專利名稱：微小rna在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微小RNA及其應用領域，具體涉及微小RNA-15a (miR-15a)和微小 RNA-16-1 (miR-16-l)在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用。
背景技術：
miRNA是基因表達和蛋白翻譯過程中的調節(jié)分子，在腫瘤的發(fā)生過程起到調控的樞紐 作用。某些miRNA可能是潛在的癌基因或者抑癌基因，通過尋找具有癌基因和抑癌基因性 質的imRNA，不僅可為腫瘤的診斷也能為腫瘤的生物治療提供新的耙標。miRNA相關的腫瘤基因治療包括敲除或敲減癌基因性miRNA，引入抑癌基因性miRNA 兩方面。 一方面引入與具有癌基因特性miRNA互補的合成反義寡核苷酸(Anti-miRNA Antisense Oligonucleotides, AMOs)，可有效的滅活腫瘤中的miRNA，延緩其生長(WeierJ, Hunziker J, Hall J. Anti2miRNA oligonucleotides (AMOs) : ammunition to target miRNAs implicated in human disease[J]. Gene Ther, 2006, 13 (6) : 496-502.)。使用與膽固醇耦聯(lián)的 AMOs注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miR-16, miR-122， miR-192和miR-194的活性 (Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R,et al. Silencing of microRNAs in vivo with"antagomirs" [J] .Nature, 2005 ， 438 (7068) :685-689.)，因而可能成為一種有希望的治療藥物。臨床上， 可以通過經常的或者持續(xù)的2'-0-甲基化或者鎖定核酸(LNA)等修飾的反義寡核苷酸給藥 使rmRNA失活。這些修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定，比其他治療手段毒性更低。另一方面，過 表達那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNA，如let-7家族也可以用于治療某些特定的腫瘤。 利用病毒或者脂質體的表達系統(tǒng)可以瞬時引入大量imRNA。這些技術可以保證在某些組織 特異性的啟動子控制之下，表達pre-miRNA及其兩側序列，并且刺激內源性的miRNA加工， 產生正確的miRNA，抑制特定基因表達。miR-15a和miR-16-l位于13q14.3， 一個30kb的缺失區(qū)域，65。/。的B-CLL這兩種基因表達 水平下調(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (39) :13944-13949.)。下調的原因之 一是大約40X的腫瘤標本發(fā)生13ql4區(qū)域缺失(Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 inchronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl cad Sci USA, 2002, 99 (24) : 15524-15529.)。 CLL
病例13ql4純合性或雜合性丟失是CLL最常見的染色體異常，50%的套細胞淋巴瘤，16~40% 的多發(fā)性骨髓瘤和60。/。的前列腺癌13ql4丟失。表明13ql4存在一個或多個腫瘤抑制基因， 與人類腫瘤的病原學發(fā)生有關。另一種可能的解釋是，部分白血病患者的miR-15a/nuR-16-l 前體下游7bp處發(fā)生C—T突變，這一突變影響miRNA的加工成熟(Calin GA, Ferracin M， Cimino A, et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J]. New Engl J Med， 2005, 353 (17) :1793-1801.)。 Amelia等(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005, 102 (39) :13944-13949.)發(fā)現(xiàn)，在CLL中，miR-15a和miR-16-l 的表達與Bcl-2的表達成負相關，兩種miRNA均可在轉錄后水平負性調節(jié)Bcl-2。 miR-15和 miR-16靠5'端的9個堿基序列相同，且這9個堿基與Bcl-2的3287-3279堿基互補。將 miR-15/miR-16轉染入MEG-01細胞，可以發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡，pro-caspase9和PARP的清除。
現(xiàn)有的研究表明mOl-15a/16-l可能與血液腫瘤的發(fā)生相關，但目前還沒有此兩種微小 RNA可用于腫瘤，尤其是淋巴瘤治療和/或預防的證據(jù)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是將miR-15a和imR-16-l用于制備預防或治療淋巴瘤的藥物。
為此，本發(fā)明提供了以下技術方案 一種微小RNA在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物
中的應用，所述藥物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前
體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
優(yōu)選地，所述微小RNA或其前體經過公知的改良性修飾。
作為上述應用的一種具體化，本發(fā)明提供一種治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，該 組合物包括有效量的微小RNA和藥學上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，所述微小RNA為 微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中 兩種以上的混合物。
作為上述組合物的一種優(yōu)選還包括能夠誘導腫瘤凋亡的化療藥物。所述的化療藥物 更優(yōu)選能夠誘導淋巴瘤細胞凋亡的藥物如阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素、甲氨 喋呤、三氧化二砷或它們中兩種以上的混合物等。
所述微小RNA或其前體可通過化學合成得到，為增強其穩(wěn)定性、生物利用度、組織靶 向性等藥學特征，可對其進行公知的改良性修飾，如硫代修飾或甲氧修飾等；或者通過構 建真核表達載體得到，也即藥物的活性成分中包括含有上述微小RNA序列的表達載體，該載體在體內表達后起到相應的藥效作用。所述真核表達載體可為質粒載體或病毒載體，以 及其它可通過本領域公知手段獲得的載體形式。
優(yōu)選地，所述真核表達載體為質粒載體或病毒載體。
本發(fā)明所述的藥物組合物適合用于預防和/或淋巴瘤，尤其Burkitt淋巴瘤的治療。 本發(fā)明的基本原理本發(fā)明首先化學合成miR-15a和miR-16-l寡核苷酸，檢測其對 Raji細胞有無凋亡誘導作用?；瘜W合成的寡核苷酸片段小，容易轉染入細胞。為研究成熟 的miR-15a/16-l與其前體對Raji細胞的影響有無功能上的差異性。本發(fā)明還構建了miR-15a 前體真核表達載體。通過將體外擴增合成的imR-15a前體序列構建于pGCSIL-GFP真核表 達載體，轉染細胞后，在U6啟動子的作用下轉錄為"莖環(huán)"結構的pre-miR-15a，通過細胞 內自身的RNA聚合酶III D1Cer的作用下剪接加工成為成熟的nnR-15a，從而發(fā)揮對靶基因 的調控作用。
