本發(fā)明涉及一種心肌細(xì)胞，特別涉及一種工程化心肌組織中心肌細(xì)胞去分化重塑的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)心肌組織工程發(fā)展迅速，以生物支架材料和種子細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的組織工程化心肌組織技術(shù)已越來(lái)越成熟。工程化心肌組織具有很大的潛在發(fā)展空間。新近研究表明，通過(guò)體外組織工程手段構(gòu)建的心肌組織不僅可以實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的損傷修復(fù)，心臟組織的重構(gòu)等，而且還被認(rèn)為是體外探討心肌生理病理問(wèn)題的良好模型體系。在過(guò)去幾年中，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道利用生物材料結(jié)合種子細(xì)胞來(lái)模擬天然心肌組織的結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建出能夠節(jié)律性收縮的心臟組織，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)心肌細(xì)胞功能的調(diào)控。然而，在心肌組織的構(gòu)建中仍然存在許多挑戰(zhàn)，且越來(lái)越多的研究者認(rèn)為利用發(fā)育生物學(xué)原理指導(dǎo)工程化心肌組織的構(gòu)建對(duì)于改善構(gòu)建的心肌組織質(zhì)量具有重要意義。

對(duì)于組織工程化心肌組織構(gòu)建的研究，以往研究者大部分把落腳點(diǎn)放在如何構(gòu)建出與在體組織高度相關(guān)的心肌組織模型。近十幾年，心臟干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的來(lái)源已經(jīng)吸引了大量的心肌組織工程研究者的關(guān)注，且已被證實(shí)在修復(fù)受損心臟組織中具有很大潛能。而受限于心臟干細(xì)胞的數(shù)量，當(dāng)心臟組織受損超過(guò)一定程度其修復(fù)效果受到限制。近幾年研究者將目光集中在是否可以實(shí)現(xiàn)工程化心肌組織中終末分化的心肌細(xì)胞恢復(fù)再生能力的研究上。他們發(fā)現(xiàn)使用終末分化心肌細(xì)胞可以在體外構(gòu)建具有節(jié)律性收縮的心臟組織且已經(jīng)成為一個(gè)值得關(guān)注的研究問(wèn)題，然而在這個(gè)過(guò)程中心肌細(xì)胞經(jīng)歷了怎樣的發(fā)育過(guò)程并實(shí)現(xiàn)了心肌組織的重塑呢，這個(gè)科學(xué)問(wèn)題還需要進(jìn)一步討論。

在傳統(tǒng)意義上認(rèn)為哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，且基本沒(méi)有增殖能力，其不能進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)而不能通過(guò)去分化和再分化的過(guò)程恢復(fù)完整的功能。但新近研究表明，斑馬魚的心肌細(xì)胞在其發(fā)育的整個(gè)階段可以保持增殖潛力，成年斑馬魚可以在部分手術(shù)切除高達(dá)20％的心室后實(shí)現(xiàn)心臟的完全恢復(fù)，甚至發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞可通過(guò)去分化促進(jìn)細(xì)胞再進(jìn)入周期實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。類似研究也表明，心肌去分化的現(xiàn)象也發(fā)生在心肌梗死邊界區(qū)。

與體內(nèi)生理病理?xiàng)l件相比，模擬體內(nèi)三維微環(huán)境，體外構(gòu)建的工程化心肌組織確實(shí)在心肌組織重建中具有特殊意義。過(guò)去我們實(shí)驗(yàn)室，已開(kāi)展了大量的工程化心肌組織構(gòu)建的研究，已成功構(gòu)建了利用新生大鼠心肌細(xì)胞與膠原/matrigel混合的心肌組織。膠原和基質(zhì)膠是常用的天然材料用于組織工程，它們是心肌組織工程構(gòu)建中重要的支架材料。然而，基于膠原/matrigel構(gòu)建的心肌組織中是心肌細(xì)胞如何發(fā)育，是否同樣存在心肌細(xì)胞的分化與去分化現(xiàn)象尚未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種工程化心肌組織中心肌細(xì)胞去分化重塑的方法。

一種工程化心肌組織中心肌細(xì)胞去分化重塑的方法，包括如下步驟：

(1)取哺乳動(dòng)物肌腱，剪碎，溶于醋酸溶液中,12000rpm/4℃離心后取上清，制成ⅰ型膠原；

(2)將ⅰ型膠原，基質(zhì)膠matrigel，dmem溶液混合，并用naoh溶液調(diào)為中性，制成混合物；

(3)取哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞，與步驟(2)制備的混合物混合，接種到孔板中，在的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0.5-1h后，添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)至心肌重塑形成。

