專利名稱：以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制的疫苗及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉及一種以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生 產(chǎn)的疫苗以及其方法。
背景技術(shù)：
目前公知的全病毒疫苗生產(chǎn)方法，多以雞胚胎蛋、動(dòng)物組織或細(xì)胞培養(yǎng)方式來產(chǎn) 制病毒；然而，以雞胚胎蛋產(chǎn)制病毒有蛋源質(zhì)量及來源不穩(wěn)定等問題，而以動(dòng)物組織產(chǎn)制全 病毒疫苗則含有太多外來的蛋白質(zhì)，容易使施打?qū)ο笠疬^敏反應(yīng)和神經(jīng)方面的并發(fā)癥； 因此，較佳的方式是找到對(duì)該病毒具有感受性的細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)方式來大量產(chǎn)制病毒。以貼附型細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒以制造全病毒疫苗(包括活毒及滅活疫苗)，其中細(xì) 胞的大量培養(yǎng)是生產(chǎn)疫苗的關(guān)鍵之一，傳統(tǒng)上，制苗用細(xì)胞系(貼附型)的培養(yǎng)，先經(jīng)過 EDTA-胰酶細(xì)胞分散消化傳代，以細(xì)胞培養(yǎng)液于適當(dāng)溫度下在培養(yǎng)盤或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，形 成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。目前實(shí)驗(yàn)室或企業(yè)大多使用轉(zhuǎn)瓶自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng) (Roller BottleSystem)，使細(xì)胞可以獲得充足的氣體及養(yǎng)分交換。然而，這種傳統(tǒng)式細(xì)胞培養(yǎng)工藝的缺點(diǎn)是準(zhǔn)備時(shí)間繁雜，無法一次大量培養(yǎng)細(xì) 胞，而且每一個(gè)培養(yǎng)盤或培養(yǎng)瓶只能培養(yǎng)單層細(xì)胞。若要短時(shí)間內(nèi)大量培養(yǎng)，所需要的空間 與設(shè)備使用及維護(hù)成本非常龐大，增加企業(yè)人力、物力的成本負(fù)擔(dān)。由此可知，以上述細(xì)胞培養(yǎng)方式制造全病毒疫苗具有諸多缺點(diǎn)，亟需加以改良。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有工藝存在的不足之處，提供一種以懸浮微載體細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法以及根據(jù)此方法制得的疫苗。該方法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且穩(wěn)定、易 操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控制，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn) 的疫苗安全性好、免疫效力高，對(duì)病毒攻毒具有完全的免疫保護(hù)作用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，包括下列技術(shù)步驟1.將制苗用細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；2.將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；3.在適當(dāng)溫度下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上繼續(xù) 生長；4.將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔數(shù)日收 獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；毒種鑒定各種疫苗須完全符合《中華人民共和國藥典》及/或《中華人民共和國 獸藥典》規(guī)范，無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。5.將上述收獲的病毒液純化后，依照是否需要滅活而加入滅活劑或不加入滅活 劑，滅活后的病毒液加入適當(dāng)佐劑，不經(jīng)滅活的病毒液則加入適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑，充分混勻后定量分裝，即得到滅活或活毒疫苗。成品檢驗(yàn)各種疫苗皆按《中華人民共和國藥典》及/或《中華人民共和國獸藥典》 進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，對(duì)該疫苗施用人體或動(dòng)物安全無副作用。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的微載體為玻璃圓珠、聚酯纖維圓片、聚酯纖維平板。上述技術(shù)方案中，(3)步驟是以攪拌通氣或是以培養(yǎng)液液面升降方式，使細(xì)胞獲得 氣體交換。上述技術(shù)方案中，步驟(2)、(3)、(4)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)溫度是36 37°C，并含有 2. 5 5% 二氧化碳。上述技術(shù)方案中，⑴步驟中的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞(MDCK)，(4)步驟中的病毒為禽流 感病毒(H5N1)。上述技術(shù)方案中，⑴步驟中的細(xì)胞為倉鼠幼鼠腎細(xì)胞(BHK)、兔腎細(xì)胞(PK13)或 非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)，(4)步驟中的病毒為豬偽狂犬病病毒(PRV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細(xì)胞為豬腎細(xì)胞(PK)、倉鼠腎細(xì)胞(HK)或非洲綠 猴腎細(xì)胞(VERO)，(4)步驟中的病毒為日本腦炎病毒(JEV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細(xì)胞為倉鼠幼鼠腎細(xì)胞(BHK)，(4)步驟中的病毒 為牛流行熱病毒(BEFV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細(xì)胞為非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)，(4)步驟中的病毒 為狂犬病病毒(rabies virus)。