本發(fā)明采用熒光定量PCR法檢測轉染后各組細胞內成熟miR-15a的表達量，實驗證明 細胞內miR-15a的表達水平，在轉染表達pre-miR-15a重組質粒后顯著增高，細胞內Bcl-2 蛋白的表達水平顯著下降，而各組Bcl-2mRNA的表達水平未見顯著性差異，可見imR-15a 是在轉錄后水平對Bcl-2進行調控，即抑制Bcl-2mRNA翻譯，從而下調Bcl-2蛋白的表達， 而不是直接降解Bcl-2 mRNA;進而采用臺盼藍拒染法和CCK8法均檢測到miR-15a組、 miR-16-l組及pre-miR-15a組細胞48h和72h增殖活性顯著下降，Hoechst染色從形態(tài)學上 可見miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a處理組有明顯的凋亡小體；FCM結果也顯示該組 的細胞凋亡率要高于其他組，即miR-15a和miR-16-l促進了 Raji細胞的凋亡。結果表明， miR-15a和miR-16-l可通過抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，促進Raji細胞凋亡，降低細胞 的增殖活性，抑制細胞的生長，可用于制備相關的預防或治療腫瘤的藥物。
許多化療藥物均是通過誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡而產生抗癌效應的。Bcl-2家族是細胞凋 亡的重要調控基因，在細胞凋亡的過程中處于調控機制的終末部分，該基因家族在維持細 胞生理分化、發(fā)育和細胞數(shù)量的動態(tài)平衡中具有重要作用，其表達狀態(tài)在一定程度上影響 著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥性的產生。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調控細胞凋亡 的基因家族，Bcl-2是Bcl-2家族中研究最廣泛深入的成員之一，能夠抑制p53對基因損傷反 應而誘導的凋亡，其過表達可導致細胞耐受不同的藥物。在Bcl-2過表達的細胞中藥物仍能 進入細胞內誘導細胞損傷，但這種損傷不能有效地轉換成凋亡信號,以致腫瘤細胞的生理性 凋亡受抑，增加了腫瘤細胞的生存時間，結果在化療期間表達BcI-2的腫瘤細胞仍能以較快 的速率重新生長。Bd-2的過表達在白血病細胞的凋亡中起重要作用，化療藥物本身抗凋亡的活性主要依賴于Bcl-2家族蛋白的表達。Bcl-2蛋白過度表達還可明顯降低腫瘤細胞對阿糖 胞苷(Ara-C)、甲氨喋呤及環(huán)磷酰胺等多種化療藥物的敏感性。Ara-C是DNA多聚酶抑制 齊U，通過對DNA多聚酶的抑制，而影響DNA的復制。Ara-C是治療急性白血病首選且非常
有效的化療藥物，是核苷類抗代謝藥物的典范，其殺滅白血病細胞的能力與其誘導腫瘤細 胞的凋亡有關。
在本發(fā)明中，我們以轉染隨機序列(或陰性對照質粒)的細胞作為參照物，比較在不 同濃度的Ara-C作用下，轉染miR-15a/16-l寡核苷酸(或表達pre-miR-15a重組質粒)的 Raji細胞與對照細胞之間細胞活力的差異。結果發(fā)現(xiàn)，轉染miR-15a/16-l (或表達 pre-miR-15a重組質粒)的Raji細胞，在不同濃度Ara-C (0 80pg/ml)作用下，細胞活力 的抑制明顯強于對照細胞，miR-15a/16-l+Ara-C組的IC50值明顯降低。CCK8法檢測顯示 miR-15a/16-1 (或表達pre-miR-15a重組質粒)與Ara-C聯(lián)用組的細胞增殖活力要遠遠低于 兩者分別單用的組別(PO.05) 。 Hoechst染色可見到經轉染miR-15a/16-l (或表達 pre-miR-15a重組質粒)的Raji細胞在使用Ara-C后出現(xiàn)大量凋亡小體。FCM檢測細胞凋 亡率結果顯示miR-15a/16-l+Ara-C組(或pre-miR-15a+Ara-C組)的細胞凋亡率明顯增高， 較單用Ara-C或隨機序列+Ara-C組(或陰性對照質粒+Ara-C組)的細胞凋亡率有顯著性差 異(PO.05)。提示miR-15a/16-l可以通過調控Bcl-2的表達，而改變Raji細胞對Ara-C 的敏感性。由此，我們有足夠的理由相信miR-15a/16-l或其前體可與能夠誘導腫瘤凋亡的 化療藥物(例如Am-C)組成一種藥物組合物，用于更好預防或治療相關的腫瘤病癥。
本發(fā)明具有如下的有益效果首先是為預防或治療淋巴瘤提供了新的可選途徑，通過 大量的實驗證明了部分微小RNA應用于制備預防或治療淋巴瘤的藥物是切實可行的；其次 是證明了部分微小RNA可用作已知化療藥物的輔助性成分，或與己知的化療藥物聯(lián)用，能 在抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡方面發(fā)揮更好的療效。


圖l轉染24h后熒光顯微鏡下圖(x100) A，B均為陰性對照質粒組。
圖2轉染miR-15a和miR-16-寡核苷酸RT-PCR測得Raji細胞的Bcl-2 mRNA表達水平；
M: marker, 1:空白對照組，2:隨機序列組，3: miR-15a組，4: miR-16-l組。
圖3轉染表達pre-miR-15a重組質粒RT-PCR測得Raji細胞的Bcl-2 mRNA表達水平；
M: marker, 1:空白對照組，2:陰性對照質粒組，3: pre-miR-15a組。
圖4轉染miR-15a/16-l 48h流式細胞儀檢測Raji細胞中Bcl-2蛋白的表達；
A:空白對照組，B:隨機序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組。圖5轉染表達pre-miR-15a重組質粒48h流式細胞儀檢測Raji細胞中BcI-2蛋白的表達；
A:空白對照組,B:陰性對照質粒組，C: pre-miR-15a組。
圖6臺盼藍拒染法檢測miR-15a和miR-16-l對Raji細胞的生長抑制作用；
a:轉染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸 b:轉染表達pre-miR-15a重組質粒
*與空白對照組和隨機序列組(或空白對照組和陰性對照質粒組)相比，P < 0.05。
圖7轉染miR-15a和miR-16-l作用于Raji細胞48h的形態(tài)學改變(Hoechst熒光染色
x400);
A空白對照組；B隨機序列組；CmiR-15a組；DmiR-16-l組。
圖8轉染表達pre-miR-15a重組質粒作用于Raji細胞48h的形態(tài)學改變(Hoechst熒光染色 x400);
A空白對照組；B陰性對照質粒組；Cpre-miR-15a組。
圖9流式細胞儀檢測miR-15a和miR-16-1作用于Raji細胞48h的凋亡圖(Annexin V/PI雙
染法)；
A空白對照組；B隨機序列組；CmiR-15a組；DmiR-16-l組。
圖10流式細胞儀檢測miR-15a和miR-16-l作用于Raji細胞48h的凋亡圖(PI染色法)；
A空白對照組；B陰性對照質粒組；Cpre-miR-15a組。
圖11 CCK8法檢測miRNA聯(lián)合Ara-C后Raji細胞活力的抑制；
a: miR-15a或miR-16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C; b:表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合Ara-C。
圖12 miR-15a和miR-16-l聯(lián)合Ara-C對Raji細胞的生長抑制作用；
*與其它組相比，P<0.05。
圖13表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合Ara-C對Raji細胞的生長抑制作用； *P<0.05 (與其它組相比)。
圖14轉染miR-15a/16-l并聯(lián)合Ara-C作用于Raji細胞48h的形態(tài)學改變(Hoechst熒光 染色 x400);
A:空白對照組，B:隨機序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組，E: Ara-C組，F(xiàn):隨機序 歹lJ+Ara-C組，G: miR-15a+Ara-C組，H: miR-16-l+Ara-C組。
