專利名稱：來自人臍帶的臍帶膠質的新生物材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由臍帶的細胞外基質形成的生物材料(尤其是水凝膠)在再生醫(yī)學中的應用。本發(fā)明尤其涉及一種由糖胺聚糖組成的生物材料及其制備方法和用途，所述糖胺聚糖僅從臍帶的臍帶膠質(Wharton' s jelly)(其任選的包含細胞)分離。
背景技術：
由多聚體形成的生物材料在再生醫(yī)學中起著重要作用，因為它們?yōu)橐浦布毎恼掣?、增殖和分化提供暫時的三維錨定。這種三維性質為細胞間的聯(lián)系以及細胞與生物材料組分之間的關系提供合適的平臺。基質和細胞之間隨時間的生物相互作用決定了細胞的增殖能力，它們組構起來形成新的組織，它們的分化以及分泌指導再生過程的信號(Dawson 等，2008)。為了產(chǎn)生這些現(xiàn)象，需要將生物材料在應用部位保持有限的時間直至其重吸收， 維持其結構足夠長的時間以便得到具有再生效果的合適細胞作用。生物材料的特定類型，水凝膠，具有許多使其適用于組織工程的特性。水凝膠是由具有天然或合成性質的交聯(lián)親水聚合物形成的結構，具有在其結構內(nèi)包含大量水的能力，是其自身重量的10-20%直至數(shù)百倍。這些凝膠顯示半固體形態(tài)，其三維點陣使其成為形成充當支持物的結構基質的理想候選物。這些三維結構可以通過物理交聯(lián)和化學交聯(lián)形成。物理交聯(lián)產(chǎn)生可逆的水凝膠，其結構根據(jù)最后的應用可以逆轉，而化學交聯(lián)產(chǎn)生固定的水凝膠，其結構在整個應用過程中都被維持(Coburn等，2007)。因此，水凝膠是采用三維網(wǎng)絡形式交聯(lián)的聚合材料(具有天然或合成的性質)，其在接觸水時膨脹，形成軟的彈性材料，并且在它們的結構中保留其大部分組分而無溶解。水凝膠具有一系列特性，諸如1.親水性歸因于它們的結構中存在水溶性基團(-0H，-C00H, -CONH2，-C0NH, SO3H)。它們具有類似于活組織的高含水量(Elisseeff等，2005)。2.不溶于水歸因于它們結構中三維聚合物網(wǎng)絡的存在。3.它們具有光滑和彈性的稠度，這是由親水起始單體和多聚體的低交聯(lián)密度決定的。它們有能力在存在水或水溶液時膨脹，顯著增加它們的體積直至達到化學_物理平衡，但不失去它們的形狀。這種膨脹能力提供與細胞在軟組織中遇到的基本相當?shù)乃晕h(huán)境。水和多孔結構的存在還允許低分子量溶質和營養(yǎng)物(毒魚細胞活性是重要和必要的)的流動，以及將細胞廢料輸送到水凝膠外(Torres等，2000)。臍帶是含有重要細胞組分的高度血管化結構。細胞和血管系統(tǒng)被整合到稱為臍帶膠質(WJ)的凝膠狀結締組織中。WJ包含少量的細胞和高水平的細胞外基質，其主要由膠原，透明質酸和硫酸化的糖胺聚糖組成。糖胺聚糖(GAG)，也稱為粘多糖，是雜多糖，發(fā)現(xiàn)其在生物體中結合稱為蛋白多糖的蛋白細胞核形成大分子。這些可以發(fā)現(xiàn)于細胞表面或細胞外基質中，并行使細胞_細胞和細胞-細胞外基質相互作用的重要功能。它們采取硫酸化和非硫酸化的形式，這些分子的常見特性是由兩種不同的糖形成的二糖重復序列的組成；其中一種通常是己糖醛 (hexuronato)，而另一種是己糖胺。二糖鍵合以及硫酸化位置的結構變化導致這些鏈物理和化學性質多樣性的增加。高硫酸化的含量和糖醛酸的存在給GAG提供大的負電荷，所以 WJ中的大量GAG使得該組織被極度水化。 存在數(shù)種類型的GAG，其直接參與基本細胞功能，不僅歸因于它們的結構，還因為它們是數(shù)個細胞信號轉導分子的錨定位點。透明質酸是WJ中最豐富的GAG。它是GAG家族中唯一非硫酸化的成員，其在體內(nèi)的功能就像游離的碳水化合物，其結構由二糖D-葡糖醛酸和(1-β-3)Ν-乙?；?D-葡糖胺的重復組成(Goa等，1994;LaUrent等，1992)。它由數(shù)種細胞類型合成，并被分泌入細胞間隙，在那里它與細胞外基質的其他組分相互作用來產(chǎn)生圍繞細胞的支持和保護結構(Collins等，2008)。它是大的多聚陰離子線性聚合物，單個分子可以具有100，000到 5. 106Da的分子量(Toole等，2004 ；Bertolami等，1992)。它具有吸收大體積的螺旋結構， 產(chǎn)生高粘度溶液。透明質酸的單個分子彼此結合，形成網(wǎng)絡或點陣。在形成組織時，透明質酸被認為是參與細胞增殖和遷移的主要結構大分子。透明質酸已經(jīng)參與數(shù)個過程，諸如血管化，形態(tài)發(fā)生，細胞外基質的整體完整性和修復。已知羊水中包含的大量透明質酸有利于胎兒傷口的修復(Longaker等，1989)。還可以觀察到在健康皮膚和疤痕之前其分子性質的變化，正常疤痕的透明質酸當然不同于肥大性疤痕的透明質酸(Ueno等，1992)。硫酸軟骨素是由D-葡糖醛酸二聚體和N-乙酰半乳糖胺重復形成的線性聚合物。 已經(jīng)在針對關節(jié)疾病的療法中檢測了其有效性，通過抑制導致軟骨組分的基質降解的酶的活性。它還作為抗炎藥，通過抑制補體，并可用于在手術和眼科診所中治療血栓栓子的病癥。硫酸皮膚素，也稱為硫酸軟骨素B，是一種有效的抗凝劑，歸因于其通過肝素輔因子II對凝血酶的選擇性抑制作用，在體內(nèi)非常有效，因為其更低的出血風險(Trowbridge 等，2002)。通常糖胺聚糖，尤其是肝素，具有調節(jié)血漿級聯(lián)活性的能力，增強內(nèi)在凝結途徑的抑制并在不同點抑制典型的補體激活途徑(RabensteinJOOl)。肝素的其他已知功能是血管發(fā)生的抑制，體液生長及其抗病毒活性。硫酸類肝素具有與肝素密切相關的結構。它在動物組織中廣泛分布，在其功能中， 細胞粘附和細胞增殖的調節(jié)是最顯著的。它具有抗蛋白降解的保護作用，調節(jié)它們輸送通過基底膜以及干涉其內(nèi)化(Rabenstein，2001)。存在數(shù)篇涉及獲自人或動物來源的粘多糖的專利文獻。文獻US3，887，703涉及獲自?；蚓d羊的胎畜的皮膚皮層和臍帶的粘多糖混合物。使用臍帶的唯一實例是1-9個月大的牛的胎畜，它沒有提及膜或血管被去除，因為第一步操作是在10°C研磨。形成混合物的單獨粘多糖或存在的量沒有被提及；通過混合物中存在的己糖胺的量鑒定活性產(chǎn)物。利用提取物制備用于治療油性頭皮和毛發(fā)以及炎癥的注射用和口服攝入形式的組合物。專利文獻US 5，814，621涉及一種基本上由與水相比更溶于有機溶劑-水混合物的藥物組成，并且粘多糖構成藥物的一部分，其中藥物的晶體或顆粒分布在粘多糖顆粒的表面，并且與其的單獨形式相比，所述藥物更快的溶于水。所述組合物可以采用顆粒形式。