本發(fā)明所提供的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，與其它現(xiàn)有技術(shù)相 互比較時(shí)，更具有下列優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明所提供的細(xì)胞培養(yǎng)方法，在一個(gè)瓶子內(nèi)可以讓細(xì)胞貼附的面積大增，可 以減少培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基的使用，其效能為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)的數(shù)十倍，可以節(jié)省許多成 本及人力，亦可減少操作人員與病毒接觸的機(jī)會(huì)，減少操作人員感染人畜共通病毒(如禽 流感H5m病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒)的機(jī)會(huì)。2.本發(fā)明提供的方法細(xì)胞接種量低，容易控制，且病毒感染效率高，生產(chǎn)效能高。


請(qǐng)參閱以下有關(guān)本發(fā)明一較佳實(shí)施例的詳細(xì)說明及其附圖，將可進(jìn)一步了解本發(fā) 明的技術(shù)內(nèi)容及其目的功效；有關(guān)該實(shí)施例的附圖為圖1為本發(fā)明的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式下面的說明部分及示意圖，僅具示范說明性而非限制性。實(shí)施例1禽流感活毒疫苗的制作1.1病毒與細(xì)胞株用來制作禽流感疫苗的病毒須由政府授權(quán)的單位提供，為H5W重配疫苗原型株 (reassortant)，該病毒株是分離自高致病性禽流感病毒株(例如A/Hong Kong/213/2003 或A/VietNam/1194/2004，或NIBRG-14)。經(jīng)過致病性測(cè)試，結(jié)果顯示H5m重配疫苗原型株 病毒不具有致病性后，才可用來制作H5W禽流感疫苗。并且使用對(duì)該病毒株具有良好的感受性的細(xì)胞系(本實(shí)施例選用狗腎細(xì)胞系Madin Darby Canine Kidney，MDCK)，作為制苗 用細(xì)胞系，通過感染并大量繁殖H5W禽流感病毒。細(xì)胞系、種毒株及量產(chǎn)用病毒株，都是依照《中華人民共和國藥典》及《中華人民共 和國獸藥典》所規(guī)定，來進(jìn)行特性試驗(yàn)、病毒含量試驗(yàn)及外來物質(zhì)試驗(yàn)。1. 2 方法(1)將制苗用狗腎細(xì)胞系(MDCK細(xì)胞)細(xì)胞接種到含有DMEM液體培養(yǎng)基(GIBC0 公司)(含體積百分比為10%的犢牛血清)與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約1小時(shí)，使上述細(xì)胞與微載體混合均勻，并使細(xì)胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細(xì) 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上生長約4 7天，直到細(xì)胞長滿整個(gè)微載體， 更換新的DMEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準(zhǔn)備接種病毒；(4)將制苗用的H5W重配疫苗原型株病毒以DMEM液體培養(yǎng)基制成病毒懸浮液 (接種濃度為10_4M.0. I.(感染復(fù)數(shù)，Multiplicity of infection))，接種于上述細(xì)胞上， 置于34°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細(xì)胞足夠 的養(yǎng)分及氣體；經(jīng)過2 3日收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進(jìn)行毒種鑒定以確 認(rèn)合乎各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；毒種鑒定(a)病毒含量以噬斑形成單位(plaque forming unit,PFU)方法計(jì)算病毒含量， 每LOmL病毒含量須彡IXIO6PFUo(b)純凈性應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(5)經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒含量彡IX 106PFU/mL H5W重配疫苗原型株病毒抗原原液 經(jīng)過離心純化后，以甲醛(formaldehyde)或2_溴乙胺(binary ethyleneimine, BEI)將病 毒滅活后，經(jīng)氫氧化鋁佐劑或以乳化(水包油，w/o)或雙相乳化(水包油包水，w/o/w)制 成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲(chǔ)存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗編號(hào)為 H5N1-T001、H5N1-TO02、H5N1-T003。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定，對(duì)施打動(dòng)物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX106PFU/mL。無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》附錄15頁進(jìn)行檢驗(yàn)， 應(yīng)無細(xì)菌生長。1. 3 結(jié)果病毒含量H5m重配疫苗原型株病毒接種MDCK細(xì)胞后，收獲病毒液，共3批，分別 測(cè)定病毒含量，每ImL病毒含量分別為109_°2PFU、10915PFU、109_°6PFU。無菌檢驗(yàn)三批產(chǎn)品均無菌生長。比較以本發(fā)明“懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)MDCK細(xì)胞 系，以增殖禽流感病毒H5m，兩系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表1-1所示。表1-1不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖禽流感病毒H5m的產(chǎn)量比較
