專利名稱：高效14價肺炎球菌結合疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體為預防肺炎球菌感染的高效14價肺炎球菌結合疫苗。
背景技術：
肺炎球菌(6". p; e^7077he)，如圖1所示，對全世界造成的威脅正日益加劇。由于抗生素耐藥性傳染病的擴散，以及肺炎球菌肺炎經常在流感感染之后出現(xiàn)，肺炎球菌疾病在流感期間發(fā)作的可能性進一步增加。由肺炎鏈球菌引發(fā)的疾病已成為全球一個重要的公共衛(wèi)生問題。肺炎球菌己成為全球兒童的頭號殺手，具體統(tǒng)計如圖2所示。
據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，平均每年有160萬人死于這種疾病，其中包括70-100萬5歲以下的兒童。2004年世界衛(wèi)生組織調查了全球肺炎球菌疾病死亡分布情況如圖3所示。
據(jù)統(tǒng)計，在美國每年約有15-57萬例肺炎球菌性肺炎，約有2600-6200例肺炎球菌性腦膜炎，兩者每年造成約4萬人死亡。肺炎病死率約10%，而50歲以上老人的病死率高達28%。肺炎球菌敗血癥的病死率約25-30%。美國的細菌性中耳炎有50_67%是由肺炎球菌引起，主要危害嬰幼兒， 一般難以徹底治愈，且復發(fā)率高。在法國每年有12.5萬人因肺炎球菌引起肺炎，近萬人死亡。
世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計多數(shù)死亡病例發(fā)生在貧困國家，在發(fā)達國家小于2歲兒童和老年人是肺炎球菌疾病的主要疾病負擔。在肺炎球菌疾病負擔最高的10個國家中，有5個位于亞洲，分別是孟加拉、中國、印度、印度尼西亞與巴基斯坦。2歲以下兒童在死亡病例中所占的比例尤高。在歐洲和美國，肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性成人細菌性肺炎最主要的病因。在這些區(qū)域，侵襲性肺炎球菌疾病的年發(fā)病率為10-100例/10萬人口。我國肺炎的病死率為16. 4%，其中50歲以上中老年人及1歲以下嬰幼兒分別高達28. 6%和22. 0%。我國肺炎球菌在健康兒童中的攜帶率較高，資料統(tǒng)計顯示，在北方地區(qū)健康兒童中的攜帶率為24.2%，南方地區(qū)為31.3%。而該病是導致5歲以下兒童死亡的重要原因。主要原因在于寶寶免疫系統(tǒng)的發(fā)育尚不完善，寶寶免疫力較弱。并且年齡越小的寶寶，免疫力越弱，特別是2歲以下的寶寶，其免疫力存在兵力不足、基礎不牢、穩(wěn)定性差三大弱點。
結合疫苗是目前最先進的疫苗技術，在特異抗原上加上蛋白質載體，可增加其免疫原性。蛋白質載體具有T細胞依賴特性，蛋白結合疫苗可將非T細胞依賴性質的多糖抗原轉變?yōu)門細胞依賴性質的抗原，激發(fā)機體的T輔助細胞產生一系列的免疫增強效應。莢膜多糖結合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細胞依賴性抗原變?yōu)門細胞依賴性抗原，增加其免疫原性。結合疫苗接種后產生的抗體在質量和數(shù)量上是一代疫苗的400-1000倍，如圖4及圖5所示的的IgG部分，產生免疫保護更廣更強，保護時間更長久，達到高效保護。
肺炎球菌大約有90種血清型(菌株)，我國的統(tǒng)計資料顯示肺炎球菌感染菌株前幾個血清型依次為5、 6、 1、 19、 23、 14、 2、 4型。據(jù)一項收集了 860株肺炎球菌分離株的研究顯示，有109株(12.7%)表現(xiàn)為血清群6，在中國肺炎球菌血清型6的紅霉素耐藥性達100%,其中的6A、6B和6C型分別為62株(56. 9%)、38株(34. 9%)和9株(8. 2%)。
中國生物技術集團成都生物制品研究所生產的23價肺炎球菌疫苗是選取了23種本土最容易致病的病菌，分離提純肺炎球菌莢膜上的多糖，按比例混合制成疫苗，起到抗肺炎的作用，保護率為50-70%。這意味著2歲以上的人群每接種兩個人大概只有一個人產生保護，而肺炎的高峰發(fā)病年齡為6-12月齡。
細菌的多糖是一種胸腺非依賴性抗原，這種抗原與胸腺依賴性抗原的主要區(qū)別在于前者不需要T淋巴細胞的輔助來產生抗體。因此多糖疫苗存在以下問題(l)在幼小動物或嬰幼兒體內只能產生微弱的免疫反應，甚至不產生免疫反應，免疫反應隨年齡的增長而增強；(2)產生低親和力的抗體，主要為IgM; (3)只產生短暫的免疫反應，不具備反復接種時的免疫記憶和免疫增強效應；(4)容易產生免疫耐受；(5)普通的佐劑對這種抗原不易起到免疫增強的作用。
多糖疫苗對嬰幼兒不起作用是因為2歲以下兒童的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，可能與人類IgG2類B淋巴細胞株的發(fā)育遲緩有關，而細菌多糖只能刺激比較成熟的B淋巴細胞。然而兒童肺炎好發(fā)年齡段確在2周歲以下，高峰發(fā)病年齡為6-12月齡，因此2歲以下嬰幼兒只能使用含胸腺依賴性抗原的疫苗。