專利申請WO 2008/021391 Al描述了包括臍帶膜的生物材料。此外，它還包括一種或更多種臍帶血管和/或臍帶膠質。生物材料優(yōu)選的是干燥的，可以是平板狀、管狀或塑形為適合特定的結構。本發(fā)明還提供制備包括至少單層臍帶膜的生物材料的方法，以及獲得所述生物材料的方法及其用于修復組織或器官的用途。說明書表征了來自臍帶的生物材料。它描述了所述材料的組成包括膠原(I、III 和IV型，這些占生物材料基質的75-80% )，纖連蛋白和糖胺聚糖。它還提及生物材料還可以包括不是來自臍帶的膠原，并具有商品化來源，或已經(jīng)利用該領域當前水平已知的方法將其從其他組織分離。作者還補充了生物材料可以包括非結構的化合物諸如生長因子，激素，抗生 素，免疫調節(jié)因子，等等。西班牙專利ES 8600613描述了以下方法用于治療機體組織，用于分離細胞膜， 核酸，脂類和細胞質組分以及形成細胞外基質，其主要組分是膠原，和用于制備適于用做機體移植物的機體組織，包括用至少一種去污劑提取所述組織并且同時將其維持為適于將其移植到體內(nèi)的大小與形狀。專利文獻ES 2 180 653 T3描述了將生物材料轉化為物質(其經(jīng)歷自溶作用以去除至少70%的細胞)的方法，以及處理所述材料以抑制其在移植入人或動物后礦化的方法。它要求起始生物材料可以是，尤其是，臍帶；盡管它具體涉及豬的主動脈瓣。盡管如此， 說明書沒有包含涉及利用臍帶實施的任何細節(jié)。使用獲得的生物材料產(chǎn)生生物心瓣膜。專利文獻US4，240，794涉及制備人或其他動物臍帶以用做血管替代物。該文獻具體描述了將臍帶在醇中脫水的技術，然后是將其固定為所需形態(tài)的方法。根據(jù)描述，一旦從臍帶上清除其他組織的可能殘留，就將其固定在軸柄上，浸于特定的乙醇溶液至脫水必需的時間。脫水后，將臍帶浸入醛溶液進行固定。專利文獻FR2，563，727描述了一種從去程序化的結締組織(用臍帶膠質浸漬并保存于冷凍溫度)制備皮移植片的方法。作者描述了一種錨定到臍帶組織的裝置，并通過注射壓縮空氣的插管將其膨脹。根據(jù)描述，然后將臍帶切割并分離，但利用這種方法得到的產(chǎn)物不僅僅由WJ組成。存在使用臍帶獲得感興趣的細胞的專利文獻，為了這個目的他們實施分離臍帶膠質并將其去除的方法，從而獲得所述細胞。例如，PCT文獻98/17791描述從臍帶分離前軟骨細胞，其隨后在治療上用于產(chǎn)生軟骨。類似地，在文獻WO 2004/072273 Al中，從位于臍帶血管周圍區(qū)域內(nèi)的臍帶膠質提取祖細胞，用于修復人組織。但是，沒有下列文獻提及從位于人臍帶的臍帶膠質中的GAG形成的生物材料(不含人臍帶膜和血管)，其可以形成適合用于不同的人病狀所需的粘度特性等的水凝膠。因此，本發(fā)明的生物材料僅僅由形成臍帶的細胞外基質(稱為臍帶膠質-WJ)的 GAG組成。細胞外基質是組織的復雜和特定生物物質。源自膀胱血管的細胞外基質完全不同于源自真皮的細胞外基質(Hiles & Hodde，2006)。因此，雖然從文獻已知數(shù)個合成細胞外基質的嘗試，但還沒有實現(xiàn)模擬某一組織自然條件的精確組合物。本發(fā)明開發(fā)的生物材料提供一種允許其用做組織工程的基質的三維結構，此外， 當在疾病中直接使用或與細胞一起使用時，它參與再生過程，對組織自身的細胞發(fā)揮呼叫作用，并為細胞過程的活化提供良好的環(huán)境。WJ的特征在于其包含非常低數(shù)量的細胞，但是，包含大量的細胞外基質(膠原和GAG)。換句話說，WJ中發(fā)現(xiàn)的細胞受到高度刺激，能夠產(chǎn)生高水平的基質。這歸因于以下事實大量生長因子在WJ中聚集，包括轉化生長因子β (TGF-β)，1型胰島素樣生長因子 (IGF-I)，成纖維細胞生長因子(FGF)，表皮生長因子(EGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)。 這些生長因子通過結合特定受體實現(xiàn)它們的細胞活性調節(jié)作用，其中一些位于組成WJ的各種GAG中。這些生長因子控制細胞增殖，分化和合成以及形成WJ的細胞外基質的重建。 大量的合成基質提供高的機械抗性，彈性和高的水合能力，其用于阻止子宮收縮或胎動引起的血管阻塞(Sobolewski等，2005)。與其他生物材料不同，本發(fā)明的生物材料由來自臍帶WJ的不同GAG的組合組成。 它主要由透明質酸組成，但此外，與其他GAG化合物不同，它包含硫酸皮膚素，硫酸類肝素， 肝素，硫酸角質素，軟骨素-4-硫酸鹽和軟骨素-6-硫酸鹽。GAG的這種組合提高了生物材料的生物活性，因為它們中的每一種都發(fā)揮細胞行為的調節(jié)功能。例如，已知硫酸類肝素和肝素是FGF和EGF的主要結合部位(Kanematsu等，2003 ；Ishihara等，2002)，其保護它們免遭蛋白水解并允許細胞環(huán)境中這些因子的局部濃度，產(chǎn)生適合于大細胞活化的分子微環(huán)境(Malkowski 等，2007)。這種生物材料中存在的GAG組合提供許多特異性的信號轉導分子結合位點，其允許在應用位點組織自身細胞的高度活化以便合成高水平的細胞外基質，其將再生和修復被治療的缺陷。
此外，本發(fā)明生物材料的來源提供非免疫原性區(qū)域的人來源的自然結構，去除了摻入正常生理循環(huán)的那些，阻止動物來源的生物材料的反應或一些合成生物材料可能造成的副作用，諸如炎癥，硬化(器官組織的硬化)，肉芽瘤的發(fā)病，粘膜壞死以及由用于其制備的有毒物質造成的組織并發(fā)癥。GAG在臍帶中最重要的功能之一是提供強度、彈性和抗性以保護位于其中的血管系統(tǒng)免遭外部侵害。實際上，這些分子的合成缺陷涉及懷孕期間重要的病狀(Gogiel等， 2005)。獲得由7種不同類型的GAG(能夠成臍帶的一部分)組成的生物材料將能夠在它們的纖維之間形成交聯(lián)，模擬生物體中存在的情況，從而提供類似于臍帶給予的強度，彈性， 抗性和收縮。


圖1 本發(fā)明生物材料中存在的GAG的表征和定量。柱狀圖顯示本發(fā)明生物材料中存在的不同類型的GAG，以及它們中每一種的百分比。HA 透明質酸，KS 硫酸角質素，C6S 軟骨素-6-硫酸鹽，HS 硫酸類肝素，C4S 軟骨素-4-硫酸鹽，DS 硫酸皮膚素，H 肝素。圖2 通過組織學染色對樣品中存在GAG和不存在細胞和DNA/RNA的驗證。左圖顯示含有細胞的樣品，右圖顯示單獨的生物材料的染色。Α、Β 蘇木素伊紅染色；C、D 甲基綠焦寧染色；Ε、F 阿爾辛藍染色。圖3 通過掃描電子顯微術顯示的本發(fā)明生物材料的內(nèi)部三維結構的圖像。該圖顯示兩種不同的放大率(Α:10μπι*Β:5μπι)下本發(fā)明生物材料的內(nèi)部結構，其中可以觀察到GAG單位彼此相連，提供非常均勻的多孔結構。圖4 本發(fā)明生物材料的細胞毒性研究的結果。
該圖顯示AMSC細胞(脂肪來源的間充質干細胞)(圖A)，小鼠成纖維細胞(圖 B9)，L929 (圖C)，成骨細胞(圖D)，軟骨細胞(圖E)和角質形成細胞(圖F)的細胞毒性曲線。給出相對于對照(不含生物材料的細胞)和陽性對照(在根據(jù)IS0-10993標準確定的有毒生物材料PVC中的細胞)的結果。從圖中可以觀察到，在任一被檢測的細胞類型中生物材料都不造成毒性，因為放置在生物材料上的細胞的線粒體活性沒有顯示與對照細胞的差異(在標準培養(yǎng)條件下)。圖5 三維生物材料的顯微圖像該圖顯示凍干后本發(fā)明固體生物材料的肉眼可見的三維結構，使用標準的24孔培養(yǎng)板作為模子。所述圖像對應于在孔中固化的生物材料的量。發(fā)明詳述臍帶包含形成軟結締組織(稱為WJ)的一部分的大量GAG(硫酸化和非硫酸化的)。在這些GAG中，主要的非硫酸化GAG是透明質酸(Hadidian等，1948 Jeanloz等， 1950)，盡管還檢測到更小比例的硫酸化GAG(Danishefsky等，1966)。此外，臍帶的組織學研究表明肝素的存在(Moore等，1957)。還很有可能的是，臍帶含有更多的仍未被識別的少量硫酸化GAG。此處描述的本發(fā)明是一種由GAG組成的水凝膠，所述GAG僅僅從臍帶的WJ獲得。 這種水凝膠完全不含人臍帶(從其獲得生物材料)的WJ中存在的細胞，所以它沒有免疫原性成分。