，1. 92g，48mmol，用己烷洗滌)的 甲苯(30mL)懸液，并攪拌。然后將甲苯(40mL)配制的1_碘-十八烷(20g，50mmol)滴加 入該反應(yīng)混合物。加入后，將該混合物在氮氣中回流過夜，冷卻至室溫。小心地將水加入該 混合物以破壞過量的NaH。然后用水(100mLX2)洗滌反應(yīng)混合物。收集有機層，硫酸鈉干 燥。蒸發(fā)溶劑，將殘留物直接用于下一反應(yīng)步驟。1，3-苯亞甲基-2-棕櫚基-甘油(9b)按照9a相同的方法合成該化合物。1，3_苯亞甲基-2-肉豆蔻基-甘油(9c)按照9a相同的方法合成該化合物。1，3_苯亞甲基-2-油基-甘油(9d)按照9a相同的方法合成該化合物。2-硬脂?；?甘油(IOa)通過在HCl (濃，30mL)和甲醇(270mL)的混合溶液中 回流5小時來水解粗產(chǎn)物9a。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓蒸發(fā)。將殘留物溶解于乙醚 (300mL)，用氫氧化鈉溶液(0. 5M，IOOmL)和水(150mLX2)連續(xù)洗滌。然后干燥醚層并蒸發(fā)。 粗產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化(30-80%乙酸乙酯-己烷)。產(chǎn)量11.3g(82重量％ 1，3-苯亞甲基甘 油)。TLC =Rf = 0. 17(洗脫劑 D)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 86 (t, J = 6. 4，3H) ；1. 29(br,30H)；
1.58 (m, 2H) ；3. 44-3. 78 (m, 7H)。為 C21H45O3+ 計算的 MALDI_MS[M+H]+345. 34，實測 345. 33。2-棕櫚基-甘油(IOb)按照IOa相同的方法合成該化合物。TLC:Rf = 0. 16(洗脫 劑 D)。1H WR(CDCl3)，S0.86(t，J = 6.4，3H) ； 1. 29(br,26H) ； 1. 57 (m, 2H) ；3. 44-3. 78 (m, 7H)。為 C19H41O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+317. 31，實測 317. 28。2-肉豆蔻基-甘油(IOc):按照1(^相同的方法合成該化合物。11(氓=0.18(洗 脫劑Dh1H NMR(CDCl3), δ 0. 87 (t，J = 6. 4，3H) ； 1. 29(br,22H) ；1.58(m，2H) ；3· 44—3. 78 (m， 7H)。為 C17H37O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+289. 28，實測 289. 26。2-油基-甘油(IOd)按照IOa相同的方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 17(洗脫 劑 D)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 87 (t, J = 6·4，3Η) ； 1. 29(br,22H) ； 1. 58 (m, 2H) ；2. 0(m,4H)； 3. 44-3. 78(m，7H) ；5. 34 (m, 2H)。為 C21H43O3+計算的 MALDI_MS[M+H]+343. 32，實測 343. 32。1-膽固醇基羰基(cab0n0yl)-2-硬脂?；?甘油(Ila) :0°C，向 10a(0. 7g， 2mmol) ,DIPEA(0. 5mL，2. 8mmol)和DMAP (0. 12g, Immo 1)的干燥無乙醇氯仿(IOmL)溶液中滴 加氯甲酸膽固醇酯(0. 94g，2. lmmol)氯仿溶液(IOmL)。0°C，攪拌該反應(yīng)混合物0. 5小時， 然后在室溫下過夜。蒸發(fā)揮發(fā)物，粗產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化(5-15%乙酸乙酯-己烷)。TLC =Rf =0. 41(洗脫劑 E)。1H 匪R (CDCl3)，δ 0. 69 (s，3H) ；0. 85-1. 65 (m，68Η) ； 1. 78-2. 01 (m，5H)；
2.40(m，2H) ；3. 52(m，2H) ；3. 60(m，2H) ；3. 68(m，lH) ；4. 22(m，2H) ；4. 43(m，lH) ；5. 40 (1H, d, J = 4. 4)；為 C49H89O5+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+757. 67，實測 757. 68。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-棕櫚基-甘油(lib)按照Ila相同的方法合 成該化合物。TLC :Rf = 0. 39(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m， 64H) ； 1. 79-2. 01 (m，5H) ；2. 39 (m, 2H) ； 2. 80(m，lH) ；3. 51(m，2H) ；3. 61(m，2H) ；3. 72 (m, 1H) ；4.21(m，2H) ；5. 39 (1H, d, J = 4.4)；為 C47H85O5+計算的 MALDI_MS[M+H]+729. 64，實測 729.61。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-肉豆蔻基-甘油(Ilc)按照Ila相同的方法 合成該化合物。TLC :Rf = 0. 40 (洗脫劑 E) · 1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m， 60H) ； 1. 78-2. 02 (m，5H) ；2. 38 (m, 2H) ； 2. 82(m，lH) ；3. 51(m，2H) ；3. 60(m，2H) ；3. 72 (m,1H) ；4.22(m，2H) ；5. 41 (1H, d, J = 4. 4)；為 C45H81O5+計算的 MALDI_MS[M+H]+711· 69，實測 711. 68。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-油基-甘油(Ild)按照Ila相同的方法合成該 化合物。TLC :Rf = 0. 40(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m，60H)； 1. 78-2. 01 (m，9H) ；2. 38 (m, 2H) ；3. 51 (m,2H) ；3. 60 (m, 2H) ；3. 71 (m, 1H) ；4.22(m，2H)；
4.46 (m, 1H) ；5. 35 (m, 2H) ；5. 40 (d，J = 4. 4，1H)；為 C49H87O5+計算的 MALDI_MS[M+H]+755. 66， 實測 755. 62。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-硬脂?；?外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12a) 按照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.05 (洗脫劑A)。為C49H89NaO8P+計算的 MALDI-MS [M+Na]+859. 62，實測 859. 60。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-棕櫚基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12b) 按照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.05 (洗脫劑A)。為C47H85NaO8P+計算的 MALDI-MS [M+Na]+831. 59，實測 831. 61。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-肉豆蔻基-外消旋-甘油基_3_磷酸酯(12c) 按照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.05 (洗脫劑A)。為C45H81NaO8P+計算的 MALDI-MS [M+Na]+803. 56，實測 803. 55。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-油基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12d)按 照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.05 (洗脫劑A)。為C49H87NaO8P+計算的 MALDI-MS [M+Na]+857. 60，實測 857. 62。1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-硬脂?；?外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿 (SML2a, ChcSePC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC :Rf = 0. 3 (洗脫 劑 Α) ο δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，68H) ； 1· 78-2. 04 (m，5H) ；2. 38(m，2H) ；3.41(s，9H)； 3. 52 (m, 2H) ；3. 68 (m, 1H) ；3. 88(m，4H) ；4. 19(m，lH) ；4.35(m，4H) ；5. 39 (1H，d，J = 4. 4)；為 C54H101NO8P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+922. 73，實測 922. 74。1-膽固醇基羰基(carbonoyl) _2_棕櫚基-外消旋-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML2b, ChcPePC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.3(洗脫 劑 Α) ο δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，64H) ； 1· 78-2. 04 (m，5H) ；2. 38(m，2H) ；3.41(s，9H)； 3. 52 (m, 2H) ；3. 68 (m, 1H) ；3. 88(m，4H) ；4. 19(m，lH) ；4.35(m，4H) ；5. 39 (1H，d，J = 4. 4)；為 C52H97NO8P+ 計算的 MALDI-MS [Μ+Η]+894· 69,實測 894. 7O。1-膽固醇基羰基(carb0n0yl)-2-肉豆蔻基-外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿 (SML2c, ChcMePC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.3(洗脫 劑 Α) ο δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，60H) ； 1. 78-2. 04 (m，5H) ；2. 38(m，2H) ；3. 41 (s,9H)； 3. 52 (m, 2H) ；3. 68 (m, 1H) ；3. 88(m，4H) ；4. 19(m，lH) ；4.35(m，4H) ；5. 39 (1H，d，J = 4. 4)；為 C52H97NO8P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+866· 66,實測邠6· 67。1-膽固醇基羰基(carbonoyl) _2_油基-外消旋-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML2d，ChcOePC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.3(洗脫 劑 Α) ο δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，60H) ； 1· 78-2. 04 (m，9H) ；2. 39(m，2H) ；3.40(s，9H)； 3. 54(m，2H) ；3. 70(m，lH) ；3. 84-3. 97 (m，4H) ；4. 20(m，lH) ；4. 35-4. 44 (m，4H) ；5. 35(m，2H)；
5.39 (1H, d, J = 4. 4)；為 C54H99NO8P+計算的 MALDI_MS[M+H]+920. 71，實測 920. 73。
實施例3 制備脂質(zhì) SML3A、SML3B、SML3C 和 SML3D合成脂質(zhì)SML3a、SML3b、SML3c和SML3d (統(tǒng)稱為SML3a_SML3d)的合成方案如流程 3所示。以下合成脂質(zhì)SML3a-d的詳述示例了該流程。流程3.合成 aSML3a_d a試劑和條件· (A)甲苯磺酸膽固醇酯、甲苯，90°C，4小時；(B) TFA-HCl (濃)2 1， THF，室溫，4小時；(C)三苯甲基氯(1.5當(dāng)量)、吡啶，50°C，18小時；(D)脂族酸(1. 05當(dāng) 量)、DCC (1.05 當(dāng)量)、DMAP (O. 3 當(dāng)量)、CHCl3,室溫，過夜；(E) BF3. Et2O (4 當(dāng)量)，CHCl3, 0°C，3小時；(F)P0C13(1. 1當(dāng)量)、吡啶(2當(dāng)量)、1~冊，01，2-3小時；出)膽堿四苯基硼酸 酯(2當(dāng)量)、TPS(2.5當(dāng)量)、吡唳，70°C，1小時，然后在室溫下，3小時?！癟r”值三苯甲基。 “Chol-OH”=膽固醇。3-(2，3_異亞丙基-1-甘油基)膽固醇(13) :80-90°C，在氮氣氣氛中攪拌甲苯磺 酸膽固醇酯(50g，90mmol)和丙酮縮甘油(solketal) (250mL,2mol)在甲苯(50mL)中的混 合物4小時。冷卻至室溫后，將甲苯(300mL)加入該混合物。用鹽水(300mL)洗滌混合物。 分離后，再向有機層加入200mL甲苯。然后用鹽水(300mL)洗滌有機層，干燥并蒸發(fā)至干。 粗產(chǎn)物直接用于下一反應(yīng)步驟。TLC =Rf = 0. 55 (洗脫劑G)。1-甘油基膽固醇(14)將粗產(chǎn)物13溶解于THF (130mL) -TFA (40mL) -HCl (濃， 20mL)的混合溶劑中。將該混合物維持在室溫下4小時。減壓蒸發(fā)揮發(fā)物。將殘留物溶解于 CHCl3/Me0H(400mL/100mL)中，用水(IOOmL)洗滌。然后用硫酸鈉干燥有機層，過濾并蒸發(fā)。 粗產(chǎn)物經(jīng)-200C，乙醇重結(jié)晶純化。TLC =Rf = 0. 12 (洗脫劑 H)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 69 (s, 3H) ；0. 85-1. 65(m，33H) ； 1. 78-2. 31 (m，7H) ； 3. 10 (m, 1H) ；3. 45-3. 70 (m，4H) ；3. 79 (m, 1H)； 5. 34 (1H, d, J = 4. 4)；為 C3tlH53O3+計算的 MALDI-MS [M+H]+461. 40，實測 461. 44。1-膽固醇基-3-三苯甲基甘油(15)按照通用方法用三苯甲基保護14的3-羥基。 產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化(9 % -25 %乙酸乙酯-己烷)。TLC :Rf = 0. 38 (洗脫劑F)。1H NMR (CDCl3)， δ 0.69 (s，3H) ；0. 85-1. 65(m，33H) ； 1.86(m，3H) ；2. 0(m，2H) ；2. 18(m，lH) ；2. 32(m，lH)； 2. 42 (br, 1H) ；3. 11-3. 22 (m, 3H) ；3. 57 (m, 2H) ；3. 93 (m, 1H) ；5. 35 (1H，d，J = 4. 4) ；7.28 (m， 9H) ；7. 43(m，6H)。為 C49H67O3+計算的 MALDI_MS[M+H]+703. 51，實測 703. 53。1-膽固醇基-2-硬脂?；?3-三苯甲基甘油(16a) :0°C，向15(2. llg，3mmol)、硬 脂酸(0.94g，3. 15mmol)和4-二甲基氨基吡啶_P，0. 13g)的干燥無乙醇氯仿(20mL)溶 液中加入DCC(0.65g，3. 15mmol)。0°C，攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后在室溫下過夜。濾出 白色沉淀物，濾液蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化(1 % -10%乙酸乙酯-己燒)。TLC =Rf = 0·5(洗脫劑E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，66H) ； 1.81(m，3H) ；2. 0(m,2H) ；2. 19 (m, 1H) ；2. 26 (m, 1H) ；2. 35(t, J = 7·2，2Η) ；3. 12 (m, 1H) ； 3. 25 (m, 2H) ；3. 67 (m, 2H) ；5. 17 (m, 1H) ；5. 32 (d, J = 4. 4，1H) ；7. 27 (m, 9H) ；7. 44 (m, 6H)。為 C67HltllO4+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+969. 