圖15轉染表達pre-miR-15a重組質粒并聯(lián)合Ara-C作用于Raji細胞48h的形態(tài)學改變 (Hoechst熒光染色 x400); A:空白對照組，B:陰性對照質粒組，C: pre-miR-15a組，D: Ara-C組，E:陰性對照質 粒+Ara-C組，F(xiàn): pre-miR-15a+Ara-C組。圖16轉染miR-15a/16-l并聯(lián)合Ara-C 48h后Raji細胞凋亡圖。(流式細胞儀一AnnexinV/PI 雙染法檢測)；
A:空白對照組，B:隨機序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組，E: Ara-C組，F(xiàn):隨機 序列+Ara-C組，G: miR-15a+Ara-C組，H: miR-16-l+Ara-C組。
圖17轉染表達pre-miR-15a重組質粒并聯(lián)合Ara-C 48h后Raji細胞凋亡圖。(流式細胞儀 —PI染法檢測)；
A:空白對照組，B:陰性對照質粒組，C: pre-miR-15a組，D: Ara-C組，E:陰性對照 質粒+Ara-C組；F: pre-miR-15a組+Ara-C組。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明做進一步地詳細說明，但本發(fā)明的實現(xiàn)方式并不局限于此。 一、實驗方法
1. miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a (miR-15a前體)寡核苷酸的設計與合成
根據(jù)MiRBase (http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列， 獲取人miR-15a、 miR-16-l和pre-miR-15a的序列。采用BLAST軟件進行分析，確定隨機對照 序列，nuR-15a、 miR-16-l寡核苷酸是由上海生物工程技術服務有限公司合成的單鏈全硫代
修飾。序列如下所示
化學合成的三條RNA:
miR-15a: 5,-uagcagcacauaaugguuugug-3' (22bp)
miR-16-l: 5，-uagcagcacguaaauauuggcg-3' (22bp)
scrambled sequence: 5'-cauuaaugucggacaacucaau-3' (22bp)
pre-miR-15a (對應的基因序列) (83bp) 5，-ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttgtggattttgaaaaggtgcaggccatattgtgctgcctcaaaaatacaagg-3'
negative control sequence: (83bp)
5'-3gCttttCC3咖3ttCtCCg犯CgtgtC3CgttCtCttg犯3Cgtg3C3CgttCgg3g肌gggttctCCgMCgtgtC3Cgt-3'
2. 質粒構建
2.1獲得目的片段
(1)從"The miRNA Registry"數(shù)據(jù)庫(http:〃mk:rorna.sanger.ac.uk/)中獲得pre-miR-15a序 列，采用BLAST軟件進行分析，確定陰性對照序列。設計并合成pre-miR-15a序列的獲得 片段(pre墨miR-15 a-1: 5 ， -cgggt^gg|ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttg tggattttgaaaaggtgc-3 ，； pre-miR-15a-2: 5，-ccggaattccttgtatttttgaggcagcacaatatg gcctgcaccttttcaaaatccac-3，)， 并弓i入v4ge
8/、&o7 /酶切位點。(2)PCR擴增獲得目的片段反應體系為pre-miR-15a-l,2各5pL, ddH20 6單，10xbuffer2nL， MgCl20,5pL， DNTPs (2.5mM) 0.8|aL， pfti polymerase 0.2pL。反 應條件94。C30s; 94。C 30s; 55°C 30s; 72°C 30s; 72。C 2min， 20個循環(huán)。(3)酶切PCR 片段使用Jge//￡coR /進行酶切消化，酶切反應體系PCR產物(100ng/^iL)5nL, 10xbuffer 5pL， 100xBSA0.5nL， (10卵)lpL， / (10 U爾L) lpL, ddH20定容至50pL。
置于37。C， lh。 2.2重組質粒的構建
(1X4ge/和￡coi /酶切pGCSIL-GFP載體以使其線性化。酶切反應體系純化的DNA 質粒(1 lug/)Ltl) 2pL， 10xbuffer 5|iL, 100xBSA0.5(iL, ^ge/ (lOU/pL) 1^iL,fc(^/ (10 U/^L) lpL,ddH20定容至5(^L。置于37'C， lh。 (2)氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài) 細胞。從于37^培養(yǎng)16小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到含100mlLB的燒瓶中。 37。C劇烈振搖培養(yǎng)3 h后，轉到冰預冷的50 ml聚丙烯管中，冰上放置10mm。 4 。C， 4000rpm， 10min，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，10 ml冰預冷的CaC2 (O.lmol/L)重懸每份 沉淀，4。C,4000rpm， 10mm，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，CaCl2 (O.lmol/L)重懸每份沉淀。 -70°(3凍存。(3)連接。反應體系酶切回收的載體DNA (100ng/nl) lpL，退火的雙 鏈DNA (100 ng/|al) lpL， 10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液lpL, T4噬菌體DNA連接 酶lpL， ddH20定容至10pL。置于4'C 12h。 (4)轉化。無菌吸頭取感受態(tài)細胞懸液200pL 至無菌微量離心管，加入2^L連接液，混勻，置冰上30mm。 42'C溫浴90s,迅速冷卻2min。 加入800pL SOC培養(yǎng)基，37'C搖床溫浴45min。取150jiL轉移至含MgS04 (20 mmol / L) 和Amp抗性(100叫/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。37"培養(yǎng)16h。 2.3陽性克隆的PCR鑒定
利用載體上的序列作為引物進行PCR鑒定陽性克隆。引物序列為上游引物5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3，，下游引物5'- GTAATACGGTTATCCACGCG -3，。 PCR反應體系:上、下游引物各0.4^L， 10xbuffer2^iL， MgCL2 0單，DNTPs (2.5 mM) 0.8(xL， Taq polymerase 0.2(iL， Template l(xL， ddH20定容至20pL。 2.4測序
挑選陽性克隆PGCSIL-GFP-pre-miR-15a菌液送測序(美季公司進行ABI 3733型測序 儀進行測序分析)。 3.從大腸桿菌中提取質粒
使用商用試劑盒或公知常用的質粒提取法提取質粒。
94. 細胞培養(yǎng)
Raji細胞系購于上海細胞庫。將Raji細胞接種于含體積分數(shù)10。/。新生牛血清、100U/mL 青霉素禾P100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在含體積分數(shù)5%(:02的培養(yǎng)箱371:連續(xù)培養(yǎng)。
5. 實驗分組及細胞轉染 5.1實驗分組
實驗在研究miR-15a/16-l寡核苷酸誘導Raji細胞凋亡部分分4組空白對照組、隨機 序列組、miR-15a組和miR-16-l組；
在研究表達pre-imR-15a重組質粒誘導Raji細胞凋亡部分分3組空白對照組、陰性 對照質粒組、pre-miR-l5a組；