生物材料由糖胺聚糖的混合物形成，所述糖胺聚糖選自透明質酸、硫酸角質素、 軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸類肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、硫酸皮膚素和肝素。優(yōu)選的發(fā)現(xiàn)生物材料形成下述組合和比例的GAG混合物透明質酸(65-75% )、 硫酸角質素(5-15%)、軟骨素-6-硫酸鹽(6-8%)、硫酸類肝素(3-7%)、軟骨素-4-硫酸鹽(2-6%)、硫酸皮膚素(1-5%)和肝素(0. 1_2%)、更優(yōu)選的GAG組合是透明質酸 (70%)、硫酸角質素(10%)、軟骨素-6-硫酸鹽(7% )、硫酸類肝素(5% )、軟骨素-4-硫酸鹽(4% )、硫酸皮膚素(3% )和肝素(1% )。本發(fā)明還涉及由先前描述的水凝膠組成的生物材料，其任選的包含細胞。因為以下事實生物材料具有與患病組織相同類型的健康細胞，在嚴重受損的組織或不可能通過患者原位細胞補充的組織的再生和組織修復過程中水凝膠的作用得到增強。其中，生物材料包含的細胞可以是未分化的間充質干細胞或分化為另一種細胞株的間充質干細胞，干細胞未分化的造血干細胞或分化為另一種細胞株的造血干細胞，軟骨細胞和成軟骨細胞， 成骨細胞和骨細胞，角質形成細胞，成纖維細胞，肌細胞，脂肪細胞，神經(jīng)元或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其他細胞，來自白血細胞系統(tǒng)的細胞，小鼠角膜細胞，內(nèi)皮細胞或上皮細胞。本發(fā)明被分為下面幾個部分(i)從臍帶的臍帶膠質獲得GAG的提取物，(ii)從臍帶的臍帶膠質分離的GAG產(chǎn)生水凝膠，(iii)表征獲得的水凝膠和(iv)生物材料的用途。從臍帶的WJ獲得GAG的提取物用于獲得生物材料的方法包括下列步驟a.獲得人臍帶；b.用鹽溶液和抗生素處理臍帶；c.消除臍帶表面的所有血液；
d.將臍帶分為l-2cm的片段；e.清除內(nèi)部殘留的所有血液；f.清除臍帶膜和血管；g.分離包括臍帶膠質的膠凝物質；h.酶消化獲得的膠凝物質；和i.沉淀并分離GAG ；具體來說，進行下列步驟以從臍帶的WJ分離糖胺聚糖獲得臍帶膠質在分娩后立即收集臍帶，將其進行處理或處理前在4°C保存，在所述條件下不應超過24小時。為了處理，臍帶優(yōu)選的在II級生物安全的層流凈化罩中無菌條件下放置。用含有抗生素混合物(青霉素、鏈霉素、兩性霉素-B)的細胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)溶液或磷酸鹽緩沖液IX(IX PBS)和/或紅細胞裂解緩沖液將其連續(xù)清洗至少3次，以完全去除血液殘留?！┣宄裟殠П砻娴难?，將其轉移到培養(yǎng)皿，分成1-2厘米的片段。將臍帶切割為片段時，臍帶血管內(nèi)殘留的血液有可能被釋放，在這種情況下有必要徹底清潔臍帶片段。在結構水平上臍帶具有兩條臍帶動脈和一條臍靜脈，由WJ的堅固基質支持并覆蓋薄膜。只是為了獲得WJ，用機械方法去除膜和血管。為了這樣做，將臍帶片段縱向切開， 利用手術刀和鑷子小心去除臍帶膜和血管。利用這種機械分離獲得的膠凝物質是WJ。從 25到200g臍帶通常獲得20-160g臍帶膠質。從臍帶膠質提取GAG使用文獻(Rogers等，2006)描述通過木瓜蛋白酶(SIGMA，Ref :P_4762)的酶促消化從人軟骨獲得GAG的方案，其中做了一些改動，以從臍帶的WJ獲得GAG。將之前獲得的WJ在60 V浸潤于IOml提取緩沖液(5mM L-半胱氨酸，IOOmM Na2HPO^l沖液，5mM EDTA，IOmg(14U/mg)木瓜蛋白酶，pH 7. 5)中24-48小時以便完全消化。—旦WJ被完全消化，將其離心以去除無用的消化殘留物。在這個時間點，觀察到消化體積大于初始體積。這種增加歸因于WJ中存在的GAG的溶解，從而釋放它們聚集的水。樣品一旦被離心，將上清轉移到另一容器，然后沉淀出樣品中存在的GAG。從臍帶的WJ沉淀和分離GAG利用5倍體積的100%乙醇沉淀出WJ的GAG。通過這個步驟，樣品的GAG以及其中存在的鹽被沉淀析出。由于樣品中存在的水分子與乙醇分子相互作用導致沉淀，這樣的話水分子無法與樣品的GAG相互作用，后者變得不溶于水，從而沉淀析出。因此，就在添加乙醇并振搖管子以后，觀察到發(fā)白的沉淀。將GAG在-20°C靜置12小時進行沉淀。一旦沉淀析出，將它們離心以去除100%乙醇，用5倍體積的75%乙醇清洗沉淀來去除可能殘留的鹽(它們沉淀析出在樣品上)。將樣品再離心一次以完全去除上清。一旦沉淀出GAG的樣品，將固體殘留物在環(huán)境溫度靜置干燥至少30分鐘，直至所有乙醇都被蒸發(fā)。一旦乙醇被蒸發(fā)，將GAG樣品重懸于Milli-Q H2O,并在4°C長期保存。這類材料的機械抗性較低；它們不被考慮帶有負載，除非它們與另一類型的復合材料或磷酸鈣類材料組成，它們是為了在受損區(qū)域進行再生的生物活性作用。但是，組成該水凝膠的多糖分子間的最大親和力使得它們維持彼此之間的高凝聚，保留在注射部位并具有膠粘性質。交聯(lián)獲得水凝膠存在需要更具抗性和耐久的生物材料的其他治療應用，所述生物材料具有允許來自應用部位相鄰組織的細胞或在其移植前排列在生物材料上的細胞形成集落的內(nèi)部結構。 在這種情況下，本發(fā)明的生物材料將作為生物活性三維基質來誘導組織傷口的治愈和修
Μ. ο透明質酸，軟骨素-6-和-4-硫酸鹽，硫酸角質素，硫酸皮膚素，硫酸類肝素和肝素調節(jié)細胞活性和并活化新細胞外基質的合成。生物材料中存在的GAG的多樣性允許大量對生長因子(調節(jié)細胞增殖和分化過程，以及細胞合成新的細胞外基質和生長因子的能力) 特異的結合位點的存在。這種作用在患病組織中引起更強的應答能力，并加速再生，就極度退化的區(qū)域來說(就像慢性潰瘍的情況)甚至允許治愈。為了生物材料能夠被用作三維基質，GAG的提取物必須穩(wěn)定，增加其機械性能并允許形成三維結構。為了實現(xiàn)這些目標，可以將GAG化學修飾或交聯(lián)以形成固體水凝膠形式的材料。這些化學修飾通常包括醇或羧基。為了獲得穩(wěn)定和固體的水凝膠，必須讓樣品經(jīng)歷交聯(lián)反應(交聯(lián)、聚合)。這一過程包括水溶性聚合物的鏈變?yōu)椴蝗苄缘?Elisseeff等，2005)。通過交聯(lián)獲得的水凝膠具有獨特的性質，使得它們能夠用于組織工程用于攜帶營養(yǎng)物或廢物的高含水量，彈性以及在3D微環(huán)境下原位包裹或固定細胞的能力。交聯(lián)密度直接影響水凝膠的孔徑大小，從而影響其物理特性，舉例來說諸如含水量或機械抗性。具有大交聯(lián)密度進而非常小的孔徑的水凝膠將吸收更少的水份，比具有更低交聯(lián)度和大孔徑的水凝膠具有更大的機械抗性。通過交聯(lián)的水凝膠形成可以通過數(shù)種方法進行溫度變化，化學反應和光聚合作用。在本發(fā)明中如下進行交聯(lián)反應獲得待交聯(lián)的多聚體的水溶液(本實例中是GAG 的水溶液)，添加將促成交聯(lián)的化學試劑。在本實例中，為了制備水凝膠，使用EDC(1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，因為EDC活化水溶液中的羧基。這些活化的羧基能夠與伯胺或羥基反應，產(chǎn)生酰胺或酯鍵。一旦形成水凝膠，將其用PBS清洗數(shù)次以去除可能剩余的EDC殘留物。如此制備GAG分子以吸收大量水份，形成具有固體和多孔外觀的水凝膠(Pkper 等，1999 ；Wissink 等，2001)。