所述醋酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；所述ⅰ型膠原的濃度為2mg/ml。

所述ⅰ型膠原，基質(zhì)膠，dmem的質(zhì)量比為5:4:1；所述dmem溶液的質(zhì)量濃度為0.1-10％。

所述naoh溶液的濃度為0.1m。

所述哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞的細(xì)胞密度為2-9×10⁶cells/ml。

所述孔板為12孔板，接種量為每孔1ml。

所述培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37uc/5％co2。

所述培養(yǎng)基的成分包括85wt％高糖dmem和15wt％fbs。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明以膠原/基質(zhì)膠為支架材料，新生sd大鼠心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建了工程化心肌組織。利用免疫熒光染色的方式，對(duì)eht中巨噬細(xì)胞的變化規(guī)律做了初步探討，結(jié)果顯示，cd206陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加而cd86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則逐漸降低。本發(fā)明的方法將工程化心肌組織中心肌細(xì)胞去分化并且重塑，深入闡明心肌細(xì)胞的再生機(jī)制并提高eht的構(gòu)建質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)3天的eht中心肌細(xì)胞發(fā)生去分化電鏡圖。

圖2是tem分析工程化心肌組織中心肌細(xì)胞的重塑電鏡圖。

圖3是培養(yǎng)第10天ehts中發(fā)生重塑的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征電鏡圖。

圖4為平面培養(yǎng)的細(xì)胞圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

一種工程化心肌組織中心肌細(xì)胞去分化重塑的方法，包括如下步驟：

(1)取成年sd大鼠鼠尾肌腱，剪碎，溶于1％的醋酸溶液中，12000rpm/4℃離心后取上清，制備2mg/ml的ⅰ型膠原；

(2)將膠原，基質(zhì)膠matrigel，dmem溶液按質(zhì)量比5:4:1混合，并用0.1m的naoh調(diào)為中性，制成混合物；所述dmem溶液的質(zhì)量濃度為1％。

(3)取sd大鼠的心肌細(xì)胞，按8×10⁶cells/ml細(xì)胞密度與上述混合物混合，接種到12孔板中，每孔1ml，在37uc/5％co2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0.5-1h后，添加培養(yǎng)基(85wt％dmem高糖+15wt％fbs)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

(1)培養(yǎng)3天的eht中心肌細(xì)胞發(fā)生去分化

通過(guò)h&e染色顯示出膠原/基質(zhì)膠中的心肌細(xì)胞的形態(tài)特征。如圖1a所示，在h&e染色切片中觀察到新生大鼠心肌細(xì)胞逐漸喪失其形態(tài)特征，且大量心肌細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)呈橢圓形，細(xì)胞核偏向一側(cè)。為了進(jìn)一步觀察心肌細(xì)胞在體外三維環(huán)境中去分化的程度，使用透射電子顯微鏡(tem)分析了eht中心肌細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1中的c)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)早期可以觀察到心肌細(xì)胞的去分化現(xiàn)象。在培養(yǎng)3天的eht中，心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中釋放出肌原纖維；且與正常的心肌細(xì)胞相比z帶結(jié)構(gòu)和周圍肌節(jié)逐漸消失。同時(shí)，心肌細(xì)胞釋放出大量的肌原纖維，通過(guò)胞吐進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)，釋放的肌原纖維環(huán)繞在心肌細(xì)胞周圍。同時(shí)，我們利用免疫熒光檢測(cè)α-平滑肌-肌動(dòng)蛋白(α-sm-a)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示工程化心肌組織中有α-sm-a陽(yáng)性表達(dá)的心肌細(xì)胞，間接說(shuō)明發(fā)生了心肌細(xì)胞發(fā)生了去分化現(xiàn)象(見(jiàn)圖1中的b)。

(2)tem分析工程化心肌組織中心肌細(xì)胞的重塑

當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生去分化后，繼續(xù)培養(yǎng)至第七天，利用tem觀察心肌細(xì)胞在eht條件下的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：隨著心肌細(xì)胞逐漸培養(yǎng)，去分化的心肌細(xì)胞在另一側(cè)開(kāi)始形成新的細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)啟動(dòng)了心肌細(xì)胞的重塑(見(jiàn)圖2中的a)。在培養(yǎng)第7天可以觀察到幼稚的心肌細(xì)胞。此時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞經(jīng)歷了新的表型變化。細(xì)胞顯示不成熟的形態(tài)和不規(guī)則的輪廓，發(fā)生了較短的延伸，圍繞核周圍發(fā)生肌節(jié)重組，且可以清晰的觀察到z帶及h帶。發(fā)生重塑的心肌細(xì)胞中存在許多線粒體和肌節(jié)絲(圖2中的b)。此外，在個(gè)別心肌細(xì)胞間形成細(xì)胞內(nèi)連接，且透射電鏡結(jié)果可以清晰的觀察到心肌細(xì)胞邊緣有類囊泡物質(zhì)與細(xì)胞膜相連(圖2中的c)。雖然在細(xì)胞質(zhì)中有新的肌節(jié)細(xì)絲組裝，但仍然缺乏標(biāo)志性的橫向和縱向肌節(jié)結(jié)構(gòu)。