5 上述對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的禽流感疫苗與 現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對(duì)雞只均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞 培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)禽流感疫苗的產(chǎn)量，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)量。實(shí)施例22. 1豬偽狂犬病活毒疫苗的制作2. 1. 1病毒與細(xì)胞株用來制作豬偽狂犬病活毒疫苗的病毒，是將偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)強(qiáng)毒株(LC)上的gl醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)雙基因以遺傳工程方式去除而成的 基因缺損弱毒株。經(jīng)過致病性測(cè)試，結(jié)果顯示gl醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)雙基因缺損 弱毒株(LCM株)病毒不具有致病性后，才可用來制作豬偽狂犬病活毒疫苗。并且使用對(duì)該 病毒株具有良好的感受性的細(xì)胞系(本實(shí)施例選用倉鼠幼鼠腎細(xì)胞BHK細(xì)胞；其它細(xì)胞如 兔腎細(xì)胞(PK13)或非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)也對(duì)豬偽狂犬病毒有良好的感受性)，作為制苗 用細(xì)胞系，通過感染并大量繁殖豬偽狂犬病病毒。2. 1. 2 方法(1)將制苗用BHK細(xì)胞接種到含有體積百分比為10%的犢牛血清DMEM液體培養(yǎng) 基(GIBC0公司)與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培 養(yǎng)基液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約1 3小時(shí)，使上述細(xì)胞與微載體混合均勻，并使 細(xì)胞貼附在微載體上；(3)于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上 述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細(xì)胞長滿整個(gè)微載 體，更換新的DMEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準(zhǔn)備接種病毒；(4)將豬偽狂犬病gl7TK_雙基因缺損株(LCM株)病毒以DMEM液體培養(yǎng)基(含體 積百分比為2%的犢牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為1 TCID5tl/細(xì)胞)，接種于上述 細(xì)胞上，置于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式， 提供細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體；每隔18 24小時(shí)(當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)90%以上)收獲病 毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進(jìn)行毒種鑒定以確認(rèn)合乎各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用DMEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、 10_83個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種BHK細(xì)胞4瓶，在36 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 120小時(shí)，每日觀察并紀(jì)錄細(xì)胞病變(CPE)，按Reed-Muench計(jì)算TCID5tl，每1. OmL病毒含量須≥IXIO5TCID50O(b)純凈性按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病
毒污染。(c)特異性將收獲的病毒液用DMEM液體培養(yǎng)基稀釋為103TCID5(1/mL，與等量抗 PRV家兔免疫血清等量混合，經(jīng)37°C感作一小時(shí)后分別接種于豬腎(PK)、兔腎(RK)等株化 細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)5日，須無細(xì)胞變性效應(yīng)，并經(jīng)次代同源細(xì)胞繼代培養(yǎng)7日，也須無細(xì)胞變性效 應(yīng)，并分別以天竺鼠、鵝及雞的紅血球進(jìn)行吸附試驗(yàn)，均須呈陰性反應(yīng)。(5)經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒含量彡1 X IO5 TCID5tZmL豬偽狂犬病gI_/TK_雙基因缺損株 (LCM株)病毒抗原原液經(jīng)過離心純化后，以50% (體積比)乳糖作為凍干保護(hù)劑，充分搖 勻后凍結(jié)真空干燥，并定量分裝，加蓋密封后儲(chǔ)存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗 編號(hào)為 PR-T1、PR-T2、PR-T3。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定，對(duì)施打動(dòng)物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX105TCID5(l/mL。無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》附錄15頁進(jìn)行檢 驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。