蛋白質載體可將胸腺非依賴性的多糖抗原轉變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖ぐl(fā)機體的T輔助細胞產生一系列的免疫增強效應。2000年，美國惠氏公司第一個7價肺炎球菌結合疫苗上市；美國惠氏公司開發(fā)嬰幼兒更有針對性的7(4、 6B、 9V、14、 18C、 19F和23F)價肺炎球菌蛋白疫苗，對5歲以下兒童也有效。莢膜多糖蛋白結合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細胞依賴性抗原變?yōu)門細胞依賴性抗原，可增加其免疫原性，可用于6周齡以上的兒童。
但是我國的資料顯示肺炎球菌感染菌株血清型依次為5、 6、 1、 19、 23、14、 2、 4，惠氏7價肺炎球菌結合疫苗對我國常見致病菌型覆蓋率只有33.9%。惠氏7價肺炎球菌結合疫苗需要接種4針劑，每針860元，價格昂貴，不利于.推廣。這些結果表明引起肺炎球菌疾病的細菌不斷變化。我國流行的肺炎球菌菌株也跟美國有所差異，肺炎球菌大約有90種血清型(菌株)。主要流行的莢膜血清型隨著年齡、時間和地域而有所不同，美國惠氏公司的7價結合疫苗不太適合我國大范圍的兒童肺炎預防。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對以上所述肺炎球菌疫苗存在的不足，提供一種綜合考慮國內普遍流行菌型、兒童和老人易感菌型、耐藥菌型及交叉保護等因素，能覆蓋我國絕大部分常見致病菌型或耐藥性菌型，對易受肺炎困擾的老年人能產生有效保護，并且適合2歲以下兒童的，覆蓋率高，價格低的高效14價肺炎球.菌結合疫苗。 .
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的高效14價肺炎球菌結合疫苗，是以分離提純14種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合后等量混合而成；所述的14種血清型肺炎球菌的血清型為1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、19A、 19F和23F;載體蛋白選用白喉菌素無毒變異蛋白CRM197、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白。 .
所述的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合是用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)和三乙胺活化，通過異脲鍵連接結合。
所述的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合的具體步驟是在10ml濃度為10mg/ml.的14種血清型肺炎球菌的莢膜多糖中分別加入用lml乙腈溶解的濃度為100mg/ml 1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)， lmin后加入4ml濃度為0.2mol/L的三乙胺活化，2.5min后加入5g載體蛋白，室溫下反應1小時，4。C再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A，及A，同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液即為結合疫苗。
所述的血清型6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型分離提純的莢膜多糖采用
1 -氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通過異脲鍵偶聯(lián)流感嗜血桿菌
D蛋白。.
所述的血清型1、 2及7F型分離提純的莢膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化， 通過異脲鍵偶聯(lián)破傷風類毒素蛋白。
所述的血清型4、 5、 9N、 9V和18C型分離提純的莢膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通過異脲鍵偶聯(lián)白喉毒素無毒變異蛋白。
本發(fā)明是鑒于肺炎對我國高發(fā)肺炎菌株特點研制的一種能覆蓋我國絕大部分常見致病菌型或耐藥性菌型的14價肺炎球菌結合疫苗。與現(xiàn)有的肺炎球菌結合疫苗相比，本發(fā)明的優(yōu)點是(1)血清型分別為十四種(l、 2、 4、 5、 6A、 6B、7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)肺炎球菌，交叉保護率達90%以上；(2)對易受肺炎困擾的老年人能產生有效保護，并且適合2歲以下兒童。


圖l為肺炎球菌的掃描電鏡圖2為2004年全球5歲以下兒童死亡原因調査數(shù)據(jù)圖(圖中顯示肺炎是全
球兒童的頭號殺手)；
圖3為世界衛(wèi)生組織2004年統(tǒng)計的全球5歲以下兒童因肺炎死亡的地區(qū)分布圖，其中東南亞所占比率僅次于非洲；
圖4為小鼠實驗中，偶聯(lián)有蛋白載體的PPS4-CRMm與PPS4免疫產生的抗體對比圖，(圖中偶聯(lián)有蛋白載體的PPS4-CRMw7是PPS4免疫產生的抗體的IOOO倍左右)；.
