專利名稱：一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體地涉及一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法。
背景技術：
腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品多糖(抗原)含量是確保疫苗有效性的基本條件之一。對于單獨結合物原液多糖含量，A群可通過測定磷含量獲得，(、￥、或胃135群可通過測定唾液酸含量獲得，而4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品，如A、C、Y、W135群結合疫苗成品中A、C、Y、W135群結合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故無法通過測唾液酸含量獲得C、Y、W135各群多糖含量。《火箭免疫電泳法定量檢測4價腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法學驗證》(林云等，發(fā)表于在國際生物制品學雜志2008年12月第31卷第6期)中介紹了一種檢測4價腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法，解決了測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技術問題，但該方法不適用于測定結合疫苗成品中各群多糖含量，因為實驗證明，結合疫苗中各群結合物的載體蛋白會對火箭免疫電泳產生影響，導致結果不能真實準確地反映多糖含量，故測定3個群以上的多糖結合疫苗成品包括A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量是一個技術難點，目前尚無該多糖結合疫苗成品各群多糖含量測定方法的相關報道，需建立一種方法準確測定該多糖結合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的多糖含量?？乖贵w反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應。這種反應即可在機體內進行，也可以在機體外進行?？乖贵w反應的特點主要有三性即特異性、比例性、可逆性。特異性，是抗原抗體反應的最主要特征，這種特異性是由抗原決定簇和抗體分子的超變區(qū)之間空間結構的互補性確定的。這種高度的特異性在傳染病的診斷與防治方面得到有效的應用。隨著免疫學技術的發(fā)展進步，還將在醫(yī)學和生物學領域得到更加深入和廣泛的應用，比如腫瘤的診斷和特異性治療等。比例性，是指抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系，只有當二者濃度比例適當時才出現可見反應，在抗原抗體比例相當或抗原過?；蚩贵w過剩的情況下，反應最徹底，形成的免疫復合物沉淀最多、最大。而當抗原抗體比例超過此范圍時，反應速度和沉淀物量都會迅速降低甚至不出現抗原抗體反應。可逆性，是指抗原抗體結合形成復合物后，在一定條件下又可解離恢復為抗原與抗體的特性。由于抗原抗體反應是分子表面的非共價鍵結合，所形成的復合物并不牢固，可以隨時解離，解離后的抗原抗體仍保持原來的理化特征和生物學活性。火箭免疫電泳技術又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術，實質上是加速度地單向擴散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，用橫距2 — 3mA / cm的電流強度進行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭。抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量成正比，用已知量標準抗原作對照，可以方便地測定未知標本中的抗原含量。
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術還沒有能對3個群以上多糖結合疫苗成品中各群的多糖含量進行測定的方法，導致該多糖結合疫苗成品質量難以控制，其目的是提供一種可以準確、快速測定腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的方法。為解決上述技術問題和達到本發(fā)明目的，本發(fā)明是通過以下技術方案實現的。本發(fā)明所述的一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，包括以下步驟
(1)檢品供試品的制備
①預處理取待檢測的4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品用注射用水按標示量復溶后，取5. Oml于超濾杯中，5000 10000 Xg離心超濾20 40min,收集濃縮液,補注射用水至總體積為I. 0ml，得超濾濃縮液；用Lowry法測定該超濾濃縮液中蛋白的濃度；
②蛋白酶K處理酶解反應體系總體積為420W，以所述的酶解反應體系總體積為基準，取1/6體積的超濾濃縮液，加入1/10體積的蛋白酶K緩沖液、蛋白酶K，蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白含量的2 8倍，并補加注射用水至420W，混勻后于37°C孵育6小時±2小時，即得檢品供試品；
(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖，加入PH8. 6的巴比妥電泳緩沖液使膠濃度為I. 5%，加熱溶脹完全，放56°C水浴10 30min，加入預測定群對應的效價為I :640的特異性抗血清，該抗血清的量為瓊脂糖溶液體積的3% (V/V)，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔；
(3)上樣
待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑，然后在其余各孔依次分別加入預測定群對應的4個以上已知不同濃度的多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/ 孔；