2. 1. 3 結(jié)果病毒含量豬偽狂犬病gl7TK_雙基因缺損株(LCM株)病毒接種BHK細(xì)胞后，收 獲病毒液，共3批，分別測(cè)定病毒含量，每ImL病毒含量分別為10715TCID5(i、107 2°TCID5(i、 IO7.35TCID50O疫苗性狀試驗(yàn)結(jié)果見表2-1。表2-1三批疫苗性狀試驗(yàn)結(jié)果 無菌試驗(yàn)為陰性，結(jié)果見表2-2。表2-2三批疫苗無菌試驗(yàn)結(jié)果 每批疫苗抽10只樣品溶解后進(jìn)行試驗(yàn)。BHI 腦心抽出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth)接種檢體后，經(jīng)37°C培 養(yǎng)1周。PPLO Agar 支原體固體培養(yǎng)基。檢體先接種于Friis液體培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1周取培養(yǎng)液移至PPLO Agar,于5% CO2條 件下繼續(xù)培養(yǎng)1周，然后以顯微鏡檢查是否有支原體菌落生成。特異性試驗(yàn)無其它病毒污染，結(jié)果見表2-3。表2-3三 CPE 細(xì)胞病變2. 2本發(fā)明制得的豬偽狂犬病活毒疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗(yàn)2. 2. 1 材料(1)疫苗豬偽狂犬病活毒疫苗(以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號(hào) PR-T1、PR-T2、PR-T3。豬偽狂犬病活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號(hào)PR-RB1。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1月齡斷奶仔豬、易感后備母豬，I3R疾病抗體均為陰性(血清中和 價(jià)彡1 2)。(3)病毒豬偽狂犬病毒(PRV) TNL強(qiáng)毒株。2. 2. 2 方法(1)安全性試驗(yàn)a.對(duì)仔豬的安全性試驗(yàn)取1月齡I3R病毒抗體陰性(血清中和抗體彡1 2)斷奶 仔豬16頭，隨機(jī)分為4組，各組分別注射PR-ΤΙ、PR-T2、PR-T3批和PR-RBl疫苗，每頭均肌 肉注射疫苗4ml，連續(xù)觀察21日，同時(shí)測(cè)溫、觀察采食、呼吸等情況。b.后備母豬的安全性試驗(yàn)取后備母豬8頭，配種前4周分別肌肉接種 PRV(LCM)-gl7TK_疫苗(批號(hào)=PR-Tl)和PR-RBl疫苗各4頭，8ml/頭。免疫后測(cè)溫，每日 作常規(guī)臨床觀察。配種懷孕后觀察是否發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障礙， 連續(xù)觀察至分娩。(2)抗體檢測(cè)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)取1月齡ra病毒抗體陰性(血清中和抗體 2)易感仔豬20頭，隨機(jī)分為5組，每組4頭，1、2、3組分別各肌肉注射PR-T1、PR-T2、
PR-T3三批PRV (LCM)-gl7TK_疫苗2ml/頭，4組肌肉注射PR-RBl疫苗2ml/頭，5組作為負(fù) 對(duì)照，21日后采血分離血清測(cè)定中和抗體效價(jià)，同時(shí)每頭豬滴鼻105_°TCID5Q2ml的PRV(TNL 強(qiáng)毒)病毒，連續(xù)觀察14日，測(cè)量并觀察仔豬臨床表現(xiàn)。2. 2. 3 結(jié)果(1)安全性試驗(yàn)1月齡斷奶仔豬分別注射免疫4ml的疫苗(PR-T1、PR_T2、PR_T3) ,PR-RBl疫苗后， 仔豬無體溫升高，采食、精神狀況及生長發(fā)育情況均正常，試驗(yàn)仔豬均存活。后備母豬免疫 8ml的疫苗(PR-Tl)和PR-RBl疫苗后，均無體溫變化，食欲正常。正常配種后，未發(fā)生目標(biāo)病 征。結(jié)果表明，三批實(shí)驗(yàn)疫苗和PR-RB疫苗對(duì)靶動(dòng)物超劑量接種是安全的。結(jié)果見表2-4。表2-4疫苗安全性試驗(yàn)結(jié)果
9 (2)抗體檢測(cè)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)以中和試驗(yàn)方法檢測(cè)疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是PR-T1、PR_T2、 PR-T3疫苗還是PR-RBl疫苗免疫后抗體均在1 16以上，攻毒后均4/4保護(hù)，對(duì)照4/4發(fā) 病，結(jié)果見表2-5。表2-5疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)BHK細(xì)胞 系，以增殖豬偽狂犬病病毒，兩系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表2-6所示。 表2-6不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖豬偽狂犬病病毒的產(chǎn)量比較 上述對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的豬偽狂犬病疫 苗與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對(duì)易感仔豬和后備母豬均具有良好的安全性及免疫效果，且以本 發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的產(chǎn)量，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn) 疫苗的產(chǎn)量。實(shí)施例33. 1日本腦炎活毒疫苗的制作3. 1.1病毒與細(xì)胞株用來制作日本腦炎活毒疫苗的病毒是“at”株，該病毒株是采自受日本腦炎感染的 豬只，以倉鼠腎細(xì)胞(hamster kidney cell,HK cell)經(jīng)過傳代220代，成為弱毒株。經(jīng)過 致病性測(cè)試，結(jié)果顯示該弱毒株病毒不具有致病性后，才可用來制作日本腦炎活毒疫苗。并 且使用對(duì)該病毒株具有良好的感受性的細(xì)胞系(本實(shí)施例選用倉鼠腎細(xì)胞(HK)；其它細(xì)胞 如豬腎細(xì)胞(PK)與非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)也對(duì)日本腦炎病毒有良好的感受性)，作為制 苗用細(xì)胞系，通過感染并大量繁殖日本腦炎病毒。