在研究rmR-15a/16-l寡核苷酸增強Ara-C誘導Raji細胞凋亡部分分8組空白對照組、 隨機序列組、miR-15a組、miR-16-1組、Ara-C組、隨機序列+Ara-C組、miR-15a + Ara-C 組和miR-16-l + Ara-C組；
在研究表達pre-miR-15a重組質粒增強Ara-C誘導Raji細胞凋亡部分分6組空白對 照組、陰性對照質粒組、pre-miR-15a組、Ara-C組、陰性對照質粒+ Ara-C組和pre-miR-15a + Ara-C組 5.2細胞轉染
(1) 根據(jù)分組,在轉染前一天，以4-8xl()S/mL的細胞密度接種到96孔培養(yǎng)板上；
(2) 溶液a的配制按每孔12.5pL無血清培養(yǎng)基+0.5^L Lipofectamine 2000進行；
(3) 溶液b的配制按每孔12.5pL無血清培養(yǎng)基+0.2pg質粒(或寡核苷酸)進行,配 好后室溫下放置5min;
(4) 將溶液a與溶液b混合，室溫下置20min;
(5) 與此同時，將96孔板中的細胞換用無血清培養(yǎng)基，終體積為125^L;
(6) 將溶液a與溶液b的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37'C， 5%
的C02中保溫5-6h;
(7) 6h后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37。C, 5%的032培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 轉染效率的檢測轉染24h后,在熒光顯微鏡下選10個200倍視野，每個視野中統(tǒng)計200
個細胞中帶綠色熒光的細胞數(shù)，計算熒光細胞的百分比。
6. 半定量RT-PCR檢測轉染細胞Bcl-2 mRNA表達水平
將轉染48h的各組細胞在無菌條件下進行離心收集。應用細胞總RNA抽提純化試劑盒和RT-PCR試劑盒測定Bcl-2 mRNA的水平。 6.1細胞總RNA的提取和純化
1) 收集離心細胞，去其上清，用PBS洗兩次后，將細胞轉移入1.5mL離心管中，每管 加Trizol試劑lmL，搖勻，室溫下置15min后，反復吹打裂細胞；
2) 將各管內消化好的細胞裂液吸到一DEPC處理過的1.5mLEP管中，加氯仿0.2mL (Trizol:氯仿約為5: 1)，輕搖15s，并在冰上孵育15min;
3) 12， 000rpm， 15min， 4°C，離心。然后取上清無色水相到DEPC處理過的EP管， 加0.5mL異丙醇，室溫下置10min;
4) 12， 000ipm， 10min， 4'C，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清；
5) 加入用DEPC水新配制的經預冷的75V。乙醇1.0mL，輕輕洗滌沉淀，12， OOOrpm， 5min， 4。C離心；
6) 去上清，時離心，用小Tip吸干液體；使沉淀自然干燥，DEPC處理水20-30pL加 入，混勻，55-60。C7乂浴10min溶總RNA;
7) 用紫外分光光度儀測總RNA純度和濃度，用瓊脂糖膠電泳鑒定RNA是否水， 鑒定后于-7(TC保存?zhèn)溆谩?br> 6.2細胞總RNA的鑒定
濃度分析和純度鑒定從提取的RNA中吸取lpL，以DEPC水稀釋至100juL，用紫外分 光光度儀分別測總RNA的濃度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。 6.3逆轉錄反應
取上述RNA樣品，將其稀釋成l嗎/jaL，在PCR管中加入下列試劑的混合物
RNA3pL (3)_ig)
Random Primer (lO^M)2|oL
dNTP Mixture (2,5岸)2^L
5xFirst- Strand Buffer化L
DTT (0.1M)l^L
RNase inhibitor (10U/)_iL)0.5^
M-MLV (200U)
RNase-free ddH20定容至50pL
在PCR儀上按照下列條件反應42。C溫浴50min,95。C加熱5min, 時離心，-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 6.4 PCR擴增
Bcl-2引物序列如下上游引物5'-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，下游引物5'-CT TCAGAGACAGCCAGGAG-3 ',產物長度212bp.內對照卩-actin弓|物序列:上游弓|物5'-TGTA TGCCTCTGGTCGTACC AC-3 ，,下游5 ， - AC AGAGTACTTGCGCTC AGGAG-3 ，,產物長度 592bp。
取上述產物cDNA先擴增內參P-actin，然后根據(jù)p-actin的結果，確定cDNA合成是否成 功，對合成成功的標本進行PCR反應，在擴增管中依次加入下列試劑
cDNA (模板) 2jiL
上游引物(lOpM) lpL
下游引物(10nM) 2pL
dNTP Mixture (2.5mM) 4pL
10xTaq buffer (含MgCl2) 5jiL
Taq酶(2.5U爾L) l(aL
ddH20 36^L 上述試劑混勻，按如下擴增條件PCR: 94°C變性lmin,55。C復性45s,72。C延伸lmin， 循環(huán)30次，72'C保溫5min。 PCR產物在3。/。的瓊脂糖凝膠上電泳觀察并照相，于Gel-DoclOOO 型紫外凝膠圖像分析儀上觀察、分析。
7.熒光定量PCR檢測法(Hairpin-it miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit)檢測
miR-15a的表達水平 7.1RNA提取(方法同前) 7. 2 RT反應合成cDNA
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的說明書進行操作，反應為 20pL體系。
5 xRT Buffer 5^L DTT (0.1M) 2.5pL dNTP (10mM) 0.75jaL Mg2+ (25mM) 3|_iL miR-RT primers (l,) 1.25|^L 脂asin (40U/nL) 0.25pL
12MMLV Reverse Transcriptase (200U/nL) 0.5|iL RNA Sample (0.2 ng to 200 ng total RNA) XpL Rnase Free H2O to 20pL 在逆轉錄反應之前須將除了逆轉錄外的各種試劑和逆轉錄rmx混勻，用手指輕彈裝試 劑的管子。反應條件為16。C30min， 42。C30min， 85°C10min。反應產物于-20。C保存。 7.3 Real-Time PCR檢測miR-15a的表達情況
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的說明書進行操作，反應為
20laL體系。
2xReal-time PCR Buffer 1 O^L
miR specific Primer set (5jxM) O,L
miRNA RT product 2pL
Taq DNA polymerase (5U/(iL) 0.2nL dd H20 To 20pL
反應條件為95。C預熱3min，如下反應進行40個循環(huán)95。C變性12s， 55。C復性25s,72T: 延伸25s。
8. 間接免疫熒光及流式細胞儀檢測Bcl-2蛋白表達情況
離心收集轉染后48h的各組細胞，用4%多聚甲醛室溫固定30min,PBS洗后加體積分數(shù) 30/oH2O2，室溫10min,PBS洗3次，每次5min,加10g/LTritonX-100,室溫10min,PBS洗后加血清 室溫封閉40min，甩去不洗，滴加鼠抗人Bcl-2抗體，4'C過夜，次日復溫30min, PBS洗,加入 2(^LCy3標記的羊抗鼠二抗孵育細胞，室溫避光反應30min,PBS洗3次，每次5min,PBS混勻 后上機，流式細胞儀(FCM)測定Bcl-2蛋白表達的陽性率。
9. 臺盼藍細胞計數(shù)法
將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述步驟進行轉染，分別于24，48和72h 收獲細胞,常規(guī)臺盼藍(0.5%)染色,用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)目,實驗重復三次.
