專利名稱：：一種小分子肽在制備促進手術后傷口愈合藥物和食品中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是分子量低于10000的肽在制備促進手術后傷口愈合藥物和食品中的新用途，特別是涉及海洋膠原肽和大豆肽在促進手術后傷口愈合中的新用途。
背景技術：
：傷口愈合是組織生長、再生的一種特殊生物學過程，所涉及的炎癥反應細胞增殖、新生血管和淋巴管形成，以及細胞外基質合成，是一個連續(xù)動態(tài)過程，不能截然分開，因此，凡是能促進或抑制某一個環(huán)節(jié)的因素，均可影響傷口愈合的整個過程。傷口愈合過程中的某些環(huán)節(jié)可受一些營養(yǎng)代謝因素的影響。海洋膠原肽是以海洋魚皮作主要原料，用酶解法生產(chǎn)的、相對分子質量低于1000的低聚肽(短肽)為主要成分的粉末狀產(chǎn)品。彭宏斌，CHKD博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫2008年博士論文《海洋膠原肽輔助降血糖和免疫營養(yǎng)功能的效果研究》研究表明海洋膠原肽可以改善高血糖和高脂膳食負荷的2型糖尿病大鼠體內過氧化應激標志的表達，具有輔助降血糖功能；海洋膠原肽短期干預可以改善糖尿病患者胰島素敏感性和改善胰島素分泌功能，縮短糖尿病患者的血糖調整期，降低夜間低血糖的發(fā)生率，改善手術后患者的營養(yǎng)狀況，提高手術后患者的免疫能力?！吨袊M織工程研究與臨床康復雜志》2008，12(23):劉桂琴等(海洋膠原肽對2型糖尿病大鼠過氧化應激標志物表達的影響)公開了體外實驗證實海洋膠原肽具有抗氧化等生物活性，可能具有一定的抗炎癥效應。關于海洋膠原肽的用途，申請?zhí)?00710157641.8專利文獻中公開了海洋膠原肽作為制備降血糖藥物、保健食品或食品的用途，申請?zhí)?00710157643.7專利文獻中公開了海洋膠原肽作為制備抗氧化藥物、保健食品、食品或化妝品的用途，申請?zhí)?00610086812.8專利文獻中公開了海洋膠原肽在制備免疫調節(jié)藥物或食品中的用途，以上專利未述及海洋膠原肽在促進手術后傷口愈合的用途?，F(xiàn)有技術中均未述及海洋膠原肽關于手術后促進傷口愈合的應用的報導。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白為主要原料，用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，主要成分為肽，且分子量分布在10000Dalton以下的粉末狀產(chǎn)品。大豆肽含有的八種必需氨基酸，除蛋氨酸為限制氨基酸以外，甘氨酸、脯氨酸等其它氨基酸均超過或接近世界衛(wèi)生組織(冊O)的推薦標準，因此具有較高的營養(yǎng)價值。分子量小于1000的肽吸收率高達90%以上。優(yōu)質大豆肽的分子量分布以小于1000的為主，分子量主要在300700范圍內。大豆肽能促進礦物質吸收；大豆肽有降低血壓的作用；促進脂肪代謝及降低膽固醇。《食品科技》2007,(7):243國明明等，大豆肽免疫調節(jié)作用的研究表明，大豆肽還有免疫功能?！渡锛庸み^程》2008，6(4):69王莉娟，大豆肽體外抗氧化活性研究表明，大豆肽還有抗氧化功能?！吨袊澄锱c營養(yǎng)》2000，(4):39陳曉光等，大豆肽的生理功能及應用前景，研究表明大豆肽還有降低血糖作用。關于大豆肽的用途，申請?zhí)?00510077612.1專利文獻中公開了具有解酒護肝功能的產(chǎn)品及制備方法和用途，申請?zhí)?00610026655.1專利文獻中公開了一種促進肥牛肌腱發(fā)育的多肽及微生物制劑及制備方法，以上專利均未述及大豆肽用于促進手術后傷口愈合的用途。