3. 1.2 方法(1)將制苗用HK細(xì)胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為10% 的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU青霉 素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時(shí)，使上述細(xì)胞與微載體混合均勻，并使細(xì)胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細(xì) 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細(xì)胞長滿整個(gè)微載體， 更換新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為10%的犢牛血清，準(zhǔn)備接種病毒；(4)將日本腦炎弱毒株(JEV- "at"strain)病毒以MEM液體培養(yǎng)基(含體積百分 比為10%的犢牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 005M. 0. I.)，接種于上述細(xì)胞上， 置于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細(xì)胞足夠 的養(yǎng)分及氣體；每隔3 5天收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進(jìn)行毒種鑒定以確 認(rèn)合乎各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、10_83個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種HK細(xì)胞4瓶，在36 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 120小時(shí)，每日觀察并紀(jì)錄細(xì)胞病變(CPE)，按Reed-Muench計(jì)算TCID5tl，每1. OmL病毒含量 須彡 IX IO5TCID50。(b)純凈性應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(c)特異性將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基稀釋為200pfu/mL，加入等量中和 抗體價(jià)為IO4以上(以噬斑法測(cè)定)的抗豬瘟病毒家兔免疫血清，經(jīng)37°C感作1. 5小時(shí)后 接種于倉鼠腎細(xì)胞(HK)經(jīng)培養(yǎng)5日，須無細(xì)胞變性效應(yīng)，并經(jīng)次代同源細(xì)胞繼代培養(yǎng)7日， 也須無細(xì)胞變性效應(yīng)，并分別以天竺鼠、鵝及雞的紅血球進(jìn)行吸附試驗(yàn)，均須呈陰性反應(yīng)。(5)經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒含量彡IX IO5TCID5ciAiL日本腦炎弱毒株病毒抗原原液 經(jīng)過離心純化后，以50 % (體積比)乳糖作為凍干保護(hù)劑，并加入5μ g/ml卡那霉素 (kanamycin)、5IU/mL青霉素(Penicillin)，充分搖勻后凍結(jié)真空干燥，并定量分裝，加蓋 密封后儲(chǔ)存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗編號(hào)為JE-TO1、JE-T02、JE-T03。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國藥典》及《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符 合規(guī)定，對(duì)施打動(dòng)物安全無副作用。疫苗病毒含量> lX105TCID5(1/mL。無菌檢驗(yàn)按《中國 獸藥典》附錄15頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。3. 1.3 結(jié)果病毒含量日本腦炎弱毒株病毒接種HK細(xì)胞后，收獲病毒液，共3批，分別測(cè)定病 毒含量及疫苗性狀，試驗(yàn)結(jié)果見表3-1。表3-1三批疫苗性狀試驗(yàn)結(jié)果 無菌試驗(yàn)為陰性，結(jié)果見表3-2。表3-2三批疫苗無菌試驗(yàn)結(jié)果 HK:倉鼠腎細(xì)胞CPE:細(xì)胞病變3.2本發(fā)明制得的日本腦炎活毒疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗(yàn)3. 2.1 材料(1)疫苗日本腦炎活毒疫苗(以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號(hào): JE-TO 1、JE-T02、JE-T03。豬溫活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號(hào)JE_RB01。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡斷奶仔豬，體重為2 3kg，日本腦炎抗體均為陰性(血清中 和價(jià)彡0. 9)。 每批疫苗抽10只樣品溶解后進(jìn)行試驗(yàn)。BHI 腦心抽出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth)接種檢體后，經(jīng)37°C培 養(yǎng)1周。PPLO Agar 支原體固體培養(yǎng)基。檢體先接種于Friis液體培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1周取培養(yǎng)液移至PPLO Agar，于5% CO2條 件下繼續(xù)培養(yǎng)1周，然后以顯微鏡檢查是否有支原體菌落生成。特異性試驗(yàn)無其它病毒污染，結(jié)果見表3-3。表3-3三批疫苗特異性試驗(yàn)結(jié)果
對(duì)照
陰性
性
mM Rr
13