10. CCK8法測細胞生長抑制率及IC50值 將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述步驟進行轉染，置于37'C、飽和
濕度、5。/。C02條件下常規(guī)培養(yǎng)24、 48和72h后，向每孔內加入30pL CCK8，再置于37。C孵 育4h。然后直接在聯(lián)檢測儀上450nm波長處測A柳值，以A45q間接反映細胞存活數(shù)量。 實驗重復3次，據(jù)此可推算miR-15a和miR-16-l轉染后各時間點對Raji細胞的抑制率。 按上述方法分組及轉染Raji細胞，分別與不同濃度的Ara-C (0、 5、 10、 20、 40、80嗎/ml)孵育，24h后CCK8法測各組A45o值，并計算以下參數(shù)
藥物濃度為N時的OD值-空白孔OD值
① 細胞活力 X100%
藥物濃度為0時的OD值-空白孔OD值
② 半數(shù)抑制濃度(IC50):采用概率單位法PROBIT (Probability umt)。
11. Hoechst染色試劑盒觀察凋亡細胞形態(tài)
收集經脂質體轉染48小時的細胞，離心收集細胞樣品于1.5ml離心管內，加入0.5ml 固定液，混勻，固定10分鐘。離心去固定液，PBS洗兩遍。最后一次離心后吸去大部分液 體保留約50)^1液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，晾干.均勻滴上0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色5分鐘,晾干。PBS洗兩遍。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片匕蓋十.-潔 凈蓋玻片，避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。
12. 流式細胞儀檢測細胞凋亡率
12.1 AnnexinV/PI雙染法
離心收集轉染后48h的各組細胞，PBS洗滌2次，離心去上清，195|iL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，加入Annexin V-FITC 5pL,避光孵育10min，離心去上清，190|iL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10pL碘化丙啶染色液，冰浴避光放置，隨即進行流式細胞 儀檢測，用MULTCYCLE軟件分析處理結果.
12.2 PI染色法
離心收集轉染后48h的各組細胞,PBS洗滌2次，離心去上清，用-2(TC預冷的體積分數(shù) 70。/。乙醇在4t:固定30min，然后棄去乙醇，力Q500nL PBS混勻細胞，然后加入碘化丙啶(PI)， 避光染色15min。置流式細胞儀測定各組細胞凋亡率，用MULTICYCLE軟件分析處理結果。
13. 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，多組間數(shù) 據(jù)比較，采用完全隨機區(qū)組設計的單因素方差分析，組間的比較選用可進行多個樣本均數(shù) 間每兩個均數(shù)比較的q檢驗或Bonferroni檢驗，IC50值計算采用Probit單位概率法。 二、 miR-15a和miR-16-l抑制Raji細胞生長 1、 pre-miR-15a重組質粒的成功構建
質粒測序結果如下GACCC，測序結果顯示所得重組質粒成功插入pre-miR-15a序列。
2、 細胞轉染效率
將轉染陰性對照質粒24h后的細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見到部分細胞呈現(xiàn) 綠色熒光(轉染質粒中含有編碼綠色熒光蛋白的基因)，在熒光顯微鏡下選10個200倍視野 每個視野中統(tǒng)計200個細胞中帶綠色熒光的細胞數(shù)，計算熒光細胞的百分比即轉染率，其值 為(39±2.4%)。后面的實驗均按該轉染效率下的脂質體與質粒比例進行轉染。圖l為轉染 24h后在倒置熒光顯微鏡下見到的圖片。
3、 熒光定量PCR法檢測miR-15a的表達水平
轉染表達pre-miR-15a重組質粒24h后，各組Gr值及摩爾數(shù)見表1。經統(tǒng)計學分析， pre-miR-15a組的rmR-15a &值及摩爾數(shù)較空白對照組和陰性對照質粒組明顯增加，差異有 統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表l轉染pre-miR-15a24h后Raji細胞中miR-15a的表達量i士 s ， n=3)
分組c丁值Moles (nmol)
空白對照組23.98±0.381.51e+001土0.64
陰性對照質粒組23.16±0.423.02e+001±0.38
pre-miR-15a組19.06±0.35^0.93e+002±0.49*
*與其他組相比，P<0.05
4、 RT-PCR檢測轉染后Bcl-2 mRNA表達水平
由Bcl-2擴增產物的凝膠電泳(圖2， 3)可見，內對照P-actin在各處理組均有表達,Bcl-2 擴增產物電泳區(qū)帶約在210bp位置，與設計引物的理論值一致。對電泳產物分析，計算Bcl-2 mRNA/(3-actin的光密度0D比值，反映各組相對豐度。轉染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸48h 后，各處理組Bcl-2表達的相對豐度依次為空白對照組0.985±0.006，隨機序列組 0.978±0.009， miR-15a組0.974士0.010， miR-16-l組0.989士0.003，各組間差異無顯著性 (P〉0.05)。轉染pre-miR-15a表達質粒48h后，各處理組Bcl-2表達的相對豐度依次為空 白對照組0.976±0.005,陰性對照質粒組0.985±0.007， pre-miR-15a組0.969士0.009，各組間亦無 顯著性差異(P〉0.05)。表明miR-15a和miR-16-l不降解Bcl-2mRNA。
5. 間接免疫熒光及流式細胞儀檢測Bcl-2蛋白表達情況(圖4,5)
圖4，5的結果顯示，Raji細胞經轉染miR-15a和miR-16-l (或pre-miR-15a表達質粒)48h后,Bcl-2蛋白的表達量均降低，與空白對照組和隨機序列組(或空白對照組和陰性對照質粒 組)比較,差異有顯著性(P<0.05);而空白對照組與隨機序列組(或空白對照組與陰性對 照質粒組)間差異無顯著性(P〉0.05)，各組Bcl-2蛋白表達量見表2， 3。 表2轉染miR-15a/16-l寡核苷酸48hBc-2 表3轉染表達pre-miR-15a重組質粒48h
蛋白表達量(iis， n=3) Bcl-2蛋白表達量(I±s， n=3)
分組/熒光陽性率 Bcl-2蛋白表達量(％) 空白對照組 95.8±0.6 隨機序列組 94.9±0.9 miR-15a組 65.6±1.1* miR-16-l組 63.8士1.3*
分組/熒光陽性率 Bcl-2蛋白表達量(。/。) 空白對照組 97.8±0.6 陰性對照質粒組 96.8±0.9 pre-miR-15a組 58.4±1.1*
*與其它組相比，PO.05 *與其它組相比，PO.05
6、 臺盼藍拒染法檢測miR-15a和miR-16-l對淋巴瘤細胞Raji的生長抑制作用 結果顯示,終濃度為0.6pmolZL的miR-15a和miR-16-l寡核苷酸(或pre-miR-15a表達質
粒)轉染Raji細胞后，24h作用效果不明顯，差異無顯著性(P>0.05) ,48h和72h可發(fā)揮 對細胞的生長抑制作用,且隨著作用吋間的增加,效果逐漸增強，48h作用效果明顯,有明顯的 時效關系(圖6)。
7、 CCK8法檢測miR-15a和miR-16-l對Raji細胞生長的影響