圖5為在小鼠實驗中，莢膜多糖結合疫苗免疫42天后產生的IgG統(tǒng)計對比圖。 '
圖6、小鼠實驗中，成都23價疫苗、惠氏7價結合疫苗和高效14價結合疫苗免疫后產生的抗體濃度統(tǒng)計對比圖(其中，+成都23價一代疫苗，
惠氏7價二代疫鶴和"*^高效M價肺炎球菌結合疫苗)；
圖7、小鼠實驗中，成都23價疫苗和高效14價結合疫苗不同劑量免疫后產生的抗體滴度統(tǒng)計對比圖(+—代23價疫苗0.5呢，
二代M價結合疫ffl 0. 5ug， --代23價疫苗lug 和
4， 二代14價結合疫苗JUg);
圖8、小鼠實驗中，成都23價疫苗、惠氏7價結合疫苗和高效14價結合疫苗免疫后產生的IgG/IgM比率統(tǒng)計對比圖(其中+成都23價一代疫苗，—*-惠氏7價二代疫苗和+高效M價肺炎球菌結合疫苗)。
具體實施例方式
以下具體結合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
高效14價肺炎球菌結合疫苗，是以分離提純14種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合后等量混合而成。14種血清型肺炎球菌選取中國本土最常見的血清型為1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、19F和23F的肺炎菌。載體蛋白選取國際認可蛋白載體白喉菌素無毒變異蛋白.CRM，97、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白。白喉菌素無毒變異蛋白CRM朋、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白與莢膜多糖結合，能提高抗原的免疫原性，從而啟動嬰幼兒的免疫機制，同時蛋白載體具有活化免疫細胞的作用，6周齡以上的嬰兒就可接種，及早產生抗體，預防肺炎球菌感染。
莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)結合為分別將14種血清型(1、 2、 4、 5、 6A、6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)肺炎球菌的莢膜上提取的莢膜多糖用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)和三乙胺活化法偶聯(lián)結合載體蛋白(白喉菌素無毒變異蛋白CRMw7、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白)。該反應為異脲鍵連接反應。在高pH時，CDAP與多糖殘基上的羥基反應，轉化成氰酸酯，載體蛋白上的氨基與其迅速反應，形成異脲鍵。該方法操作簡單，容易重復。具體步驟如下在檢測合格10ml濃度為10mg/ml的上述14種血清型肺炎鏈球菌的莢膜多糖中分別加入用lml乙腈溶解的濃度為100mg/ml CMP， lmin后加入4ml濃度為0.2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g載體蛋白，室溫下反應1小時，4r再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印haroseCL-4B層析介質純化，以波長A娜及A，同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液即為結合疫苗。
高效14價肺炎球菌結合疫苗的具體制作方法如下
(1) 選取14種血清型(1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、
19F和23F)的肺炎球菌培養(yǎng)。
(2) 分別提純以上14種血清型肺炎球菌中抗原性強的莢膜多糖肺炎球菌滅活后離心收集上清液，經超濾濃縮，根據(jù)各肺炎球菌血清型特性分別加入適量(體積分數(shù)為70%的)預冷乙醇，離心收集，得粗制多糖；將粗制多糖溶于乙酸鈉溶液中，然后按l: 2比例以冷酚混勻，離心去除蛋白，反復酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析后液體加2mol/L氯化鈣溶液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補加乙醇(終濃度80%攪拌)，離心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥后即為精制莢膜多糖，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> (3) 取檢測合格的各型肺炎鏈球菌的莢膜多糖，用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟'化硼(CDAP)和三乙胺活化法結合載體蛋白得到結合疫苗。
實施例l: 14種血清型肺炎球菌的培養(yǎng)
綜合考慮國內普遍流行菌型、兒童和老人易感菌型、耐藥菌型及交叉保護
等因素，選取14種血清型(1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、19F和23F)的肺炎球菌培養(yǎng)；
(1)菌種1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F共計14個血清型別菌種，可以購自中國藥品生物制品檢定所(中國醫(yī)學細菌保藏
管理中心)，保藏編號分別為31401、 31402、 31404、 31405、 31406、 31409、 31414、31419、 31423、 31426、 31451、 31456、 31457和31468?？梢韵炔捎脽晒鈽擞浀姆椒ㄨb別，先采用來自兔的血清型特異的一抗孵育，然后采用Rhodamine Red-X標記的羊抗兔IgG(二抗)進行孵育，正常結果為可見紅色的鏈球狀熒光。
(2) 培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基為含10%脫纖維羊血的普通瓊脂培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基PN96含胰蛋白胨、氨基酸、葡萄糖、維生素、過氧化氫酶及多種無機鹽離子。以上培養(yǎng)基可以購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。
