專利名稱：復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體說涉及復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制 備方法。
背景技術(shù)：
人工合成血管和自體血管是目前臨床上小直徑血管移植物的主要來源。在實踐中人工合 成血管存在植入后容易造成血栓形成、內(nèi)膜增生、遠(yuǎn)期通暢率不高等問題；自體血管受到來 源、大小等限制，無法滿足小直徑血管移植物的需求。血管組織工程為解決小直徑血管移植 物來源提供了有效的途徑，其基本原理是將正常血管細(xì)胞與生物可降解支架材料復(fù)合培養(yǎng)， 以形成具有特定形態(tài)和功能的血管組織，達(dá)到修復(fù)病變、創(chuàng)傷和重建功能的目的。利用血管 組織工程方法已開展臨床應(yīng)用的研究，2002年，日本研究人員首次報道通過組織工程方法構(gòu) 建的血管移植物應(yīng)用臨床，他們利用聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA) 制備多孔網(wǎng)狀支架，種植自體骨髓細(xì)胞并移植體內(nèi)。臨床跟蹤結(jié)果顯示，植入體內(nèi)32個月后 血管移植物仍然保持通暢。
支架材料在組織工程血管中起關(guān)鍵作用，不僅具有直接支撐細(xì)胞的特性，而且影響細(xì)胞 的生長、遷移、分化以及決定新生組織的結(jié)構(gòu)。令人滿意的血管組織工程支架材料應(yīng)盡可能 地模擬天然血管細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)及生理功能，有良好的生物相容性，包括抗凝血、 抗炎癥以及非免疫原性、允許細(xì)胞的黏附和生長等生物學(xué)性能；模擬天然血管的彈性和順應(yīng) 性；良好的生物降解性能，材料支架的降解速率須與植入的細(xì)胞組織形成相匹配；易于加工 成形，并具縫合性和滅菌性等特點。
在組織工程血管支架材料的研究中，天然蛋白如膠原蛋白是最早用于構(gòu)建組織工程血管 支架的材料，但因天然蛋白機(jī)械強(qiáng)度不夠、獲取有一定困難，而且還存在一些問題，如抗原 性、在處理過程中容易變性等，盡管有大量的研究來改進(jìn)，但仍受力學(xué)性能不足所限。之后 更多的研究工作是尋找人工合成、具有一定力學(xué)性能、可降解的高分子材料，聚羥基乙酸 (PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥丁酸(P4HB)、聚乳酸(PLA)及其共聚物等是本世紀(jì)初廣泛應(yīng)用于構(gòu)建血管支架的材料。然而，由于存在PGA降解過快、PCL缺乏細(xì)胞親和性、PLA 力學(xué)強(qiáng)度不匹配等問題，亦不理想?；谔烊谎芙Y(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，很難使某一材料同 時滿足血管支架材料的要求，需要將天然材料和人工合成材料按照一定的比例混合，以發(fā)揮 天然材料和人工合成材料的優(yōu)點，制備兼具良好生物相容性和優(yōu)良力學(xué)性能的復(fù)合支架材料。 蜘蛛絲是一種特殊的蛋白質(zhì)纖維，是天然的高分子纖維和生物材料，根據(jù)蜘蛛絲的結(jié)構(gòu) 和功能特性，福建師范大學(xué)李敏等于2004年(李敏，黃建坤，涂桂云等,RGD-蜘蛛拖絲蛋白 基因的構(gòu)建、表達(dá)與純化，生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2004,21(6):1006)應(yīng)用基因工程為核心的現(xiàn) 代生物技術(shù)，利用原核生物表達(dá)體系,構(gòu)建了多種特殊序列的蛛絲蛋白基因，并在蛛絲蛋白的 功能重復(fù)基因序列中引入RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽密碼子，構(gòu)建并表達(dá)了RGD-重組蛛絲蛋白(命名為pNSR16和pNSR32，分子量分別約為65KD和102KD)。生物活性分子 RGD三肽是黏附蛋白中能夠為細(xì)胞表面特異受體蛋白識別的最小短肽序列，是目前應(yīng)用最廣、 最有效的促黏附肽。