交聯(lián)過程中在為了所述目的設計的模子中具有特定形狀和大小的水凝膠固化，這樣的話所需的形狀和大小取決于使用的模子?？梢酝ㄟ^稱為凍干的方法干燥固體水凝膠從而獲得多孔結構，這歸因于水凝膠中存在的GAG分子間插入的水分子的去除(圖5)。此外，一旦生物材料被凍干，可以通過掃描電子顯微術(SEM)表征水凝膠的三維結構(圖3)。通過凍干法將獲得的固體水凝膠冷凍， 一旦被冷凍，將其放入真空室以便通過稱為升華的過程去除水。實質上通過各種冷凍循環(huán)去除了初始水凝膠包含的所有自由水。一旦獲得其最終形狀的水凝膠，通過暴露于紫外線將其滅菌40分鐘。水凝膠上進行的無菌試驗顯示生物材料被徹底滅菌。一旦被滅菌，水凝膠就是最終的產(chǎn)品形式，準備好直接應用或與細胞聯(lián)用。利用本發(fā)明水凝膠的細胞結合測定證明所述生物材料不造成對細胞的毒性作用， 其增殖能力類似于標準培養(yǎng)條件下存在的增殖能力(圖4)。牛物凝膠的用涂本發(fā)明的生物材料(與細胞組合的形式或單獨的形式)可以采用其注射用形式用于關節(jié)系統(tǒng)疾病和美容治療。其中，可以使用的細胞是未分化的間充質干細胞或分化為另一種細胞株的間充質干細胞，未分化的造血干細胞或分化為另一種細胞株的造血干細胞，軟骨細胞和成軟骨細胞，成骨細胞和骨細胞，角質形成細胞，成纖維細胞，肌細胞，脂肪細胞，神經(jīng)元或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其他細胞，來自白血細胞系統(tǒng)的細胞，小鼠角膜細胞，內(nèi)皮細胞或上皮細胞。取決于水凝膠的預期應用，注射技術將是不同的，水凝膠的粘性應適合注射系統(tǒng)的口徑。注射用水凝膠的粘性是10到15，OOOcSt,優(yōu)選的10-2，OOOcSt。交聯(lián)的水凝膠的粘性可以大于15，OOOcSt。根據(jù)需要可以通過交聯(lián)改變水凝膠的粘性，能夠獲得大于 15，OOOcSt 的粘性。本發(fā)明開發(fā)的生物材料優(yōu)選的以注射用形式用于下列病狀重建，填充或重構軟組織，治療皺紋，皺褶和疤痕，燒傷，潰瘍，軟組織增大，臉部脂肪萎縮，椎間盤疾病，軟骨修復，肌骨胳損傷，骨關節(jié)炎和關節(jié)周炎；治療腫瘤，陰道疾病，腦損傷，骨髓修復，神經(jīng)變性病癥，心血管疾病和潤滑過程，作為止痛劑和抗炎藥。采用其固體形式的本發(fā)明生物材料具有實質的多孔結構。在所述結構中，孔徑是 1，000 μ m，優(yōu)選的500 μ m，可以具有大于15000cSt的粘性。采用其固體形式的所述生物材料優(yōu)選的用于下面病狀治療燒傷、潰瘍和皮膚表皮缺陷，治療眼科疾病，諸如角膜損傷，視網(wǎng)膜損傷或白內(nèi)障；修復軟骨，治療骨關節(jié)系統(tǒng)，諸如骨軟骨缺陷、骨關節(jié)炎或骨缺陷，和陰道疾病解析中的佐劑，治療牙齦炎和牙周炎；用于開發(fā)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。軟骨疾病是世界范圍內(nèi)重要的社會經(jīng)濟問題。從這種意義上講，盡管很難記錄它們的發(fā)病率，據(jù)估計關節(jié)損傷折磨5億人。軟骨病狀作為損傷或疾病的結果出現(xiàn)，如果不進行治療，可能導致退行性疾病諸如骨關節(jié)炎(OA)。OA是最常見的關節(jié)炎類型之一，其在美國和歐洲折磨3500萬到4000萬人。。它是一種變性疾病，引起軟骨的分解并伴隨骨的反應。它通常影響手，膝，髖部，腳和頸部，在成人中，它被認為是身體失能的最常見原因之一。關節(jié)軟骨是高度特化的無血管組織，保護動關節(jié)的骨免受與體重和撞擊有關的力，它們會引起關節(jié)表面間的摩擦。該組織由單一的細胞類型(軟骨細胞)以及重要并且豐富的細胞外基質組成。所述基質由II型膠原纖維(主要的分子)的致密網(wǎng)絡以及這一網(wǎng)絡內(nèi)的蛋白多糖大聚集物(包含GAG諸如硫酸軟骨素，硫酸角質素，透明質酸和聚集蛋白聚糖)組成。軟骨的特化結構以及其有限的修復能力使得這類損傷的治療非常復雜。血管化的缺失使其再生能力非常有限，因為再生過程中干細胞無法接近受損區(qū)域發(fā)揮作用。近年來，已經(jīng)使用可生物降解的生物材料來治療軟骨損傷。從這種意義上講，宏觀的合成多聚體(乳酸、羥基乙酸、己內(nèi)酯…)已經(jīng)成為最重要的和各種類型的生物材料。但是，這些固體的宏觀材料需要侵入性手術方法的使用，諸如常規(guī)手術。為了克服這些限制， 目前正在開發(fā)可以通過最低限度的侵入性技術植入(諸如通過注射或關節(jié)鏡技術)的新的生物基質。因此，本發(fā)明注射用生物材料的一個應用是骨關節(jié)炎退化過程中受損的關節(jié)軟骨的再生。通過經(jīng)皮技術(諸如關節(jié)鏡技術或通過任何注射裝置)，所述生物材料可以方便的在待再生的區(qū)域施用。除了方便施用之外，注射用水凝膠具有形成穩(wěn)定植入物的性質，其適合退化組織的大小和幾何形狀。所述生物材料的另一應用是三維生物材料用于傷口治療的用途。在美國，慢性糖尿病，褥瘡和靜脈曲張性潰瘍是折磨3-6百萬人的重要問題。這種病狀折磨發(fā)達國家人口的1_3%，普遍認為醫(yī)院中15%的患者患有這種疾病。患有這些病害的大量患者造成相當大的社會經(jīng)濟和保健反響，因此形成高的治療費用，患者的生活質量也被顯著改變。潰瘍是對生物體具有巨大影響的創(chuàng)傷，具有相當復雜的生理病理學。在創(chuàng)面床上存在的成纖維細胞(真皮的細胞)，角質形成細胞(表皮的細胞)，細胞外基質和血漿衍生的蛋白之間發(fā)生復雜的協(xié)同相互作用，這樣的話存在不同的創(chuàng)傷愈合期，止血，炎癥，修復和重建。但是，慢性病性質和復發(fā)是臨床進展中最相關的發(fā)生方式。盡管目前存在大量可用的治療和敷料，但治愈百分比和治愈速度仍然非常低，因此需要更有效的治療方法，以實現(xiàn)快速的創(chuàng)傷愈合。近年來獲得越來越多的關于慢性潰瘍的生理病理學的知識已經(jīng)開發(fā)出新的敷料，它是所述疾病治療的顯著進步。但是迄今為止，沒有覆蓋皮膚的理想敷料；所述敷料必須符合一系列基本特點，諸如快速粘附到傷口，提供防止液體損失的有效屏障，耐受機械壓力以提供長期穩(wěn)定性，它們必須容易滅菌，易于處理和運輸，并且它們必須是無害的。本發(fā)明的固體生物材料具有能夠有效治愈慢性潰瘍的敷料必需的大部分特點。從這種意義上講，為評價對慢性潰瘍的治療效果，利用小鼠進行體內(nèi)實驗研究。