(3) 肺炎球菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)啟開(l、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、18C、 19A、 19F和23F)血清型肺炎鏈球菌的凍干菌種，分別接種于10%脫纖維羊血普通瓊脂培養(yǎng)基，在C02環(huán)境中37t:培養(yǎng)后，將固體培養(yǎng)物(中國藥品生物制品檢定所109培養(yǎng)基)接種兩代液體培養(yǎng)基(中國藥品生物制品檢定所N96培養(yǎng)基)靜止培養(yǎng)，染色鏡檢為革蘭"陽性"雙球菌。在同一菌株內，由肺炎球菌所表達的莢膜多糖的量也不一樣，大多數(shù)肺炎球菌分離物能在至少兩種形式之間發(fā)生表型變化，這兩種形式可以通過菌落的不透明性進行區(qū)分，不透明型(0)菌落與相同菌株的透明(T)變體在所合成的莢膜的量方面不同，(0)型的菌落通常能產生大量的CPS。選擇莢膜光滑透明的(0)型的菌落進行生化反應后，進行血清凝集。經血清凝集實驗后，種子批菌種進行固體培養(yǎng)基傳代并進行檢定。判斷合格后，接種于改良的綜合培養(yǎng)基上。
(4) 按接種量約108CFU/ml培養(yǎng)基計，將菌液接種于含45L液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內于37。C進行攪拌培養(yǎng)，自培養(yǎng)2h后起每隔lh取樣一次，測定菌液濃度，用50%葡萄糖溶液調節(jié)糖濃度，以7.5mol/L NaOH調節(jié)pH至7.5。間歇通入壓縮空氣7 9h終止培養(yǎng)，當細菌培養(yǎng)到0D大于等于1.5時，停止繼續(xù)培養(yǎng)，用甲醛滅菌，離心，去除菌體，收集上清。菌液濃度測定采用分光光度計在600nm波長下測OD值。
實施例2:提純肺炎球菌莢膜多糖及其質量鑒定1.肺炎球菌莢膜多糖的純化(1)滅菌后的菌液用離心機進行離心去除菌體，得到原液-粗聚多糖，離心分離出來的菌體用甲醛殺菌。(2)得到原液聚集多糖粗液后，加入十六烷基三甲
基溴化銨進行沉淀復合多糖工作，并進行沉淀離心聚集多糖。(3)完成沉淀離心收集復合多糖后，進行氯化鈣解離純化。隨后，加入濃度為95%的酒精進行去核酸。之后，繼續(xù)加入濃度為95%酒精進行沉淀多糖。(4)完成沉淀收多糖后，加入苯酚進行酚棄去蛋白質，去除原液多糖抗原中多余的蛋白成分。(5)完成酚棄去蛋白后，利用高速離心機進行超速離心去除內毒素。之后，進行再用酒精進行沉淀多糖和多糖純化，完成精制多糖工序處理。(6)經過以上工序處理后，得到純化精制的多糖原液。到此時，多糖原液收取處理工作完成，只需再進行真空干燥去除部分水分和除菌過濾處理。
2.莢膜多糖質量鑒定
(1) 生化檢測分別用蒸餾水按6mg/ml稀釋精制多糖，0. 22mn濾膜過濾即為送檢樣品。蛋白含量用Lorry法測定，核酸含量用分光光度法測定，總氮用凱氏定氮法測定，磷含量用鉬酸銨法測定，o-乙酰基用堿性鹽酸羥胺-三氯化鐵法測定，糖醛酸含量用咔唑-乙醇溶液法測定，氨基己糖含量用二氨基苯甲醛顯色法測定，甲基戊糖含量用半胱氨酸顯色法測定，分子大小應用SDS-聚丙烯酰胺膠過濾。
(2) 鑒別實驗和血清學特異性實驗采用各型多糖的成對抗體結合ELISA夾心法鑒別各型多糖抗原。
(3) 毒性實驗:用5只體重約350g豚鼠，每只腹腔注入3. 45mg (2. 5ml)單價多糖，觀察7天不得引起明顯的癥狀和死亡；5只體重約20g小白鼠每只腹腔注入0.69mg (0.5ml)單價多糖，觀察7d不得引起明顯的癥狀和死亡為合格產品。
實施例3:載體蛋白(流感嗜血D蛋白、破傷風類毒素蛋白與白喉毒素無毒變異蛋白CRM加)的質量控制
采用己通過臨床實驗驗證的安全有效的流感嗜血D蛋白、破傷風類毒素蛋白與白喉毒素無毒變異蛋白CRMw作為我們結合疫苗的蛋白載體，參照現(xiàn)有國際公認的質量標準，對其特性和純度進行質量復核采用HPLC法測定流感嗜血D蛋白、破傷風類毒素蛋白與白喉毒素無毒變異蛋白CRM^的純度，純度在90%以上為合格；確保各蛋白的氨基酸序列正確無誤；確保不與白喉類毒素在同一車間生產；采用SDS-PAGE圖譜分析測定純化后的蛋白組成；脂多糖的含量小于8%為質量合格；載體蛋白的家兔熱原實驗必須合格。
實施例4:莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合。
在動物實驗中多種因素影響著結合疫苗的免疫原性，如蛋白載體的選擇、結合物中游離多糖的含量、結合前多糖分子的大小、結合疫苗的濃度以及結合疫苗中的糖蛋白比等因素。本發(fā)明依據(jù)肺炎球菌莢膜多糖結構及蛋白載體的特性，選擇適宜的蛋白載體和結合工藝匹配各型肺炎球菌的多糖，具體如下
一、莢膜多糖6A、 6B、 14.、 19A、 19F和23F型，采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法偶聯(lián)結合流感嗜血桿菌 D蛋白
(1) 分別取檢測合格10mg/ml的6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型肺炎鏈球菌莢膜多糖10ml。
(2) 對于6A、 6B加入用lml乙腈溶解的濃度為100mg/ml的CDAP， kiin后加入4ml濃度為0.2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血桿菌D蛋白，室溫下反應l小時，4。C再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A,及A28Q同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液作為結合疫苗備用。
(3) 對于14型莢膜多糖加入用0. 3ml乙腈溶解的濃度為100mg/ml CDAP，lmin后加入0. 3ml濃度為0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血桿菌D蛋白，室溫下反應l小時，4'C再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A鵬及A280同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液作為結合疫苗備用。