聚己內(nèi)酯(PCL)是近年來國外開發(fā)的一種合成高分子聚酯材料，是美國食品和藥物管理 局(FDA)認(rèn)可的一類生物醫(yī)用材料，具有良好的物理機(jī)械性、化學(xué)穩(wěn)定性、無毒性及易加 工成形等特點。殼聚糖(CS)是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，是自然界中第二大豐富的生物材料， 具有良好的生物相容性、可生物降解和抗血凝性，并可促進(jìn)傷口愈合和抗菌等功能，是一種 理想的生物醫(yī)用材料。研制思路是將上述三種材料按一定比例共混，從而吸取材料各自的優(yōu) 點，制備具有一定黏附功能、適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能以及抗凝血性能的血管組織工程支架。
目前，血管支架制備技術(shù)方法主要有澆鑄-浸漬法、細(xì)胞自組裝法以及凝膠紡絲。然而， 澆鑄-浸漬法的缺點是在支架殘留有毒溶劑且不能很好地控制孔徑的大小和分布；細(xì)胞自組裝 技術(shù)對制備的條件要求很高，必須在無菌條件下操作，并且通過該技術(shù)所構(gòu)建的血管所需的 長期培養(yǎng)也受到相當(dāng)大的限制，至于構(gòu)建物在植入后是否表現(xiàn)合適的彈性和順應(yīng)性難以確定； 凝膠紡絲法雖然可以制備微型的血管支架，但是支架的微觀結(jié)構(gòu)無法很好模擬細(xì)胞外基質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和功能。
靜電紡絲是一項獨特的技術(shù)，利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場作用下形成噴射流，射流 凝固形成納米纖維，以無紡布狀排列在收集板上。應(yīng)用該技術(shù)不僅可模仿細(xì)胞外基質(zhì)納米纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，制備大小在500nm以內(nèi)的纖維，而且所制備的納米纖維具有高孔隙率和比表面 積，有利于細(xì)胞的黏附、生長及增殖。迄今，有數(shù)十種高分子合成材料以及甲殼素、纖維素、 蠶絲等天然聚合物成功電紡，其中有不少作為支架材料廣泛應(yīng)用于骨、軟骨、皮膚、膀胱、 神經(jīng)等組織工程研究領(lǐng)域。與其他納米纖維制備方法如相分離、自組裝相比，靜電紡絲能夠 制備成小直徑(<6mm)的管狀結(jié)構(gòu)，并具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能，這些特點賦予靜電紡絲技術(shù) 在組織工程血管支架構(gòu)建領(lǐng)域突出的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR32或pNSR16)與聚己內(nèi)酯(PCL)和殼聚糖(CS) 按照一定比例共混配成一定濃度的電紡液，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備內(nèi)徑為3-6mm的復(fù)合納米 纖維管狀物，作為小直徑血管組織工程支架。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是以甲酸為共同溶劑，根據(jù)血管支架的要求， 將RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR32或pNSR16)與聚己內(nèi)酯(PCL)和殼聚糖(CS)按照適當(dāng)?shù)?比例共混，制備電紡溶液，備用。調(diào)節(jié)不銹鋼轉(zhuǎn)軸的直徑以控制管狀支架的內(nèi)徑，考察不同 電紡參數(shù)(如紡絲液濃度、電壓、擠出速度、固化距離、溫度、轉(zhuǎn)速等)對支架宏觀形貌和 微觀結(jié)構(gòu)的影響，以確定最佳的紡絲條件。在不銹鋼轉(zhuǎn)軸上涂上一薄層潤滑劑以便于取出血 管支架，潤滑劑必須無毒且通過一定的處理可以將其去除。
具體制備方法為