77，實測 969. 73。1-膽固醇基-2-棕櫚酰基-3-三苯甲基甘油(16b)按照16a相同的方法合成該化 合物。TLC:TLC:Rf = 0.5(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 68(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，62H)； 1.80(m，3H) ； 1.99(m，2H) ；2. 10 (m, 1H) ；2. 27 (m, 1H) ；2.35 (t，J = 7·2，2Η) ；3. 12 (m, 1H)； 3. 25 (m, 2H) ；3. 66(m，2H) ；5. 16(m，lH) ；5. 32 (d，J = 4. 4，1H) ；7.26(m，9H) ；7. 42 (m，6H)。為 C65H97O4+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+941. 74，實測 941. 72。1-膽固醇基-2-肉豆蔻?；?3-三苯甲基甘油)(16c)按照16a相同的方法合成 該化合物。TLC:Rf = 0.5(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，58H)； 1.81(m，3H) ； 2. 0(m,2H) ；2. 19 (m, 1H) ；2. 26(m，lH) ；2.35 (t，J = 7·2，2Η) ；3. 12 (m, 1H)； 3. 25 (m, 2H) ；3. 66 (m, 2H) ；5. 17 (m, 1H) ；5. 32 (d, J = 4. 4，1H) ；7. 27 (m, 9H) ；7. 44 (m, 6H)。為 C63H93O4+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+913. 71，實測 913. 71。1-膽固醇基-2-油?；?3-三苯甲基甘油(16d)按照16a相同的方法合成該化合 物。TLC =Rf = 0. 5 (洗脫劑 Ε)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 69(s，3H) ；0. 85-1. 65 (m, 58H) ；1. 81 (m, 3H) ；2. 01(m,6H) ；2.11(m，lH) ；2. 27 (m, 1H) ；2. 37 (t, J = 7·2，2Η) ；3. 13 (m, 1H) ；3.24 (m， 2H) ； 3.66(m，2H) ；5. 17 (m, 1H) ；5. 35 (m, 3H) ； 7. 28(m,9H) ;7.45(m，6H)。為 C67H99O4+計算的 MALDI-MS [M+H]+967. 75，實測 967. 74。1-膽固醇基-2-硬脂?；视?17a)按照通用方法除去三苯甲基。該粗產(chǎn)物直 接用于下一反應(yīng)步驟。TLC=Rf = 0.08 (洗脫劑E)。1-膽固醇基-2-棕櫚?；视?17b)按照通用方法除去三苯甲基。該粗產(chǎn)物直 接用于下一反應(yīng)步驟。TLC=Rf = 0.08 (洗脫劑E)。1-膽固醇基-2-肉豆蔻酰基甘油(17c)按照通用方法除去三苯甲基。該粗產(chǎn)物 直接用于下一反應(yīng)步驟。TLC =Rf = 0. 08己烷/EtOAc (10/1)。1-膽固醇基-2-油?；视?17d)按照通用方法除去三苯甲基。該粗產(chǎn)物直接 用于下一反應(yīng)步驟。TLC =Rf = 0. 08 (洗脫劑E)。1-膽固醇基-2-硬脂?；?外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18a)按照磷酸化的通 用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 05 (洗脫劑A)。1-膽固醇基-2-棕櫚?；?外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18b)按照磷酸化的通 用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 05 (洗脫劑A)。1-膽固醇基-2-肉豆蔻?；?外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18c):按照磷酸化的 通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 05 (洗脫劑A)。1-膽固醇基-2-油?；?外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18d)按照磷酸化的通用 方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 05 (洗脫劑A)。1-膽固醇基-2-硬脂酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3a，CheSPC)按 照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.31 (洗脫劑A)。1HNMR(⑶Cl3), δ 0.68 (s，3H) ；0. 85-1. 65(m，66H) ； 1.84(m，3H) ；2. 0(m，2H) ；2. 12(m，lH) ；2. 30(m，3H)； 3. 15 (m, 1H) ；3.39 (s，9H) ；3. 63(m，2H) ；3.81(m，2H) ；4. 25-4. 45 (m，5H) ；5.33 (d，J = 4. 4， 1H)。為 C53H99NO7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+892. 72，實測 892. 73。
45
1-膽固醇基-2-棕櫚酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3b，ChePPC)按 照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.31 (洗脫劑A)。1HNMR(⑶Cl3), δ 0.68 (s，3H) ；0. 85-1. 65(m，62H) ； 1.83(m，3H) ； 1.99(m，2H) ；2. ll(m，lH) ；2. 29(m，3H)； 3. 14(m，lH) ；3.38 (s，9H) ；3.64(m，2H) ；3. 82 (m, 2H) ；4. 24-4. 44 (m, 5H) ；5. 32 (d, J = 4.4， 1H)。為 C51H95NO7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+864. 68，實測 864. 70。1-膽固醇基-2-肉豆蔻?；?外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3c，CheMPC)按 照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.31 (洗脫劑A)。1H NMR(CDCl3), δ 0.68 (s，3H) ；0. 85-1. 65 (m, 58Η) ； 1. 83 (m, 3H) ； 1. 99 (m, 2H) ；2. 12 (m, 1H) ； 2. 30(m，3H)； 3. 14(m，lH) ；3.39 (s，9H) ；3. 62(m，2H) ；3. 83(m，2H) ；4. 22-4. 42 (m，5H) ；5.33 (d，J = 4.4， 1H)。為 C49H91NO7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+836. 65，實測 836. 65。1-膽固醇基-2-油?；?外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3d，CheOPC)按照磷酸 膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 30 (洗脫劑A)。1HNMR(⑶Cl3)，δ 0. 68 (s, 3H) ；0. 85-1. 65(m，58H) ； 1.83(m，3H) ；2. 0(m,6H) ；2. 12 (m, 1H) ；2. 29(m，3H) ；3. 13(m，lH)； 3.36(s，9H) ；3. 60(m，2H) ；3. 82(m，2H) ；4. 25-4. 45 (m，5H) ;5.32(m，3H)。為 C53H97NO7P+計算 的 MALDI-MS [M+H]+890. 70，實測 890. 67。實施例4制備脂質(zhì)SML4A-4D合成脂質(zhì)SML4a、SML4b、SML4c和SML4d (統(tǒng)稱為SML4a_d)的合成方案如流程4所 示。以下合成脂質(zhì)SML4a-d的詳述示例了該流程。流程4.合成 aSML4a_d a試劑和條件.㈧NaH(1.7當(dāng)量)、溴烷(0. 9當(dāng)量)、甲苯，120°C，過夜；(B)HCl， MeOH配制(2M)，回流，1.5小時；(C)三苯甲基氯(1. 5當(dāng)量)、吡啶，50°C，18小時；(D)氯甲 酸膽固醇酯(1. 2當(dāng)量)、DMAP(1. 2當(dāng)量)、CHCl3，室溫，過夜；(E)BF3. Et2O (4當(dāng)量)、CHCl3, 0°C，3小時；(F)P0C13(1. 1當(dāng)量)、吡啶(2當(dāng)量)、1~冊，01，2-3小時；出)膽堿四苯基硼酸 酯(2當(dāng)量)、TPS(2.5當(dāng)量)、吡啶，70°C，1小時，然后在室溫下，3小時?！癈hol-OH”=膽固 1-棕櫚基_2，3-異亞丙基甘油(19b)向NaH (9g，0. 225mol)的50mL無水甲苯懸 液中滴加丙酮縮甘油(19.8g，0. 15mol)。加入后，于120°C攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。然后 向該混合物中加入1-溴十四烷(40mL，0. 134mol)，將反應(yīng)維持在120°C過夜。將反應(yīng)混合 物冷卻至室溫后，小心加入水(400mL)以破壞過量的NaH，然后加入己烷(400mL)。隨后用 水(200mLX2)洗滌有機層，硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物直接用于下一反應(yīng)步驟。
1-肉豆蔻基-2，3-異亞丙基甘油(19c)按照19b相同的方法合成該化合物。1-油基-2，3-異亞丙基甘油(19d)按照19b相同的方法合成該化合物。1-棕櫚基甘油(20b)將粗產(chǎn)物19b溶解于200mL甲醇和40mL濃HCl中并回流 1.5小時。然后將該混合物冷卻至室溫，并置于4°C過夜。收集晶體，進行甲醇重結(jié)晶。TLC: Rf = 0. 1(洗脫劑 D)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 87(t, J = 7. 2，3H) ；1. 27(br,26H) ；1. 53 (m, 2H)；
2.52(br,2H) ；3. 30-3. 90 (m, 7H)。為 C19H41O3+計算的 MALDI_MS[M+H]+317. 31，實測 317. 30。1-肉豆蔻基甘油(20c)按照20b相同的方法合成該化合物。TLC :Rf = 0. 1 (洗脫 劑 D)。1H WR(CDCl3)，S0.87(t，J = 7.2，3H) ； 1. 27(br,22H) ； 1. 52 (m, 2H) ；2. 50(br,2H)；
3.31-3. 90 (m, 7H)。為 C17H37O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+289. 28，實測 289. 25。 1-油基甘油(20d)按照20b相同的方法合成該化合物，但通過HPFC純化 (30-70% 乙酸乙酯-己烷)。TLC =Rf = 0. 1(洗脫劑0)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 87 (t，J = 7. 2， 3H) ； 1. 27(br,22H) ； 1. 57 (m, 2H) ；2. 0(m，4H) ；2. 62(br,2H) ；3. 36-3. 54 (m，4H) ；3.68 (m， 2H) ；3. 85 (m, 1H) ；5.34(m，2H)。為 C21H43O3+計算的 MALDI_MS[M+H]+343. 32，實測 343. 36。1-硬脂?；?3-三苯甲基甘油(21a)按照通用方法引入3_三苯甲基。TLC=Rf =0. 11(洗脫劑 E)。1H 匪R(CDCl3)，δ 0. 87 (t, J = 7. 2，3H) ；1. 27(br,30H) ；1. 55 (m, 2H)； 2. 40 (br, 1H) ；3. 18 (m, 2H) ；3. 32-3. 53 (m, 4H) · 3. 94 (m, 1H) ；7. 23 (m, 9H) ；7. 43 (m, 6H)。為 C40H59O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+587· 45,實測 587· 44。1-棕櫚基-3-三苯甲基甘油(21b)按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC=Rf = 0. 11(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 87 (t, J = 7. 2,3H) ； 1. 27(br,26H) ； 1. 55 (m, 2H)； 2. 42 (br, 1H) ；3. 18 (m, 2H) ；3. 32-3. 53 (m, 4H) · 3. 94 (m, 1H) ；7. 22 (m, 9H) ；7. 42 (m, 6H)。為 C38H55O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+559. 42，實測 559. 40。1-肉豆蔻基-3-三苯甲基甘油(21c)按照通用方法引入3_三苯甲基。TLC=Rf =0. 11(洗脫劑 E)。1H 匪R(CDCl3)，δ 0. 87 (t, J = 7. 2，3H) ；1. 27(br,22H) ；1. 55 (m, 2H)； 2. 41 (br, 1H) ；3. 14 (m, 2H) ；3. 34-3. 53 (m, 4H) · 3. 94 (m, 1H) ；7. 27 (m, 9H) ；7. 44 (m, 6H)。為 C36H51O3+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+531. 39，實測 531. 38。1-油基-3-三苯甲基甘油(21d)按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC=Rf = 0. 11(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 88 (t, J = 7. 2,3H) ； 1. 28(br,22H) ； 1. 56 (m, 2H)； 2. 0(m,4H) ；2. 42 (br, 1H) ；3. 20 (m, 2H) ；3. 36-3. 54 (m, 4H) ；3. 96 (m, 1H) ；5. 35 (m, 2H)； 7. 25(m，9H) ；7. 45 (m, 6H)。為 C4tlH57O3+計算的 MALDI_MS[M+H]+585. 43，實測 585. 44。1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-3-三苯甲基甘油(22a)室溫下， 向21a(2.4g，4mm0l)和DMAP(0.6g)的干燥無乙醇氯仿(IOmL)溶液中滴加氯甲酸膽固醇 酯(2.2g，4.8mmol)的氯仿(5mL)溶液。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。然后將CHCl3/MeOH/ H20(40mL/20mL/30mL)混合溶劑加入該反應(yīng)混合物。硫酸鈉干燥有機層，過濾并蒸發(fā)。粗 產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化(0-10%乙酸乙酯-己烷)。TLC =Rf = 0. 43 (洗脫劑E)。1H NMR(CDCl3)， δ 0.69 (s，3H) ；0. 85-1. 65(m，68H) ； 1. 79-2. 02 (m，5H) ；2. 42(m，2H) ；3. 25(m，2H) ； 3.38 (m， 2H) ；3. 60(m，2H) ；4. 48 (m, 1H) ；5. 04 (m, 1H) ；5. 39 (d, J = 4. 4，1H) ；7.27(m，9H) ；7.43 (m， 6H)。為 C68Hltl3O5+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+999. 78，實測 999. 75。1-棕櫚基-2-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-3-三苯甲基甘油(22b)按照22a 相同的方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.43 (洗脫劑E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H)；0. 85-1. 65(m，64H) ； 1. 79-2. 02 (m，5H) ；2. 42(m，2H) ；3. 24(m，2H) ；3. 37(m，2H) ；3.61 (m， 2H) ；4. 48 (m, 1H) ；5. 04 (m, 1H) ；5. 39 (d, J = 4. 4，1H) ；7. 27 (m, 9H) ；7. 43 (m, 6H)。為 C66H99O5+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+971. 