3. 2. 2 方法(1)安全性試驗(yàn)取4周齡日本腦炎病毒抗體陰性(血清中和抗體< 0. 9)斷奶仔豬8頭，隨機(jī)分為 4組，各組分別注射JE-T01、JE-T02、JE-T03批和JE-RBOl疫苗，每頭均肌肉注射建議劑量 疫苗(2mL)，連續(xù)觀察14日，同時(shí)測(cè)體重、觀察采食、神經(jīng)學(xué)上的癥狀等情況。(2)抗體檢測(cè)試驗(yàn)取4周齡日本腦炎病毒抗體陰性(血清中和抗體彡1 10)易感仔豬10頭，隨機(jī) 分為5組，每組2頭，第1、2、3組分別各肌肉注射1倍劑量的JE-TO 1、JE-T02、JE-T03疫苗， 第4組肌肉注射1倍劑量的JE-RBOl疫苗，第5組不注射任何疫苗，以作為負(fù)對(duì)照；免疫14 日后采血分離血清，以測(cè)定中和(NT)抗體力價(jià)與血凝抑制(HI)抗體力價(jià)。3. 2. 3 結(jié)果(1)安全性試驗(yàn)4周齡斷奶仔豬分別注射免疫建議劑量的疫苗(JE-T01、JE-T02、JE-T03)、 JE-RBOl疫苗后，仔豬無體溫升高，采食、精神狀況及生長發(fā)育情況均正常，試驗(yàn)仔豬均存 活。結(jié)果表明，三批實(shí)驗(yàn)疫苗和JE-RBOl疫苗對(duì)靶動(dòng)物超劑量接種是安全的。結(jié)果見表3-4。表3-4疫苗安全性試驗(yàn)結(jié)果 (2)抗體檢測(cè)試驗(yàn)以中和試驗(yàn)方法檢測(cè)疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是JE-T01、 JE-T02、JE-T03疫苗還是JE-RBOl疫苗免疫后抗體力價(jià)均在1 20以上，結(jié)果見表3-5。表3-5疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果
免疫前 免疫14天 免疫前 免疫14天 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)HK細(xì)胞系， 以增殖日本腦炎病毒，兩系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表3-6所示。表3-6不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖日本腦炎病毒的產(chǎn)量比較 上述對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的日本腦炎疫苗 與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對(duì)易感仔豬均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載 體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)日本腦炎疫苗的產(chǎn)量，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。實(shí)施例44. 1牛流行熱滅活疫苗的制作4. 1.1病毒與細(xì)胞株以牛流行熱病毒強(qiáng)毒株(bovine ephemeral fever virus，BEFV，例如Tn73 或 Τη88128株)制作牛流行熱滅活疫苗，并且使用對(duì)該病毒株具有良好的感受性的細(xì)胞系(本 實(shí)施例選用倉鼠幼鼠腎細(xì)胞BHK)，作為制苗用細(xì)胞系，通過感染并大量繁殖牛流行熱病毒。4. 1.2 方法
(1)將制苗用BHK細(xì)胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為7% 的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU青霉 素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時(shí)，使上述細(xì)胞與微載體混合均勻，并使細(xì)胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細(xì) 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細(xì)胞長滿整個(gè)微載體， 更換新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準(zhǔn)備接種病毒；(4)將牛流行熱病毒強(qiáng)毒株(Tn88128株)以MEM液體培養(yǎng)基(含2%犢牛血清) 制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 05M. 0. I.)，接種于上述細(xì)胞上，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán) 境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體；每隔3 5 天收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進(jìn)行毒種鑒定以確認(rèn)合乎各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、 10_83個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種BHK細(xì)胞4瓶，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 120小時(shí)，每日觀察并紀(jì)錄細(xì)胞病變(CPE)，按Reed-Muench計(jì)算TCID5tl，每1. OmL病毒含量 須彡 IX IO6TCID50。(b)純凈性按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病
^fe ο(5)經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒含量彡IX 106TCID5(1/mL牛流行熱病毒抗原原液經(jīng)過離心 純化后，以2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)將病毒滅活后，經(jīng)雙相乳化(水包油包 水)制成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲(chǔ)存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗 編號(hào)為 BEF-TO1、BEF-T02、BEF-T03。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定，對(duì)施打動(dòng)物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX106TCID5(l/mL。