(4)電泳及膠片處理
按常規(guī)方法進行電泳、干膠制備、染色和脫色處理；
(5)結果計算
用游標卡尺量取預測定群對應的各多糖標準品及檢品供試品的峰高值，以多糖標準品濃度對數為橫坐標，對應峰高值為縱坐標作回歸曲線，將檢品供試品峰高值帶入回歸曲線計算供試品多糖含量。步驟(3)所述的預測定群對應的4個以上已知不同濃度的多糖標準品是預測定群對應的濃度分別為2. 5Mg/ml、5Mg/ml、10Mg/ml、20Mg/ml、40Mg/ml的5個多糖標準品。步驟(I)所述的4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品為A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品。本發(fā)明所述的4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品是指4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的最終生產產品。所述的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品是指A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗的最終生產產品。
本發(fā)明方法的有益效果是
本發(fā)明方法通過使用蛋白酶K降解多糖結合物中的載體蛋白，消除了各群結合物載體蛋白在免疫電泳中的影響，建立了檢測4個群以上腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖的適宜檢測體系，提供了一種準確、快速測定4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的方法，該方法從準確性、精密度及耐用性驗證的結果來看，具有耐用性強、準確性及精密度高的特點，建立了評價腦膜炎球菌多糖結合疫苗質量的方法。實施例I一實施例12對A、C、Y、W135群腦 膜炎球菌多糖結合疫苗成品中各群多糖含量的測定，每一群作了 3個處理，每個處理3次重復，每個群9次實驗，A、C、Y、W135群各群多糖含量測定的標準偏差SD分別為0. 34,0. 28,0. 37,0. 37，表明本發(fā)明方法重復性好、耐用性強。其A、C、Y、W135群各群多糖含量測定的相對標準偏差CV分別為5. 65%,4. 46%、6. 19%,6. 14%，表明本發(fā)明方法的精密度高(詳見表I一表4)。實施例還采用了用已知多糖濃度的單群腦膜炎球菌多糖結合物直接進行免疫電泳檢測其多糖濃度，與用相同結合物采用本發(fā)明方法檢測其多糖濃度的比較實驗，驗證本發(fā)明方法的準確性，實驗表明
直接進行免疫電泳檢測單群腦膜炎球菌結合物中多糖含量，重復性較差，且檢測值與實際值偏差較大，回收率低(69. 08%—75. 92%)，不能準確反映多糖結合物中的多糖濃度，故直接進行免疫電泳檢測的方法不適于檢測結合疫苗成品中多糖含量(詳見表5)。而本發(fā)明方法對已知多糖濃度的單群腦膜炎球菌多糖結合物中多糖含量的檢測，通過使用蛋白酶K對多糖結合物供試品進行處理，消除了載體蛋白在免疫電泳中對電泳遷移率等相關因素的影響。其檢測重復性好，檢測值與實際值偏差較小，從A群、C群、Y群到W135群的標準偏差SD分別為3. 22%,2. 98%,3. 21%、2. 60%，相對標準偏差CV分別為3. 25%、3. 00%,3. 22%、2. 61%，酶處理后的各群結合物多糖含量重復性檢測結果平均回收率X均在99%以上，標準偏差SD及相對標準偏差CV值均在5%以內，驗證了本發(fā)明方法的準確性和精密度均高，本發(fā)明方法可以準確測定結合疫苗成品中各群多糖含量(詳見表5)。本發(fā)明方法采用的低濃度的標準品即2. 5Mg/ml、5Mg/ml、10Mg/ml、20Mg/ml、40Mg/ml來制作的標準曲線，既曲線線性好，又增強了檢測靈敏度。在4個群以上腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中，每I劑量各群多糖含量都較低，本發(fā)明采用的降低標準品濃度(2. 5^/ml、5Mg/ml、10Mg/ml、20Mg/ml、40Mg/ml)來制作標準曲線,從各群標準曲線相關系數r的數據可以看出，各群標準曲線相關系數r平均值均在0. 985以上，且精密度高，即標準偏差SD在0. 0009 0. 0013之間，相對標準偏差CV值均低于1%，曲線的重復性和穩(wěn)定性都非常好，檢測靈敏度高(詳見表6)。
具體實施例方式以下各實施例所用樣品、試劑均為市售。實施例I A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中A群多糖含量的測定
A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中A群多糖含量的測定，作3次重復，分別為重復I、重復2、重復3，各重復均按以下步驟進行
(I)檢品供試品制備①預處理取A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品12瓶(標示量是每瓶
0.5ml)，用注射用水6ml復溶后(即用注射用水按標示量復溶)，取5. Oml于超濾杯中，5000Xg 4°C離心超濾40min,收集濃縮液,補注射用水至I. Oml,得超濾濃縮液；用Lowry法測定該超濾濃縮液中蛋白的濃度，測得其蛋白濃度為271. 2Pg/ml ；
②蛋白酶K處理酶解反應體系總體積為420W，以酶解反應體系總體積420W為基準，取1/6體積的超濾濃縮液70沿，加入1/10體積的蛋白酶K緩沖液42沿，加入2W蛋白酶K、并補加注射用水至420W，混勻后于37°C孵育4小時，即得檢品供試品。加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的2倍。蛋白酶K的量的計算 超It濃縮液體積X趄濾濃縮液中蛋白的濃度X2=酶解反應體系總體積X I X超濾濃縮液中
6
蛋白的濃度X 2，目P:
蛋白爾 K 的量=0.42 mix i X271. mix2=3Sug=O.OBSme.