表4顯示轉染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸的Raji細胞增殖能力最差，其24h,48h 和72hOD值均明顯低于空白對照組和隨機序列組(P<0.05)，其中轉染24h后，miR-15a 組與隨機序列組之間經Bonferroni檢驗即顯示差異有顯著性,P岣.005， miR-16-l組與隨機序 列組之間差異亦有顯著性，P=0.014;表5顯示pre-miR-15a組細胞的增殖能力較空白對照 組和陰性對照質粒組弱，差異有顯著性(PO.05)，其中轉染24h后，pre-nnR-15a與陰性 對照質粒組之間經Bonferroni檢驗顯示差異有顯著性,P二0.004;說明miR-15a和miR-16-l 能夠抑制Raji細胞的生長與增殖，且24h,48h和72h均可發(fā)揮作用,隨作用時間的增加,效果 逐漸增強,72h作用效果最明顯,且有明顯的時效關系。
表4轉染miR-15a和miR-16-l后CCK8法檢測Raji細胞吸光度A值(7±、11=5)
分組_^_^_^_
空白對照組 1.209±0.029 1.419±0.018 1.599±0.015
隨機序列組 1.208±0.021 1.417±0.013 1.604±0.014
miR-15a組 1.115±0.015* 1.207士0.038* 1.242±0.035*
16miR陽16-l組 1.137±0.016* 1.211±0.040* 1.241±0.032
*與其他組相比^<0.05
表5轉染表達pre-miR-15a重組質粒后CCK8法檢測Raji細胞吸光度A值(± s, ir分組 24h48h72h
空白對照組 1.432±0.0161.541±0.0131.652±0.010
陰性對照質粒組 1.439±0.0131.543±0.0051.646±0.007
pre-miR-15a組 1.328±0.00741.298±0.005*1.288±0細*
*與其他組相比，PO.05 8、 Hoechst染色檢測細胞凋亡形態(tài)
圖7， 8為轉染后48hHoechst染色圖。miR-15a組和miR-16-l組及pre-miR-15a組均可 見明顯的凋亡細胞核膜完整，體積變小，核質固縮；而其他組未見明顯凋亡細胞。 9、流式細胞儀檢測細胞凋亡率
轉染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸后48h，流式細胞儀一AnnexinV/PI雙染法顯示 miR-15a組的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為9.74%和9.65%,， miR-16-1組的早期凋亡率 和晚期凋亡率分別為9.70%和9.34%，與空白對照組和隨機序列組比較差異有顯著性
(P<0.05)。而空白對照組和隨機序列組的凋亡率差異無顯著性(P>0.05)，見表6。轉染表 達pre-miR-15a重組質粒后48h,pre-miR-15a組的凋亡率為12.43%，顯著高于空白對照組 和陰性對照質粒組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照質粒組間差異無顯著性(P〉0.05)， 見表7?？梢?，miR-15a和miR-16-1可誘導Raji細胞的凋亡(圖9， 10)。
表6轉染miR-153和1^11-16-1后48h流式細胞儀一AnnexinV/PI雙染法
_檢測Raji細胞的凋亡(7± s ， n=5)_
分組/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白對照組 0.70±0.2 1.73±0.3
隨機序列組 2.18±0.4 1.54±0.3
miR-15a組 9.74±0.5* 9.65士0.4"^
miR-16-l組_9,70±0.8*_9.34士0.6*_
永與其它組比,P0.05 表7轉染表達pre-miR-15a重組質粒后48h流式細胞儀一PI染法
_檢測Raji細胞的凋亡(5土s， n=5)
分組/凋亡率 凋亡率/%空白對照組
陰性對照質粒組
pre-miR-15a組
1.26±0,34.69±0,612.43±1.2*
*與其它組相比，PO.05三、miR-15a和miR-16-l可增強Raji細胞對阿糖胞苷敏感性1.CCK8法檢測IC50值變化
1.1轉染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji細胞后Ara-C IC50值的變化
轉染miR-15a的Raji細胞在0、 5、 10、 20、 40、 80jng/ml 6種濃度的Ara-C作用24h后，
細胞活力分別為(97.15±5.87 % ) 、 ( 67.0±3.96% ) 、 ( 37.23±2,98% ) 、 ( 20.15±2.24% )、(0.85±0.02%)、 (0.01±0.01%),轉染miR-16-l的Raji細胞活力分別為(96.85±6.14% )、(66.38±4.53%)、 (37.77±3.61%)、 (20.85±3.01%)、 ( 1.69±0.75%)、 (0.31±0.06%)，明顯低
于相應Am-C濃度作用下，轉染隨機序列的Raji細胞活力分別為(99.54±6.23 % )、(73.00±4.09%)、 (51.06±3.52%)、 (26.46±2.96%)、 (4.62±1.38%)、 (1.92±0.96%),尸值均
<0.05，見圖lla。可見，轉染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji細胞后可使Ara-C的IC50值
明顯降低，各組IC50值見表8。
1.2 轉染表達pre-miR-15a重組質粒入Raji細胞后Ara-C IC50值的變化
轉染表達pre-miR-15a重組質粒的Raji細胞在0、 5、 10、 20、 40、 80|ug/ml 6種濃度的Ara-C作用24h后，細胞活力分別為(96.08±6.3% )、 (67.85±4.9%)、 (38.46±2.1%)、
(14.62±2.4%)、 (1.00±0.4%)、 (0.08±0.08%),明顯低于相應Ara-C濃度作用下，轉染陰性對照質粒的Raji細胞活力分別為(96.00±5.3 % ) 、 ( 72.00±4.8% ) 、 (51.38±4.4% )、
(26.00±3.8%)、 (8.00±2.1%)、 (2.23±1.6%),尸值均<0.05，見圖llb?？梢姡D染表達pre-miR-15a重組質粒入Raji細胞可使Ara-C的IC50值明顯降低，各組IC50值見表9。
表8轉染miR-15a/16-l寡核苷酸入
表9表達pre-miR-15a重組質粒入
Raji細胞Ara-C IC50值的變化Raji細胞Ara-C IC50值的變化組別IC50值(ug/mL)分組IC50值(ug/mL)
空白對照組15.43±1.21空白對照組15.37±0.69
隨機序列組14.92±1.08陰性對照質粒組15.14±0.79
miR-15a組10.41±0.96*pre-miR-15a組10.02士0.84'
miR-16-l組10.86±0.78*
*與其它組相比，P<0.05
*與其它組相比，P<0.052. 臺盼藍拒染法檢測細胞生長抑制情況
2.1 miR-15a/16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C后對Raji細胞的生長抑制作用
實驗結果顯示，終濃度為0.6pmol/L的miR-15a/16-l寡核苷酸轉染Raji細胞后，miR-15a+Ara-C組和miR-16-l+Ara-C組的細胞數(shù)較單用miR-15a組、單用miR-16-l組、單用Ara-C組及隨機序列+Ara-C組明顯降低，miR-15a/16-l寡核苷酸作用24h時開始發(fā)揮作用，且隨著作用時間的增加，其效果逐漸增強,72h作用效果明顯.(圖12)2.2表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合Ara-C后對Raji細胞的生長抑制作用