(3)培養(yǎng)第10天ehts中發(fā)生重塑的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

培養(yǎng)10天后，采用h&e染色可以清晰的觀察到典型的心肌細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形(見(jiàn)圖3中的b)，這些具有再分化表型的心肌細(xì)胞的比例增多，但也同時(shí)發(fā)現(xiàn)ehts中分布于膠原/基質(zhì)膠邊緣的心肌細(xì)胞再分化程度與分布于中心的心肌細(xì)胞再分化程度不同，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征不清晰(見(jiàn)圖3中的a)。透射電鏡顯示心肌細(xì)胞的表型開(kāi)始改變并且呈現(xiàn)極性。在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量的線粒體和肌原纖維(見(jiàn)圖3中的d)。它們可能為心肌細(xì)胞再分化提供能量基礎(chǔ)。再分化心肌細(xì)胞呈現(xiàn)不連續(xù)的輪廓，雖然心肌細(xì)胞仍然不成熟，細(xì)胞輪廓和肌絲的形態(tài)接近正常心肌細(xì)胞的形態(tài)(見(jiàn)圖3中的c)。我們還可以觀察到材料(膠原/matrigel)和細(xì)胞膜之間的連接(見(jiàn)圖3中的d)。我們同樣發(fā)現(xiàn)不是所有的去分化心肌細(xì)胞都可以經(jīng)歷再分化過(guò)程從而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞重構(gòu)，但掃描電鏡結(jié)果已可證實(shí)工程化心肌組織中心肌細(xì)胞經(jīng)歷去分化和再分化的過(guò)程恢復(fù)再生能力。

在發(fā)現(xiàn)ehts中心肌細(xì)胞去分化及重塑發(fā)生的同時(shí)，發(fā)明人檢測(cè)了其中巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物cd206，cd86，cd68的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期，ehts中有少量cd206的表達(dá)，但cd86表達(dá)較多。這意味著培養(yǎng)3天的eht發(fā)生炎癥反應(yīng)。同時(shí)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，cd206的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有顯著增加，發(fā)明人分析，cd206陽(yáng)性細(xì)胞可能有利于心肌細(xì)胞的再分化；相反，cd86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，暗示心肌細(xì)胞再分化過(guò)程中炎癥反應(yīng)減少。直到培養(yǎng)第14天，cd206陽(yáng)性數(shù)量與第3天和第7天比最多，但幾乎不存在cd86的表達(dá)。期間，cd68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化不明顯。

發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，平面培養(yǎng)的細(xì)胞中同樣有巨噬細(xì)胞的表達(dá)，其中除cd86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸減少外，cd206及cd68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化并不明顯(圖4)。

本發(fā)明在體外構(gòu)建工程化心肌組織，通過(guò)闡述工程化心肌組織中心肌細(xì)胞是否發(fā)生去分化進(jìn)而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的重塑，并最終恢復(fù)增殖能力，以期為構(gòu)建高質(zhì)量心肌組織，探討心臟再生機(jī)制提供理論依據(jù)。本發(fā)明以膠原/基質(zhì)膠為支架材料，新生sd大鼠心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建了工程化心肌組織。采用h&e染色，透射電鏡及免疫熒光檢測(cè)手段證實(shí)了在培養(yǎng)第3天，心肌細(xì)胞發(fā)生去分化，觀察到細(xì)胞核偏向一側(cè)，肌原纖維被釋放出胞質(zhì)。培養(yǎng)7天后，心肌細(xì)胞開(kāi)始表現(xiàn)出幼稚的細(xì)胞形態(tài)，并在核周圍逐漸重新形成肌節(jié)。在培養(yǎng)第14天天，再分化表型的心肌細(xì)胞比例增加。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量pcr，免疫熒光染色檢測(cè)了工程化心肌組織中心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的變化規(guī)律。結(jié)果表明α-actinin及ctnt隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加先降低后升高，而心肌細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(gata4/nkx2.5)則隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)升高后降低。利用免疫熒光染色的方式，對(duì)eht中巨噬細(xì)胞的變化規(guī)律做了初步探討，結(jié)果顯示，cd206陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加而cd86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則逐漸降低。本發(fā)明闡述了工程化心肌組織中心肌細(xì)胞的去分化及重塑現(xiàn)象，在深入闡明心肌細(xì)胞的再生機(jī)制并提高eht的構(gòu)建質(zhì)量方面發(fā)揮巨大潛能。

以上公開(kāi)的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。