實施例實施例1.獲得臍帶膠質為了從臍帶的WJ分離GAG，進行下列步驟分娩后立即將50g臍帶收集到無菌瓶，之前已經(jīng)在瓶中保存了 300mllX濃度的 PBS(對于 1 升 H2O 來說:8g NaCl,0. 2g KCl，1. 44g Na2HPO4,0. 24g KH2PO4, pH = 7. 4 溶于 IL H2O)和 3ml 青霉素(30，000 單位)，鏈霉素(30，000 μ g)和兩性霉素-B (75 μ g) (L0NZA， Ref :17-745E)的IX濃度的抗生素混合物。臍帶可以在4°C保存不超過24小時直至進一步處理，但在本實施例中，在收到臍帶后立即將其處理。為了進行處理，臍帶在II級生物安全層流凈化罩的無菌條件下放置，進行連續(xù)清洗以完全去除它包含的血液殘留物。為此，將其置于容器中，添加300ml的IX PBS(對于1升 H2O 來說8g NaCl, 0. 2g KCl, 1. 44gNa2HP04,0 . 24g KH2PO4,pH = 7. 4 溶于 IL H2O),包含 3ml 青霉素(30，000 單位)，鏈霉素(30，000 μ g)和兩性霉素-B (75 μ g) (LONZA, Ref 17-745E)的抗生素混合物；通過豎直地搖動瓶子5次(10秒)，將其人工振蕩，棄去液體，重復這一操作至少3次直至去除大部分血液。然后用500ml IX濃度的紅細胞裂解液(對于1升H2O來說8. 99g NH4Cl, Ig KHCO3, 37mg EDTA, ρΗ 7. 3)清洗臍帶直至完全去除血液殘留物。一旦清除掉臍帶表面的血液，將其轉移到IOcm培養(yǎng)皿，用無菌剪切成1-2厘米的片段。因為將臍帶切成片段時血管中殘留的血液被釋放，添加IOml IX PBS(包含Iml抗生素(10，000單位)，鏈霉素(10，000 μ g)和兩性霉素-B (25 μ g)的混合物)以徹底清潔所述片段，將片段表面壓在其支持表面，用無菌手術刀沿著片段作水平移動。重復該步驟直至去除內(nèi)部的所有血液殘留物。將完全清潔的臍帶片段轉移到無菌管，立刻進行處理，盡管如果需要，它們可以在-80°C長期低溫保存。然后用機械方法去除圍繞臍帶的膜以及位于其中的血管。為了這樣做，將臍帶片段縱向打開，利用手術刀和鑷子小心去除臍帶膜和血管。利用這種機械分離獲得的膠凝物質是WJ。獲得40g WJ。實施例2.從臍帶膠質提取GAG使用描述的用于從人軟骨獲得GAG的方案(其中有一些改動)以從臍帶的WJ獲得 GAG (Rogers 等，2006)。將實施例1獲得的WJ浸潤于IOml提取緩沖液(242 μ 1的200mM L-半胱氨酸， 1. 42ml 的 704mM Na2HPO4 緩沖液，100 μ 1 的 0. 5Μ EDTA, 10mg(14U/mg)，ρΗ 7. 5 木瓜蛋白酶 (SIGMA, Ref :P_4762))，將其在60°C放置24小時以完全消化WJ，一旦其被消化，將樣品在 SOOrpm離心5分鐘以去除消化殘留物。觀察到消化體積是30ml，超過IOml的起始體積大約20ml，這源于WJ中存在的GAG的溶解，進而歸因于這些聚集的水的釋放。樣品一旦被離心，將上清轉移到另一管，然后沉淀出樣品中存在的GAG。實施例3.從臍帶的WJ沉淀和分離GAG利用5倍體積的100%乙醇沉淀出存在于上清中的WJ的GAG。通過這個步驟，樣品的GAG以及其中存在的鹽被沉淀析出。這歸因于以下事實樣品中存在的水分子與乙醇分子相互作用，這樣的話水分子無法與樣品的GAG相互作用。將GAG在_20°C靜置12小時進行沉淀。一旦沉淀析出，將它們在2500rpm離心5分鐘，從而去除所有的100%乙醇。將沉淀用5倍體積的75%乙醇清洗以去除可能殘留的鹽，它們可能沉淀析出在樣品上。然后將其在2500rpm離心約5分鐘，完全去除上清。一旦沉淀出GAG的樣品，將固體殘留物在環(huán)境溫度靜置干燥約30分鐘，直至所有乙醇都被蒸發(fā)。從約40g WJ樣品起始沉淀出的GAG的量范圍是50-300mg，這取決于起始原料。就這個具體例子來說，獲得200mg GAG沉淀物，將其用2ml Milli-Q H2O重懸，并在4°C 保存直至產(chǎn)生水凝膠。實施例4.包含臍帶WJ的GAG的注射用水凝膠的產(chǎn)生。水凝膠的含水量可以為其自重的10%到100倍，取決于其應用需要的粘性。將沉淀的GAG用2ml H2O重懸后獲得的水凝膠再用注射用生理血清溶液重懸以產(chǎn)生IOOOcSt的粘性。隨后將該水凝膠用8ml注射用生理血清溶液重懸以產(chǎn)生200厘沲(cSt) 的粘性，將其在渦旋振蕩器中溫和攪拌 直至完全溶解和勻漿，以防止凝膠結構的降解。一旦水凝膠被溶解，將其在4°C保存，在這種條件下它可以長期保存。實施例5.包含來自臍帶WJ的GAG的固體水凝膠的產(chǎn)生。
為了產(chǎn)生固體水凝膠，實施文獻(Cui等，2006)描述的方法。從根據(jù)實施例3的獲自WJ的GAG提取物制備水溶液。具體來說，在H2O中制備的GAG溶液。為此，向沉淀和分離后獲得的200mg GAG中添加IOml H2O(實施例3)。向溶液中添加1. 2g己二酸二胼 (ADH)，利用0. IN HCl將溶液的pH調節(jié)為pH = 3. 5。一旦調節(jié)到所述pH，向溶液中添加
0.6g固定劑，EDC(1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(SIGMA, Ref :E6383)。 混合物在環(huán)境溫度恒定攪拌條件下維持30分鐘到1小時，直至獲得固體水凝膠。一旦形成固體水凝膠，將其用IX PBS(對于1升吐0來說8g NaCl,0. 2g KCl,
1.44g Na2HPO4,0. 24g KH2PO4, pH = 7. 4溶于IL H2O)清洗3次，每次5分鐘，以去除過量的 EDC0就水凝膠的物理形狀而言，它具有其固化所在模子的形狀，這樣的話可以使用標準的 96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或具有所需形狀的任何其他容器。此外，水凝膠可以在大的容器(諸如燒杯)中固化，一旦其固化，可以將水凝膠切割成特定的形狀和厚度。具體來說，在本實施例中水凝膠在24孔板的孔中固化，一旦固化，將其用500μ 1的IX PBS清洗 3次(5分鐘)。在這種情況下，在24孔板中交聯(lián)的固體水凝膠經(jīng)歷凍干過程，其包括下列步驟 在-80°C冷凍水凝膠。將冷凍的水凝膠樣品放入冷凍干燥器的真空室。水凝膠樣品置于真空，并且溫度按照0. 1°C /分鐘的速率升溫至-40°C，將溫度在-40°C維持20分鐘。隨后按照0. rc /分鐘的速率將溫度升至-20°c，維持-20°c的溫度15分鐘。隨后按照0. rc /分鐘的速率將溫度升至0°c，維持0°C的溫度15分鐘。之后按照0. rc/分鐘的速率將溫度升至25°C，在此溫度維持一段時間，所述時間是真空室內(nèi)外壓力達到相同所需的。在本實施例中，為了通過掃描電子顯微術(SEM)表征三維的水凝膠，一旦水凝膠被凍干，進行下列步驟切割凍干水凝膠的切片，在AUT0SAMDRI-814干燥機中用CO2將該切片干燥到臨界點，并在SPUTTER中用金進行金屬化。在JEUL掃描電子顯微鏡(JSM35)中 20KV的電壓下觀察所述制品。水凝膠的SEM分析(圖3)顯示它具有均勻的多孔結構，并且它包含孔的互聯(lián)網(wǎng)絡。顯微照片顯示高孔隙度三維結構的存在，孔徑范圍是0.5-500 μ m?？椎倪@個范圍包括微孔和大孔的存在。大孔(300-500μπι)是必需的，以便進行合適的細胞群集，這樣的話大量細胞匯集，不同的細胞類型共存，有利于形成結構化組織，例如，可以形成血管網(wǎng)絡。中等大小的孔允許細胞摻入。微孔(0. 5-50 μ m)是細胞存活必需的，因為它們負責進行氣體、營養(yǎng)物的有效擴散和細胞代謝產(chǎn)生的廢物的去除?；趻呙桦娮语@微鏡獲得的米尺測量孔徑。在這種情況下，與注射用生物材料的先前實施例不同，固體水凝膠提供三維結構， 它是細胞在其整個結構(內(nèi)部和外部)中生長和群集的基質。這種生物材料顯示更高的結構靈敏性，提示其應用不僅滿足生物活性性質和營養(yǎng)作用，而且是可以暫時容納細胞直至進行組織修復的結構，諸如尤其是潰瘍和其他皮膚表皮疾病的治療，軟骨的修復和眼科治療。生物材料中包含 的細胞可以是鄰近于植入部位的組織的細胞(其能夠形成集落)，也可以是在其臨床應用前體外排列在生物材料上的細胞，這樣的話其再生作用被增強。這種生物材料具有大小范圍是0. 01-500微米的孔的均勻分布，通過掃描電子顯微術技術測定。這種孔隙范圍適合于氣體和營養(yǎng)物擴散通過其整個結構，以及允許細胞進入其中。