關于低分子肽類的藥物，申請?zhí)枮?00410022266.2專利文獻中公開了c-ski基因及其多肽促進損傷愈合又減輕瘢痕；申請?zhí)枮?1109400.l專利文獻中公開了基因重組成纖維細胞生長因子一8a多肽具有上調細胞連接蛋白(Connexin43)表達，活化上皮功能，加速傷口愈合，以及促進軟骨分化等生物活性；申請?zhí)枮?00610152684.2專利文獻中公開了具有促進血管形成、組織再生及傷口愈合作用的多肽組合制劑；申請?zhí)?00410098483.X專利文獻中公開了一組具有促進新血管形成、組織再生及傷口愈合作用的活性小分子多肽胸腺素P16及其藥物組合物；申請?zhí)?00410015853.9專利文獻中公開了促進皮膚、結締組織、骨生長的多肽組合物；申請?zhí)?1820299.3專利文獻中公開了新的一類多肽成纖維細胞生長因子具有促進傷口愈合等作用；申請?zhí)?00610112159.8專利文獻中公開了涉及用于加速傷口愈合的組合物，該組合物中包含有血栓調節(jié)蛋白的EGF樣區(qū)域之氨基酸序列的多肽或其中保守性變異體；申請?zhí)?0116910.6專利文獻中公開了一種新的多肽——上皮形成素9.9和編碼這種多肽的多核苷酸用于促進傷口愈合等；申請?zhí)?9816184.5專利文獻中公開了取代的雜環(huán)?；脑趥谟虾头乐寡“迥壑械挠猛尽＞C上所述，目前還沒有關于分子量在10000以下的天然來源的肽在促進手術后傷口愈合方面的報道。
發(fā)明內容海洋膠原肽以深海魚的魚皮為主要原料，分子量分布在lOOOODalton以下淡黃色粉術狀小分子肽，其中140-1000分子量范圍占70%以上。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白為主要原料，分子量分布在10000Dalton以下的粉末狀產(chǎn)品，其中140-1000分子量范圍占70%以上。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，分子量140-10000的肽能促進手術后傷口愈合，可用于制備促進術后傷口愈合的食品或藥品，有很好的應用前景。具體實施例方式分子量小于ioooo的肽促進手術后大鼠傷口愈合的功效研究l.材料與方法1.1海洋膠原肽以深海魚的魚皮為主要原料，采用生物酶法生產(chǎn)的分子量分布在10000Dalton以下淡黃色粉末狀小分子肽，其中140-1000分子量范圍占80%以上。1.2大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白為主要原料，用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，分子量分布在10000Dalton以下的粉末狀產(chǎn)品，其中140-1000分子量范圍占70°/。以上。1.3實驗動物健康雄性二級SD大鼠，體重230-250克。1.4實驗條件清潔級動物室，溫度范圍21-23°C，相對濕度50%—60%。1.5實驗方法1.5.1動物模型建立方法大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后，剃去背部皮膚，常規(guī)皮膚消毒，背部兩側分別切一個2cm長的縱行切口，同時切開肌肉，深達腹腔，然后逐層縫合肌肉和皮膚。整個過程模擬臨床手術過程，同時手術當天計為術后5第0天(POD0)，以此類推。1.5.2實驗動物分組取216只體重為230-250g的大鼠，隨即分為9組，每組24只，包括空白對照組、4個海洋膠原肽組(分別為0.667g/kg.bw、2.Og/kg.bw、6.Og/kg.bw和12g/kg.bw)和4個大豆肽組(分別為0.667g/kg.bw、2.Og/kg.bw、6.Og/kg.bw和12g/kg.bw)，相當于人體推薦劑量的3.3倍、10倍、30倍和60倍)，空白對照組灌胃給予等體積溶劑。手術當天開始，每日灌胃。分別于第3、7、14天處死大鼠，每個時間點各8只動物。1.5.3傷口愈合觀察1.5.3.1肉眼觀察每日用放大鏡觀察切口變化情況。各組于術后第3天觀察傷口及其周圍組織的創(chuàng)傷反應，第7、14天觀察傷口的恢復情況。術后創(chuàng)傷反應及傷口恢復情況統(tǒng)一按本實驗室自建標準評定。1.5.3.1.1傷口及其周圍組織的創(chuàng)傷反應評定①I期反應傷口有輕度腫脹。②n期反應傷口及周圍組織輕度水腫，皮下有散在淤血斑。③m期反應切口有少量血痂附著，傷口及周圍組織明顯水腫。1.5.3.1.2傷口恢復情況評定①優(yōu)傷口組織無腫脹，皮膚青紫現(xiàn)象消失。②良傷口組織輕度腫脹，皮下淤血斑消失，青紫現(xiàn)象逐漸消退。③差傷口及周圍組織腫脹。1.5.3.2切口愈合的組織病理學觀察各組大鼠分別于術后第3、7、14天于傷口處距切口邊緣約0.5cm取全層皮膚組織。左側傷口所取組織的一半用4%多聚甲醛固定，保存待做石蠟切片及HE、Masson染色，另一半用于抗拉力檢測，右側傷口皮膚用于羥脯氨酸測定和其他指標的檢測。