75，實測 971. 78。1-肉豆蔻基-2-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-3-三苯甲基甘油(22c)按照22a 相同的方法合成該化合物。TLC :Rf = 0.43 (洗脫劑E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H)； 0. 85-1. 65(m，60H) ； 1. 79-2. 02 (m，5H) ；2. 42(m，2H) ；3. 23(m，2H) ；3. 37(m，2H) ；3. 61 (m， 2H) ；4. 48 (m, 1H) ；5. 04 (m, 1H) ；5. 39 (d，J = 4. 4，1H) ；7.27(m，9H) ;7.43(m，6H)。為 C64H95O5+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+943. 72，實測 943. 71。1-油基-2-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-3-三苯甲基甘油(22d)按照22a相 同的方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.43(洗脫劑 E)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 69(s,3H)； 0. 85-1. 65(m，60H) ； 1. 79-2. 02 (m，9H) ；2. 40(m，2H) ；3. 23(m，2H) ；3. 37(m，2H) ；3. 61 (m， 2H) ；4. 48 (m, 1H) ；5. 04 (m, 1H) ；5. 33-5. 39 (m，3H) ；7.27(m，9H) ；7. 44 (m，6H)。為 C68HltllO5+計 算的 MALDI-MS [M+H]+997. 77，實測 997. 74。1-硬脂酰基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23a)按照除去三苯甲基的通 用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 63(洗脫劑D)。1-棕櫚基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23b)按照除去三苯甲基的通用 方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 63 (洗脫劑D)。1-肉豆蔻基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23c)按照除去三苯甲基的通 用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 63(洗脫劑D)。1-油基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23d):按照除去三苯甲基的通用方 法合成該化合物。TLC =Rf = 0.63(洗脫劑D)。1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基_3_磷酸酯(24a) 按照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 57 (洗脫劑C)。1-棕櫚基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24b)按 照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 57 (洗脫劑C)。1-肉豆蔻基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24c) 按照磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 57 (洗脫劑C)。1-油基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24d)按照 磷酸化的通用方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 57 (洗脫劑C)。1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿 (SML4a, SeChcPC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC :RF = 0. 53 (洗脫劑 A)。1H NMR (CDCl3), δ 0. 68(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，66H) ； 1· 84-2. 05 (m，5H) ；2.36(m，2H)； 3. 39(s，9H) ；3.44(m，2H) ；3. 61(m，2H) ；3. 83(m，2H) ；4. 01(m，2H) ；4. 35(m，2H) ；4.44 (m， 1H) ；4. 98 (m, 1H) ；5. 39(d，J = 4. 4，1H)。為 C54HltllNO8P+計算的[M+H]+922. 73，實測 922. 73。1-棕櫚基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML4b, PeChcPC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.53 (洗脫劑 A)。1H NMR (CDCl3), δ 0. 68(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，62H) ； 1· 84-2. 05 (m，5H) ； 2. 36 (m, 2H)； 3. 38(s，9H) ； 3. 45(m，2H) ； 3. 61(m，2H) ； 3. 82(m，2H) ；4. 02(m，2H) ；4. 35(m，2H) ；4.44 (m， 1H) ；4. 98 (m, 1H) ；5. 39 (d，J = 4. 4，1H)。為 C52H97NO8P+計算的 MALDI-MS [M+H]+894. 69，實測894. 68。1-肉豆蔻基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿 (SML4c, MeChcPC)按照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.53 (洗脫劑 A)。1H NMR (CDCl3), δ 0. 68(s,3H) ；0· 85—1. 65 (m，58H) ； 1· 84—2. 05 (m，5H) ； 2. 37 (m, 2H)； 3. 39(s，9H) ； 3. 44(m，2H) ； 3. 61(m，2H) ； 3. 83(m，2H) ；4. 02(m，2H) ；4. 35(m，2H) ；4.44 (m， 1H) ；4. 98 (m, 1H) ；5. 39 (d，J = 4. 4，1H)。為 C5tlH93NO8P+計算的 MALDI_MS[M+H]+866. 66，實測 866.64。1-油基-2-膽固醇基羰基_外消旋_甘油基-3-磷酸膽堿(SML4d，OeChcPC)按 照磷酸膽堿合成的通用方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.53 (洗脫劑A)。1H NMR(CDCl3), δ 0.69 (s，3H) ；0. 85-1. 65 (m, 58Η) ； 1. 84-2. 05 (m，9H) ；2.37(m，2H) ； 3.38(s，9H) ；3.45 (m， 2H) ；3.62(m，2H) ；3.84(m，2H) ；4.02(m，2H) ；4. 35 (m, 2H) ；4. 45 (m, 1H) ；4. 98 (m, 1H)； 5. 35-5. 39 (m, 3H)。為 C54H99NO8P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+920. 71，實測 920. 71。實施例5制備脂質(zhì)SML5A-5D合成脂質(zhì)SML5a、SML5b、SML5c和SML5d (統(tǒng)稱為SML5a_d)的合成方案如流程5所 示。以下合成脂質(zhì)SML5a-d的詳述示例了該流程。流程5.合成 aSML5a_d SML5a :R = C17H35 ； SML5b :R = C15H31SML5c :R = C13H27 ； SML5d :R = C17H33a試劑和條件· (A)氯甲酸膽固醇酯(2. 3當(dāng)量),DMAP (4當(dāng)量)、CHCl3,室溫，16小 時?！癈hol-OH”=膽固醇。1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyD-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML5a， SChcPC)室溫下，向1-硬脂?；?2-羥基-Sn-甘油基-磷酸膽堿(lg，1.91mm0l)和 DMAP(Ig)的無乙醇干燥氯仿(50mL)溶液滴加氯甲酸膽固醇酯(2g，4. 45mmol)的氯仿溶液 (IOmL)。室溫下反應(yīng)16小時后，蒸發(fā)溶劑，殘留物經(jīng)HPFC純化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC :Rf = 0. 54(洗脫劑 C)。1H NMR(CDCl3/MeOH_d4/吡啶-d5，10 2 1)， δ 0.68 (s，3H) ；0. 85-1. 65 (m, 66Η) ； 1. 84-2. 05 (m，5H) ；2.33 (t，J = 7. 6Hz，2H) ；2.39 (m， 2H) ；3.28 (s，9H) ；3. 67(m，2H) ；4. 10(m，2H) ；4. 24(m，lH) ；4. 32(m，2H) ；4. 47(m，2H)； 5. 11 (m，1H) ；5. 41 (d，J = 4. 4，1H)。為 C54H99NO9P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+937. 61，實測 937. 67。1-棕櫚?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyD-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML5b， PChcPC)按照5a相同的方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.54 (洗脫劑C)。1H NMR(O)Cl3/ Me0H-d4/ 吡啶-d5，10 2 1)，5 0. 68(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m, 62H) ； 1. 84-2. 05 (m, 5H)； 2. 31 (t, J = 7. 6，2H) ；2. 36(m，2H) ；3. 27(s，9H) ；3. 66(m，2H) ；4. 08(m，2H) ；4. 23 (m, 1H) ；4. 30 (m, 2H) ；4. 44 (m, 2H) ；5. 08 (m, 1H) ；5. 40 (d, J = 4. 4，1H)。為 C52H95NO9P+ 計算的MALDI-MS [M+H]+908. 67，實測 908. 67。1-肉豆蔻?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl) -sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML5c， MChcPC)按照5a相同的方法合成該化合物。TLC:Rf = 0. 54(洗脫劑C)。1H NMR(O)Cl3/ MeOH-d4/ 吡啶-d5，10 2 1)，5 0. 69(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m, 58H) ； 1. 84-2. 05 (m, 5H)； 2. 33(t，J = 7. 6，2H) ；2. 39(m，2H) ； 3. 27(s，9H) ； 3. 67(m，2H) ；4. 09(m，2H) ；4.24 (m， 1H) ；4. 31 (m, 2H) ；4. 45 (m, 2H) ；5. 09 (m, 1H) ；5. 40 (d, J = 4. 4，1H)。為 C52H95NO9P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+908. 67，實測 908. 67。1-油?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyD-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML5d， OChcPC)按照5a相同的方法合成該化合物。TLC=Rf = 0.54 (洗脫劑C)。1H NMR(O)Cl3/ MeOH-d4/ 吡啶-d5，10 2 1)，5 0. 69(s,3H) ；0. 85-1. 65 (m, 58H) ； 1. 84-2. 06 (m, 9H)； 2. 33 (t, J = 7·6，2Η) ；2. 39(m，2H) ；3.28(s，9H) ；3. 68(m，2H) ；4.10(m，2H) ；4. 24(m，lH)； 4. 32 (m, 2H) ；4. 47 (m, 2H) ；5. 10 (m, 1H) ；5. 36 (m, 2H) ；5. 40 (d, J = 4. 4，1H)。為 C54H97NO9P+ 計 算的 MALDI-MS [M+H]+934. 69，實測 934. 68。實施例6制備脂質(zhì)SML6a_d合成脂質(zhì)SML6a、SML6b、SML6c和SML6d (統(tǒng)稱為SML6a_d)的合成方案如流程6所 示。以下合成脂質(zhì)SML6a-d的詳述示例了該流程。流程6.合成 aSML6a_d SML6a :RH =膽固醇 SML6b :RH =膽固醇SML6c:RH=豆固醇SML6d =RH = β-谷固醇1，2-二膽固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML6a，DChcPC)將 甘油磷酸膽堿(0. 514g,2mmol)和四苯基硼酸鈉(0. 719g，1. 05當(dāng)量)溶解于15mL甲醇。蒸 發(fā)溶劑，用甲苯共沸干燥殘留物。然后將干燥的固體溶解于無水吡啶(60mL)，隨后加入4， 4_ 二甲基氨基吡啶(0. 732g，6mmol)。室溫下，將氯甲酸膽固醇酯(2. 70,6mmol)分部分加入 該反應(yīng)混合物并劇烈攪拌。然后用氮氣吹掃反應(yīng)燒瓶，避光維持3天。揮發(fā)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。 將粗產(chǎn)物溶解于氯仿-甲醇(2 l，150mL)，用50mL蒸餾水洗滌。無水硫酸鈉干燥有機層， 過濾并蒸發(fā)。殘留物應(yīng)用HPFC作進一步純化(CHCl3到ΟΚ^/ΜθΟΗ/^Ο^δΛδΛ))。產(chǎn)量， 0. 38g(17. 7% ) ο TLC :Rf = 0· 4 (洗脫劑 A)。1H NMR(CDCl3)，δ 0. 68(s，6H) ；0. 85-1. 65 (m,66H) ；1. 81-2. 06 (m, 10H) ；2. 37(m，4H) ；3. 42(s，9H) ；3.89(m，2H) ；4. 06 (m，2H)，4. 26 (m， 2H) ；4. 36(m，2H) ；4. 44(m，2H) ；5. 04(m，lH) ；5.38 (d，J = 4. 4，2H)。為 C64H109NOiciP+計算的 MALDI-MS [M+H]+1082. 79，實測 1082. 73。1，2-二膽固醇基半琥珀?；?hemisuccinoyD-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML6b， DCHEMSPC)將甘油磷酸膽堿(1.03g，4mmOl)和四苯基硼酸鈉(1.33g，l當(dāng)量)溶解于30mL 甲醇。蒸發(fā)溶劑，用甲苯共沸干燥殘留物。然后將干燥的固體溶解于無水吡啶(120mL)，隨 后加入4，4_ 二甲基氨基吡啶(0. 9g)和半琥珀酸膽固醇酯(4. 86g，1 Ommol)。將混合物溫和 升溫以完全溶解固體。冷卻至室溫后，將二環(huán)己基碳二亞胺(2. 32g, llmmol)加入反應(yīng)混合 物。室溫下，在氮氣氣氛中攪拌該混合物3天。揮發(fā)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將殘留物溶解于氯仿-甲 醇(2 l，300mL)，用SOmL蒸餾水洗滌。無水硫酸鈉干燥有機層，過濾，蒸發(fā)并應(yīng)用HPFC作 進一步純化(CHCl3 到 CHCl3/Me0H/H20(65/25/4))。產(chǎn)量，2. 3g(48% ) TLC =Rf = 0. 42 (洗脫 劑 A)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 68(s,6H) ；0· 85-1. 65 (m，66H) ； 1. 81-2. 06 (m, 10H) ；2.30(m，4H)； 2. 60(m，8H) ；3. 39(s，9H) ；3. 85(m，2H) ；3. 99 (m，2H)，4. 23 (m，2H) ；4. 35(m，2H) ；4.58 (m， 2H) ；5. 22(m，lH) ；5. 37 (d，J = 4. 4，2H)。為 C7tlH116NO12P+計算的 MALDI-MS [M+H]+1194. 84，實 測 1194. 79。1，2-二豆固醇基半琥珀?