6 " ' ^
蛋白■ K的加入睞積蛋白酶K的置0.03Smg +蛋白酶K的濃度20mg/ml=0.002iiiI=2|iL
(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖0. 1489g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴lOmin，加入效價為I :640的A群腦膜炎球菌多糖抗血清，該抗血清的量為瓊脂糖溶液體積的3% (V/V，即體積分數)即為0. 3ml，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔。(3)上樣
待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑、然后，在其余各孔依次分別加入已知不同濃度的5個A群腦膜炎球菌多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/孔；5個A群腦膜炎球菌多糖標準品的濃度分別是2. 5l^g/ml、5l^g/ml、lOl^g/ml、20l^g/ml、40Mg/ml。(4)電泳及膠片處理
穩(wěn)壓40V電泳5小時，然后將瓊脂糖膠片于生理鹽水中浸泡、振搖2小時，再置于兩層干凈濾紙之間，放37°C過夜制成干膠；將干膠于考馬斯亮藍染色液中浸泡10分鐘，脫色液脫色至膠片火箭峰清晰、背景無色。(5)結果計算
用游標卡尺量取各多糖標準品(2. 5Mg/ml、5Mg/ml、10Mg/ml、20Mg/ml、40Mg/ml)及檢品供試品的峰高值，以多糖標準品濃度對數為橫坐標，對應峰高值為縱坐標作回歸曲線，將檢品供試品峰高值帶入回歸曲線計算供試品多糖含量。結果見表I。實施例2 A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中A群多糖含量的測定 除以下步驟的操作不同外，其余操作與實施例I相同，不再贅述。( I)檢品供試品制備
②蛋白酶K處理取超濾濃縮液70沿，加入4W蛋白酶K、42W蛋白酶K緩沖液并補注射用水至420W，混勻后于37°C孵育6小時，即得檢品供試品。加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的4倍。(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備稱取瓊脂糖o. 1521g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴20min，加入0. 3ml效價為I :640的A群腦膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔；結果見表I。實施例3 A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中A群多糖含量的測定
除以下步驟的操作不同外，其余操作與實施例I相同，不再贅述。( I)檢品供試品制備
②蛋白酶K處理取超濾濃縮液70沿，加入8W蛋白酶K、42W蛋白酶K緩沖液并補注射用水至420W，混勻后于37°C孵育8小時，即得檢品供試品。加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的8倍。 (2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖0. 1522g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴30min，加入0. 3ml效價為I :640的A群腦膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔。結果見表I。
表I 實施例I—實施例3結果匯總
1丨實施例I實施例2實施例3 1
雷■競' I 雷"菊"9 雷'競' ^ 雷"每"I 雷9 宙'官^ 領"窗I 雷"官9 雷"首^
多糖含簠
,63 5.6 6.1 5.8 5.S 5.7 6.6 63 5.8
ug/0.3ml
X(n=9)=SD=6.0=0.34, C\'=5.65%
分析本發(fā)明方法的技術方案中有檢品供試品預處理時離心條件5000 IOOOOXg離心超慮20 40min，蛋白酶K處理時37°C孵育6小時±2小時以及加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的2 8倍等，在實施例I一實施例3中分別對以上技術參數進行了范圍兩端及中間參數運用的實驗，每一實驗重復進行了 3次，共計9次實驗，通過對檢測結果的統(tǒng)計分析，多糖重復性測定結果相對標準偏差CV在6%以內，表明本方法的耐用性強，且測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中A群多糖含量的精密度高。實施例4 A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中C群多糖含量的測定 除以下步驟的操作不同外，其余操作與實施例I相同，不再贅述。(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖0. 1513g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴IOminJPA 0. 3ml效價為I :640的C群腦膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔。(3)上樣
待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑、然后，在其余各孔依次分別加入已知不同濃度的5個C群腦膜炎球菌多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/孔；5個C群腦膜炎球菌多糖標準品的濃度分別是2. 5l^g/ml、5l^g/ml、10l^g/ml、20l^g/ml、40Mg/ml。結果見表2。實施例5 A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中C群多糖含量的測定 除以下步驟的操作不同外，其余操作與實施例I相同，不再贅述。( I)檢品供試品制備