① 配制電紡溶液以甲酸為共同溶劑，將RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR32或pNSR16)、聚 己內(nèi)酯以及殼聚糖按照質(zhì)量比為l : 8 : 1配制成濃度為20% 30% (w/v)的靜電紡絲液。
② 小直徑血管支架的制備通過帶圓柱狀轉(zhuǎn)軸收集器(涂有聚乙二醇)的靜電紡絲設(shè)備， 在高壓靜電的作用下，制備復(fù)合納米纖維管狀支架。圓柱狀轉(zhuǎn)軸橫截面的直徑為3mm 6mm， 轉(zhuǎn)動速度為1500rpm 2000ipm，固化距離為15 cm 30cm，電壓為50 kV 150kV,擠出速度 為3 ml/h 7ml/h，溫度45。C 50。C。
③ 去除聚乙二醇?xì)埩魧⒅Ъ芤来谓?jīng)過以下處理PBS漂洗，70M酒精20min，無菌水3min， 無菌PBS5min。即可除去支架上殘留的聚乙二醇。
本發(fā)明所選用的靜電紡絲液是指以濃度為70。/。 98。/。甲酸為溶劑的RGD-重組蛛絲蛋白/聚己內(nèi)酯/殼聚糖混合溶液。RGD-重組蜘蛛絲蛋是通過由福建師范大學(xué)李敏等建立的可規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)酵罐高密度發(fā)酵工藝條件等技術(shù)而獲得，公眾也能根據(jù)其公開的技術(shù)(參見李
敎章Jt^,紫舉,黃遵雄;鄉(xiāng)錄潛遂歪A基齒游稱碧J!在丈應(yīng)^f蘑^游表達(dá)/^主激工薦學(xué)j乾M02^W熟以簡便易行、低成本和有效的分離純化方法規(guī)?；苽渲亟M蛛絲蛋白。
本發(fā)明所選用的靜電紡絲專用設(shè)備——靜電紡絲儀，由福建師范大學(xué)研制定型的產(chǎn)品。該儀器具有:電源電壓可調(diào)范圍為0 300kV,可更換的圓柱形轉(zhuǎn)軸收集器的橫截面直徑為4 10mm,旋轉(zhuǎn)速度可調(diào)范圍為1000rpm 4500rpm,收集距離可調(diào)范圍為10 30cm、擠出速度可調(diào)范圍為2ml/h 10ml/h，電紡最高溫度可達(dá)6(TC 。
采用本發(fā)明的技術(shù)，具有
1、 RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR32或pNSR16)具有良好的生物相容性，其特殊的RGD序列能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)種子細(xì)胞在支架上的黏附和生長。
2、 聚己內(nèi)酯具有良好的物理機(jī)械性，化學(xué)穩(wěn)定性、無毒性及易加工成形等特點，但其降解速度較慢，與降解速度較快的殼聚糖共混，不僅可以提高支架材料的降解速度，為細(xì)胞的生長提供足夠的空間，殼聚糖還可以提高支架材料的抗凝血性。這樣血管支架具有良好力學(xué)性能的同時，還擁有良好的生物相容性和抗凝血性能，并且支架所攜帶的RGD促黏附肽有利于種子細(xì)胞的黏附和生長，從而達(dá)到三贏的效果。
3、 應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)，可以很方便地控制血管支架的內(nèi)徑大小。此外，靜電紡絲所制備支架的微觀結(jié)構(gòu)模擬了天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的生長提供一個仿生的環(huán)境。


下面結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進(jìn)一步說明。
圖l是血管支架外觀形貌圖。
圖2是血管支架橫截面。
圖3是血管支架的腔內(nèi)表面。
圖4是血管支架的腔外表面。
具體實施例方式
下面根據(jù)實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實施例1
1、 電紡液配制分別稱取配0.1g pNSR16、 0.8gPCL以及0.1gCS溶解于5ml88。/。甲酸，得到20% (w/v)的pNSR32/PCL/CS混合電紡溶液。
2、 轉(zhuǎn)軸處理在不銹鋼轉(zhuǎn)軸上涂上一薄層聚乙二醇(PEG)。