；?hemisuccinoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML6c， DStigHSPC)按照SML6b相同的方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 36 (洗脫劑A)。通過NMR 和MALDI-MS證實結(jié)構(gòu)。1，2-二谷固醇基半琥珀?；?hemisuccinoyD-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML6d， DSitoHSPC)按照SML6b相同的方法合成該化合物。TLC =Rf = 0. 40 (洗脫劑A)。通過NMR 和MALDI-MS證實結(jié)構(gòu)。實施例7制備前藥脂質(zhì)SML7A-B按照實施例3的類似合成路線合成視黃酸前藥SML7a和SML7b (統(tǒng)稱為SML7a_b)。 合成SML7a-b的簡明合成路線示于流程7。以下合成脂質(zhì)SML7a_b的描述示例了該流程。流程7.合成 aSML7a_b ML7a :RC02H =全反式視黃酸SML7b =RCO2H = 13-順式視黃酸Chol-OH=膽固醇；‘‘Tr"=三苯甲基按照以上實施例3所述相同的方法合成選擇性保護的膽固醇基甘油中間體。然后 將視黃酸經(jīng)酯鍵偶聯(lián)于sn-2羥基，然后從3-羥基除去三苯甲基(Tr)。然后按照實施例的 通用方案所述的標(biāo)準(zhǔn)方法將中間體立即轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸膽堿。終產(chǎn)物經(jīng)HPFC純化，通過 TLC、匪R和MALDI-MS證實結(jié)構(gòu)。實施例8 制備脂質(zhì)SML8A-F合成脂質(zhì)SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e 和 SML8f (統(tǒng)稱為 SML8a_f)的合成 方案如流程8所示。以下合成脂質(zhì)SML8a-f的詳述示例了該流程。 SML8d :R2H =膽固醇基羰基SML8e =R2H =膽固醇基SML8f :R2H =膽固醇基氧基氧丙基按照流程8所示的合成路徑合成固醇_溶血鞘磷脂偶聯(lián)物(SMLSa-c)。首先，通過 DCC，用N-羥基琥珀酰亞胺活化固醇的半琥珀酸酯。然后，將固醇的活化酯偶聯(lián)于溶-鞘磷 脂的氨基。終產(chǎn)物經(jīng)HPFC進一步純化。溶-鞘磷脂分別與氯甲酸膽固醇酯、甲苯磺酸膽固醇酯和丙烯酸膽固醇酯合成 SML8d-f0膽固醇基氧基-4-氧代丁酰胺基-3-羥基十八碳-4-烯基2_(三甲銨基 (trimethylammonio))乙基磷酸酯(SML8a)室溫下，向溶-鞘磷脂(25mg, 53 μ mol)的 無乙醇干燥氯仿(6mL)溶液加入琥珀酰亞胺基膽固醇基琥珀酸酯(62mg，106ymol)和 DMAP (IOmg)。室溫下，攪拌該反應(yīng)混合物24小時。蒸發(fā)溶劑。殘留物應(yīng)用HPFC純化(CHCl3 到 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC :Rf = 0. 33 (洗脫劑 C)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 68 (s, 3H)； 0. 85-0. 92 (m, 14H) ； 1. 00-1. 15 (m，10H) ； 1. 25(br,28H) ； 1. 42-1. 62 (m，6H) ； 1. 84-2. 05 (m， 7H) ；2.29(m，2H) ；2. 51(m，4H) ；2. 68 (br, 1H) ；3.28(s，9H) ；3. 72 (m, 1H) ；4. 01 (m,4H)； 4. 28 (m, 2H) ；4. 58 (m, 2H) ； 5. 34 (m, 1H) ；5.44 (d，J = 4. 2，1H) ；5. 68 (m, 1H) ；7. 51 (br，1H)。 為 C54H98N2O8P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+933. 72，實測 933. 68。2-膽固醇基氧基羰基氨基-3-羥基十八碳-4-烯基2-(三甲銨基)乙基磷酸酯 (SML8d)室溫下，向溶-鞘磷脂(25mg,53ymol)和DMAP(20mg)的無乙醇干燥氯仿(4mL) 溶液中加入2mL干燥無乙醇氯仿配制的氯甲酸膽固醇酯(48mg，106ymol)。室溫下攪拌24 小時后，蒸發(fā)溶劑。殘留物應(yīng)用HPFC純化(CHCl3到CHCl3-Me0H-H2065/25/4)。TLC =Rf =
0.41 (洗脫劑 C)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 68(s,3H) ；0· 85-0. 92 (m，14H) ； 1. 00-1. 15 (m, 10H)；
1.25(br,28H) ； 1. 47-1. 528 (m，6H) ； 1. 84-2. 05 (m，7H) ；2. 29 (m,2H) ；2. 65 (br, 1H) ；3. 3(s,9H) ；3. 61(m，lH) ；3. 89(m，4H) ；4. 28(m，4H) ；5. 34(m，lH) ；5.48 (d，J = 4. 4，1H) ；5.73 (m， 1H) ；6. 16 (br, 1H)。為 C51H94N2O7P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+877. 69，實測 877. 76。實施例9.制備脂質(zhì)SML9A-C合成脂質(zhì)SMLSa-c的具體合成方案如流程9所示。以下合成脂質(zhì)SML9a_c的詳述 示例了該流程。流程9.合成 aSML9a_c SML9a :RH =膽固醇SNL9b:RH=豆固醇SML9c :RH = b_ 谷固醇可按照流程9所示的合成路線合成可聚合的SML脂質(zhì)(SML9a_c)。首先，可將固醇 的半琥珀酸酯選擇性偶聯(lián)于甘油磷酸膽堿的sn-Ι位置。然后，將10，12- 二十三碳二炔酸 偶聯(lián)于sn-2位置從而得到終產(chǎn)物。粗產(chǎn)物可經(jīng)HPFC純化。實施例10 制備分支脂質(zhì)SMLlOA-F合成脂質(zhì)SMLlOa-f的具體合成方案如流程10所示。以下合成脂質(zhì)SMLlOa-f的 詳述示例了該流程。流程10.合成 aSML10a_f SMLlOaSMLlObSMLlOcSMLlOdSMLlOeSMLlOf 采用實施例6所述SML6b的相似合成方法將該分支的異-硬脂酸偶聯(lián)于甘油磷酸 膽堿(glycerophocholine)的sn_l位置，但起始材料的摩爾比例不同。然后通過HPFC分
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υΜRz
=R1OH =異-硬脂酸，R2OH =半琥珀酸膽固醇酯 =R1OH =異-硬脂酸，R2OH =半琥珀酸豆固醇酯 =R1OH =異-硬脂酸，R2OH =半琥珀酸谷固醇酯 =R1OH =異-硬脂酸N，R2OH =半琥珀酸膽固醇酯 =R1OH =異-硬脂酸N，R2OH =半琥珀酸豆固醇酯 =R1OH =異-硬脂酸N，R2OH =半琥珀酸谷固醇酯
異-硬脂酸⑷離單-異-硬脂?；姿崮憠A，并經(jīng)二環(huán)己基碳二亞胺偶聯(lián)于固醇的半琥珀酸酯。終產(chǎn)物 經(jīng)HPFC純化。實施例11 制備分支脂質(zhì)SMLllA-F合成脂質(zhì)SMLlla-f的具體合成方案如流程11所示。以下合成脂質(zhì)SMLlla-f的 詳述示例了該流程。流程11 ·合成 aSML 11 a-f SMLlla =R1 = C17H35，R2OH =膽固醇SMLllb =R1 = C17H35，R2OH =豆固醇SMLllc =R1 = C17H35，R2OH =谷固醇SMLlld =R1 = C15H31，R2OH =膽固醇SMLlle =R1 = C15H31，R2OH =豆固醇SMLllf =R1 = C15H31，R2OH =谷固醇可利用肉堿作為起始材料，兩步合成靶SML脂質(zhì)SMLlla_f。首先，將活化的脂族酸 經(jīng)酯鍵偶聯(lián)于羥基。然后，將固醇也經(jīng)酯鍵連接于羧基。終產(chǎn)物可經(jīng)HPFC純化。實施例12 制備具有酪氨酸的SML, SML12A-F合成脂質(zhì)SML12a-f的具體合成方案如流程12所示。以下合成脂質(zhì)SML12a_f的 詳述示例了該流程。流程12.合成 aSMLlla_f SML 12a =R1 = C18H37，R2OH =膽固醇SML 12b =R1 = C18H37，R2OH =豆固醇SML12c =R1 = C18H37, R2OH =谷固醇SML12d =R1 = C18H33, R2OH =膽固醇SML12e =R1 = C18H33, R2OH =豆固醇SML12f =R1 = C18H33, R2OH =谷固醇可按照流程12所示合成路線合成固醇修飾的兩親脂質(zhì)SML12a-f。首先，將脂族醇偶聯(lián)于選擇性保護的酪氨酸的羧基，然后用哌啶除去Fmoc基團。然后將半琥珀酸固醇酯偶 聯(lián)于氨基。除去叔丁基后，硫酸化酚基。還可將酚基轉(zhuǎn)化成磷酸酯基、膦酸酯基、磺酸酯基、 硼酸酯基或腙。該途徑提供基于其它氨基酸的固醇修飾脂質(zhì)的合成路線，其中適當(dāng)保護的 氨基酸用作分支核心。實施例13 制備還原-敏感件SML13A-H將還原-敏感性SML脂質(zhì)設(shè)計成該分子具有可在還原性生物學(xué)條件下，例如在 細胞胞質(zhì)溶膠中可選擇性切割的還原鍵。這會使得脂質(zhì)顆粒去穩(wěn)定并有助于選擇性釋放 藥物。可將二硫鍵置于分子的不同部分，例如側(cè)鏈(SML13a-h)或首基(SML13i-k)。脂質(zhì) SML13a-k的合成示于流程13. 1、流程13. 2和流程13. 3。以下合成脂質(zhì)SML13a_k的詳述示 例了該流程。流禾! SML13a :R = C18H37 ；SML 13bSML13c :R = C14H29 ；SML13d流程13. 2 合成 SML13e_h SML131 =R1H =膽固醇，R2 = C17H35SML13i =R1H =膽固醇，R2 = C15H31SML 13k =R1H =豆固醇，R2 = C17H35可通過以上實施例4所述SML4a_d的相似方法合成SML13a_d。將2_膽固醇基雙 硫烷基乙酸(cholesteryldisulfanyl acetic acid)，而非氯甲酸膽固醇酯偶聯(lián)于sn-2羥 基?？砂凑誗ML5a-d的相同方法，用2-膽固醇基雙硫烷基乙酸替代氯甲酸膽固醇酯合成 SML13e-h。合成SML13i-k時，首先將2-硫代吡啶活化的二硫鍵部分連接于氨基。然后，將 該固醇偶聯(lián)于伯醇，再將脂肪酸連接于仲醇。最后，通過二硫鍵交換反應(yīng)引入陽離子首基。 SML13i-k是還原-敏感性陽離子SML化合物。它們對于基因和siRNA遞送可能十分有用。實施例14.制備在首基末端具有疊氮化物的SML, SML14A-F靶向脂質(zhì)體的設(shè)計在很大程度上取決于良好控制的生物偶聯(lián)反應(yīng)的開發(fā)，該反應(yīng) 在大多數(shù)情況中涉及將配體偶聯(lián)于攜帶功能化脂質(zhì)錨定部分的預(yù)先形成囊泡的表面。在許 多可用的偶聯(lián)方法中，最常用的包括含巰基配體與攜帶巰基反應(yīng)活性官能團，例如馬來酰 亞胺、溴乙酰基或2-吡啶二巰基連接鍵的錨定物反應(yīng)，從而產(chǎn)生硫醚或二硫鍵，或疊氮基， 通過“沖壓_化學(xué)方法(click-chemistry) ”與炔環(huán)化。優(yōu)選利用末端-功能化的SML作為 靶向配體或表面標(biāo)記物的錨定物。SML化合物SML14a-f是在首基末端具有疊氮基的一些模 型化合物，所述疊氮基可通過“沖壓_化學(xué)方法”用于連接配體或生物標(biāo)記?？刹捎孟嗨品?式引入其它官能團，例如炔丙基。合成脂質(zhì)SML14a-f的具體合成方案如流程14所示。以 下合成脂質(zhì)SML14a-f的詳述示例了該流程。流程14.合成 SML14a_fSML14a= R1H=膽固醇，R2=C17H-
SML14b= R1H=豆固醇，R2=C17H-
SML14c= R1H=谷固醇，R2=C17H-
SML14d= R1H=膽固醇，R2=C15H;
SML14e= R1H=豆固醇，R2=C15H;
SML14f= R1H=谷固醇，R2=C15H;SML14a-f的合成簡單。首先，將疊氮基功能化的聚氧化乙烯連接于更具反應(yīng)活性 的胺。然后，將半琥珀酸固醇酯偶聯(lián)于伯醇。在最后一步中，將脂肪酸連接于反應(yīng)活性最低 的仲醇。由于官能團的反應(yīng)活性不同，無需保護基團。實施例15 所詵SML的示差掃描量熱法利用特定SML作為模型化合物來研究SML化合物的特性。相特性(phasebehavior) 是脂雙層的最重要特性之一，其與細胞膜的各種生物學(xué)功能有關(guān)。將游離膽固醇加入磷脂 雙層會因游離膽固醇與甘油脂和鞘脂的混合以及游離膽固醇的異戊二烯尾部影響填充在
56雙層中的酰基鏈而改變該雙層的相特性。采用示差掃描量熱法顯示SML對填充在合成脂質(zhì) 構(gòu)成的雙層中的酰基鏈的影響與游離膽固醇相似。因此，選擇含有C-16鏈與各種連接鍵的 SML(SMLlb-5b)和含不同鏈的一組的SML (SML5a_5d)以供DSC研究。利用配有三個的可重復(fù)使用哈司特樣品安瓿(Hastelloy sample ampoule)和一 個參比安瓿的升級高溫MC-DSC 4100量熱計(猶他州林頓市量熱科學(xué)公司(Calorimetry Sciences Corp. ,Lindon,UT))進行示差掃描量熱法(DSC)研究。通常以0. 5°C /分鐘的速 度收集5-85°C范圍的數(shù)據(jù)，利用Milli-Q 水作為參比。利用CSC的CpCalc 2. 1軟件包將 原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成摩爾熱容(MHC)。然后將數(shù)據(jù)傳輸至Origin 6. O (馬薩諸賽州北安普敦的 微卡公司(Microcal，Northampton, MA))作進一步加工和計算。65°C，在氬氣氣氛中將脂 質(zhì)薄膜(ΙΟμπιοΙ)在Milli-Q 水(200 μ L)中水合并作間歇渦流振蕩來制備用于DSC檢測 的脂質(zhì)體。然后將樣品冷卻至室溫，脫氣并用氣密性Hamilton 注射器(每份樣品100 μ L) 加載入樣品安瓿。通過加熱_冷卻_加熱循環(huán)掃描樣品，第二次加熱掃描數(shù)據(jù)用于分析。在游離膽固醇和二?；字某Ｒ?guī)脂質(zhì)混合物中，根據(jù)下式計算總脂質(zhì)中膽固醇 (Chol)的摩爾百分比Chol % = nchol/ (nchol+n 二?；?X 100，式中nchol指膽固醇的摩爾數(shù)，η 二 gt基指二?；|(zhì)的摩爾數(shù)。當(dāng)m-SML(單固醇SML)與二酰基磷脂混合時，計算二?；|(zhì)總摩爾數(shù)時包括 m-SML中的額外?；?。按照常規(guī)脂質(zhì)混合物的方法，采用下式計算m-SML和二酰基脂質(zhì)的 混合物中當(dāng)量固醇摩爾百分比固醇nm_SML/(l·5Xnm_SML+n二酸基)X100，式中nm_stc 指 m-SML 的摩爾數(shù)，η 二 gt基指二?；|(zhì)的摩爾數(shù)。例如，純的m-SML具有一個固醇和一個?；?，因此當(dāng)量游離固醇百分比是 1/1.5X100 = 67。在m-SML和二?；|(zhì)的1 1摩爾混合物中，當(dāng)量游離固醇百分比是 1/(1. 5+1) X 100 = 40。同一計算方法適用于所有其它m-SML制劑。DSC結(jié)果示于圖1和圖 2。在圖1中，當(dāng)量膽固醇(Chol)的百分比數(shù)值指摩爾百分比。DSPC指二硬脂酰 基磷脂酰膽堿；SChcPC指具有一個固醇的SML，特別是1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基 (carbonoyl) _sn_ 甘油基 _3_ 磷酸膽堿(SML5a)。在圖2中，含各種摩爾百分比的游離膽固醇的SML/二?；|(zhì)混合物的轉(zhuǎn)變溫度 和焓。將SML與相同鏈長的二?；|(zhì)。在圖2中檢驗的SML如下所示· 1-膽固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕櫚基氨甲?；鵢sn-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML lb, ChcPaPC)· 1-膽固醇基羰基(carbonoyl) _2_棕櫚基-外消旋-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML2b, ChcPePC)· 1-膽固醇基-2-棕櫚?；?外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3b，ChePPC)· 1-棕櫚基-2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基_3_磷酸膽堿(SML4b, PeChcPC)· 1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl) -sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML5a， SChcPC)· 1-棕櫚?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl) -sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML5b， PChcPC)·1-肉豆蔻?