實施例6.本發(fā)明生物材料中存在的GAG的表征和定量。通過質譜(ESI/MS)技術分析和定量本發(fā)明生物材料中存在的不同GAG?？紤]到通過這種技術只能測定分子量為200-2000道爾頓的分子并且GAG分子大部分超過這個范圍， 首先將樣品用酶消化以便獲得分子量在200-2000Da之間的GAG鏈。作為GAG鑒定和定量的標準品，使用它們中每一種濃度已知的標準商品化化合物。具體來說，用于進行GAG定量的標準品是對于透明質酸透明質酸鉀(SIGMA，Ref 53750)；對于硫酸軟骨素硫酸軟骨素鈉(SIGMA，Ref :C4384)；對于硫酸皮膚素硫酸皮膚素鈉(SIGMA, Ref :C3788)；對于硫酸角質素硫酸角質素(CHEMOS，Ref 7295)；對于肝素 肝素鈉(SIGMA，Ref :H8537)；和對于硫酸類肝素硫酸類肝素鈉(SIGMA，Ref51541)?；谑褂酶鞣NGAG標準品得到的結果獲得樣品中存在的GAG的定量值。按照文獻描述的方法(Mahoney等，2001)，進行GAG的酶促消化。為此，使用對每種GAG的消化特異的酶。對于透明質酸，使用透明質酸酶(SIGMA，Ref :H3506)；對于硫酸軟骨素，使用軟骨素酶(SIGMA，Ref :C2780)；對于硫酸皮膚素，使用軟骨素酶B (SIGMA，Ref :C8058)；對于肝素，使用肝素酶I (SIGMA，Ref :H2519)；對于硫酸類肝素，使用肝素酶I (SIGMA，Ref :H2519)； 對于硫酸角質素，使用角質素酶(K2876)。通過將440U相應酶重懸于IOml下列緩沖液制備這些酶2ml IOOmM磷酸鹽緩沖液 ρΗ = 7· 77，770μ 1 IM NaCl，Img BSA 和 7. 23ml H2O0含有160U/ml酶濃度的酶促消化緩沖液如下制備將4. 5ml酶(2000U)添加到 7. 5ml 消化緩沖液，1. 5ml IM NaCl, 0. 333ml 3M 醋酸鈉 ρΗ = 5. 2 和 5. 67ml H2O0 用于酶促消化的樣品和標準品如下制備將500 μ 1消化緩沖液(80U酶)添加到500 μ 1各種GAG的標準品(濃度為2mg/ml)，這樣的話標準品最終溶液的濃度為lmg/ml。對于GAG樣品同樣如此將500 μ 1消化緩沖液(80U酶)添加到500 μ 1 GAG樣品。樣品在37°C消化1小時，之后通過在60°C熱變性5分鐘將酶滅活。一旦消化完成，通過質譜分析樣品和標準品。質譜是一種實驗研究法，用于確定待分析的樣品中存在的某些離子的質荷比。質譜儀由三個基本部件組成離子源，質量分析器和檢測器。通過離子源將待分析的樣品離子化，它們在質量分析器中分離并被檢測產(chǎn)生質譜，其中顯示與特定離子類型的相對豐度比較的質荷值。具體來說，在本實施例中，如下將樣品注射入質譜儀按照0.2ml/分鐘的流速將20 μ 1樣品直接注射入質量/質量檢測器(Thermo LCQ model)。使用陰性電噴射電離 (ESI-)方法，層析時間設為10分鐘。選擇根據(jù)文獻(Mahoney等，2001)對應于已知的各類 GAG分子量的士6Da范圍的分子離子。所述離子存在于標準GAG的樣品和待分析的樣品，所以樣品中各種GAG的存在被定性顯示。為了確保結果的再現(xiàn)性，樣品和標準品一式兩份進行注射。對于不同GAG的定量，對于lmg/ml各GAG的標準品做標準線。做出的標準線包括下列濃度的各標準GAG (透明質酸，硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，肝素，硫酸類肝素和硫酸角質素)，用于制備標準線:750μ g/ml,500y g/ml,250y g/ml,100y g/ml,0y g/mL· 利用 H2O進行標準線的稀釋，包含相等比例的酶促消化緩沖液和H2O的混合物被用作該線的空白對照。本發(fā)明生物材料中各GAG的鑒定結果和比例如下，考慮到生物材料的來源是天然的，這意味著在它們的組成中存在小的變化(圖1)70%透明質酸10%硫酸角質素7%軟骨素-6-硫酸鹽5%硫酸類肝素4%軟骨素-4-硫酸鹽3%硫酸皮膚素
0158]I0ABM棚列7.力T·丨丨物遍本發(fā)明的生物材料包含天然來源的GAG組合。這種天然來源增強了它們的再生效果以及對細胞活性的作用，因為GAG的結構以及它們之間的相互作用與生理條件下在細胞外基質中發(fā)現(xiàn)的類似。臍帶是一種免疫原性不高的組織，實際上，WJ中包含的干細胞的異源使用在許多情況下被認為可用于治療。還有一些情況從臍帶的血管發(fā)展動脈或靜脈系統(tǒng)，也用于異源使用。但是，為了確保本發(fā)明的生物材料不含細胞和細胞殘余(它們可引起炎癥反應或植入物排斥反應)，進行蘇木素_曙紅、阿爾新藍和甲基綠_焦寧組織染色(圖2)。蘇木素-曙紅這是組織病理水平使用最廣泛的組化染餼。它允許觀察細胞和細胞組分。蘇木素顯示對細胞的酸成分(特別是核酸)的親和力，而曙紅顯示對堿性區(qū)域的親和力，允許很好的觀察細胞的細胞質。對GAG樣品的制品(圖2Β)進行染色，細胞的延展 (extensions)被用作陽性對照(圖2A)。進行蘇木素-曙紅染色的方法如下進行通過無菌拭子將GAG樣品在載玻片上延展，并將該延展物靜置干燥至少24小時。一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5 分鐘。隨后，通過用H2O清洗去除固定劑。載玻片用蘇木素染色3分鐘(PANREAC，DC Harris 蘇木素溶液)。隨后，通過用H2O清洗去除過量的染料。所有載玻片都經(jīng)過含0. 5% HCl的 H2O以去除染料的非特異性結合。用H2O清洗載玻片。載玻片用曙紅(0.5%溶于水H2O)染色30秒。載玻片用H2O清洗以去除過量的曙紅。向所述制品添加數(shù)滴Fluoromoimt-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH, Ref :0100_01)，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用蘇木素-曙紅染色的結果(圖2，圖像A和B)顯示被分析的GAG樣品中沒有細胞。阿爾新藍阿爾新藍是主要的陽離子染料之一(在其分子中包含正電荷)，其結合多糖帶負電荷的位點，所述多糖載有硫酸鹽，磷酸鹽或碳酸鹽基團(構成蛋白聚糖的一部分)。這些靜電鍵取決于培養(yǎng)基的PH ；在中性pH染料結合含中性基的蛋白聚糖；在酸性pH 它結合蛋白聚糖硫酸鹽；和在堿性PH它結合蛋白聚糖磷酸鹽。當pH = 1時，阿爾新藍結合弱和強硫酸化的蛋白聚糖，其包含硫酸軟骨素，硫酸皮膚素硫酸類肝素和硫酸角質素(構成臍帶膠質GAG的一部分)。對GAG樣品的制品(圖2F)進行染色，細胞的延展被用作陽性對照(圖2E)。本實施例中進行阿爾新藍染色的方法具體如下進行透過過無菌拭子將GAG樣品在載玻片上延展，該延展物靜置干燥至少24小時。一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5分鐘。隨后，用IX PBS清洗去除固定劑。將載玻片浸于0. IN HCl pH = 1中5分鐘。隨后將它們用溶于0. IN HCl pH = 1的阿爾新藍染色2小時。將載玻片浸于0. IN HCl中5分鐘，立刻用H2O清洗以去除過量的染料。 