(4) 對于19A、 19F和23F型莢膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的濃度為100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml濃度為0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血桿菌D蛋白，室溫下反應l小時，4t:再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A娜及A28。同歩監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液作為結合疫苗備用。
二、 血清型l、 2及7F多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法偶聯(lián)結合破傷風類毒素蛋白
對于1、 2和7F型莢膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的濃度為100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml濃度為0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流破傷風類毒素蛋白，室溫下反應l小時，4。C再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A鵬及A28。同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液作為結合疫苗備用。
三、 莢膜多糖4、 5、 9N、 9V和18C型，采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法，偶聯(lián)結合白喉毒素無毒變異蛋白
對于4、 5、 9N、 9V和18C型莢膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的濃度為100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml濃度為0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g白喉毒素無毒變異蛋白，室溫下反應1小時，4。C再反應10 15小時，加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A鵬及A280同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液作為結合疫苗備用。
以上的氯化鈉溶液的濃度可以為％0. 09，以波長A鵬及A28。同步監(jiān)測的儀器
可以為分光光度計。
實施例5:免疫親和層析法純化偶聯(lián)物(莢膜多糖-流感嗜血桿菌D蛋白、莢膜
多糖-破傷風類毒素與莢膜多糖-白喉毒素無毒變異蛋白)單克隆抗體的制備
首先取莢膜多糖-流感嗜血桿菌D蛋白、莢膜多糖-破傷風類毒素和莢膜多糖-白喉毒素無毒變異蛋白作為抗原，免疫小鼠，而后取小鼠脾與骨髓瘤細胞進行融合，篩選融合細胞，進行抗體鑒定、評估，通過腹水生產，抗體純化來進行成品鑒定后備用。
瓊脂糖活化(1)取20ml的S印harose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的濃度為0. lmol/L、 pH值為9.0的NaHC03液洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。(2)在通風櫥內稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2mol/L NaOH，使pH保持在11左右，反應10min。在1 2min迅速調整pH值為8. 0 11. 0維持10min。 (3)將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的濃度為0. lmol/L、 pH值為9. 0的NaHC03溶液抽洗。
偶聯(lián)單克隆抗體
20ml S印harose 4B液體相當于一半的固相載體。(D事先將需要偶聯(lián)的抗體(莢膜多糖-流感嗜血桿菌D蛋白抗體、莢膜多糖一破傷風類毒素蛋白抗體和莢膜多糖-白喉毒素無毒變異蛋白抗體)分別200mg置于0. lmol/L pH 9.0 NaHC03液中透析數(shù)小時(一般偶聯(lián)量為10 30mg/g載體)。(2)將活化的瓊脂糖迅速倒入抗體液中(在1.5min內，從抽洗到偶聯(lián))，4"C緩慢攪拌12小時，使抗體與活化的
瓊月旨結合。
裝柱
(l)選柱；不宜過大， 一般以1.5X15cm的層析柱可裝偶聯(lián)抗體的瓊脂糖約30ml。 (2)裝柱將已與抗體偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以lml/min的速度流出。(3)洗柱以0. 2mol/LpH9. 0 NaHC03(含0. lmol/L NaCl)洗滌至洗出液的0D28。<0. 02為止。收集全部的洗脫液，測得的OD，值乘以洗脫液的總毫升數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計算偶聯(lián)率。
吸附與解吸附
(1)加入待純化的各型多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物3ml，濃度為1 2%，緩慢加入待純化的抗原，用濃度0.01mol/L、 pH值為7.4的PBS液洗脫，流速為lml/min，至洗出液0D28。<0. 02為止。(2)加濃度為0. lmol/L、 pH值為2. 4的甘氨酸-HC1緩沖液，流速lml/min，收集解吸附下來的成分，立即以lmol/L NaHC03中和，以免抗體變性。(3)以兩倍體積的7mol/L尿素洗滌，再用濃度為0. 01mol/L、 pH值為7.4的PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入濃度為 0.02% NaN3的于4t:保存。防止冷凍和干裂。
實施例6:莢膜多糖結合疫苗鑒定
(1) 蒽酮法測定多糖含量。
糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或 羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與 糖的含量成正比。糖類與蒽酮反應生成的有色物質在可見光區(qū)的吸收峰為 630nm，在此波長下進行比色。通過制作標準曲線計算可溶性糖的含量.