實驗結果顯示，表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合10嗎/ml的Ara-C后,Raji細胞的生長較其他組明顯受到抑制(P<0.05)，于24h開始發(fā)揮作用，且隨著作用時間的增加，其效果逐漸增強,72h作用效果明顯.(圖13)
3. CCK8法檢測細胞增殖情況
3.1 CCK8法檢測miR-15a/16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C對Raji細胞生長的影響
CCK8結果(表10)顯示Raji細胞在經miR-15a/16-l寡核苷酸和10嗎/mLAra-C聯(lián)合處理后，細胞增殖活性大大降低，并明顯低于其它組別(P<0.05);而Ara-C與隨機序列聯(lián)合作用導致的細胞增殖活力與單用Ara-C組相當，無顯著差異(P>0.05)。這說明轉染miR-15a或miR-16-l寡核苷酸可以增強Ara-C對Raji細胞生長的抑制作用。
表10 miR-15a和miR-16-l寡核苷酸聯(lián)合Am-C CCK8法檢測Raji細胞吸光度A值
(x ± s,n=5)
組別24h48h72h
空白對照組1.414±0.0121.459±0條1.532±0.010
隨機序列組1.405±0.0041.457±0細1.535±0.007
miR-15a組1.291±0.0111.238±0遍1.201±0.006
miR-16-l組1.302±0.0081.251±0.0221.200±0.007
Ara-C組1.200±0.0121.151±0.0121.097士0.010
隨機序列+Ara-C組1.199±0.0091.163±0.0101.098±0.009
miR-15a+Ara-C組1.014±0.020*0.844±0.012*0.631士0.01(f
miR-16-l+Ara-C組1.010士0.03(f0.851±0.014*0.639±0.010*
承其他組相比，P《.05。3.2 CCK8法檢測表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合Ara-C對Raji細胞生長的影響
CCK8結果(表ll)顯示轉染表達pre-miR-15a重組質粒并加用10嗎/mL Ara-C后
19的Raji細胞增殖能力最差，pre-miR-15a+Ara-C組的CCK8值要顯著低于空白對照組、陰性對照質粒組、pre-miR-15a組、Ara-C組、陰性對照質粒+Ara-C組(PO.05);而Ara-C聯(lián)用陰性對照質粒與單用Ara-C相比細胞增殖活性無明顯差別(P〉0.05)。這說明表達pre-nnR-15a重組質粒與化療藥物Ara-C聯(lián)用后可以增強Ara-C對Ra力細胞生長的抑制作用。表11表達pre-miR-15a重組質粒聯(lián)合Ara-C CCK8法檢測Raji細胞吸光度A值
(x ± i1, n=5)
組別24h48h72h
空白對照組1.292±0.3811.436士0.2961.546±0.159
陰性對照質粒組1.237±0.4261.396±0.3611.458±0.312
pre-miR-15a組1.189±0.5671.215±0.6231.314±0.432
Ara-C組1.098±0.1691.148±0.3981.159±0.231
陰性對照質粒+Ara-C組0.967±0.3591.103±0.5781.116±0.553
pre-miR-15a+Ara-C組0.775±0.216*0.718±0.648*0.619±0.156*
求與其他組相比，PO，05。4. Raji細胞凋亡的形態(tài)學改變
經轉染miR-15a/16-l寡核苷酸或表達pre-miR-15a重組質粒并聯(lián)合Ara-C組經Hoechst
染色后均可見大量凋亡細胞核膜完整，體積變小，核質固縮；而其他組未見或僅見少量凋亡細胞(圖14,15)。5.細胞凋亡率分析
5.1轉染miR-15a/16-l寡核苷酸及聯(lián)用Ara-C (流式細胞儀一AnnexinV/PI雙染法)
各組細胞凋亡率見表12。 miR-15a或miR-16-l寡核苷酸與Ara-C (10嗎/mL)聯(lián)用時的細胞凋亡率最高，與單用miR-15a或miR-16-l寡核苷酸、單用Ara-C、隨機序列聯(lián)用Ara-C組相比有顯著性差異(PO.05);而隨機序列+Ara-C組與單用Ara-C組之間、miR-15a與miR-16-l之間比較細胞凋亡率未見顯著性差異(P>0.05)。表明miR-15a/16-l寡核苷酸與Ara-C聯(lián)用可顯著增加細胞的凋亡率。(圖16)
表12轉染miR-15a/16-l及并聯(lián)合Ara-C后48h流式細胞儀雙染法檢測Raj湖胞凋亡率
(7 ± s ， n=5 )
組別/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白對照組 0.25±0.3 0.65±0.1
隨機序列組 0.96±0.1 2.26±0.2miR-15a組miR-16-l組Ara-C組
隨機序列+Ara-C組miR-15a+Ara-C組miR-16-l+Ara-C組
6.99逸44.73±0.510.88±0.314.39±0.520.93±0,6 :20.69±0.8 '
10.08±0.3
10.64±0.4
11.83±0.2
11.93±0,4
25,27±0.5*
23.13±0.7*
承與其他組相比,P0.055.2轉染表達pre-miR-15a重組質粒及聯(lián)用Ara-C (流式細胞儀一PI染法)
各組細胞凋亡率見表13。表達pre-miR-15a重組質粒與Ara-C (10嗎/mL)聯(lián)用的細胞凋亡率最高，與單用表達pre-rmR-15a重組質粒、單用陰性對照質粒、單用Am-C、陰性對照質粒聯(lián)用Ara-C相比有顯著性差異(PO.05);而單用Am-C與陰性對照質粒聯(lián)用Am-C之間細胞凋亡率未見顯著性差異(P>0.05)。表明表達pre-miR-15a重組質粒與Ara-C聯(lián)用可顯著增加細胞的凋亡率。(圖17)
表13轉染表達pre-miR-15a重組質粒及聯(lián)合Ara-C后48h流式細胞儀單染法檢測Raji細胞凋亡率(i±s, n=5)
組別/凋亡率
凋亡率/%
空白對照組1.93±0.1
陰性對照質粒組3.40±0.5
pre-miR-15a組12.24±1.0
Ara-C組20.87±0.5
陰性對照質粒+Ara-C組21.76±1.2
pre-miR-15a+Ara-C組32.56±1,4*
*與其它組相比，PO.05上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。<110><120><130〉〈160〉〈170><210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<221〉<222〉〈223〉<400〉
序列表
暨南大學
微小RNA在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用
090612
13
Patentln version 3. 31
22RNA
人工序列
micro腿(l).. (22)miR-15a序列1
U3gcagcac3 im肌gguuug ug 22
<210> 2
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
<220〉
<221〉 microRNA〈222〉 (1).. (22)〈223〉 microRNA 16-1序列〈400> 2
U3gc3gcacg im幼U3Uugg eg 22
<210> 3