向所述制品添加數(shù)滴Fluoromount-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH, Ref :0100_01)，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用阿爾新藍染色的結果(圖2，圖像E和F)顯示被分析的生物材料樣品中存在 GAG0甲基綠-焦寧這種染色用于組織包含的核酸的組織學研究，以及顯示淋巴細胞和漿細胞的存在。它還用于組織切片和細胞學制品中漿細胞和RNA的鑒定。焦寧把漿細胞的細胞質和大部分核仁染為紅色。甲基綠將DNA染為藍綠色(略呈紫色的)。對GAG樣品的制品(圖2D)進行染色，細胞的延展被用作陽性對照(圖2C)。本實施例中進行甲基綠-焦寧染色的方法具體如下進行透過過無菌拭子將各GAG樣品在載玻片上延展，該延展物靜置干燥至少24小時。 一旦載玻片被干燥，將延展物用70%甲醇固定5分鐘。隨后，通過用H2O清洗去除固定劑。將載玻片浸于0. IN HCl pH=l中5分鐘。隨后將它們用甲基綠-焦寧染色5分鐘(0. 012% 甲基綠溶于H20,0. 01 %焦寧溶于H20,0. 75%甲醇)，立即用H2O清洗以去除過量的染料。向所述制品添加數(shù)滴Fluoromount-G封固劑(SOUTHERN BIOTECH, Ref :0100_01)，用蓋玻片覆蓋，并在顯微鏡下觀察。用甲基綠-焦寧染色的結果(圖2，圖像C和D)顯示被分析的GAG樣品中沒有核酸。從圖4的圖像可以看出，在本發(fā)明的材料中觀察不到細胞和核酸殘留。但是，通過阿爾新藍染色在開發(fā)的生物材料中觀察到GAG的存在。實施例8.數(shù)種細胞類型在本發(fā)明生物材料上的毒性。生物材料能夠用于移植或作為組織工程基質的主要要求是完全沒有細胞毒性。為了驗證本發(fā)明的生物材料不引起毒性作用，通過MTT法(Roche Diagnostics) 測定細胞毒性，并由歐洲替代方法驗證中心(ECVAM，European Centre for the Validation of Alternative Methods)對排列在本發(fā)明生物材料上的細胞進行驗證。使用的細胞類型與生物材料針對的病狀有關，諸如，皮膚角質形成細胞和成纖維細胞，骨的成骨細胞，軟骨的軟骨細胞和脂肪來源的間充質干細胞，以及ISO 10993中指定的用于L929毒性測定的細胞系。MTT測定法基于活細胞的線粒體酶將某些底物轉化為其他次級代謝產(chǎn)物的能力。 形成的化合物的量取決于線粒體脫氫酶的活性，這是培養(yǎng)物中存在的活細胞數(shù)目的明確指標。具體來說，這種線粒體檢測，細胞增殖試劑盒I (MTT)Cat. No. 1465 007羅氏，通過細胞線粒體琥珀酸脫氫酶將(黃色)四唑鹽變?yōu)椴蝗苄缘?藍色)甲臜晶體來測定轉化。 隨后將細胞透化，溶解形成的 晶體，產(chǎn)生染色的溶液，這通過ELISA微板讀數(shù)器在550nm波長處測量其吸光度進行定量。得到的結果顯示于圖4。如下所述進行該方法1.將細胞種于防粘的96孔板，每孔50 μ 1生物材料，密度為2000-5000個細胞/孔(取決于細胞類型)。先前已經(jīng)確定每一細胞類型的合適細胞濃度。成纖維細胞，成骨細胞，軟骨細胞和脂肪來源的間充質干細胞，所有均來自人來源的原代培養(yǎng)物，按照4000個細胞每孔的濃度接種，L929小鼠成纖維細胞系按照200個細胞每孔的濃度接種，獲自人皮膚原代培養(yǎng)的角質形成細胞按照5000個細胞每孔的濃度接種。2.在開始細胞毒性測定前，將細胞靜置在37°C和5% C02條件下穩(wěn)定24小時。該測定包括陽性對照(細胞+培養(yǎng)基+已知誘導細胞毒性的材料，就本例來說是聚乙烯多氯化物或PVC)，對照(細胞+標準培養(yǎng)基)，以及接觸本發(fā)明生物材料的細胞。3.將其在培養(yǎng)箱中37°C溫育實驗方案指定的時間段直至進行測定，就本例來說是接觸24，48和72小時。4.溫育期結束后，對每孔各100μ 1培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物添加10μ IMTT溶液 (0. 5mg/ml)，并在培養(yǎng)箱中37°C溫育4小時。5.溫育結束后，可以觀察到細胞內(nèi)部的甲臜晶體。每份培養(yǎng)物或每孔中添加 100 μ 1增溶液，并在培養(yǎng)箱37°C溫育過夜。細胞因此被透化，晶體用指定的100 μ 1增溶劑溶解，產(chǎn)生可方便定量的染色溶液。6. 一旦晶體被溶解，用ELISA讀數(shù)器在550nm處直接讀取培養(yǎng)板。在讀取前，建議用乙醇清潔板的底面。從圖4可以看出，本發(fā)明的生物材料不對被檢測細胞系的任意一種產(chǎn)生毒性作用，與對照相比不存在顯著差異。棚列9.絲■棚賊刪勿遍細臺碑為了在OA中體內(nèi)鑒定本發(fā)明生物材料的治療效果，使用實施例3獲得的水凝膠， 將其用8ml注射用生理血清溶液重懸以產(chǎn)生200cSt的粘性。在一個膝蓋處接受前十字韌帶切除術的兔被用作實驗模型。通過外側關節(jié)切開術進行韌帶的這種切除。隨后，為了使膝蓋失穩(wěn)，等待數(shù)月到數(shù)周的時間，在此期間發(fā)生類似于骨關節(jié)炎的軟骨侵蝕。此外，在膝蓋處未進行關節(jié)切開術的動物被用作對照組。利用關節(jié)鏡手術通過清洗和清創(chuàng)術制備受損的關節(jié)表面，用本發(fā)明的注射用生物材料覆蓋損傷處。放置生物材料4周后，處死動物并提取軟骨。將獲得的軟骨用4%多聚甲醛固定以便其后續(xù)的組織學處理。為了獲得組織切片，將樣品包埋入石蠟，為此將其置于 50,70,90和100%的醇中5分鐘。隨后將樣品放入citrosol 5分鐘，并包埋入石蠟直至獲得固體塊。利用切片機獲得5 μ m組織切片，利用這些切片進行組織染色和免疫染色。通過免疫組化技術分析組織切片中軟骨細胞外基質的不同標記物。被研究的軟骨細胞外基質的特異性分子和分子標記物是II型膠原，硫酸角質素，軟骨素-4-硫酸鹽和軟骨素-6-硫酸鹽。使用單克隆抗體進行免疫染色。用于標記組織切片的技術是直接的免疫染色，使用標記熒光染料的單克隆抗體。使用共焦顯微鏡觀察標記。獲得的結果顯示生物材料誘導受損軟骨的再生，因為一旦被植入，注射用生物材料不引起毒性，即，在組織切片的肉眼可見和顯微鏡水平?jīng)]有觀察到炎癥現(xiàn)象。生物材料適合待修復的傷口的幾何形狀和大小，并停留在移植區(qū)域內(nèi)。沒有觀察到鄰近植入物區(qū)域的健康組織細胞表型的改變。在植入物區(qū)域的對軟骨特異的細胞外基質分子(諸如II型膠原)的存在表明再生過程的起始，伴隨與天然組織相同質量的新細胞外基質的形成。在植入物區(qū)域觀察到軟骨細胞的存在，其表明細胞遷移、粘附和增殖的刺激。這些事實證明本發(fā)明的生物材料促進軟骨缺陷的再生，這與對照動物(其不存在任何軟骨修復的跡象)不同。實施例10.三維牛物材料的用涂實施例5獲得的本發(fā)明固體生物材料具有能夠有效治愈慢性潰瘍的敷料必需的大部分特點。從這種意義上講，為了評價對慢性潰瘍的治療效果，使用Swiss白化小鼠(在背部區(qū)域接受約3cm2的熱蝕)進行體內(nèi)實驗研究。使用接受相同類型的傷害但用商品化的透明質酸凝膠治療的動物作為對照組。對于本發(fā)明生物材料的應用，通過清洗、消毒和手術清創(chuàng)術制備誘導傷害的表面， 用本發(fā)明的可塑固體生物材料在深度和表面兩方面均覆蓋和填充所述損傷。在放置生物材料15天后，處死動物，切除傷口區(qū)域并在4%多聚甲醛中固定用于其后續(xù)的組織學檢查。