無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》附錄15頁進(jìn)行檢驗(yàn)， 應(yīng)無細(xì)菌生長。4. 1.3 結(jié)果病毒含量牛流行熱病毒病毒接種BHK細(xì)胞后，收獲病毒液，共3批，分別測(cè)定病毒 含量，每 ImL 病毒含量分別為 1 X ΙΟ8'2TCID50,1 X IO8' 5TCID50,1 X IO8' 35TCID500無菌檢驗(yàn)按2000年獸用生物制品規(guī)程附錄445頁進(jìn)行，三批產(chǎn)品均無菌生長。4. 2本發(fā)明制得的牛流行熱滅活疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗(yàn)4. 2.1 材料(1)疫苗牛流行熱滅活疫苗(以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號(hào) BEF-TO1、BEF-T02、BEF-T03。豬溫活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號(hào) BEF-RBO1。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6月齡仔牛，牛流行熱病毒抗體均為陰性(血清中和價(jià)< 1 10)。4. 2. 2 方法抗體檢測(cè)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)取6月齡仔牛10頭，牛流行熱病毒抗體呈陰性(血清中和抗體 10)，隨機(jī)分為5組，每組2頭，第1、2、3組分別各肌肉注射1倍劑量的 BEF-TOU BEF-T02、BEF-T03疫苗，第4組肌肉注射1倍劑量的BEF-RBOl疫苗，第5組不注 射任何疫苗，以作為負(fù)對(duì)照；免疫8周后采血分離血清，以測(cè)定中和抗體力價(jià)。4. 2. 3 結(jié)果以中和試驗(yàn)方法檢測(cè)疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是BEF-T01、 BEF-T02、BEF-T03疫苗還是BEF-RBOl疫苗免疫后抗體力價(jià)均在1 32以上，結(jié)果見表4_1。表4-1疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)BHK細(xì)胞 系，以增殖牛流行熱病毒，兩系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表4-2所示。表4-2不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖牛流行熱病毒的產(chǎn)量比較 上述對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的牛流行熱疫苗 與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對(duì)易感仔牛均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載 體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)牛流行熱疫苗的產(chǎn)量，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。實(shí)施例5狂犬病滅活疫苗的制作5.1病毒與細(xì)胞株
以狂犬病病毒強(qiáng)毒株(Rabies virus, RV，例如CTN_1或aGV株)制作狂犬病滅 活疫苗，并且使用對(duì)該病毒株具有良好的感受性的細(xì)胞系(本實(shí)施例選用非洲綠猴腎細(xì)胞 VER0)，作為制苗用細(xì)胞系，通過感染并大量繁殖狂犬病病毒。5. 2 方法(1)將制苗用VERO細(xì)胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為 7%的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU 青霉素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時(shí)，使上述細(xì)胞與微載體混合均勻，并使細(xì)胞貼附 在微載體上；(3)于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細(xì) 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上生長約7天，直到細(xì)胞長滿整個(gè)微載體，更換 新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準(zhǔn)備接種病毒；(4)將狂犬病病毒強(qiáng)毒株(aGV株)以MEM液體培養(yǎng)基(含體積百分比為2%的犢 牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 05M. 0. I.)，接種于上述細(xì)胞上，置于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體； 于接種第4天收獲第1次病毒液，并加入新的MEM培養(yǎng)液(含體積百分比為2%的犢牛血 清)，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天連續(xù)收獲病毒液；收獲的病毒液置于4°C保存，并進(jìn)行毒種鑒定以 確認(rèn)合乎各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染，并測(cè)定病毒液滴度，每LOmL 病毒含量須彡5. 51g LD5tlAil ；(5)經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒含量彡5. 51g LD5tlAil的狂犬病病毒抗原原液經(jīng)過離心純 化后，以甲醛或2-溴乙胺(BEI)將病毒滅活后，經(jīng)氫氧化鋁佐劑或以乳化(水包油，w/o)或 雙相乳化(水包油包水，w/o/w)制成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲(chǔ)存于2 8°C得 到成品。成品檢驗(yàn)應(yīng)符合規(guī)定，對(duì)施打動(dòng)物安全無副作用。疫苗病毒含量>5.51g LD50/ ml，且應(yīng)無細(xì)菌生長。5. 3 結(jié)果病毒含量狂犬病病毒接種VERO細(xì)胞后，連續(xù)收獲病毒液，共重復(fù)2次試驗(yàn)，分別 測(cè)定病毒含量，每ImL病毒含量分別如表5-1所示。表5-1病毒收獲量