②蛋白酶K處理取超濾濃縮液70沿，加入4W蛋白酶K、42W蛋白酶K緩沖液并補注射用水至420W，混勻后于37°C孵育6小時，即得檢品供試品。加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的4倍。(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖0. 1503g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴20min，加入0. 3ml效價為I :640的C群腦膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即鋪板、在抗
(3)上樣
待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑、然后，在其余各孔依次分別加入已知不同濃度的5個C群腦膜炎球菌多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/孔；5個C群腦膜炎球菌多糖標準品的濃度分別是2. 5l^g/ml、5l^g/ml、10l^g/ml、20l^g/ml、40Mg/ml。結果見表2。實施例6 A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品中C群多糖含量的測定
除以下步驟的操作不同外，其余操作與實施例I相同，不再贅述。( I)檢品供試品制備
②蛋白酶K處理取超濾濃縮液70沿，加入8W蛋白酶K、42W蛋白酶K緩沖液并補注射用水至420W，混勻后于37°C孵育8小時，即得檢品供試品。加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白的含量的8倍。(2)抗血清瓊脂糖膠板的制備
稱取瓊脂糖0. 1518g，加入pH8. 6巴比妥電泳緩沖液10. 0ml，加熱溶脹完全，放56°C水浴30min，加入0. 3ml效價為I :640的C群腦膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔。(3)上樣
待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑、然后，在其余各孔依次分別加入已知不同濃度的5個C群腦膜炎球菌多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/孔；5個C群腦膜炎球菌多糖標準品的濃度分別是2. 5l^g/ml、5l^g/ml、10l^g/ml、20l^g/ml、40Mg/ml。結果見表2。
權利要求
1.一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，包括以下步驟 (1)檢品供試品的制備 ①預處理取待檢測的4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品用注射用水按標示量復溶后，取5. Oml于超濾杯中，5000 10000 Xg離心超濾20 40min,收集濃縮液,補注射用水至總體積為I. 0ml，得超濾濃縮液；用Lowry法測定該超濾濃縮液中蛋白的濃度； ②蛋白酶K處理酶解反應體系總體積為420W，以所述的酶解反應體系總體積為基準，取1/6體積的超濾濃縮液，加入1/10體積的蛋白酶K緩沖液、蛋白酶K，蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白含量的2 8倍，并補加注射用水至420W，混勻后于37°C孵育6小時±2小時，即得檢品供試品； (2)抗血清瓊脂糖膠板的制備 稱取瓊脂糖，加入PH8. 6的巴比妥電泳緩沖液使膠濃度為I. 5%，加熱溶脹完全，放56°C水浴10 30min，加入預測定群對應的效價為I :640的特異性抗血清，該抗血清的量為瓊脂糖溶液體積的3%，混均后立即鋪板、在抗血清瓊脂糖膠板的一端打一排孔； (3)上樣 待抗血清瓊脂糖膠板凝固后，在其中一個孔加入溴酚藍指示劑，然后在其余各孔依次分別加入預測定群對應的4個以上已知不同濃度的多糖標準品、檢品供試品，加入量均為7W/ 孔； (4)電泳及膠片處理 按常規(guī)方法進行電泳、干膠制備、染色和脫色處理； (5)結果計算 用游標卡尺量取預測定群對應的各多糖標準品及檢品供試品的峰高值，以多糖標準品濃度對數為橫坐標，對應峰高值為縱坐標作回歸曲線，將檢品供試品峰高值帶入回歸曲線計算供試品多糖含量。
2.根據權利要求I所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，其特征在于步驟(3)所述的預測定群對應的4個以上已知不同濃度的多糖標準品是預測定群對應的濃度分別為2. 5Mg/ml、5Mg/ml、10Mg/ml、20Mg/ml、40Mg/ml的5個多糖標準品。
3.根據權利要求I或2所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，其特征在于所述的4個群以上的腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品為A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，屬生物技術領域。該方法在檢品供試品的制備中采用蛋白酶K處理酶解反應體系總體積為420μl，以總體積為基準，加入蛋白酶K、1/10體積的蛋白酶K緩沖液和1/6體積的超濾濃縮液，混勻后于孵育；加入的蛋白酶K的量為酶解反應體系中蛋白含量的2～8倍。本發(fā)明方法消除了各群結合物載體蛋白在免疫電泳中的影響，建立了檢測4個群以上腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖的適宜檢測體系，提供了一種準確、快速測定4個群以上腦膜炎球菌多糖結合疫苗成品各群多糖含量的方法，該方法具有耐用性強、準確性及精密度高的特點，建立了評價腦膜炎球菌多糖結合疫苗質量的方法。
文檔編號G01N33/68GK102809655SQ201210304908
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月26日 優(yōu)先權日2012年8月26日
發(fā)明者黃鎮(zhèn), 吳凱, 樊會蘭, 張勝祥, 馬波, 周燕美, 李如彪, 包南艷, 楊志偉, 周進寶, 劉國秀, 錢紅兵 申請人:玉溪沃森生物技術有限公司