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML5c， MChcPC)· 1-油?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML5d， OChcPC)。SChcPC及其與DSPC的混合物的DSC熱分析圖(圖1)是測試的大多數(shù)SML的典型 結(jié)果。將主要轉(zhuǎn)變溫度(Tm)和焓(ΔΗ)對脂質(zhì)混合物中膽固醇的百分比作圖(圖2)。無 論何種SML的化學(xué)結(jié)構(gòu)，測試的所有SML在10-80°C溫度范圍內(nèi)沒有可檢測的相轉(zhuǎn)變。因 此，如果膽固醇和脂族鏈彼此靠近，可以獲得高膽固醇濃度(約67%)的均勻液體有序雙 層。在活細胞中，如果膜蛋白對于脂質(zhì)鏈和膽固醇具有強烈親和力，則可在質(zhì)膜上形成類似 的結(jié)構(gòu)域。與加入游離膽固醇一樣，將SML加入相應(yīng)的二酰基脂質(zhì)加寬了轉(zhuǎn)變峰 (transition peak)，降低了轉(zhuǎn)變溫度和焓。該效應(yīng)是濃度依賴性的，最終當(dāng)膽固醇達到某 種濃度時，導(dǎo)致相轉(zhuǎn)變的消除。雖然不同連接鍵的SML的凝聚作用(condensing effect)不同，但特別是作為同 種型的ChcPePC和PeChcPC之間的Tm和ΔΗ沒有明顯差別。ChcPePC能快速降低Tm和ΔH, 并在30%當(dāng)量膽固醇時完全消除相轉(zhuǎn)變，而具有相同鏈長的其它SML需要至少35%的當(dāng)量 膽固醇。通過比較ChcPePC與ChcPaPC和PeChcPC,看來是ChcPePC的2-醚連接鍵導(dǎo)致該差 異。還應(yīng)注意，當(dāng)膽固醇未高于20%時，將OChcPC加入DSPC導(dǎo)致極寬的轉(zhuǎn)變峰。這明顯不 同于SChcPC對DSPC的影響(圖1)，可能導(dǎo)致不飽和的油酰基鏈與飽和的硬脂?；溨g 的鏈錯配。實施例16 將鈣黃綠素有效負(fù)載包封在脂質(zhì)體中加入50%氫氧化鈉(695 UL, 13. 2mmol)后，將熒光染料鈣黃綠素(2. 49g,4mmol) 溶解于Tris-HCl緩沖液(10mM，pH7. 5，6mL)。然后將該儲備液加載于S印hadex LH-20柱 (2. 5cmX40cm)，用Tris-HCl緩沖液(10mM,pH 7. 5)洗脫。通過檢測pH 9時稀釋樣品的吸 光度(494nm)來測定合并的鈣黃綠素部分的濃度。然后將純化的鈣黃綠素(56mM)包封入 脂質(zhì)體以供滲漏試驗。60°C，在氬氣氣氛中，在ImL含鈣黃綠素的緩沖液中將給定配方的干 燥脂質(zhì)薄膜(ΙΟμπιοΙ)水合15分鐘，并作間歇渦流振蕩。然后在60°C將樣品經(jīng)聚碳酸酯膜 擠出11次，再用相應(yīng)的等滲洗脫劑流過S印hadex G_50柱。然后分析合并的脂質(zhì)體組分以 測定鈣黃綠素濃度，并稀釋至線形熒光范圍以供下述的滲漏研究。實施例17 滲透應(yīng)力誘導(dǎo)滲漏含SML的脂質(zhì)體的一個優(yōu)選特性是耐受脂質(zhì)體的脂質(zhì)體內(nèi)含物(例如，藥物)滲 漏。在脂雙層中包含SML通常使得脂質(zhì)體在體外不易滲漏。已證明檢驗脂質(zhì)體在滲透壓下 的滲漏是評估脂質(zhì)膜的彈性變形和致命缺陷的有效方法。當(dāng)脂質(zhì)體經(jīng)歷高滲透壓時，該膜 會腫脹并在臨界點破裂從而快速釋放內(nèi)含物。然后一旦有足夠的內(nèi)含物排出，囊泡會重新密封成機械穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。因此，滲透滲漏特性依據(jù)人工滲透梯度下的快速平衡。按照上述方法(實施例11)制備本項研究所用的含高濃度內(nèi)含物(56mM鈣黃綠 素，IOmM Tris,711mM NaCl)的脂質(zhì)體，經(jīng)IOOnm膜擠出，并用等滲緩沖液(50mM HEPES, 775mM NaCl)洗脫。單獨1，2- 二肉豆蔻酰基_sn-甘油基-磷酸膽堿(DMPC)和DMPC及膽 固醇(1 1摩爾比)的脂質(zhì)體在SML化合物Ch。MaPC(l-膽固醇基羰基(carb0n0yl)-2-肉 豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；SMLlc)脂質(zhì)體的滲漏研究中用作陽性對照。通 過混合不含鈣黃綠素的等滲緩沖液(ieOOmOsm)和50m0sm稀釋緩沖液(50mM HEPES)制備各 種滲透濃度的溶液。然后在37°C，通過混合IOyL脂質(zhì)體與990 μ L測試緩沖液而使得脂質(zhì) 體接觸各種滲透濃度的溶液。平衡5分鐘后，利用Quantech 熒光計(衣阿華州杜布克的 B/T 公司(Barnstead/Thermolyne, Dubuque, IA))讀取 517nm 的熒光強度(ext. :494nm)。 然后加入100μ L10% Triton X_100來連接脂質(zhì)體，從而完全釋放鈣黃綠素。檢測總鈣黃綠 素的熒光，用作100%信號(F1(KI%)。裂解前，保留在脂質(zhì)體中的鈣黃綠素部分定義為
號-Ffie)/(F讓-Ffie)，其中F信號是樣品的熒光強度，F(xiàn)fie是等滲緩沖液中脂質(zhì)體的熒光強 度。結(jié)果如圖3所示。370C，監(jiān)測滲透壓梯度下ChcMaPC和DMPC/膽固醇(1 1)的滲漏(圖3)。與DMPC 脂質(zhì)體相比，兩種脂質(zhì)體均顯示相似的滲透滲漏特征和良好的穩(wěn)定性。其它SML顯示的滲 透滲漏特征與ChcMaPC的相似。因此，SML脂質(zhì)體在所測試的滲透梯度下保留它們的內(nèi)含物 至少與相應(yīng)的膽固醇/二?；|(zhì)混合物一樣好。實施例18 評估含SML的脂ilH本在30%胎牛血清中的滲漏情況生理環(huán)境是體內(nèi)脂質(zhì)體藥物遞送的另一難點，S卩，血清蛋白質(zhì)和生物膜易從脂質(zhì) 體雙層中提取游離膽固醇，從而導(dǎo)致滲漏。用PEG(聚乙二醇)屏蔽脂質(zhì)體表面可極大降低 這種相互作用。測試了 SML脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和耐受性?？赏ㄟ^上述方法將鈣黃綠素包封入脂質(zhì)體。經(jīng)200nm膜擠出脂質(zhì)體，利用HEPES緩 沖液(IOmM HEPES, 140mM NaCl, pH7. 4)作為等滲洗脫劑使脂質(zhì)體流過S印hadex G-50柱。 含有40%膽固醇(摩爾百分比)的常規(guī)脂質(zhì)體制劑用作長期滲漏試驗中的對照。用30% 胎牛血清將等份脂質(zhì)體樣品(20-50 μ L)稀釋至總體積為2mL。然后將樣品密封在玻璃試管 中，37°C溫育。在不同數(shù)據(jù)點監(jiān)測樣品的熒光強度，通過滲透應(yīng)力誘導(dǎo)滲漏的相似方法測定 保留在脂質(zhì)體中的鈣黃綠素部分。測試的SML包括〇1-膽固醇基羰基(Carb0n0yl)-2-肉豆蔻基氨甲?；鵢sn-甘油基_3_磷酸膽 堿(SMLlc, ChcMaPC)〇1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyD-sn-甘油_3_磷酸膽堿(SML5a， SChcPC)〇1-膽固醇基-2-肉豆蔻?；?外消旋-甘油基-3-磷酸膽堿(SML3c，CheMPC)〇1-肉豆蔻?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl) -sn-甘油基_3_磷酸膽堿 (SML5c, MChcPC)DSPC與游離膽固醇(DSPC/Chol)和DMPC與游離膽固醇(DMPC/Chol)的脂質(zhì)體用 作對照。如圖4中結(jié)果所示，ChcMaPC脂質(zhì)體保留完好，而DSPC/膽固醇脂質(zhì)體的內(nèi)含物在 隨后4周內(nèi)逐漸釋放。由2 1摩爾比的Ch。SaPC和膽固醇構(gòu)成的脂質(zhì)體顯示的滲漏特征與Ch。MaPC的相似。由于Ch。SaPC/膽固醇(2 1)和DSPC/膽固醇(1 1)的脂質(zhì)體具有 相同比例的膽固醇(50% )和鏈長(C-18)，它們的滲漏特征差異主要源于膽固醇摻入雙層 的方式。 明顯觀察到CheMaPC脂質(zhì)體保持完好，而DSPC/膽固醇脂質(zhì)體的內(nèi)含物在所測試 的4周內(nèi)逐漸釋放。由2 1摩爾比的Ch。SaPC和膽固醇構(gòu)成的脂質(zhì)體顯示的滲漏特征與 ChcMaPC的相似。由于Ch。SaPC/膽固醇(2 1)和DSPC/膽固醇(1 1)的脂質(zhì)體具有相 同比例的膽固醇(50%)和鏈長(C-18)，它們的滲漏特征差異主要源于膽固醇摻入雙層的 方式。SML中的共價鍵足夠強，從而能防止血清蛋白質(zhì)以任何非共價親和力從雙層提取膽固這些結(jié)果表明與常規(guī)脂質(zhì)體相比，本文公開的通式I所示化合物形成更穩(wěn)定的脂 質(zhì)體。實施例19 分析膽固醇交換通過擠出方法制備單層脂質(zhì)體。供體脂質(zhì)體由40%膽固醇(或SML的摩爾當(dāng) 量)、10%帶負(fù)電荷的1，2_ 二棕櫚酰基-Sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)和50% 1， 2- 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)(或SML的摩爾當(dāng)量)構(gòu)成。具體地說， 采用以下摩爾比配制三種供體脂質(zhì)體1) PChcPC/DPPC/DPPG (50/40/10)，2) DChcPC/DPPC/ DPPG (25/65/10)，3) Chol/DPPC/DPPG (40/50/10)。中性 1_ 棕櫚?；?_2_ 油?；?sn-甘油 基-3-磷酸膽堿(POPC)脂質(zhì)體用作接受體。擠出后，供體脂質(zhì)體的直徑約為lOOnm，接受體 脂質(zhì)體的為140nm。對于交換實驗，首先在37°C溫暖ImL供體脂質(zhì)體(IOmM)和ImL接受體脂質(zhì)體 (IOOmM, IOfold)，然后混合并在37°C溫育。在給定時間點取得混合物的試樣(250 μ L)，施 加于小(約Icm長)陰離子交換柱(Q-Sepharose XL)。加載交換樣品之前，用0. ImL IOmM POPC預(yù)處理柱以減少中性脂質(zhì)體的非特異性結(jié)合。用ImL IOmM NaCl, IOmM HEPES pH7. 4 緩沖液洗脫柱。凍干洗脫液，通過膽固醇試樣分析以定量測定膽固醇的交換量。如圖5所示，含有DChcPC或PChcPC的脂質(zhì)體的膽固醇交換極少或者檢測不到， 特別是與Chol/DPPC/DPPG的對照脂質(zhì)體相比。這些數(shù)據(jù)說明SML化合物中共價相連的膽 固醇未以顯著量移出雙層，而就膽固醇交換而言，常規(guī)脂質(zhì)體中游離膽固醇的半衰期約為2 小時。因此，膽固醇交換實驗的結(jié)果進一步證實通式I所示化合物中共價相連的膽固醇 未以顯著或可檢測水平移出雙層，而就膽固醇交換而言，常規(guī)脂質(zhì)體中游離膽固醇的半衰 期約為2小時。實施例20 細胞毒性評估采用標(biāo)準(zhǔn)MTT (3- (4，5_ 二甲基噻唑基-2) -2，5_ 二苯基四唑鐺溴化物)試驗方法 評估SML脂質(zhì)的細胞毒性。簡言之，37°C，將C26細胞與各種濃度的脂質(zhì)溫育一定時期。然 后將培養(yǎng)基替換為MTT工作試劑，細胞再溫育2小時。然后小心除去諸試劑。將轉(zhuǎn)化染料 溶解于酸性異丙醇。在570nm檢測染料的吸光度，本底扣除為650nm。然后通過比較處理細 胞和未處理細胞的結(jié)果獲得細胞活力數(shù)據(jù)。所選SML脂質(zhì)的結(jié)果總結(jié)于圖6。大多數(shù)SML 在高達ImM的濃度下未顯示明顯細胞毒性。含有氨基甲酸酯連接鍵的一些SML顯示一定細 胞毒性，例如ChcPaPC和ChcSaPC。因此，可能通過改變通式I所示化合物的R1、R2的組合
60以及連接類型來調(diào)整SML的毒性。實施例21 利用磷脂酶A2的藥物釋放視黃酸用作研究酶觸發(fā)藥物釋放的模型藥物。用包括牛、莫桑比克射毒眼鏡蛇 (naja mossambica)禾口紫紅鏈霄菌(streptomyces vialaceoruber)的各種來源的憐月旨醇 A2 (PLA2)評估SML7a (1-膽固醇基_2_全反式-視黃酰基(retinoyl) -sn-甘油磷酸膽堿) 的全反式視黃酸的釋放。所有PLA2購自阿爾德里奇-西格瑪公司(Aldrich-Sigma)。利 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50mL圓底燒瓶中蒸發(fā)SML7a(50ymol)的氯仿溶液。將該燒瓶置于高真空 下過夜。脂質(zhì)薄膜在含有 20mMTriton X-IOOUOmM CaCl2UOmM HEPES 和 50mM KCl 的 IOmL PH8.8緩沖液中水合。室溫下，10分鐘間歇渦流振蕩后獲得清澈的溶液。37°C，溫育溶液的 試樣(250 μ L) 10分鐘，然后用于PLA2試驗。37°C預(yù)溫育PLA2溶液(25單位，IOmM HEPES 和50mM KCl的250 μ L ρΗ8. 8緩沖液配制)10分鐘，與SML7a的預(yù)溫?zé)崛芤涸嚇踊旌?。在?同時間點，通過TLC分析水解樣品，用比重計定量測定。結(jié)果示于圖7。雖然所有三種PLA2 酶能從SML7a完全釋放全反式視黃酸，但莫桑比克射毒眼鏡蛇的PLA2顯示活性最高。t施仿I丨22在梓禾Φ C26結(jié)腸癌腫瘤的BALB/C小鼠中比較句,封入各禾帖目成的脂ilH本 _聽·膽聽云力麵舌■口向為證明含SML的脂質(zhì)體作為藥物運載體的普遍適用性，將抗癌癥藥物包封在含有 各種固醇基磷脂(steroylphospholipid)的許多脂質(zhì)體組合物中。在接種了 C26結(jié)腸癌的 Balb/C小鼠中比較這些制劑與非包封阿霉素或Doxil (美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)的市 售阿霉素脂質(zhì)體制劑)對腫瘤進展和動物存活的影響(圖8和9，表3)。在該模型中，用不含藥物的載體PBS治療的模型動物的中值存活時間是22天，沒 有動物活過60天(表3)。用最高耐受劑量的非包封阿霉素(10毫克/千克體重)治療的 動物的中值存活時間是26天，沒有動物活過60天。用15毫克/千克的Doxil 治療的動 物的中值存活時間大于60天，80%的動物活過60天。用含雙固醇的制劑，DCHEMSPC-DSPC -PEGDSPE2000- α T (33 61. 8 5. 0 0. 2)中的阿霉素，以15mg/kg治療的動物的中值存活 時間大于60天，100%的動物活過60天(表3)。在C26結(jié)腸癌模型中，包封在含各種固醇 基脂質(zhì)的制劑中的阿霉素提供顯著的療效，與批準(zhǔn)的不含固醇脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑一樣好或者 更好(表3，圖8和9)。所有的合成磷脂購自阿拉巴馬州伯明翰的阿凡提極性脂質(zhì)公司。如上所述合成 SML磷脂。膽固醇(Chol)購自密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)品公司(Sigma Chemical Co.，St. Louis, M0)。道威克斯(Dowex) 50WX4樹脂購自威斯康星州密爾沃基的阿爾德里 奇公司(Aldrich，Milwaukee, WI)。阿霉素(DOX)購自俄亥俄州貝德福德的貝德福德實驗 室(Bedford Laboratories, Bedford, 0H)。從 UCSF 細胞培養(yǎng)機構(gòu)(UCSF Cell Culture Facility)獲得培養(yǎng)基(MEM，含厄爾氏平衡鹽溶液(EBSS)的Eagle)。所有其它試劑是分析 級的。將溶液經(jīng)0.2微米無菌膜過濾入無菌容器中。所有的溶液是無菌和無熱原的。通過本領(lǐng)域熟知和，例如(Liposomes :2nd edition (脂質(zhì)體第二版)，牛津大學(xué) 出版社，2003，V. Torchilin和V. Weissig編)所述的方法制備大學(xué)確定的加載有藥物的脂 質(zhì)體。室溫下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥玻璃試管中溶解于氯仿的10微摩爾脂質(zhì)混合物， 然后維持高真空過夜來制備脂質(zhì)薄膜。在螺旋蓋玻璃試管中，在該脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度以上用 250mM無菌硫酸銨溶液再水合脂質(zhì)薄膜，然后于60°C，在水浴型超聲儀中超聲處理10分鐘來制備脂質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體制品經(jīng)0. 1微米聚碳酸酯膜擠出。4°C，用100-倍體積的5% 葡萄糖進行透析(24小時更換一次)以除去未包封的硫酸銨。60°C，將溶解于5%葡萄糖 的阿霉素溶液與含硫酸銨的脂質(zhì)體溫育2小時來包封阿霉素。將該制品流過含道威克斯 50WX4的柱從脂質(zhì)體中除去未包封的阿霉素。包封效率通常大于70%，其中藥物磷脂比 例約為100微克/微摩爾總脂質(zhì)。采用多峰模塊程序，通過動態(tài)光掃描檢測的平均囊泡制 劑為85-140nm，伴有單分散性粒度分布(馬爾文儀器公司(Malvern Instruments)，英國)。 脂質(zhì)體包封阿霉素制品經(jīng)0. 2微米膜過濾入無菌的15mL無菌錐形離心管中，4°C儲存直至 注射入動物。根據(jù)加利福尼亞州舊金山分校的動物研究委員會批準(zhǔn)的方案，進行的所有動物實 驗符合NIH動物研究指南。