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
〈220〉
<221> misc—feature〈222〉 (1).. (22)<223〉隨機序列〈400〉 3
cauuaauguc ggacaacuca au 22
<210〉 4
<211〉 83
〈212> 鵬
<213> Homo sapiens
<220>
<221〉 gene
<222> (1). . (83)
<223> pre-raiR-15a前體基因序列〈400〉 4
ccttggagta aagtagcagc acataatggt ttgtggattt tgaaaaggtg caggccatat 60
tgtgctgcct c肌aaat3ca 3gg 83
<210〉 5
<211〉 83
<212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221〉 gene<222〉 (1). . (83)
〈223〉根據(jù)pre-miR-15a前體基因序列設計的陰性對照序列<400〉 5
agcttttcca aaaattctcc gaacgtgtca cgttctcttg aaacgtgaca cgttcggaga 60
agggttctcc gaacgtgtca cgt 83
<210〉 6
<211> 62
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature<222> (1).. (62)
<223> pre-miR-15a前體基因的獲得片段1<400〉 6
cgggtaccgg tccttggagt aaagtagcag cacataatgg tttgtggatt ttgaaaaggt 60gc
<210〉 7<211〉 59<212〉 DNA<213>人工序列<220>
<221〉 misc—feature<222> (l)..卿
<223〉 pre-miR-15a前體基因的獲得片段2<400〉 7
ccggaattcc ttgtattttt gaggcagcac aatatggcct gcaccttttc aaaatccac 59
<210> 8
<211〉 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc—feature<222> (1)..(24)
<223>包含pre-miR-15a前體基因序列的重組質粒構建過程所用陽性克隆鑒定引物1<400〉 8
cctatttccc atgattcctt cata 24
〈210> 9
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature〈222〉 (1). . (20)
〈223〉包含pre-miR-15a前體基因序列的重組質粒構建過程所用陽性克隆鑒定引物2
<400〉9
gt犯tacggt tatccacgcg〈210〉10
<211>19
<212〉DNA
<213〉人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l).. (19)
<223>Bcl基因檢測引物1
<400〉10
gtggccttct ttgagttcg<210〉11
<211>19
<212〉DNA
<213>人工序列
<220〉
<221〉misc—feature
<222〉(l).. (19)
<223>Bel基因檢測引物2
<400>11
CttC3gag3C 3gCC3gg3g<210>12
〈211〉22
〈212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l)..咖
<223〉P-actin引物1
<400>12
tgtatgcctc tggtcgtacc ac〈210〉13
〈211〉22
20
19
19
22
24<212> DNA<213>人工序列〈220〉
<221> misc—feature
<222〉 (1)..咖
<223> P-actin引物2
<400〉 13
acagagtact tgcgctcagg ag
權利要求
1、微小RNA在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用，其特征在于所述藥物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
2、 根據(jù)權利要求l所述微小RNA在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用，其特征在 于所述微小RNA或其前體經過公知的改良性修飾。
3、 根據(jù)權利要求2所述微小RNA在制備治療和/或預防淋巴瘤藥物中的應用，其特征在 于所述微小RNA或其前體為單鏈或由該單鏈和該單鏈的互補鏈構成的雙鏈形式。
4、 一種治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于包括有效量的微小RNA和藥 學上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，所述微小RNA為微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小 RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
5、 根據(jù)權利要求4所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述藥物的 活性成分還包括能夠誘導腫瘤凋亡的化療藥物。
6、 根據(jù)權利要求5所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述化療藥 物為阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素、甲氨喋呤、三氧化二砷或它們中兩種以上的 混合物。
7、 根據(jù)權利要求6中任一項所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所 述微小RNA或其前體經過公知的改良性修飾。
8、 根據(jù)權利要求4-7中任一項所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所 述微小RNA或其前體通過化學合成得到；或者通過構建真核表達載體得到。
9、 根據(jù)權利要求S所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述真核表達載體為質粒載體或病毒載體。
10、 根據(jù)權利要求4-7中任一項所述治療和/或預防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述淋巴瘤為Burkitt淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及微小RNA在制備治療和/或預防腫瘤藥物領域的應用。具體是將微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物用于制備此類的藥物。本發(fā)明通過將上述寡核苷酸序列在淋巴瘤細胞中過表達，證明上述序列有抑制淋巴瘤細胞生長和促進其凋亡的作用，并進一步揭示它們與化療藥物如阿糖胞苷等的聯(lián)用可增強原有藥物的效力，從而確證了上述寡核苷酸序列在制備治療和/或預防腫瘤藥物領域的應用潛能。此類的藥物可以是單獨的包含上述任一種寡核苷酸序列或其混合物及藥用載體的組合物，或者是還包括化療藥物的聯(lián)用組合物。
文檔編號A61K31/7068GK101590243SQ20091004047
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權日2009年6月23日
發(fā)明者何冬梅, 琴 諶 申請人:暨南大學