為了進行處理，將樣品包埋入石蠟，為了這個目的將其置于50，70，90和100%的醇中5分鐘。 隨后將樣品放入citrosol 5分鐘，并包埋入石蠟直至獲得固體塊。利用切片機獲得5 μ m 組織切片，利用這些切片進行組織染色和免疫染色。通過免疫組化技術分析組織切片中的不同表皮表型標記物，諸如5和10角蛋白， 分化標記物，諸如外皮蛋白和兜甲蛋白，皮膚標記物波形蛋白，和基質成分諸如層粘連蛋白。用于標記組織切片的技術是直接的免疫染色，使用標記熒光染料的單克隆抗體。使用共焦顯微鏡觀察標記。獲得的結果顯示生物材料在潰瘍再生中是有效的，因為用于傷口的生物材料是免疫無活性的，未顯示毒性癥狀。生物材料適合待修復的傷口的幾何形狀和大小，在深度和表面均完全覆蓋患病區(qū)域。生物材料促進止血現(xiàn)象，這是愈合過程開始的跡象。隨著愈合過程進展，生物材料降解，并被皮膚的上皮組分取代。組織切片顯示生物材料誘導成纖維細胞和角質形成細胞(它們在其中仍是有活性的)的遷移和增殖。本發(fā)明的生物材料誘導傷口愈合的有效性是對照動 物的兩倍，此外，新疤痕組織的質量顯著高于沒有應用本發(fā)明生物材料的動物。參考文獻-Collins Μ. 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權利要求
1.一種生物材料，其特征在于，該生物材料包括源自人臍帶的糖胺聚糖(GAG)的混合物，所述臍帶不含人臍帶膜和血管。
2.根據(jù)權利要求1的生物材料，其特征在于，所述GAG的混合物從存在于人臍帶中的臍帶膠質提取。
3.根據(jù)權利要求1-2的生物材料，其特征在于，其包括選自透明質酸、硫酸角質素、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸類肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、硫酸皮膚素和肝素的糖胺聚糖混合物。
4.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物65-75%的透明質酸。
5.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物5-15%的硫酸角質素。
6.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物6-8%的軟骨素-6-硫酸鹽。
7.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物3-7%的硫酸類肝
8.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物2-6%的軟骨素-4-硫酸鹽。
9.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG總混合物1-5%的硫酸皮膚
10.根據(jù)權利要求3的生物材料，其特征在于其包括占GAG總混合物0.1-2%的肝素。
11.根據(jù)權利要求3的源自人臍帶的生物材料，其特征在于，其包含透明質酸 (70%)、硫酸角質素(10%)、軟骨素-6-硫酸鹽(7% )、硫酸類肝素(5% )、軟骨素-4-硫酸鹽(4% )、硫酸皮膚素(3% )和肝素(1% )。
12.根據(jù)權利要求1-11的源自人臍帶的生物材料，其特征在于，該生物材料是水凝膠。
13.根據(jù)權利要求12的生物材料，其特征在于，其是注射用水凝膠。
14.根據(jù)權利要求12-13的生物材料，其特征在于所述注射用水凝膠具有10到 15，OOOcSt 的粘性。
15.根據(jù)權利要求12的生物材料，其特征在于具有10到2，OOOcSt的粘性。
16.根據(jù)權利要求12的生物材料，其特征在于具有大于15，OOOcSt的粘性。
17.根據(jù)權利要求12的生物材料，其特征在于，其是固體水凝膠。
18.根據(jù)權利要求17的生物材料，其特征在于，具有孔徑為0.5-1000 μ m的充分多孔結構。
19.根據(jù)權利要求18的生物材料，其特征在于，所述孔徑是0.5-500 μ m0
20.根據(jù)權利要求1-19的生物材料，其特征在于，該生物材料還包括細胞。
21.根據(jù)權利要求20的生物材料，其特征在于，所述細胞選自未分化的間充質干細胞或分化為另一種細胞株的間充質干細胞、和/或未分化的造血干細胞或分化為另一種細胞株的造血干細胞、和/或軟骨細胞和/或成軟骨細胞、和/或成骨細胞和、和/或骨細胞、和 /或角質形成細胞、和/或成纖維細胞、和/或肌細胞、和/或脂肪細胞、和/或神經(jīng)元和/ 或來自神經(jīng)系統(tǒng)的其他細胞、和/或來自白血細胞系統(tǒng)的細胞、和/或小鼠角膜細胞、和/ 或內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞。
22.用于獲得權利要求1-21的生物材料的方法，其特征在于，其包括下列步驟a)獲得人臍帶；b)用鹽溶液和抗生素處理臍帶；c)消除臍帶表面的所有血液；d)將臍帶分為l-2cm的片段；e)清潔內(nèi)部殘留的所有血液；f)清除臍帶膜和血管；g)分離包括臍帶膠質的膠凝物質；h)酶法消化獲得的膠凝物質；和i)沉淀并分離GAG。
23.用于獲得權利要求1-21的生物材料的方法，其特征在于，所述生物材料包括通過權利要求22所得GAG的溶解而獲得的水凝膠，該水凝膠具有10到15，OOOcSt的粘性。
24.用于獲得權利要求17-19的生物材料的方法，其特征在于，其包括通過基于權利要求22所得GAG的交聯(lián)獲得的水凝膠，其具有孔徑為0. 5-1000 μ m的充分多孔的三維結構。
25.根據(jù)權利要求24所述的用于獲得生物材料的方法，其特征在于，所述孔徑優(yōu)選的是0. 5-500 μ m0
26.根據(jù)權利要求24-25所述的用于獲得生物材料的方法，其特征在于，通過溫度變化、化學反應或光聚合進行交聯(lián)。
27.根據(jù)權利要求1-26的生物材料的用途，用于重建、填充或重構軟組織，治療皺紋， 皺褶和疤痕，燒傷，潰瘍，軟組織增大，臉部脂肪萎縮，椎間盤疾病，軟骨修復，肌骨胳損傷， 骨關節(jié)炎和關節(jié)周炎；治療腫瘤，陰道疾病，腦損傷，骨髓修復，神經(jīng)變性病癥，心血管疾病和潤滑過程，作為止痛劑和抗炎藥；治療燒傷，潰瘍和皮膚表皮缺陷，治療眼科疾病，諸如角膜損傷，視網(wǎng)膜損傷或白內(nèi)障；修復軟骨，治療骨關節(jié)系統(tǒng)，諸如骨軟骨缺陷、骨關節(jié)炎或骨缺陷的情況，和解析陰道疾病的佐劑，治療牙齦炎和牙周炎；用于開發(fā)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由臍帶的細胞外基質形成的生物材料(尤其是水凝膠)在再生醫(yī)學中的應用。本發(fā)明尤其涉及一種由糖胺聚糖組成的生物材料及其制備方法和用途，所述糖胺聚糖專有地從臍帶的臍帶膠質(其任選的包含細胞)分離。
文檔編號A61L27/44GK102176881SQ200880131511
公開日2011年9月7日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2008年10月10日
發(fā)明者安娜·伊莎貝爾·阿隆索瓦羅納, 特奧多羅·帕洛馬爾斯卡薩多, 瑪麗亞·畢格納·卡斯特羅費奧, 胡里奧·方特佩雷斯, 邁特·德爾奧爾莫巴斯特里夏, 阿朗茨·因凡特馬丁內(nèi)斯 申請人:海斯特賽爾有限公司