對于所有化療實驗，在第0天，在Balb/c小鼠的右肋皮下注射 C26腫瘤細胞(每只小鼠4X105個細胞)，然后隨機分組(每組5只)并編號。實驗期間 每日稱重小鼠并監(jiān)測腫瘤大小。用卡尺檢測3個正交直徑(a，b和c)來評估腫瘤體積；該 體積計算為(aXbXc) X0. 5cm3。剛可觸知的腫瘤規(guī)定為ImmX ImmX 1mm。在各實驗中，監(jiān) 測小鼠最長至接種后60天，或者直至符合以下安樂死的條件1)它們的體重降低至原始體 重的15%以下；2)它們的腫瘤在橫穿任何維度上均大于2. Ocm ；3)它們變得昏睡或嘔吐且 不能進食；或者4)發(fā)現(xiàn)它們死亡。在第60天，所有存活的小鼠施以安樂死；然而，如果在第 60天任何存活小鼠具有可觸知的腫瘤，則監(jiān)測實驗中剩余的所有小鼠直至第90天，此時對 小鼠施以安樂死。活過60天的所有小鼠存活至第90天。表3 在各種組成的脂質(zhì)體中遞送的阿霉素對接種C26結(jié)腸癌的Balb/C小鼠存活 的影響 各制劑下標(biāo)出了制劑組分的摩爾比例。DCHEMSPC = SML6b ；DSPC = 二硬脂?；?磷脂酰膽堿；PE⑶SPE = 1,2- 二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙二 II)-2000] ；αΤ= α-生育酚；SeCHcPC = 1-硬脂?；?2-膽固醇基羰基(carbonoyl)-外 消旋-甘油基-3-磷酸膽堿。實施例23包封兩件霉素B的脂質(zhì)體評估所選SML對兩性霉素B的包封作用。用相應(yīng)的二?；鵓C(相同鏈長)配制 SML來以各種比例包封兩性霉素B。首先，蒸發(fā)給定比例的SML/ 二?；鵓C脂質(zhì)混合物的氯 仿溶液，將脂質(zhì)薄膜置于高真空下過夜。然后將給定量的兩性霉素B DMSO溶液(20mg/mL) 加入脂質(zhì)薄膜，隨后加入PH 7.4PBS。60°C，在氬氣氣氛中超聲處理該混合物1小時。然后 用PH7.4PBS透析該混合物。得到的黃色溶液經(jīng)220nm膜過濾除菌。4°C儲存產(chǎn)物以供進一 步研究。當(dāng)用SML適當(dāng)配制兩性霉素B，例如SML PC AmB = 2 2 1(摩爾)時，大 多數(shù)制劑在4°C能穩(wěn)定一年以上，例如含有PeChcPC、MeChcPC、SChcPC和PChcPC的制劑。這 些結(jié)果顯示可利用SML獲得優(yōu)化的制劑以便包封兩性霉素B。實施例24用于蛋白質(zhì)遞送的脂質(zhì)體某些治療性蛋白質(zhì)可結(jié)合脂質(zhì)體表面。當(dāng)脂質(zhì)體蛋白質(zhì)復(fù)合體注射入動物時，這 能穩(wěn)定蛋白質(zhì)并導(dǎo)致更長的循環(huán)時間。例如，重組FVIII非共價，但以高親和力結(jié)合脂質(zhì)體 外表面。已利用合成的PEG化脂質(zhì)體重建因子VIII來延長因子VIII的循環(huán)時間和降低臨 床前模型和動物的出血，所述脂質(zhì)體是將97 3摩爾比的90% (重量/重量)棕櫚?；?酰基-磷脂酰膽堿(POPC)和1，2_ 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙 二醇)-2000] (DSPE-PEG2000)懸浮在50_mM檸檬酸鈉緩沖液(9%重量/體積溶液)中構(gòu)成 的。該制劑不是最佳的，因為沒有膽固醇存在下，其從循環(huán)中清除太快。說明蛋白質(zhì)遞送的穩(wěn)定SML脂質(zhì)體制劑如下所示。如實施例3所述合成的 SML3d和DSPE-PEG2000 (阿凡提極性脂質(zhì))構(gòu)成的SML脂質(zhì)體制劑如阿霉素實施例所 述制備，除了將100微摩爾脂質(zhì)混合物懸浮在50mM檸檬酸鈉pH7. 0中。將1毫升單層 SML3d-DSPE-PEG2000脂質(zhì)體與100IU單位的重組因子VIII，Kogenate FS(伯克利的拜 耳保健藥物公司(Bayer HealthCare Pharmaceuticals，Berkeley))混合。與缺乏膽 固醇的制劑，例如棕櫚?；王；?磷脂酰膽堿(POPC)和1，2_ 二硬脂?；?sn-甘油 基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙二醇)-2000] (DSPE-PEG 2000) ,97 3摩爾比相比， 該SML3d-DSPE-PEG2000脂質(zhì)體制劑提供更穩(wěn)定的脂質(zhì)體以供配制因子VIII。可利用 SML3d-DSPE-PEG2000脂質(zhì)體以增強因子VIII的體內(nèi)活性。
蛋白質(zhì)可與SML脂質(zhì)體形成穩(wěn)定顆粒而不喪失活性。將含多聚組氨酸標(biāo)簽的 蛋白質(zhì)通過脂質(zhì)-三-次氨基三乙酸，例如Bioconj. Chem. 2006，17，1592-1600所述的 DOD-tri-NTA錨定在SML脂質(zhì)體上。典型的制劑包含5% D0D-tri_NTA、50%二?；姿崮?堿和45%m-SML。將蛋白質(zhì)通過NTA-Ni-組氨酸相互作用摻在脂質(zhì)體上。通過流過尺寸排 阻柱純化加載蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。然后用合適的方法評估制劑穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)活性。實施例25SML對高膽固醇血癥的應(yīng)用已知植物固醇，例如β -谷固醇和β -豆固醇能抑制膽固醇吸收并降低人的血漿 膽固醇水平。含有β-谷固醇的SML可用于治療高膽固醇血癥。將含有β-谷固醇的SML配制成食品添加劑，或配制成注射劑以幫助降低血液膽 固醇食品。例如，將SML雙固醇脂質(zhì)SML6d以30mg/mL濃度溶解于叔丁醇，然后經(jīng)0. 1微米 玻璃濾器除菌。-70°C冷凍無菌脂質(zhì)溶液，然后用凍干機凍干24小時以完全干燥。將干燥 的脂質(zhì)粉末(150mg)與30mg果膠、42mg鈣(如磷酸二鈣)、26mg磷(如磷酸二鈣)和微晶 纖維素混合。將干燥的粉末填充入明膠膠囊以提供150mg 二谷固醇磷脂酰膽堿的劑量。當(dāng) 恰在進食前口服攝入時，該谷固醇衍生物能用于抑制膽固醇吸收。實施例26利用SML制備微泡微泡是通過單層脂質(zhì)穩(wěn)定的填充有氣體的氣泡。過去，用不含膽固醇的合成磷脂 混合物制備微泡。這是因為當(dāng)微泡與生物膜和脂蛋白接觸時，膽固醇快速離開單層從而導(dǎo) 致微泡不穩(wěn)定。SML可用于配制微泡。從SML制備的脂質(zhì)體在有血清存在下更能保留內(nèi)含物(實 施例18)。從十氟丁烷(decaf luorobutane)氣體制備微泡，用90 10摩爾比的SML4a (實 施例4)和PEG-DSPE-2000 (阿凡提極性脂質(zhì)公司，阿拉巴斯特，阿拉巴馬州)的混合物構(gòu)成 的單層穩(wěn)定。將氯仿配制的適當(dāng)量的SML4a、PEG-DSPE-2000 (90 10，摩爾比)加入玻璃 試管。在N2氣氛下除去氯仿，然后真空蒸發(fā)至少2小時。將IOOmM Tris (pH7. 4)甘油 丙二醇(80 10 10，體積比)組成的氣泡稀釋劑加入干燥的脂質(zhì)以產(chǎn)生lmM(lmg/mL)的 脂質(zhì)濃度。在脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度(60°C )以上充分混合脂質(zhì)懸液以形成多層囊泡的乳狀溶 液。利用水浴超聲儀(20kHz，100W, 10分鐘)超聲處理懸液至透明。將終濃度為lmg/mL的 脂質(zhì)體溶液以ImL等份加入2-mL小瓶。然后將IOcm3十氟丁烷氣體(美國田納西州紐波 特的弗魯拉公司(Flura，Newport，TN，USA))經(jīng)橡膠帽緩慢注射入小瓶，利用針頭(20G1，短 斜面(short Bevel)，B_D公司(Becton-Dickinson))作為出氣口交換空氣。利用橡膠帽上 的鋁封條給小瓶迅速加帽。可在4°C儲存含有脂質(zhì)體溶液(上方是十氟丁烷)的密封小瓶 待用?？衫蒙镏閾u床(Biobead shaker)，通過機械攪拌含脂質(zhì)體溶液的小瓶來形成微 泡。振蕩小瓶45秒后，該溶液呈乳狀，將其抽入3-mL注射器，利用IOmM磷酸緩沖鹽水(PBS， PH7.4)將其稀釋至3mL的最終體積。可通過300 X g浮選3分鐘除去溶液中的脂質(zhì)體(未 摻入微泡的)和亞微米大小的氣泡。然后可注射從含有化合物SML4a的組合物形成的微泡以便采用超聲破碎在動物 的指定部位顯像或遞送分子。有具有各種物理化學(xué)特性的SML可用能配制特性精確受控的 微泡。實施例27利用從化合物SML9a制備的聚丁二炔囊泡或單層的診斷試驗平臺有人提出在雙層囊泡中形成聚丁二炔的脂質(zhì)體比色試驗可用于診斷試驗，因為分析物與摻入聚合囊泡表面的受體結(jié)合后聚丁二炔的吸收光譜漂移大。該試驗的靈敏度取決 于聚丁二炔聚合物的長度及其取向。通常用于該應(yīng)用的組合物由混合的合成磷脂，例如二 肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)和10，12-二十三碳二炔酸(TRCDA)構(gòu)成。利用二氯甲烷制 備6/4摩爾比的TRCDA和DMPC的儲備溶液。隨后利用254nm的便攜式UV燈使從該組合物 制備的脂質(zhì)體聚合。這些組合物不適用于許多生物學(xué)液體中，因為該液體的蛋白質(zhì)與脂質(zhì) 體表面相互作用并導(dǎo)致顏色產(chǎn)生非特異性改變。將游離膽固醇包含入這些混合物以降低蛋 白質(zhì)吸附的嘗試不令人滿意，因為TRCDA聚合后，膽固醇相分離，從而脂質(zhì)體對分析物起反 應(yīng)的能力受損?？捎肧ML2c替代以上組合物中的DMPC以提供更穩(wěn)定的TRCDA組合物。另一方法是利用含有實施例9所述的SML化合物SML9a以增強穩(wěn)定性。SML9a含 有連接于膽固醇的可聚合二十三碳二炔酸，所述膽固醇含有磷脂酰膽堿首基。在脂質(zhì)體雙 層中，TRCDA最好根據(jù)毗連的膽固醇定向以便于聚合。聚合時，膽固醇不能相分離，因為其 與磷脂相連。SML9a脂質(zhì)連同97/3摩爾比的氯仿溶液中的脂質(zhì)連接受體，例如神經(jīng)節(jié)苷脂 GMl —起在玻璃試管的側(cè)面上干燥，蒸發(fā)溶劑。將磷酸緩沖鹽水加入干燥的脂質(zhì)混合物(終 濃度，ImM總脂質(zhì))并進行水浴超聲處理。超聲處理期間將樣品加熱至45°C以確保脂質(zhì)在 主要相轉(zhuǎn)變溫度以上。由于SML中有共價相連的膽固醇存在，可在低溫制備脂質(zhì)體；這對于 可包含在試驗中的許多生物學(xué)靶標(biāo)(例如，受體)的穩(wěn)定性至關(guān)重要。趁熱經(jīng)0. 8微米聚碳酸酯膜過濾SML脂質(zhì)體制品，4°C儲存過夜。將樣品升溫至室 溫，利用254nm光的便攜式UV燈聚合從而產(chǎn)生聚合囊泡的暗藍色/灰色溶液?？衫迷摼?合的單固醇SML脂質(zhì)體組合物檢測生物學(xué)液體中大腸桿菌內(nèi)毒素是否存在，因為內(nèi)毒素結(jié) 合GM1。SML中共價相連的膽固醇部分使得聚合的脂質(zhì)體穩(wěn)定以免生物相中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì) 插入，從而不會如游離膽固醇那樣從脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移入生物膜。因此，SML使得診斷系統(tǒng)的應(yīng)用 更靈敏、更穩(wěn)定。_仿丨丨28 ■■ SML X仔靴料射謂誦艦磷脂和膽固醇是人體的主要組分，還是滋養(yǎng)、潤濕、清潔和調(diào)理皮膚和頭發(fā)的個人 護理產(chǎn)品的典型成分。單固醇和雙固醇SML甘油脂和SML鞘脂在一個分子中組合了這兩種 主要的組分。它們還以生物可降解或生物穩(wěn)定的形式提供。在本實施例中，用以下成分(以重量百分比加入)制備頭發(fā)調(diào)理組合物水 86.6%,羥乙基纖維素0.7%，二硬脂酸甘油酯0.7%，鯨蠟醇2.0%，SML化合物SML4d(實 施例4) 10%。為制備該混合物，在高速恒定攪拌和加熱至60°C的條件下，將羥乙基纖維素 加入水中。其余成分在持續(xù)攪拌下加入并升溫至70°C。此時可加入著色劑、芳香劑和抗微 生物劑。攪拌混合物直至諸組分形成具有理想稠度的光滑液體。將該組合物冷卻至室溫。 將該頭發(fā)調(diào)理劑應(yīng)用于頭發(fā)賦予其健康和理想的外觀。用于該領(lǐng)域的中醚連接單固醇SML 的儲存期長，制劑中各種組分混合充分。實施例29利用單固醇和雙固醇SML形成的納米乳液納米乳液或亞微米乳液是平均液滴直徑為50-1000nm的水包油乳液。液滴的平均 大小通常在100-500nm。納米乳液通常含有用0. 5_2%雞蛋或達到卵磷脂穩(wěn)定的10-20% 油。本實施例所述的SML是理想的乳化劑，其不會讓固醇組分如游離膽固醇那樣與兩親首 基發(fā)生相分離。在本實施例中，SML納米乳液的制備采用高壓勻漿化和SML化合物SML5d。形成的
65顆粒顯示通過磷脂的單分子層與環(huán)繞的水相分開的液體狀親脂性核心。這種卵磷脂穩(wěn)定油 滴的結(jié)構(gòu)與乳糜微粒相當(dāng)。因此，納米乳液不同于脂質(zhì)體，其中磷脂雙層將水性核心與疏水 性外相隔開。或者，用過量磷脂制備的納米乳液可同時形成脂質(zhì)體。
可用生物可降解的SML配制用于皮膚護理目的的納米乳液。例如，SML5d因SML水 解而產(chǎn)生膽固醇和油酸，因此可用于皮膚護理產(chǎn)品。下表4說明了 SML納米乳液皮膚護理 組合物。 以上皮膚護理制劑的一種改變形式是上述制劑(表4)中1重量％的SML5d脂質(zhì) (實施例5)替換成1 %的SML7a (實施例7)。SML7a脂質(zhì)提供的皮膚護理組合物具有緩釋 形式的反式-視黃酸?？衫煤笠环N皮膚護理制劑使皮膚恢復(fù)年輕并除去皺紋。_仿丨丨30入人胃一_肺膽遞送爾中頓斜中_藥物聯(lián)用是臨床癌癥治療中廣為接受的方案。雖然可以在體外系統(tǒng)地研究不同藥 物比例的藥物相互作用，但這些比例來不能簡單地應(yīng)用于體內(nèi)，因為不同藥物的不同藥代 動力學(xué)特征。將兩種藥物共包封入脂質(zhì)體可以使藥物的分布“同步”，如果藥物可以穩(wěn)定地 包埋于其內(nèi)的話。理論上，這能將體外結(jié)果更直接地應(yīng)用于體內(nèi)。然而，如果物質(zhì)的穩(wěn)定性 差并且從幫助脂質(zhì)體中滲漏，包封的藥物可以不同速度釋放，從而難以預(yù)測有效的游離藥 物濃度。在本實施例中，利用穩(wěn)定的SML脂質(zhì)體受控、同步釋放各種藥物組合。如上所 述，在體外條件下，DMPC/游離膽固醇組合物和從基于SML的磷脂SMLlc制備的脂質(zhì)體 (ChcMaPC)之間模型化合物的滲透誘導(dǎo)釋放沒有差異。然而，在模擬體外條件的條件下，有 30%胎牛血清存在下鈣黃綠素的釋放有實質(zhì)性差異，7天從DMPC/游離膽固醇組合物中約 有80%滲漏，相比之下基于SML的SMLlc脂質(zhì)體在28天中的滲漏小于(圖4)。因此， 將磷脂藥物共包封在SML構(gòu)成的脂質(zhì)體中可極大降低體外釋放和體內(nèi)釋放的差異，包括更 好地從體外數(shù)據(jù)預(yù)測體內(nèi)釋放。以下兩種藥物組合的穩(wěn)定共包封作用使得它們在體內(nèi)從SML制備的脂質(zhì)體中同 步遞送依立替康/氟脫氧尿苷(fluoxuridine)、柔紅霉素/阿糖胞苷、順鉬/柔紅霉素、順 鉬/阿霉素、長春瑞濱/順鉬、蛋白質(zhì)激酶抑制劑/阿霉素、光神霉素/氮芥、紫杉醇/托泊 替康、7-羥基星形孢菌素/喜樹堿、亞葉酸/5-氟尿嘧啶、亞葉酸/氟乳清酸、巰基嘌呤/阿 糖胞苷、長春瑞濱/紫杉醇、長春瑞濱/阿霉素、阿糖胞苷/順鉬、白藜蘆醇(reversatro 1) / 阿糖胞苷、碳鉬/吉西他濱(gemcitobine)、托泊替康/順鉬或來自藥物與siRNA或氣體寡 核苷酸的組合。按照已知的體內(nèi)有效劑量共包封藥物，利用尺寸排阻柱通過分開包封藥物 與釋放的藥物來體外測定它們的釋放特征。實施例31用于肺部藥物遞送的SML構(gòu)成的脂質(zhì)體數(shù)十年來，肺部藥物遞送系統(tǒng)已用于遞送治療呼吸道疾病，例如哮喘、肺氣腫、革蘭氏陰性細菌感染和真菌感染的藥物。將氨基糖苷類，例如妥布拉霉素遞送給患有囊性纖 維化的患者已經(jīng)是CF患者中抗細菌治療的主要手段。技術(shù)進步口服了吞噬作用、粒度優(yōu)化 和降解等難題，從而能利用肺部的表面積大來遞送藥物進入血液循環(huán)。肺部據(jù)信是諸如蛋 白質(zhì)等藥物(例如胰島素)避開胃腸道的最佳選擇。盡管需求很大，但沒有脂質(zhì)體包封的藥物被批準(zhǔn)用于遞送入肺部。沒有利用脂質(zhì) 體的肺部藥物遞送的原因在于肺部充滿了可破壞目前用合成脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體的表面活 性劑。游離膽固醇不能用于穩(wěn)定目前的脂質(zhì)體，因為脂質(zhì)體中的游離膽固醇與肺部表面活 性劑快速交換。本文所述的SML化合物避免了肺部表面活性劑破壞脂質(zhì)體的問題，同時還有助于 藥物從脂質(zhì)體控釋進入肺部。在本實施例中，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，從SML和實施例23所述的二?；?脂的混合物制備含有兩性霉素B的SML脂質(zhì)體，所述方法描述于，例如(Liposomes =2nd edition (脂質(zhì)體第二版)，牛津大學(xué)出版社，2003，V. Torchilin和V. Weissig編)。兩性 霉素B加載的SML脂質(zhì)體在測試動物或患者的肺中霧化作為真菌感染，例如曲霉病的治療。 在另一例子中，將按照實施例23所述制劑制備的兩性霉素B加載的SML脂質(zhì)體凍干并作為 干燥粉末遞送入肺部。