3、 小直徑血管支架的制備吸取1.5ml的紡絲液到規(guī)格為2ml的注射器中，將注射器安置在注射泵上，采用橫截面直徑為4mm圓柱狀轉(zhuǎn)軸收集器，以1000r/min的速度旋轉(zhuǎn)，固化距離為18cm、電壓為80kV、擠出速度為5ml/h、溫度45°〇的條件下，制得內(nèi)徑為4mm的pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架。
4、 支架制備后處理將支架經(jīng)以下處理PBS漂洗、70%酒精浸泡20min、無菌水3min以及無菌PBS5min后，即可除去支架表面上殘留的聚乙二醇。
實施例2
1、 電紡液配制分別稱取配0.15gpNSR32、 1.2gPCL以及0.15gCS溶解于5ml98o/。甲酸，得到30% (w/v)的pNSR32/PCL/CS混合電紡溶液。
2、 轉(zhuǎn)軸處理在不銹鋼轉(zhuǎn)軸上涂上一薄層聚乙二醇(PEG)。
3、 小直徑血管支架的制備吸取2.0ml的紡絲液到規(guī)格為2.5ml的注射器中，將注射器安置在注射泵上，采用橫截面直徑為6mm圓柱狀轉(zhuǎn)軸收集器，以1500r/min的速度旋轉(zhuǎn),固化距離為20cm、電壓為100kV、擠出速度為7ml/h、溫度5(TC的條件下，制得內(nèi)徑為6mm的pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架。
4、 支架制備后處理將支架經(jīng)以下處理PBS漂洗、70%酒精浸泡20min、無菌水3min以及無菌PBS5min后，即可除去支架表面上殘留的聚乙二醇。
權(quán)利要求
1、一種復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法，其特征在于①配制靜電紡絲液將RGD-重組蛛絲蛋白、聚己內(nèi)酯和殼聚糖溶于甲酸中，配制成靜電紡絲液；②小直徑管狀支架的制備通過圓柱狀、橫截面的直徑為3mm～6mm的轉(zhuǎn)軸為收集器的靜電紡絲設(shè)備，在高壓靜電作用下制備出復(fù)合納米纖維管狀支架；③去除聚乙二醇?xì)埩魧⒅Ъ芤来谓?jīng)過以下處理PBS漂洗，70％酒精20min，無菌水3min，無菌PBS5min。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法，其特征在 于所述的靜電紡絲液中，RGD-重組蛛絲蛋白、聚己內(nèi)酯以及殼聚糖按照質(zhì)量比為1 : 8 : 1配 制，配制后靜電紡絲液濃度為20% 30% (w/v)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法，其特征在 于配制靜電紡絲液時所用的甲酸濃度為70% 98%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法，其特征在 于復(fù)合納米纖維血管支架制備過程中所用的圓柱狀轉(zhuǎn)軸收集器旋轉(zhuǎn)速度為1000 1500r/min, 固化距離為15 30cm、電壓為50 150kV、擠出速度為3 7ml/h，溫度為45 50'C。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體說涉及復(fù)合納米纖維小直徑血管組織工程支架材料的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是以甲酸為共同溶劑，根據(jù)血管支架的要求，將RGD-重組蛛絲蛋白與聚己內(nèi)酯和殼聚糖按照質(zhì)量比為1∶8∶1進(jìn)行共混配成濃度為20～30％(w/v)紡絲液，電紡過程參數(shù)為圓柱狀轉(zhuǎn)軸橫截面的直徑為3～6mm，轉(zhuǎn)動速度為1500～2000rpm，固化距離為15～30cm，電壓為50～150kV，擠出速度為3～7ml/h，溫度45～50℃。本發(fā)明得到的小直徑血管支架具有良好的促細(xì)胞黏附能力、抗凝血性以及擁有抵抗生理環(huán)境的力學(xué)性能，有望作為小直徑血管組織工程支架在臨床上的應(yīng)用。
文檔編號A61L27/48GK101653624SQ20091011252
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者敏 李, 薛正翔, 陳登龍 申請人:福建師范大學(xué)