1.5.3.3膠原纖維染色(Masson染色)組織切片脫蠟至蒸餾水，蘇木素染色5IO分鐘，鹽酸酒精分化，流水藍化，蒸餾水洗，麗春紅酸性品紅液中染58分鐘，蒸餾水，1%磷鉬酸中染13分鐘，直接入苯胺藍液或亮綠液5分鐘，水速洗，置6(TC溫箱中烘干，二甲苯透明，封固。結果膠原纖維綠色，肌纖維、纖維素紅色。1.5.3.4切口的抗張強度檢測術后第7、14天，沿切口垂直方向切取以切口為中線，寬為0.5cm長為中線雙側各0.5cm，并包含切口在內的皮膚試件組織，去除皮下脂肪組織，于長方形短邊以絲線縫合作為牽引線，將皮條置于帶有張力感受器的裝置中間，張力感受器另一端連接于多功能生物信號采集系統(tǒng)，采用帶有游標卡尺的微調裝置手動逐漸拉伸皮條，記錄皮條被拉斷時的張力。測微尺測量皮膚的厚度，每平方毫米面積的張力即為切口的抗張強度。1.5.3.5羥脯氨酸測定切取大鼠切口周圍2-3毫米的皮膚用于測定羥脯氨酸，方法依據(jù)南京建成生物工程公司的羥脯氨酸檢測試劑盒進行操作。1.5.4統(tǒng)計方法采用SPSS軟件進行單因素方差分析。2.結果2.1大鼠術后傷口愈合的肉眼觀察結果肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，術后第3天，對照組大鼠傷口多數(shù)有血痂附著，傷口及周圍組織明顯水腫，而海洋膠原肽組大鼠傷口的水腫程度明顯減輕(表l)。術后第7和14天，海洋膠原肽組、大豆肽組大鼠傷口愈合明顯好于對照組大鼠傷口。海洋膠原肽組、大豆肽組大鼠比對照組大鼠傷口提前l(fā)-2天愈合，同時發(fā)現(xiàn)6.Og/kg.bw和12g/kg.bw劑量組愈合最佳(表2)。表l各組傷口創(chuàng)傷反應情況比較例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2各組傷口恢復情況比較例(％)第7天(16只/組)第14天(8只/組)組別-優(yōu)良差優(yōu)良差0/kg.bw3(18.75)6(37.5)7(43.75)4(50)3(37.5)1(12.5)0.667g/kg.bw(海洋肽)5(31.25)5(31,25)6(37.5)5(62.5)2(25.0)1(12.5)2.Og/kg.bw(海洋肽)6(37.5)6(37.5)4(25.0)5(62.5)2(25.0)1(12.5)6.Og/kg.bw(海洋肽)8(50.0)4(25.0)4(25.0)6(75,0)2(25,0)012g/kg.bw(海洋肽)8(50.0)5(31.25)3(18,7)7(87.5)1(12.5)00.667g/kg.bw(人豆肽)5(31.25)5(31.25)(31.25)(62.5)2(25.0)1(12.5)2.Og/kg.bw(大豆肽)6(37.5)6(37.5)4(25.0)(62.5)2(25.0)'(12.5)6.Og/kg.bw(大豆肽)8(50.0)4(25.0)4(25.0)(87.5)1(12.5)012g/kg.bw(大豆肽)8(50.0)5(31.25)2(12.5)7(87.5)1(12.5)02.2海洋膠原肽對大鼠術后傷口皮膚愈合的組織學觀察結果組織學結果發(fā)現(xiàn)，術后第7天組織切片觀察對照組傷口表皮囊性增生為主，瘢痕組織較多，炎性細胞浸潤明顯多于海洋膠原肽組，而成纖維細胞和毛細血管則明顯少于海洋膠原肽組、大豆肽組。術后第14天組織切片觀察顯示，對照組傷口表皮以增生為主，瘢痕組織和炎性細胞還是多于海洋膠原肽組、大豆肽組，而各個海洋膠原肽、大豆肽組組傷口表皮完整，瘢痕組織明顯少于對照組，炎性細胞明顯減少，其中以6.Og/kg.bw劑量組最佳。2.3Masson染色光鏡組織學觀察Masson染色將結締組織和膠原纖維染成綠色，平滑肌染成紅色，細胞核染成褐色。術后第3天切口各個組之間的膠原纖維數(shù)量沒有明顯的差異。術后第7天結果發(fā)現(xiàn)，海洋膠原肽組、大豆肽組膠原纖維數(shù)量明顯多于對照組，以6.Og/kg.bw和12g/kg.bw劑量組最佳，。術后第14天同樣發(fā)現(xiàn)海洋膠原肽組、8大豆肽組膠原纖維數(shù)量明顯多于對照組。2.4術后不同時間傷口抗張力比較術后第7、14天各組傷口抗張力值見表1。