在是尤其有利的，因為其代表了對患者更方便的劑型和更穩(wěn)定的劑 型。在另一例子中，實施例6所述雙固醇SML脂質(zhì)用于制備在有肺部表面活性劑存 在下穩(wěn)定的抗生素加載脂質(zhì)體。諸如妥布拉霉素或環(huán)丙沙星等抗生素可用于該目的。從 純的SML6b或從SML6b和各種合成二?；字?，例如二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕 櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-PEG2000 (PEG-DSPE-2000)的組合制備脂質(zhì)體。通過本領(lǐng)域熟知的方法制備大小確定的 脂質(zhì)體，所述方法描述于，例如(Liposomes =2nd edition (脂質(zhì)體第二版)，牛津大學(xué)出版 社，2003，V. Torchilin和V. Weissig編)。室溫下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥玻璃試管中溶 解于氯仿的100微摩爾脂質(zhì)混合物，然后維持高真空過夜來制備脂質(zhì)薄膜。具體的組合物 是95微摩爾SML6b和5微摩爾DSPE-PEG或40微摩爾SML6b、55微摩爾DSPC和5微摩爾 PEG-DSPE-2000或SML2a和5微摩爾PEG-DSPE-2000。在螺旋蓋玻璃試管中，在該脂質(zhì)的轉(zhuǎn) 變溫度以上用200mg/mL無菌妥布拉霉素溶液再水合該脂質(zhì)薄膜，然后于60°C，在水浴型超 聲儀中超聲處理10分鐘來制備脂質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體制品經(jīng)0. 1微米聚碳酸酯膜擠出。 4°C，用100-倍體積的50mM tris/HCL，pH7. 4 (24小時更換一次)以除去未包封的妥布拉霉 素。包封效率通常大于10%，其中藥物磷脂比例約為200微克/微摩爾總脂質(zhì)。根據(jù)所 選的制劑，通過動態(tài)光掃描檢測的平均囊泡直徑為100-150nm。(馬爾文儀器公司，英國)。 脂質(zhì)體包封的妥布拉霉素制品經(jīng)0. 2微米膜過濾入無菌的15mL無菌錐形離心管中，4°C儲 存直至在測試動物中霧化。該組合物的藥學(xué)上可接受的制劑可在患者中霧化。在還有另一例子中，從基于肉堿的SML化合物(實施例11)制備的陽離子脂質(zhì)制 劑用于和陰離子寡核苷酸，例如siRNA或多核苷酸，例如DNA形成復(fù)合體。室溫下利用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥玻璃試管中溶解于氯仿的100微摩爾脂質(zhì)混合物，然后維持高真空過夜 來制備脂質(zhì)薄膜。具體的組合物是30微摩爾SML6a和70微摩爾1，2-二油?；?3-三甲 銨-丙烷(DOTAP)。在螺旋蓋玻璃試管中，在該脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度以上用無菌的IOmM tris/HCl pH7. 0再水合該脂質(zhì)薄膜，然后于25°C，在水浴型超聲儀中超聲處理10分鐘來制備脂 質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體制品經(jīng)0.1微米聚碳酸酯膜擠出。將待遞送的核酸與脂質(zhì)體制品以 三甲銨基團與核酸磷酸基團為3/1的摩爾比混合。在這些條件下，所有核酸與脂質(zhì)顆粒結(jié) 合。根據(jù)所選的制劑，通過動態(tài)光掃描檢測的平均粒徑為100-200nm。(馬爾文儀器公司，英 國)。脂質(zhì)體結(jié)合的核酸制品經(jīng)0. 4微米無菌膜過濾入無菌的15mL無菌錐形離心管中，4°C 儲存直至在測試動物中霧化。該制劑或其在藥學(xué)上可接受的制劑適于將多核苷酸或siRNA 轉(zhuǎn)移入測試動物的肺中。_仿丨丨32遞艦i秀辦· SML禾口 SML挪-SML ■混☆■成■旨 質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒SML化合物在生物學(xué)液體中具有出乎意料的穩(wěn)定性，同時能維持高度流動性。這些 特征使得它們成為遞送抗原的良好候選對象。在一個例子中，從以1/1摩爾比混合的SML8a(實施例8)和1，2_ 二油?；鵢3_三 甲銨-丙烷(DOTAP)制備疫苗應(yīng)用的SML制劑。在另一例子中，基于肉堿的陽離子 SML(SMLlla)取代DOTAP。室溫下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥玻璃試管中溶解于氯仿的100 微摩爾脂質(zhì)混合物，然后維持高真空過夜來制備脂質(zhì)薄膜。在螺旋蓋玻璃試管中，在該脂質(zhì) 的轉(zhuǎn)變溫度以上用無菌的IOmM tris/HCl pH7. 0再水合該脂質(zhì)薄膜，然后于25°C，在水浴型 超聲儀中超聲處理10分鐘來制備脂質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體制品經(jīng)0. 1微米聚碳酸酯膜擠出。 將蛋白質(zhì)或肽表位(稱為抗原)與脂質(zhì)體制品以各種重量比(30/1脂質(zhì)/抗原到1/1脂質(zhì) /抗原)混合。如果抗原帶凈負(fù)電荷(取決于抗原的等電點)，抗原與構(gòu)成陽離子SML制劑 的脂質(zhì)顆粒結(jié)合。根據(jù)所選的制劑，通過動態(tài)光掃描檢測的平均粒徑為100-300nm。(馬爾 文儀器公司，英國)。SML脂質(zhì)體結(jié)合的抗原制品經(jīng)0.4微米無菌膜過濾入無菌的15mL無 菌錐形離心管中，4°C儲存直至給予測試動物。通過真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、口服、肺部 或胃腸外途徑給予適于該給藥途徑和動物種類的劑量的該制劑?？蓪⒃摻M合物的藥學(xué)上可 接受的制劑給予患者。在另一例子中，利用混合的SML化合物SMLSa和二硬脂?；字Ｄ憠A(9/1摩爾 比)制備陰離子SML脂質(zhì)體制劑。此外，如上所述制備25微克對1毫克脂質(zhì)的單磷酸脂 質(zhì)A(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，St.L0Uis，M0))。為增加該陰離子SML脂質(zhì) 體制劑的免疫應(yīng)答，將肽或蛋白質(zhì)抗原以每毫克脂質(zhì)25-100微克抗原的比例連接于脂質(zhì) 體雙層。該連接可以是共價的或通過非共價方式，例如通過電荷相互作用或利用脂質(zhì)體表 面螯合的金屬與抗原上的組氨酸標(biāo)簽(“His-Tag”)之間的金屬螯合相互作用。通過真皮 內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、口服、肺部或胃腸外途徑給予適于該給藥途徑和動物種類的劑量的 該制劑?？蓪⒃摻M合物的藥學(xué)上可接受的制劑給予患者。在其它例子中，制備固體核心SML脂質(zhì)乳液以供抗原遞送。25°C，從含有硬脂酰 基或棕櫚?；湹母视腿ブ苽涔腆w核心SML顆粒。如上所述，從以1/1摩爾比混合的 SML8a(實施例8)和1，2- 二油?；鵢3_三甲銨-丙烷(DOTAP)制備合適的SML疫苗制劑。^MM 33 含有SML的H旨Jlig合體PB共核Il遞送可利用陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)將核酸，例如RNA、DNA、寡核苷酸、siRNA或其它寡聚和多 核苷酸遞送入培養(yǎng)的細胞和動物或患者的細胞。文獻中已描述了含有陽離子脂質(zhì)的大量陽 離子脂質(zhì)和系統(tǒng)。所有這些的體內(nèi)核酸運送效率有限，因為這些顆粒在體內(nèi)不穩(wěn)定。例如，缺乏穩(wěn)定性可能是因為當(dāng)注射入動物或患者時，缺乏膽固醇的陽離子系統(tǒng)被蛋白質(zhì)快速覆 蓋這一事實。當(dāng)體內(nèi)給予時，含有游離膽固醇以圖穩(wěn)定脂質(zhì)系統(tǒng)的那些喪失游離膽固醇，其 進入細胞膜。含有SML化合物的脂質(zhì)復(fù)合體(lipoplex)組合物沒有該問題。將如上所述制備的基于陽離子SML的脂質(zhì)體或基于陽離子SML的膠束與陰離子核 酸混合，從而通過核酸上的負(fù)電荷與基于陽離子SML的脂質(zhì)顆粒上的正電荷之間的電荷相 互作用形成復(fù)合體。這些復(fù)合體稱為脂質(zhì)復(fù)合體或SML脂質(zhì)復(fù)合體。當(dāng)DNA是與基于陽離 子的脂質(zhì)體或基于陽離子的膠束形成復(fù)合體的多核苷酸時，該SML制劑可用于遞送DNA (例 如，“基因轉(zhuǎn)移”)。當(dāng)寡核苷酸，例如siRNA與基于陽離子SML的脂質(zhì)體或基于陽離子SML 的膠束形成復(fù)合體時，該SML制劑可用于遞送siRNA或修飾的siRNA (例如，“基因沉默”)。在一個例子中，將雙固醇SML，例如化合物SML6a構(gòu)成的脂質(zhì)混合物與1，2_二油酰 基-3-三甲銨-丙烷(DOTAP)以1/4 :SML/D0TAP的摩爾比在氯仿溶液中混合。室溫下利用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥玻璃試管中溶解于氯仿的100微摩爾脂質(zhì)混合物，然后維持高真空過 夜來制備脂質(zhì)薄膜。在螺旋蓋玻璃試管中，在該脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度以上用無菌的IOmM tris/ HCl pH7. 0再水合該脂質(zhì)薄膜，然后于25°C，在水浴型超聲儀中超聲處理10分鐘來制備脂 質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體制品經(jīng)0.2微米聚碳酸酯膜擠出。隨后將溶解于IOmM tris/HCl pH8. 0 中的核酸加入陽離子SML脂質(zhì)體，從而陽離子脂質(zhì)正電荷與核酸負(fù)電荷為3/1，其稱為SML 脂質(zhì)復(fù)合體。然后將該SML脂質(zhì)復(fù)合體加入培養(yǎng)的細胞或通過各種途徑，例如通過注射給 予測試動物。脂質(zhì)SML6a為脂質(zhì)復(fù)合體提供的膽固醇形式不易經(jīng)水相轉(zhuǎn)移入生物膜。因此，脂 質(zhì)復(fù)合體在生物相中遠比用游離膽固醇形成的穩(wěn)定。此外，當(dāng)膽固醇與脂質(zhì)之比上升到約 30摩爾％膽固醇之上時，脂質(zhì)SML6a能誘導(dǎo)新相形成。這體現(xiàn)在圖10的DSC曲線中，其中 當(dāng)當(dāng)量游離膽固醇摩爾百分比為30摩爾％時，在約20°C觀察到新的過渡。從該脂質(zhì)混合物 制備的脂質(zhì)復(fù)合體是良好的多核苷酸轉(zhuǎn)移試劑。本實施例中的陽離子脂質(zhì)是D0TAP，但任何 單陽離子或多陽離子性的陽離子脂質(zhì)可用于替代D0TAP。在另一例子中，基于肉堿的SML化合物(實施例11)用作單一物質(zhì)以形成陽離子 SML顆粒并與核酸，例如siRNA相互作用。根據(jù)固醇部分和脂族部分的連接位置以及脂族 鏈長、脂族鏈的不飽和或分支程度來調(diào)節(jié)這種陽離子SML顆粒的特性。將IOmM tris/HCl pH8. 0中的核酸以3/1的陽離子與陽離子電荷比加入IOmM tris/HCl pH7. 0中的預(yù)形成陽 離子顆粒，從而在基于陽離子SML的脂質(zhì)體和核酸之間形成復(fù)合體。如此形成的SML脂質(zhì) 復(fù)合體是細胞培養(yǎng)和體內(nèi)的有效核酸遞送載體。從單一 SML化合物和核酸形成基于SML的 脂質(zhì)復(fù)合體的另一優(yōu)點在于它們易于凍干并能快速再水合成核酸轉(zhuǎn)移活性脂質(zhì)復(fù)合體。因此，如本實施例所述，不難形成各種單價和多價SML化合物作為脂質(zhì)復(fù)合體組 合物以便用作核酸遞送載體。實施例34 含有可還原SML的納米脂質(zhì)顆粒組合物以供核酸藥物遞送為獲得能將核酸體內(nèi)遞送至指定靶位的長循環(huán)納米顆粒，必需除去或有效屏蔽納 米顆粒表面的陽離子電荷。過去有人試圖通過利用在PH7. 4不質(zhì)子化的可滴定陽離子基 團，通過在納米顆粒形成后使陽離子基團反應(yīng)從而形成陰離子或中性基團來除去陽離子基 團，或通過二硫鍵交換反應(yīng)將陽離子基團與陰離子或中性基團交換來實現(xiàn)。另一方法是避 免使用陽離子物質(zhì)并用在PH7. 4時不是陽離子的氫鍵取代靜電相互作用。盡管作出了這些嘗試，納米脂質(zhì)顆粒在體內(nèi)依然缺乏穩(wěn)定性，特別是與血漿蛋白及血液和其它體液中發(fā)現(xiàn) 的脂蛋白的破壞性相互作用?？衫帽疚乃龅腟ML化合物，通過提供不可交換的固醇以 及除去或有效屏蔽納米顆粒表面上的陽離子電荷而增加納米脂質(zhì)顆粒的穩(wěn)定性。在一個例子中，制備利用二硫鍵作為可切割連接鍵的SML納米顆粒以便體內(nèi)遞送 生物反應(yīng)性多核苷酸。接頭的體內(nèi)切割取決于氧化胞外間隙和還原胞內(nèi)環(huán)境之間的高氧化 還原電位差。例如，含有二硫鍵連接的陽離子功能化脂質(zhì)的陽離子SML納米顆粒在胞外基 質(zhì)中穩(wěn)定，但在細胞質(zhì)的還原性環(huán)境中從錨定脂質(zhì)上切割下來。從脂質(zhì)上切下陽離子部分 從納米顆粒上釋放了帶電荷的凝聚DNA，從而DNA遷移入核。在本實施例中，透析方法與含 有SML化合物SML13i (實施例13)的陽離子二硫化物用于將質(zhì)粒DNA包封入PEG-屏蔽的 納米脂質(zhì)顆粒(圖11)。然后分別通過與半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)的二硫鍵轉(zhuǎn)換 反應(yīng)將表面正電荷轉(zhuǎn)換成中性或負(fù)電荷。因此，該方法可用于產(chǎn)生具有中性。兩性或非離 子性表面的顆粒。此外，目前用SML穩(wěn)定非陽離子SML納米顆粒。可通過摻入靶向配體，例 如對細胞表面分子有反應(yīng)活性的抗體來進一步修飾非陽離子納米顆粒，從而將該納米顆粒 結(jié)合于細胞表面。在具體例子中，將質(zhì)粒DNA加入28mM辛基葡糖苷中摩爾比為1/5/5的PEG-脂質(zhì) /SML5d/陽離子二硫化物SML13i脂質(zhì)混合物，用20mM Hepes pH8. 5透析除去辛基葡糖苷。 在5mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH8. 5)配制的1. 47ml 28mM正辛基- β -D-吡 喃型葡萄糖(OG)中水合總干燥脂質(zhì)2. 5微摩爾(PEG-脂質(zhì)/SML5d/SML13i的摩爾比例為 1/5/5)，0. 5小時。將相同體積的洗滌劑緩沖液配制的DNA脂質(zhì)(137. 3 μ g)加入脂質(zhì)溶液， 輕柔渦流振蕩30秒。然后將該溶液轉(zhuǎn)移至Slide-A-Lyzer 透析盒(MWCO 10K，伊利諾斯 州羅克福德的皮爾斯公司(Pierce, Rockford, IL)), ffi 1升20mM HEPES緩沖液(ρΗ7· 4)在 4°C透析2天，更換透析緩沖液四次。為修飾顆粒的表面電荷，將GSH或Cys (摩爾比例比用于顆粒形成的SML13i用量 高10倍)加入SML納米脂質(zhì)顆粒溶液，溫育溶液5分鐘，然后置于透析盒中，迅速用1升 20mM HEPES緩沖液(pH7. 4)在4°C透析以除去還原劑。得到的SML納米顆粒的粒徑基本上小于(約IOOnm直徑)相同電荷比例的脂質(zhì)復(fù) 合體制劑(170-360nm)?？赏ㄟ^分別短期混合SML納米脂質(zhì)顆粒與過量的還原劑GSH和 Cys來進一步修飾顆粒表面。通過透析除去SML納米脂質(zhì)混合物中未反應(yīng)的還原劑。得到 的SML納米脂質(zhì)顆粒的粒徑通常增加約40nm。與陽離子脂質(zhì)復(fù)合體中86%的包封數(shù)值相 比，表面修飾后約50%的包封DNA質(zhì)粒保留在顆粒內(nèi)。用GSH或Cys處理的陽離子SML納 米脂質(zhì)顆粒的表面電荷分別轉(zhuǎn)化成陰離子或中性電荷。表面電荷的這種改變是因為陽離子 首基與帶負(fù)電荷的GSH或兩性離子Cys交換。這些SML納米脂質(zhì)顆粒還適用于體內(nèi)多核苷 酸或siRNA遞送，可通過將脂質(zhì)連接的靶向配體摻入用于制備靶向SML納米脂質(zhì)顆粒的脂 質(zhì)混合物作進一步修飾。實施例35 制備脂質(zhì)SML15a_i合成脂質(zhì)SML 15a, SML 15b, SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、SML15g、SML15h、 SML15i和SML15 j (統(tǒng)稱為SML15a_j)的具體合成方案如流程15所示。以下合成脂質(zhì)SML15f 的詳述示例了該流程。流程15.合成 SML15a_j
70
SML15a=R1 =C5H11,R2H=膽固醇
SML15b=R1 =C7H15,R2H=膽固醇
SML15c=R1 =C9H19,R2H=膽固醇
SML15d=R1 =CllH23，R2H=膽固醇
SML15e=R1 =C13H27，R2H=膽固醇
SML15f=R1 =C15H31，R2H=膽固醇
SML15g=R1 =C17H35，R2H=膽固醇
SML15h=R1 =C17H33，R2H=膽固醇
SML15i=R1 =CigH39，R2H=膽固醇
SMLl5j=R1 =C21H43，R2H=膽固醇
SML15k=R1 =C23H47，R2H=膽固醇