(2) Lowry法測定蛋白含量。
蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質-銅復合物，此復合物 使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在吸收峰波長下進行比色，利用光吸 收值與蛋白質濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質的濃度。
(3) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定多糖結合疫苗分子量。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質氫鍵和疏 水鍵，并按比例地結合到這些蛋白質分子上形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物， 每克蛋白質一般結合1.4g SDS。 SDS與蛋白質的定比結合使蛋白質-SDS復合物 均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過蛋白質原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質間 原有的電荷差異。在水溶液中，蛋白質-SDS復合物具有相同的構象，近似雪茄 煙形的長橢園棒(短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化)，克服 了蛋白質間原有的形狀差異。這樣蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受 原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質分子量的函數(shù)。用本法測定蛋白質的分子 量只需根據(jù)待測蛋白質在已知分子量的標準蛋白質的相對位置，就能得知分子 量。本實驗采用SDS-不連續(xù)垂直電泳法l)凝膠脫盡底色后，色帶清晰顯出。 按實樣描下或攝下電泳圖譜；2)根據(jù)各蛋白遷移距離和染料遷移距離的比值，求 出各蛋白的相對遷移率(mr)，然后作出lgMr-mr關系圖，從圖中找出未知蛋白相 對遷移率對應的分子量。實施例7: 14種多糖-蛋白結合物原液的質量控制
多糖與載體蛋白結合工藝反應步驟較多，條件要求高。為了確保多糖-蛋白 結合物的穩(wěn)定性、安全性和批間一致性，建立以下相應的質量控制方法。由于結 合反應可能影響多糖的結構，多糖-蛋白結合后(單價結合物未混合前)進行多糖 的鑒別實驗。此外，對純化后的多糖-蛋白結合物進行以下檢測①采用適宜的 檢測方法，確保多糖-蛋白結合物原液經過純化后，多糖-蛋白結合反應中所使用 的試劑(CDAP或三乙胺等化學試劑)已被清除；②分別測定結合物中結合多糖和 結合蛋白的含量，通過結合物中多糖/蛋白比作為判斷結合反應的一個間接標志； ③活化終止后，確保結合物中多糖或載體蛋白不再殘留有活化后未結合的功能基 團；④采用凝膠過濾的方法將結合多糖和游離多糖分離，確保未被結合的游離多 糖含量不超過5%;⑤采用質譜(HPLC)的方法測定多糖-蛋白結合物中結合蛋白和 未結合蛋白的含量；確保未被結合的載體蛋白含量不超過5%;⑥采用SDS-聚丙 烯酰胺凝膠垂直電泳對各批次多糖結合疫苗原液進行相對分子大小的測定;⑦按 現(xiàn)行版《中國藥典》的要求，對多糖結合疫苗原液進行熱原實驗及內毒素含量測 定，確保疫苗的毒性實驗合格。
實施例8:單種多糖結合抗原在小鼠模型中的初期模擬實驗
14種多糖結合抗原分別免疫接種幼鼠后，對產生的抗體成分、濃度、親和 力、吞噬能力進行比較，從而確定合適的免疫劑量。
(1) 多糖結合疫苗免疫原性實驗
12-14g雌性3周齡BALB/c.幼鼠，隨機分為兩組，每組20只，分別腹腔注 射不同糖蛋白比結合疫苗，于第0周和第4周程序注射2次，每只幼鼠0. 5ml 含(lug偶聯(lián)物)。每個實驗組分別于第一針注射前和第二針注射后的14天取10 只幼鼠采血，分離血清，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> (2) 小鼠血清各型莢膜多糖特異性
IgG抗體檢測采用間接ELISA法，將各型肺炎多糖溶解于0. 05mol/L pH 9. 6. 的碳酸鹽緩沖溶液中，以20ug/ml濃度包被酶標板，2y。的BSA液封閉。實驗時將 待檢血清20倍稀釋后加入酶標板，置37'C反應40min，常規(guī)洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗。用四氨基聯(lián)苯胺顯色，酶標儀450nra波長處讀取A.值。
(3)體液免疫應答的評價
免疫接種之后進行體液免疫應答的評價，從而定量血清抗PPS免疫球蛋白 的濃度。例如在PPS4評價實驗中，用間接ELISA法檢測IgG濃度。收集各實 驗組血清中anti-PPS抗體的濃度，計算95%的置信區(qū)間內的算術平均及標準差。 對各免疫接種組，在免疫前抗體水平和免疫接種后抗體水平(將數(shù)據(jù)轉換對數(shù)形 式后)進行比對，以消除小鼠個體間的差異。用標準t檢驗比較成對的不同免疫 接種組間的差異，微軟Excel表格軟件用來編輯數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析。