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無菌檢驗(yàn)三批產(chǎn)品均無菌生長。比較以本發(fā)明“懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)VERO細(xì)胞 系，以增殖狂犬病病毒，兩系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表5-2所示。表5-2不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖狂犬病病毒的產(chǎn)量比較 上述對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)狂犬病疫苗的產(chǎn) 量，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。雖然已經(jīng)就特別具體實(shí)例及應(yīng)用說明過本發(fā)明，不過諳于此技者，從本揭示可以 產(chǎn)生附加的具體實(shí)例，及修改而不違離所主張的本發(fā)明旨意或超過本發(fā)明所主張的范圍。 因此，要了解本文的圖式及說明部份是僅提出作為例子以幫助本發(fā)明的理解且不應(yīng)該視為 要限制其范圍。上列詳細(xì)說明是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本 發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案的專利范圍中。
權(quán)利要求
以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在于包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；(3)在適當(dāng)溫度下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；于一定時(shí)間或一段時(shí)間連續(xù)收獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；(5)將上述收獲的病毒液純化后，加入適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑，充分混勻后定量分裝，即得到所需的活毒疫苗。
2.以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在于包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；(3)在適當(dāng)溫度下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；于一定時(shí)間或一 段時(shí)間連續(xù)收獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；(5)將上述收獲的病毒液純化后，以滅活劑進(jìn)行滅活，并加入適當(dāng)?shù)淖魟?，充分混勻?定量分裝，即得到所需的滅活疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的微載體為玻璃圓珠、聚酯纖維圓片、或聚酯纖維平板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞，(4)步驟中的病毒為禽流感病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于⑴步驟中的細(xì)胞為倉鼠幼鼠腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞或非洲綠猴腎細(xì)胞，⑷步驟中的病毒 為豬偽狂犬病病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細(xì)胞為豬腎細(xì)胞、倉鼠腎細(xì)胞或非洲綠猴腎細(xì)胞，⑷步驟中的病毒為日 本腦炎病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細(xì)胞為倉鼠幼鼠腎細(xì)胞，(4)步驟中的病毒為牛流行熱病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細(xì)胞為非洲綠猴腎細(xì)胞，(4)步驟中的病毒為狂犬病病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(3)步驟是以攪拌通氣方式使細(xì)胞獲得氣體交換。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(3)步驟是以培養(yǎng)液液面升降方式，以提供細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體交換。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(4)步驟是以1至5天為時(shí)間單位收獲1次病毒液，并連續(xù)收獲病毒液。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法制備的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以懸浮微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制的疫苗及其方法，包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；(3)在適當(dāng)溫度下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細(xì)胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔1～3日收獲病毒液或含有病毒的細(xì)胞，并且更換培養(yǎng)液；(5)將上述收獲的病毒液純化后，視需要進(jìn)行滅活，滅活后的病毒液加入適當(dāng)佐劑，不經(jīng)滅活的病毒液則加入適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑，充分混勻后定量分裝，即得到所需的疫苗。該方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101869702SQ20091013782
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者郭村勇, 陳旭中 申請(qǐng)人:福又達(dá)生物科技股份有限公司