i-棕櫚?；?2_膽固醇基半琥珀?；?br> PChemsPC)室溫下，向1_棕櫚酰基_2_羥基-sn-甘油基-磷酸膽堿(0. 95g，1. 91mmol)和 半琥珀酸膽固醇酯(1.86g,3. 82mmol)的無乙醇干燥氯仿(50mL)溶液中加入DMAP (0. 24g，
1.91mmol)和DCC (0. 79g，3. 82mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時。過濾混合物，通過 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液。殘留物應(yīng)用HPFC純化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC :Rf =0. 54(洗脫劑 C)。1H 匪R (CDCl3)，δ 0. 68 (s，3H) ；0. 85-1. 65 (m，62Η) ； 1. 84-2. 05 (m，5H)；
2.29-2. 31 (m，4H) ；2. 55—2. 62 (m，4H) ；3. 31(s，9H) ；3. 78(m，2H) ；4. 04(m，2H) ；4. 24 (m, 1H) ；4. 41 (m，3H) ；4. 55 (m，1H) ；5. 21 (m，1H) ；5. 40 (d，J = 4. 4，1H)。為 C55H99NO10P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+964. 71，實測 964. 68。實施例36制備脂質(zhì)SML16A-MSML16的合成示于流程16。代表性過程如下所述。流程16.合成 SML16a_m SML 16a :R = C5H11
SML16b :R = C7H15SML16c :R = C9H19SML16d :R = C11H23SML16e :R = C13H27SML16f :R = C15H31SML16g :R = C17H35SML 16h :R = C17H33SML16i :R = C19H39SML16j :R = C21H43SML16k :R = C23H47SML161 :R = C15D31SML16m :R = CH3 (OCH2CH2) 81-膽固醇基半琥珀?；?2-羥基1-3-甘油基-磷酸膽堿是合成SML6B (參見實施 例6)的副產(chǎn)物，其用作合成SML 16a-m的起始材料。1-膽固醇基半琥珀?；?2-棕櫚?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML16f， ChemsPPC)室溫下，向1_膽固醇基半琥珀?；鵢2_羥基1_3_甘油基-磷酸膽堿(206mg， 0. 28mmol)和棕櫚酸(87. 3mg,0. 34mmol)的無乙醇干燥氯仿(6mL)溶液中加入DMAP (35mg， 0. 28mmol)和DCC(70. 2mg，0. 34mmol)。室溫下(r. t.)攪拌反應(yīng)混合物48小時。過濾 該混合物，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液。殘留物應(yīng)用HPFC純化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC =Rf = 0.34(洗脫劑 C)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 67(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m， 62H) ； 1. 84-2. 05(m，5H) ；2. 20(t，J = 9，4H) ；2. 50(m，4H) ；3. 31 (s,9H) ；3. 78 (m, 2H)； 3. 88 (m, 2H) ；4. 09 (m, 1H) ；4. 28 (m, 3H) ；4. 50 (m, 1H) ；5. 10 (m, 1H) ；5. 27 (d，J = 4. 2，1H)。為 C55H99NO10P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+964. 71，實測 964. 73。1-膽固醇基半琥珀?；?2- (2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代二十六烷-26-酰 基)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML16m，ChemsPE08PC)室溫下，向1_膽固醇基半琥珀酰 基-2-羥基 1-3-甘油基-磷酸膽堿(140mg, 0. 193mmol)和 2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代 二十六-26-烷酸(100m g，0. 242mmol)的無乙醇干燥氯仿(6mL)溶液中加入DMAP (20mg)和 DCC(60mg，0.29mmol)。室溫下攪拌該反應(yīng)混合物48小時。過濾該混合物，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮濾液。殘留物應(yīng)用 HPFC 純化(CHCl3 到 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC =Rf = 0. 47 (洗脫 劑 C)。1H NMR(CDCl3), δ 0. 67(s,3H) ；0· 85-1. 65 (m，33H) ； 1. 84-2. 05 (m，5H) ；2· 29-2. 31 (m， 2H) ；2. 55-2. 62 (m,6H) ；3. 31 (s,9H) ；3. 37(s,3H) ；3. 54-3. 69 (m, 30H) ；3. 81 (m,2H)； 3. 98 (m, 2H) ；4. 16 (m, 1H) ；4. 35 (m, 3H) ；4. 58 (m, 1H) ；5. 21 (m, 1H) ；5. 35 (d, J = 4. 4，1H)。為 C57H103NO18P+ 計算的 MALDI-MS [M+H]+1120. 70，實測 1120. 64。實施例37 :SML16M的應(yīng)用通過用兩親聚(乙二醇)鏈替代疏水性脂質(zhì)鏈將SML16m設(shè)計成表面積大于常規(guī) 磷脂。SML16m易溶于水。濃度為IOmM時，SML16m在水中不形成可檢測的顆粒。與常規(guī)兩 親分子不同，SML16m溶液在攪拌時不起泡，而是沿著玻璃壁在溶液表面上形成薄膜。SML16m 可以1 1或更高的摩爾比有效溶解兩性霉素B從而獲得5mg/mL的濃度。還可用其它脂 質(zhì)配制SML16m，從而獲得小脂質(zhì)體。例如，當(dāng)加入20摩爾％ SML16m時，DPPC的多層囊泡的粒徑顯著降低。t施例38 在30%胎牛血清中5-羧某熒光素從含SML的脂ilH本中控釋藥物從脂質(zhì)體中釋放的速度受脂雙層的剛性和滲透性的控制。烷基鏈程度和不飽 和程度在脂質(zhì)體制劑中起著至關(guān)重要的作用。在HEPES緩沖鹽水(IOmM HEPES, 140mM NaCl, PH 7.4) (HBS)和30%胎牛血清(FBS)中評估5-羧基熒光素(CF)從SML脂質(zhì)體中的釋放。通過實施例16所述相似的方法將CF包封在脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)體經(jīng)200nm聚碳 酸酯膜擠出，用HBS作為等滲洗脫劑洗脫加載在新澤西州皮斯卡塔韋的GE保健公司(GE Healthcare, Piscataway, NJ)的PD-10柱上的脂質(zhì)體來除去游離CF。在96-孔板中，用HBS 或FBS將等份脂質(zhì)體樣品(10 μ L)稀釋至含有0. 02%疊氮鈉，總體積為200 μ L。然后用透 明的塑料薄膜密封該平板，37°C溫育。在不同時間點監(jiān)測樣品的熒光強度，通過下式測定從 脂質(zhì)體釋放的CF百分比。CF%= (Ft-F0)/(Fa-F0)* 100%式中F0 =背景熒光信號Fa=總熒光信號Ft =檢測時的熒光信號測試的SML包括〇1-己?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15a)〇1-癸?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15c)〇1-十二烷?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15d)〇1-十四烷?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15e)〇1-十六烷?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15f)〇1-十八烷酰基-2-膽固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15g)〇1-油?；?2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML15h)〇1- 二十烷酰基(Icosanoyl)-2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基_3_磷酸膽 堿(SML15i)〇1-二十二烷酰基-2-膽固醇基半琥珀?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SML15j)O 1,2- 二膽固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(SML6b)四類脂質(zhì)體制劑用于CF釋放測試(l)SML6b和含有45摩爾％當(dāng)量膽固醇的二?；字闹|(zhì)體，如圖12中Fl所 示；(2)相同鏈長的1-?；?2-膽固醇基半琥珀酰基-磷酸膽堿和二?；字闹|(zhì) 體，如圖12中F2所示；(3)膽固醇和含有45摩爾％膽固醇的二酰基磷脂的脂質(zhì)體，如圖12中F3所示；和(4)純1-?；?2-膽固醇基半琥珀?；鵢磷酸膽堿(SML15系列)的脂質(zhì)體，如圖 12中F4所示。如圖12顯示的結(jié)果所示，含有長鏈脂質(zhì)的所有制劑顯示良好的穩(wěn)定性和滲漏耐 受性。純1-?；?-膽固醇基半琥珀酰基-PC的脂質(zhì)體在最低從ClO開始的各種鏈長范圍 顯示穩(wěn)定性，CF釋放小于30%。然而，與二?；|(zhì)混合使得曲線向更長的烷基鏈急劇漂移。二?；?SML6b脂質(zhì)體要求烷基鏈略長于常規(guī)二酰基/膽固醇脂質(zhì)體以減少CF的釋放。 不可能從二?；滈L短于12的二?；?膽固醇混合物制備穩(wěn)定的脂質(zhì)體。這是SML制劑 F4的另一優(yōu)點。二酰基/SML6b的完全釋放特征示于圖13。綜合來看，三種SML制劑為以 所需速度控釋藥物提供更廣泛的選擇。
權(quán)利要求
一種包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)(SML)的化合物，所述固醇修飾的兩親脂質(zhì)具有親水性首基和兩個或更多個疏水性尾基，其中所述疏水性尾基中的至少一個包含固醇。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述首基包含磷酸根。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述親水性首基選自下組磷酸根、磷酸 膽堿、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷酸肌醇和乙基磷酰膽堿。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述磷酸乙醇胺首基選自下組磷酸乙醇 胺-N-[單甲氧基聚乙二醇]2000和磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸。
5.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述固醇選自下組動物固醇和植物固
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，所述固醇選自下組膽固醇、類固醇激素、 油菜固醇、谷固醇、麥角固醇和豆固醇。
7.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述疏水性尾基中的至少一個包含非_固
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，所述非_固醇疏水性尾部包含飽和或不飽 和的、線形或分支的、取代或未取代的脂族烴。
9.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述SML選自下組單固醇修飾的兩親脂 質(zhì)和雙固醇修飾的兩親脂質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述SML選自下組固醇修飾的甘油磷 脂、固醇修飾的神經(jīng)鞘氨醇磷脂、固醇修飾的肉堿脂質(zhì)和固醇修飾的氨基酸脂質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述親水性首基選自下組氨基酸、活化 的官能團、三聚氰胺、葡糖胺、多胺、羧酸根(coo—)、硫酸根(SO4-)、磺酸根(SO3-)、分支聚乙 二醇、聚甘油、三-次氨基乙酸和碳水化合物。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述疏水性尾基之一是前藥。
13.一種選自下組的固醇修飾的兩親脂質(zhì)SMLla、SMLlb、SMLlc、SML2a、SML2b、SML2c、 SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、SML4d、SML5a、SML5b、SML5c、 SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e、 SML8f、SML9a、SML9b、SML9c、SML 10a, SMLlOb、SMLlOc、SMLlOd、SMLlOe、SMLlOf、SMLl la、 SMLllb、SMLllc、SMLlId、SMLlle、SMLlIf、SML12a、SML12b、SML12c、SML12d、SML12e、SML12f、 SML13a、SML13b、SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML13i、SML13j、SML13k、 SML14a、SML14b、SML14c、SML14d、SML14e、SML14f、SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、 SML15f、SML15g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、SML16d、SML16e、 SML16f、SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML161 禾口 SML16m 以及它們的 行生物。
14.一種包含權(quán)利要求1所述固醇修飾的兩親脂質(zhì)(SML)的組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述SML是固醇修飾的兩親磷脂 (SPL)。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含治療劑、美容劑和可 檢測標(biāo)記物中的至少一種。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含非固醇兩親脂質(zhì)，其 中所述非固醇兩親脂質(zhì)包含飽和或不飽和的、線形或分支的、取代或未取代的脂族烴。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述SPL和非固醇兩親脂質(zhì)包含長度大 致相同的疏水性尾基。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述SPL是單固醇修飾的兩親磷脂，所 述非固醇兩親脂質(zhì)是二?；字?，各自具有鏈長約6-24個碳的非固醇疏水性尾部。
20.一種合成固醇修飾的兩親脂質(zhì)的方法，該方法包括將至少一個固醇尾基經(jīng)分支核心偶聯(lián)于親水性首基，從而產(chǎn)生具有與兩個或更多個疏 水性尾基相連的親水性首基的固醇修飾的兩親脂質(zhì)，其中至少一個所述疏水性尾基包含所 述固醇尾基。
21.—種產(chǎn)生包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物的方法，該方法包括將固醇修飾的兩親脂質(zhì)與非固醇兩親脂質(zhì)、治療劑、美容劑、可檢測標(biāo)記物、緩沖劑、溶 劑和賦形劑中的至少一種混合。
22.一種將包含固醇修飾的兩親脂質(zhì)的組合物給予動物或細胞的方法，該方法包括使 所述動物或細胞與權(quán)利要求14所述的組合物接觸。
23.一種檢測流體中某分析物存在與否的方法，該方法包括使該流體與權(quán)利要求14所述的組合物接觸，和；檢測該脂質(zhì)組合物或流體的可檢測特性中的至少一種改變。
全文摘要
公開了具有兩個或更多個疏水性尾部的固醇修飾兩親脂質(zhì)化合物，所述尾部中至少一個是固醇。還公開了合成這些化合物的方法、包含這種化合物的組合物和這種化合物在遞送感興趣試劑，例如治療劑、顯像劑、用于超聲應(yīng)用的造影物質(zhì)、疫苗、生物傳感器、營養(yǎng)添加劑和皮膚護理產(chǎn)品中的應(yīng)用。
文檔編號A61K8/02GK101909581SQ200880125025
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者F·C·小斯佐卡, 黃兆華 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會