為了檢測并評價免疫接種后脾臟中誘導產生的抗體分泌細胞，在第1劑免 疫接種前和第2劑免疫接種半月后的兩個時間點收獲脾臟。分離淋巴細胞，用 ELISpot分析評價疫苗。
實施例9:混合多糖結合抗原在小鼠模型中的初期模擬實驗
14種多糖結合疫苗等量混合，每一針劑含混合后的多糖結合疫苗2ug。免疫 接種小鼠后，對產生的抗體成分、濃度、親和力和調理吞噬能力進行分析。從而 確定效果最佳的肺炎球菌結合疫苗組分。高效14價肺炎球菌多糖結合疫苗在小 鼠實驗中免疫效果優(yōu)于惠氏的7價多糖結合疫苗及成都的23價多糖疫苗，如見 圖6、圖7和圖8所示。
疫苗的配方研究對疫苗的配方進行研究，確保疫苗中添加的穩(wěn)定劑成分、 緩沖液、佐劑等對疫苗在穩(wěn)定性、保存期、免疫原性和安全性方面的正面影響遠 遠大于負面影響。
藥理、毒理和生物分布進行肺炎球菌結合疫苗的藥理學實驗，包括疫苗 發(fā)生的作用原理、生物效價與劑量的關系、免疫程序和接種途徑與效果的關系等 實驗；建立一套適當?shù)膶嶒灱皺z測方法來評價疫苗，通過評價優(yōu)化免疫程序和接
種途徑。
實施例10:血清型為4型的莢膜多糖結合疫苗先將血清型為4型的肺炎球菌，單獨培養(yǎng)擴增；提純其莢膜上的多糖，4 型肺炎球菌滅活后離心收集上清，經超濾濃縮，加入適量預冷乙醇(70%)，離心 收集，粗制多糖；粗糖以適宜的濃度溶于乙酸鈉溶液中，然后按l: 2比例以冷
酚混勻，離心去除蛋白，反復酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析后 液體等量加2mol/L氯化鈣溶液，加入適量乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清， 補加乙醇(終濃度80%攪拌)，離心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥 后即為精制多糖，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 采用國外已通過臨床實驗驗證的安全有效的白喉毒素無毒變異蛋白 (CRM197)，參照國外相應的質量標準，對其特性和純度進行質量復核；取檢測合 格的4型肺炎鏈球菌莢膜多糖(10mg/ml， 10ml)，采用CDAP(l-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼)和三乙胺活化法結合載體蛋白 (白喉菌素無毒變異蛋白 CRM197)。 首先加入用lml乙腈溶解的100mg/ml CDAP， lmin后加入4ml 0. 2mol/L的三乙 胺活化，2.5min后加入5g載體蛋白，室溫下反應1小時，4'C再反應12小時， 加入1. 5ml 0. 5mol/L，用pH7. 5 0. 75mol/L HEPES溶解的乙醇胺終止反應，再 經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A娜及A28Q同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗 脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液即為結合疫苗。
血清型4莢膜多糖結合疫苗小鼠模型評價
① 小鼠及免疫接種10-11 weeks雌性BALB/c小鼠(廣東省實驗動物中心)， 皮下接種lug PPS4、 PPS4-CRM^(溶解在200ul無菌無內毒素的PBS中)。28天后 同樣的抗原進行第二次免疫接種，二次接種14天后心臟穿刺取血。
② 間接ELISA測定anti-PPS4抗體濃度對PPS4-IgM及PPS4-IgG特異的 間接ELISA法用來測定免疫血清anti-PPS4抗體濃度。純化的anti-PPS4單克隆 抗體IgM9.2和IgG44.2是分析檢測中的標準對照物。在酶標板的實驗孔中，每 孔加入馳1 10ug/ml的純化PPS4(溶解在0. lmol/L pH 9. 6 NaHC(V溶液中)包 被，用含1% BSA和0. 1%疊氮鈉的'200ul PBS室溫孵育lh封閉。用含0. 1% Tween-20 的PBS洗板。實驗孔加入適宜稀釋a00-1000倍)的100ul樣品，利用標準品做 標準曲線。洗板后加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠二抗，37。C孵育lh。最后洗板， 用Sigma-104磷酸酶底物顯色，酶標儀上405nm波長讀取吸光值。通過標準曲線函數(shù)計算抗體濃度。結果顯示偶聯(lián)有蛋白載體的PPS4-CRMiy7免疫產生的抗體是 PPS4免疫的1000倍左右，見圖4及圖5所所示的IgG部分。
③ IgG純化二次免疫14天后的血清樣品，用PPS4-CRM，免疫接種的 PPS4-IgG抗體濃度約為77. 3±26. 9ug/ml。用lml G蛋白HiTrap親和色譜柱純 化血清IgG。隨后G蛋白柱洗脫，收集含IgG的部分，YM10膜過濾富集。富集的 IgG用PBS溶解。 .