從表3可見，第7天和第14天海洋膠原肽組、大豆肽組與對照組傷口的抗張力強度均有差異，并有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表3術后各組傷口抗張力值(g/mm2,、XDSD)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*表示與對照組比較，尸<^.02.5切口肉芽組織羥脯氨酸結果術后第7天、14天各組傷口羥脯氨酸檢測結果見表4。結果發(fā)現(xiàn)第7天和第14天海洋膠原肽組、大豆肽組與對照組傷口羥脯氨酸表達均有差異，并有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表4術后各組羥脯氨酸結果("g/mg，XDSD)時間0/kg.bw0.667g/kg.bw2.Og/kg.bw6.Og/kg.bw12g/kg.bw(膠原)術后7.8402.179.21Q3.049.67D2.48*10,43Q3.35*11.03Q3.97*第7日(膠原)術后8.43口2.4510.57口3.81*11.咖3.29*12.89口3.74*13.73口2.43*第14日(大豆)術后7.49口1.879.05口2.659.93口2.18*10.85口3.41*11.52CB.59*第7日(大豆)術后8.66口2.349.89[J2.81*11.39EB.02*13.06口3.24*13.87d2.65*第14曰注*表示與對照組比較，尸<0.053.結論本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口給予術后大鼠不同濃度的海洋膠原肽、大豆肽組后，各個濃度的海洋膠原肽、大豆肽組都能夠提高術后傷口的抗張力值、膠原纖維、羥脯氨酸的表達水平，表明海洋膠原肽、大豆肽能夠促進術后大鼠的傷口愈合程度，同時發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，海洋膠原肽、大豆肽促進傷口愈合的效果逐漸增強。本研究得出海洋膠原肽、大豆肽能夠促進大鼠傷口愈合的最小劑量是0.667g/kg.bw。二、低聚肽含量測定1.方法提要低分子量的蛋白質水解物(包含肽類及游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白質在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質物質，測定出離心清液中的酸溶蛋白質含量，清液中的酸溶蛋白質含量減去游離氨基酸含量即為低聚肽的含量。2.分析步驟2.1酸溶蛋白質含量的測定稱取2g(精確至lmg)樣品，加入10mL15%三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10min。將樣品溶液在4000rpm下離心10min后，取全部清液，按GB/T5009.5規(guī)定的方法測定清液中的酸溶蛋白質，蛋白質換算系數(shù)為6.25。檢驗結果根據(jù)樣品的干燥失重，折算為干基。2.2游離氨基酸含量的測定樣品前處理稱取2030mg樣品，精確到0.0001g，用3%磺基水楊酸溶液溶解均勻。將樣品溶液轉移至50ml容量瓶中，定容。將樣品溶液在轉速為4000r/min離心機上離心5min得清液，再用0.45um微孔濾膜過濾清液，將濾液轉移至50ral容量瓶中，定容后作為儀器檢測用樣品。其余操作同GB12292水果、蔬菜汁游離氨基酸含量的測定規(guī)定的方法。2.3結果的表述10低聚肽的含量^按式(1)計算尸2□f□^(1)式中尸2——樣品中低聚肽含量(以干基計)，％;S——樣品中酸溶蛋白質含量(以干基計)，％;^——樣品中游離氨基酸含量(以干基計)，％。2.4測定結果測定海洋膠原肽粉和大豆肽粉低聚肽含量，結果見表5。表5、肽粉中低聚肽的含量測定結果樣品海洋膠原肽大豆肽低聚肽含量85.5%79.7%3.相對分子質量小于1000的肽所占比例(高效凝膠過濾色譜法)3.1方法提要采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220mn條件下檢測，使用凝膠色譜測定相對分子質量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到低聚肽的相對分子質量大小及分布范圍。3.2試劑乙腈色譜純；三氟醋酸分析純；水超純水或二次蒸餾水。