④ 調理吞噬實驗流式細胞術被用來分析工gG的調理吞噬情況，由于標記 有異硫氰酸熒光素的肺炎球菌會發(fā)生熒光淬滅，實驗中細菌表面用熒光 Alexa488標記。準備高度莢膜包被的血清型4肺炎球菌，使其處在細菌生長第 三期即平衡期。細菌表面用EZ-LinkSulfoNHS-LC-Biotin生物素?；?，并用PBS 洗三遍。生物素?；姆窝浊蚓?(TC孵育lh滅活，洗一次，與熒光素Alexa488 孵育，洗一次后，用含有鈣離子、鎂離子、1% BSA的HBSS重懸，-2(TC冷凍儲 存。熒光素Alexa488在加入4mg/ml臺盼藍的情況下很容易就終止。標記的具莢 膜完整性及抗原性的PPS4與PPS4-IgG 44. 2或PPS4-IgM 9. 2孵育，結合帶有藻 紅蛋白的適當二抗，上流式細胞儀檢測，或者玫瑰紅標記熒光顯微鏡上觀察。標 記有熒光素Alexa488的細菌，用Nikon-E600熒光顯微鏡被來顯影確認 anti-PPS4抗體的結合，或者通過雙色熒光流式細胞術來確認，并證實細菌在熱 滅活后保持莢膜抗原性。 '
小鼠巨噬細胞系RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(來自 ATCC)，培養(yǎng)三天后傳代使用。細胞在吞噬實驗使用前標記7-氨基放線菌素D進 行活力評定，活力在90%以上為合格。用5ul熒光素Alexa488調理標記的細菌， 和未標記的細菌與20ul來自免疫小鼠的純化IgG或20ul純化的小鼠PPS4-IgG 44.2單克隆抗體結合做內部對照，加入含1% BSA的HBSS至終體積50ul，在兩 個測試中PPS4-IgG終濃度為0.25 2.0ug/ml。混合物在水浴搖床中37。C孵育 55min。混合物中加入RAW264. 7細胞(50ul，細胞密度5X 107ml)37。C繼續(xù)孵育 30min。然后在4。C細胞用冷的含1% BSA的HBSS洗兩次，0. 5ml PBS重懸。每個 測試加入等體積的8mg/ml的臺盼藍，混合孵育15s，立即上流式細胞儀檢測。 結果顯示多糖結合疫苗接種后產生的抗體活性滴度，是多糖疫苗的10-100倍。對于另外13種血清型(1、 2、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)的肺炎球菌的莢膜多糖結合疫苗制作和效果檢測如實施例10所述的
實施方案基本一致。
權利要求
1、高效14價肺炎球菌結合疫苗，其特征在于是以分離提純14種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合后等量混合而成；所述的14種血清型肺炎球菌的血清型為1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F；載體蛋白選用白喉菌素無毒變異蛋白CRM197、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白。
2、 如權利要求l所示的，高效14價肺炎球菌結合疫苗，其特征在于所 述的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合是用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三 乙胺活化，通過異脲鍵連接結合。
3、 如權利要求2所示的，高效14價肺炎球菌結合疫苗，其特征在于所 述的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合的具體步驟是在10ml濃度為10mg/ml的 14種血清型肺炎球菌的莢膜多糖中分別加入用lml乙腈溶解的濃度為100mg/ml l-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼，lmin后加入4ml濃度為0. 2mol/L的三乙胺 活化，2. 5min后加入5g載體蛋白，室溫下反應1小時，4匸再反應10 15小時， 加入乙醇胺終止反應，再經S印harose CL-4B層析介質純化，以波長A卿及A28。 同步監(jiān)測，氯化鈉溶液洗脫，收集兩波長重疊峰處的洗脫液即為結合疫苗。
4、 如權利要求2所示的，高效14價肺炎球菌結合疫苗，其特征在于所 述的血清型6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型分離提純的莢膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通過異脲鍵偶聯(lián)流感嗜血桿菌D蛋白。
5、 如權利要求2所示的，高效14價肺炎球菌結合疫'苗，其特征在于所 述的血清型1、 2及7F型分離提純的莢膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通過異脲鍵偶聯(lián)破傷風類毒素蛋白。
6、如權利要求2所示的，高效14價肺炎球菌結合疫苗，其特征在于所述的血清型4、 5、 9N、 9V和18C型分離提純的莢膜多糖釆用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通過異脲鍵偶聯(lián)白喉毒素無毒變異蛋白。
全文摘要
高效14價肺炎球菌結合疫苗，是以14種血清型肺炎球菌提取的莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)結合而成；所述的14種血清型肺炎球菌的血清型為1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F；載體蛋白為白喉菌素無毒變異蛋白CRM₁₉₇、破傷風毒素蛋白和流感嗜血桿菌D蛋白。與現(xiàn)有的肺炎球菌結合疫苗相比，本發(fā)明的優(yōu)點是(1)血清型分別為(1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F)十四種肺炎球菌，交叉保護率達90％以上；(2)對易受肺炎困擾的老年人能產生有效保護，并且適合2歲以下兒童。
文檔編號A61K47/42GK101590224SQ200910040659
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權日2009年6月30日
發(fā)明者勇 胡 申請人:廣州精達醫(yī)學科技有限公司