相對分子質量校正曲線所用標準品細胞色素C(cyyochrome，MW12500);抑酞酶(aprotinin,MW6500);桿菌酶(bacitracin,MW1450);乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸(MW451);乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(MW189)3.3儀器和設備高效液相色譜儀配有紫外檢測器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站或積分儀；流動相真空抽濾脫氣裝置；超聲波振蕩器；分析天平感量O.0001g。3.4色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗色譜柱TSKgelG2000SWXL300mmX7.8mm或性能與此相近的同類型其他適用于測定蛋白質和多肽的凝膠柱；流動相乙腈水三氟乙酸，45:55:0.1(體積比)檢測波長UV220nm;流速0.5ml/min;柱溫30°C;進樣體積lOul。為使色譜系統(tǒng)符合檢測要求，規(guī)定在上述色譜條件下，凝膠色譜柱的柱效即理論塔板數(shù)(N)按三肽標準品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰計算不低于5000,低聚肽的分配系數(shù)(Kd)應在01之間。3.5相對分子質量校正曲線制作分別用流動相配制成O.1%(W/V)的上述不同相對分子質量的肽標準品溶液，用孔徑為O.2-0.5um聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后分別進樣，得到系列標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數(shù)(lgMW)對保留時間作圖或作線性回歸得到相對分子質量校正曲線及其方程。3.6樣品制備稱取樣品20.0mg于10mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2-0.5uni聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后，上機進樣。3.7相對分子質量的計算將3.6制備的樣品溶液在上述色譜條件下分析。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算，即可得到樣品中肽的相對分子質量及其分布范圍。用峰面積歸一化法計算相對分子質量范圍在1000以下的肽的峰面積相對百分比之和。3.8測定結果海洋膠原肽和大豆肽分子量分布范圍測定結果見表6，7。表6、海洋膠原肽結果分子量范圍開始時間min結束時間min重均分子量峰面積％(入220nm)1000-1000013.96618.99514098.2023500-100018.99520.50967227.1174140-50020.50923.28931761.354270-14023.28924.8021082.2662表7、大豆肽結果分子』t范圍開始時間min結束時間min重均分子量峰面積％(A220nm)1000-1000013.96618.995201214.6817500-100018.99520.50967226.8898140--50020.50923.28931753.456170-14023.28924.8021084.3834以上結果表明，海洋膠原肽和大豆肽分子量主要集中在140-1000，占70%以上。權利要求1.一種分子量≤10000的肽在制備促進手術后傷口愈合藥物和食品中的應用。2.根據(jù)權利要求l所述的肽，其特征在于分子量小于2000。3.根據(jù)權利要求1或者2所述的肽，其特征在于140-1000分子量范圍的肽含量》70%。4.根據(jù)權利要求l-3任意所述的肽，其特征在于它是一種海洋膠原肽。5.根據(jù)權利要求l-3任意所述的肽，其特征在于它是一種大豆肽。全文摘要本發(fā)明涉及一種分子量小于10000的肽在制備促進手術后傷口愈合藥物和食品中的應用，其中在140-1000分子量范圍的肽含量不低于70％，它是一種海洋膠原肽和大豆肽。文檔編號A61K38/02GK101461934SQ20091011480公開日2009年6月24日申請日期2009年1月4日優(yōu)先權日2009年1月4日發(fā)明者付玉梅,盧建中,呂毅斌,萍喻,堯梅香,群廖,易敏之,勇李,李詒光申請人:江中藥業(yè)股份有限公司